美洲大蠊總蛋白的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了美洲大蠊總蛋白的提取方法，它包括如下操作步驟：取美洲大蠊藥材，粉碎，以水為溶劑，于25～55℃下以閃式提取1～3次，每次加水10～22倍量，1～3min/次，提取電壓為50～110V，水的pH為6～10。本發(fā)明通過對提取方法的篩選，最終得到了美洲大蠊的最佳閃式提取方法，能夠保證較高的蛋白質(zhì)收率基礎上，縮短提取時間，為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了可能。
【專利說明】美洲大蠊總蛋白的提取方法

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及美洲大蠊總蛋白的提取方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 美洲大蠊（Periplaneta americana Linnaeus)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科 大蠊屬昆蟲。已有研究指出經(jīng)提取、純化而得的美洲大蠊蛋白具有良好的對抗四氯化碳所 致小鼠急性肝損傷作用，本研究前期工作基礎亦證實美洲大蠊的水閃式提取物藥效明顯， 提示了閃式提取法應用于該活性部位制備過程的潛質(zhì)，因此本研究擬以總蛋白含量為指 標，對閃式提取法與傳統(tǒng)提取方法展開比較，并應用閃式提取法對提取工藝進行單因素考 察，以確定主要因素與水平，繼而采用正交設計法優(yōu)選閃式提取工藝，為動物藥蛋白類熱不 穩(wěn)定活性成分的提取建立技術(shù)平臺。
[0003] 中國專利申請：CN 103083363 A，公開了美洲大蠊提取物的制備方法，它是采用閃 式提取方法進行提取的，其中，出膏率平均為47. 59%，蛋白質(zhì)含量可以達到約15mg/g。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種提取效果更優(yōu)異的美洲大蠊總蛋白的提取方法。
[0005] 本發(fā)明提供了美洲大蠊總蛋白的提取方法，它包括如下操作步驟：
[0006] 取美洲大蠊，粉碎，以水為溶劑，于25?55°C下以閃式提取1?3次，每次加水 10?22倍量，1?3min/次，提取電壓為50?110V，水的pH為6?10。
[0007] 進一步地，提取溫度為45?55°C，優(yōu)選為45°C。
[0008] 進一步地，閃式提取為Imin/次，提取電壓70V。
[0009] 優(yōu)選地，提取次數(shù)為3次。
[0010] 進一步地,每次加水量為16?20倍。
[0011] 優(yōu)選地，每次加水量為20倍。
[0012] 中國專利申請：CN 103083363 A中，并未提及任何關(guān)于溶劑pH與提取效果之間的 關(guān)聯(lián)。然而，本發(fā)明在研究中意外地發(fā)現(xiàn)，提取溶劑的PH對提取效果也有顯著影響，因此， 本發(fā)明中還對溶劑PH進行了考察：
[0013] 進一步地，水的pH為8. 3?9. 3。在此條件下，提取效果優(yōu)于純水。
[0014] 優(yōu)選地，水的pH為8. 8。
[0015] 本發(fā)明通過對提取方法的篩選，最終得到了美洲大蠊的最佳閃式提取方法，能夠 保證較高的蛋白質(zhì)收率基礎上，縮短提取時間，為工業(yè)化大生產(chǎn)提供了可能。
[0016] 本發(fā)明經(jīng)實驗驗證，所得美洲大蠊閃式提取物中總蛋白質(zhì)的含量和出膏率均明顯 優(yōu)于專利號CN 103083363 A的專利公開方法所制備的美洲大蠊閃式提取樣品。

【具體實施方式】
[0017] 實施例1本發(fā)明提取方法
[0018] 取美洲大蠊藥材，粉碎，以水溶溶劑，于45°C下以閃式提取3次，每次加水20倍量， Imin/次，提取電壓為70V，水的pH為9. 3。
[0019] 實施例2本發(fā)明提取方法
[0020] 取美洲大蠊藥材，粉碎，以水溶溶劑，于45°C下以閃式提取3次，每次加水20倍量， Imin/次，提取電壓為70V，水的pH為8. 8。
[0021] 實施例3提取方法的篩選
[0022] 1 材料
[0023] 美洲大蠊藥材（購自云南騰沖，經(jīng)生藥教研室盧先明教授鑒定為蜚蠊科大蠊屬昆 蟲美洲大蠊Periplaneta americana L.)，考馬斯亮藍G250(成都市科龍化工試劑廠，批號 20120924)〇
[0024]JHBE-50T型閃式提取器（河南金鼐科技發(fā)展有限公司），UV-1700型紫外-可見 分光光度計（島津制作所分析計測事業(yè)部）。
[0025] 2 方法與結(jié)果
[0026] 2. 1總蛋白含量測定方法
[0027] 2. L 1供試品溶液的制備方法
[0028] 取藥材適量，按各法提取，合并濾液。2. 3項下濾液定容至500mL，作為儲備液，精 密吸取水提儲備液8mL定容至25mL，作為供試品溶液；2. 4項下濾液定容至IOOOmL,作為儲 備液，精密吸取水提儲備液5或IOmL定容至25mL，作為供試品溶液。
[0029] 2.1.2標準曲線的建立
[0030] 以A595為縱坐標，BSA濃度為橫坐標，回歸方程為y =(λ0041χ+(λ 1500 (r = 0. 9995)，在30. 69?153. 45 μ g，其濃度與吸光度之間線性關(guān)系良好。
[0031] 2.1.3供試品溶液含量測定
[0032] 精密吸取供試品液各lmL，按2. 4.2顯色，測定A595。通過標準曲線計算總蛋白含 量。
[0033] 2.2出膏率測定
[0034] 按照2. I. 1項下方法制備儲備液，各取IOOmL置蒸發(fā)皿中，水浴揮干，105°C常壓干 燥至恒重，稱定質(zhì)量，計算出膏率。
[0035] 2. 3提取工藝的單因素考察
[0036] 藥材全蟲與最粗粉的前處理均為45°C烘干。提取后過濾、離心、合并濾液，分別按 2. I. 1、2. 1. 4項下方法制備供試品溶液并測定總蛋白含量，另按2. 2項下方法測定出膏率。 以總蛋白含量與出膏率為提取工藝考察的評價指標。
[0037] 2. 3. 1提取方法的確定
[0038] 取最粗粉約25g，加入10倍量水，于25°C分別按閃式提取法（3min/次，70V)、 回流提取法（lh/次）、攪拌提取法（12h/次）提取各2次?？偟鞍缀亢统龈嗦史謩e為 19. 03,7. 74,6. Olmg .g-1和56. 19% ,46. 64% ,49. 53%。閃式提取法能以最低的出膏率獲 得最高的總蛋白含量，符合制劑學減小劑量、提高療效的要求。
[0039] 2. 3. 2溶劑種類的確定
[0040]取最粗粉約25g，分別加入10倍量純水、堿水（pH = 9. 0)、95 %乙醇，于25°C按閃 式提取法（3min/次，70V)提取2次。總蛋白含量和出膏率分別為19. 03,19. 80,10. 17mg j1 和56. 19% ,56.63% ,45.75%。以水為溶劑提取，總蛋白含量明顯高于95%乙醇，因此后 續(xù)研究以水為溶劑進行；而PH= 9的堿水又優(yōu)于純水，因此本發(fā)明擬對溶劑pH作出進一步 考察。
[0041] 2. 3. 3藥材投料狀態(tài)的確定
[0042] 取全蟲和最粗粉適量，加入10倍量水，于25°C按閃式提取法（lmin/次，70V)提取 1次?？偟鞍缀亢统龈嗦史謩e為18. 94, 19. 81mg·g_1和52. 06%，52. 27%。兩指標均接 近，考慮到刀頭的維護，后續(xù)研究以最粗粉投料。
[0043] 2. 3. 4提取次數(shù)考察
[0044] 取最粗粉適量，加入10倍量水，于25 °C按閃式提取法（lmin/次，70V)各提取 1，2, 3, 4次。隨著提取次數(shù)的增加，總蛋白含量與出膏率有所增長，分別為19.01,19. 13， 19. 77,19.83mg·g-1 和 56.09 % ,56.21% ,56. 72%，56. 74%，但逐漸趨于平穩(wěn)，經(jīng)3 次提 取總蛋白已基本提取完全。
[0045] 2. 3. 5提取溫度考察
[0046] 取最粗粉適量，分別于25, 35, 45, 55 °C下加入10倍量水，按閃式提取法 (lmin/次，70V)提取1次。在25-45°C，隨著提取溫度的升高，總蛋白含量與出膏率 呈增長趨勢，而在45-55 °C呈下降趨勢，分別為18. 32,19. 01，19. 56,19. 12mg·g4和 55. 17% ,56. 15%，56. 34%，56. 42%，推測在55°C左右某些蛋白的結(jié)構(gòu)遭到破壞、產(chǎn)生絮 凝，影響溶出。
[0047] 2. 3. 6提取時間考察
[0048] 取最粗粉適量，加入10倍量水，于25°C按閃式提取法（各l，2,3,4min/次，70V) 提取1次。結(jié)果提取時間不超過3min時，總蛋白含量與出膏率隨時間增加而升高，而在 4min略微下降，分別為 18. 47,19. 13,19. 69,19. 44mg·g-1 和 54. 03%，56. 11%，56. 29%， 56. 47 %，提不每次提取2-3min總蛋白可基本提取完全。
[0049] 2. 3. 7溶劑倍量考察
[0050] 取最粗粉適量，分別加入10, 14, 18, 22倍量水，于25°C按閃式提取法（lmin/次， 70V)提取1次。結(jié)果當溶劑倍量不超過18倍時，總蛋白含量與出膏率隨其增加而顯著 升高，而在其達到22倍量時反而略微降低，分別為18. 55,19. 26,19. 71，19. 64mg·g-1和 52. 09% ,56. 33% ,56. 68%，56. 69%，提示料液比控制在1:18左右較為合理。
[0051] 2.3.8提取電壓考察
[0052] 取最粗粉適量，加入10倍量水，于25 °C按閃式提取法（lmin/次，各 50, 70, 90, 110V)提取1次。結(jié)果隨著提取電壓的升高，總蛋白含量與出膏率呈現(xiàn)先增后降 的趨勢，分別為 18. 63,19. 81，19. 49,19. 42mg.g-1 和 55. 21%，56. 56%，56. 54%，56. 72%， 在70V時達到最高值，推測當提取電壓超過70V時，刀頭的高速轉(zhuǎn)動可能造成提取液溫度陡 升，影響了總蛋白的溶出。該實驗結(jié)果明顯優(yōu)于專利號CN103083363A的專利公開方法 (80-120伏特電壓下提取）所制備的美洲大蠊閃式提取樣品。
[0053] 2. 3. 9 溶劑pH考察
[0054]取最粗粉適量，分別加入10倍量pH= 6. 3, 7. 3, 8. 3, 9. 3的水，于25°C按閃式提取 法（lmin/次，70V)提取1次?？偟鞍缀统龈嗦史謩e為：18. 55,19. 51，19. 69,19. 62mg·g4 和55. 55%，56. 57%，56. 82%，56. 76%，從實驗所得數(shù)據(jù)可知，總蛋白含量在pH= 8. 33時 最高，提示可控制溶劑pH在8. 3?9. 3。
[0055] 單因素考察結(jié)果顯示：各因素對總蛋白提取的影響順序為提取次數(shù)〉溶劑倍量〉 溶劑pH>提取電壓〉提取溫度〉提取時間，前三者作為主要因素，可選取較佳水平進一步優(yōu) 選提取工藝。
[0056] 2.4 正交設計優(yōu)選閃式提取工藝以總蛋白含量和出膏率為指標，固定次要因 素水平為提取電壓70V、提取溫度45°C、提取時間2min，采用L9(34)正交表安排試驗，因素 水平表、試驗結(jié)果及方差分析結(jié)果分別見表1?3。
[0057] 表1閃式提取工藝優(yōu)選因素水平
[0058]

【權(quán)利要求】
1. 美洲大蠊總蛋白的提取方法，其特征在于：它包括如下操作步驟： 取美洲大蠊，粉碎，以水為溶劑，于25?55°C下以閃式提取1?3次，每次加水10? 22倍量，1?3min/次，提取電壓為50?110V，水的pH為6?10。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：提取溫度為45?55°C，優(yōu)選為45°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：閃式提取為lmin/次，提取電壓70V。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任意一項所述的提取方法，其特征在于：提取次數(shù)為3次。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：每次加水量為16?20倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于：每次加水量為20倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于：水的pH為8. 3?9. 3。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的提取方法，其特征在于：水的pH為8. 8。
【文檔編號】C07K1/14GK104341485SQ201410379560
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年8月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月2日
【發(fā)明者】王達賓, 蘇柘僮, 熊永愛, 鄒俊波, 姜小東, 郭華 申請人:成都百草和濟科技有限公司