一種河蜆抗氧化肽及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種河蜆抗氧化肽及其制備方法。所述的河蜆抗氧化肽是利用復(fù)合酶微波協(xié)同可控酶解技術(shù)對河蜆肉進(jìn)行深度開發(fā)，制備出新型且具有抗氧化功效的抗氧化肽。本發(fā)明提高了河蜆資源的利用率，為河蜆的深度加工提供一條新的途徑，提升河蜆附加值，促進(jìn)農(nóng)民增收，同時(shí)在促進(jìn)河蜆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展方面將取得更好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種河蜆抗氧化肽及其制備方法
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及一種河蜆抗氧化肽及其制備方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]河蜆,學(xué)名(corbicula fluminea),又稱黃蜆、金紺、扁螺等,是雙殼類軟體動(dòng)物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)貝類之一。河蜆含有豐富的蛋白質(zhì)(干樣中粗蛋白含量達(dá)60%以上)、糖原、必需氨基酸、?；撬?、多種維生素、以及鈣、磷、鐵、硒等具有特殊生理作用的礦物質(zhì)，還含有活性肽等生理活性物質(zhì)。
[0003]近年來，從水產(chǎn)蛋白中提取抗氧化活性肽的研究也逐漸展開，如已從鱗魚、鯖魚、巨魷魚皮、白蝦頭和黃鰭金槍魚骨架蛋白中提取出具有顯著抗氧化活性的肽段，這充分證明水產(chǎn)品中的優(yōu)質(zhì)蛋白具有制備抗氧化肽的潛力。
[0004]天然抗氧化肽是繼化學(xué)性抗氧化物質(zhì)如BHA、BHT、PG等和天然抗氧化活性物質(zhì)如茶多酚、VC、類胡蘿卜素等之后的一種新型外源性抗氧化劑，其對清除人體內(nèi)自由基、抑制人體衰老具有良好的效果，而且安全無毒。抗氧化肽不僅分子質(zhì)量小、容易被人體吸收，而且還有易溶解、低黏度、不易形成凝膠等良好的功能特性，故抗氧化肽正作為一種新興抗氧化劑而逐漸受到人們推崇。
[0005]目前，河蜆資源的利用僅局限在鮮食，制成蜆干、咸蜆和罐頭等粗加工方面，附加值低。
[0006]中國申請CN 102160594A公開了一種河蜆蛋白粉及其制作方法，所述方法包括以下步驟:河蜆肉清潔；絞碎成河蜆肉糜；內(nèi)源酶和外源酶協(xié)同水解；滅酶；添加綠茶粉和活性炭脫色除臭；膜過濾；減壓濃縮；離心噴霧干燥。該方法所得的河蜆蛋白粉，適當(dāng)利用河蜆內(nèi)源酶分解河蜆軟體組織蛋白，結(jié)合加入外源生物酶，降低蛋白粉的苦味，提高水解度，減少了外源酶的消耗，所制備的河蜆蛋白粉，容易消化，無腥臭苦味。但上述技術(shù)方案存在酶解不充分，所得河蜆抗氧化肽的活性不高的缺陷。
[0007]因此，依然有待提出改進(jìn)河蜆抗氧化肽的制備方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的第一目的在于提供一種河蜆抗氧化肽的制備方法，通過利用復(fù)合酶微波協(xié)同可控酶解技術(shù)對河蜆肉進(jìn)行深度開發(fā)，制備出新型且具有抗氧化功效的河蜆抗氧化肽，不僅可提高河蜆資源的利用率，為河蜆的深度加工提供一條新的途徑，提升河蜆附加值，促進(jìn)農(nóng)民增收，同時(shí)在促進(jìn)河蜆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展方面將取得更好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種河蜆抗氧化肽的制備方法，其特征在于:包括如下步驟:
(1)微波協(xié)同復(fù)合酶協(xié)同酶解河蜆肉，得酶解物；
(2)超濾去除酶解物中大分子蛋白；
(3)將濾過液依次通過葡萄糖凝膠G-50和G-25進(jìn)行分離純化，冷凍干燥，即得。
[0010]其中，步驟(1)具體為:取新鮮河蜆肉或速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按l:2-l:6(w/w)的料液比加水，進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至6~8，添加河蜆肉質(zhì)量的0.7%~1.5%復(fù)合蛋白酶，在微波功率70(T900W，55~60°C條件下酶解2(T35min，酶解完成后滅酶，離心，取上清液，得酶解物。
[0011 ] 優(yōu)選步驟(1)具體為:取新鮮河蜆肉，或速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按1:4 (w/w)的料液比加水，采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2，添加河蜆肉質(zhì)量的1.0%~1.2%復(fù)合蛋白酶，在微波功率800W，55~60°C條件下酶解25~30min，酶解完成后100°C下滅酶15~20min，冷卻到室溫，4000r/min離心2(T25min，取上清液，得酶解物。
[0012]其中，所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比2~3:1，優(yōu)選2:1得到的混合物。所述的中性蛋白酶可采用現(xiàn)有技術(shù)公開的多種中性蛋白酶，包括但并不局限于中性蛋白酶(N0V0分裝，CAS:9068-59-1 ACT:200000u/g EXP: 11/2014上海奧宇生物科技有限公司)。風(fēng)味蛋白酶同樣可采用現(xiàn)有技術(shù)公開的多種，包括但并不局限于、風(fēng)味蛋白酶(N0V0分裝，ACT:15000u/g EXP:08/2014上海奧宇生物科技有限公司)，中性蛋白酶屬于一種內(nèi)切酶，具有一定的切割位點(diǎn)；針對一些應(yīng)用的實(shí)際性會(huì)復(fù)配出復(fù)合蛋白酶等，切割位點(diǎn)更廣譜，達(dá)到完全分解的更理想效果，而風(fēng)味蛋白酶，在更精細(xì)定位切割位點(diǎn)的情況下，分解出一些具風(fēng)味的氨基酸或肽。中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比疒3:1進(jìn)行酶解，是經(jīng)過不同酶種類篩選試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用該比例范圍內(nèi)這兩種酶對河蜆進(jìn)行酶解得到的產(chǎn)物其總抗氧化能力較強(qiáng)，再將這兩種酶按不同比例復(fù)配進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比2:1進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物的總抗氧化能力最強(qiáng)。
[0013]此外，本發(fā)明步驟(1)優(yōu)選采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿。
[0014]本發(fā)明所述的制備方法，步驟(2)采用超濾膜切割分子量為3KD的杯式過濾器過濾。
[0015]步驟(3)具體為:
將步驟(2)得到的濾過液通過裝有葡聚糖凝膠G-50的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.5"lmL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,分別測定每管的A280nm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A280nm值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有5個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到5個(gè)不同的組分，將總抗氧化能力最強(qiáng)的組分繼續(xù)通過裝有葡聚糖凝膠G-25的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.5^1mL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集，每5min收集一管,每管3mL,分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tol值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有3個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到3個(gè)不同的組分。分別測定3個(gè)組分羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最強(qiáng)的洗脫液組分冷凍干燥，即為河蜆抗氧化肽。
[0016]更具體如:將步驟(2)得到的濾過液通過裝有葡聚糖凝膠G-50的玻璃層析柱，以蒸懼水為洗脫液，流速為0.5"lmL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集400管，分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tlnm值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有5個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到5個(gè)不同的組分，分別命名為CF5,將總抗氧化能力最強(qiáng)的CF2繼續(xù)通過裝有葡聚糖凝膠G-25的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.5~lmL/min，通過自動(dòng)部分收集器分管收集，每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分別測定每管的A28tol值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tlnm值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有3個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到3個(gè)不同的組分。分別測定3個(gè)組分羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最強(qiáng)的洗脫液組分冷凍干燥，即為河蜆抗氧化肽。
[0017]其中，所述的玻璃層析柱為02.0\100011，洗脫液的體積為48￥。
[0018]其中，步驟(3)所述的冷凍干燥為:在真空度為5~10Pa，溫度為-51~_53°C的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥l(Tl2h。
[0019]本發(fā)明的第二目的在于保護(hù)上述方法制備得到的河蜆抗氧化肽。
[0020]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
(I)本發(fā)明的河蜆抗氧化肽CF2a抗氧化活性高，lmg/mL的反應(yīng)體系羥基自由基清除率達(dá)91.67%，DPPH自由基清除率達(dá)67.15%。
[0021](2)本發(fā)明制備的河蜆抗氧化肽CF2a，具有分子量小，通過葡聚糖凝膠G-75測定其分子量為1810Da，可被人體直接吸收的特點(diǎn)，因此可以廣泛應(yīng)用于食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域。
[0022](3)河蜆采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿，樣品破碎全過程都在4°C~6°C低溫水浴中進(jìn)行，保持原有物質(zhì)活性和性能；且壓力高達(dá)200MPa，使河蜆肉超微細(xì)化，有利于酶解時(shí)酶與底物的接觸，促進(jìn)酶解順利進(jìn)行。
[0023](4)本發(fā)明所提供的河蜆抗氧化肽的制備方法采用復(fù)合酶微波協(xié)同酶解，微波可以加強(qiáng)復(fù)合蛋白酶酶解蛋白的能力，促進(jìn)酶解順利進(jìn)行，保證具有抗氧化活性的肽最大程度釋放出來。酶解條件簡單可控，反應(yīng)條件溫和，大大縮短酶解時(shí)間，且抗氧化肽得率高；所得酶解液經(jīng)過簡單直觀的超濾杯過濾除去大分子蛋白，操作更便利。采用葡聚糖凝膠G-50和G-25對多肽進(jìn)行純化，得到的抗氧化肽羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率分別是酶解液粗肽的3.41倍和2.65倍。
[0024](5)本發(fā)明制備的抗氧化肽以河蜆為原料，價(jià)格低廉，得到的抗氧化肽能替代市售的人工合成抗氧化劑，以此降低生產(chǎn)成本和節(jié)約社會(huì)資源，增加河蜆的附加值，為河蜆的深加工利用開辟了新途徑。

【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
1、速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至6.8，添加河蜆肉質(zhì)量的1.0%復(fù)合蛋白酶(中性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，55°C條件下酶解30min，酶解完成，100°C下滅酶15 min，冷卻到室溫，4000r/min離心20min,取出上清液。
[0026]2、步驟I得到的上清液經(jīng)超濾膜切割分子量為3KD的杯式過濾器過濾，取濾過液。
[0027]3、將步驟2得到的濾過液通過裝有葡聚糖凝膠G-50的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.5mL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tol值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有5個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到5個(gè)不同的組分，分別命名為CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，將總抗氧化能力最強(qiáng)的CF2繼續(xù)通過裝有葡聚糖凝膠G-25的玻璃層析柱，以蒸懼水為洗脫液，流速為0.5mL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分別測定每管的A28tol值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tol值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有3個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到3個(gè)不同的組分分別命名為CF2a、CF2b、CF2c。分別測定3個(gè)組分羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，組分CF2a、CF2b、CF2c清除羥自由基能力分別為91.67%,63.33%、16.80%,清除DPPH自由基的能力分別為67.15%,36.35%、15.61%。
[0028]4、收集清除自由基能力最強(qiáng)的洗脫液組分CF2a在真空度為5 Pa，溫度為_53°C的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥12h得到粉末，即為河蜆抗氧化肽CF2a。
[0029]本實(shí)施例制備的河蜆抗氧化肽CF2a，具有分子量小，通過葡聚糖凝膠G_75測定其分子量為1810Da。此外，該河蜆抗氧化肽CF2a抗氧化活性高，lmg/mL的反應(yīng)體系羥基自由基清除率達(dá)91.67%，超過lmg/mL BHT的羥自由基清除能力(84%)。在亞油酸脂質(zhì)過氧化體系中的抗氧化能力為65%，高于同樣條件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0030]實(shí)施例2
1、速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至7.0，添加河蜆肉質(zhì)量的1.1%復(fù)合蛋白酶(中性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，58 V條件下酶解28min，酶解完成，100°C下滅酶18min，冷卻到室溫，4000r/min離心22min,取出上清液。
[0031]2、步驟I得到的上清液經(jīng)超濾膜切割分子量為3KD的杯式過濾器過濾，取濾過液。
[0032]3、將步驟2得到的濾過液通過裝有葡聚糖凝膠G-50的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.8mL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tol值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有5個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到5個(gè)不同的組分，分別命名為CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，將總抗氧化能力最強(qiáng)的CF2繼續(xù)通過裝有葡聚糖凝膠G-25的玻璃層析柱，以蒸懼水為洗脫液，流速為0.8mL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分別測定每管的A28tol值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tol值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有3個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到3個(gè)不同的組分；分別命名為CF2a、CF2b、CF2c。分別測定3個(gè)組分羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，組分CF2a、CF2b、CF2c清除羥自由基能力分別為87.56%,58.45%、17.82%，清除DPPH自由基的能力分別為64.78%,32.75%、16.71%。
[0033]4、收集清除自由基能力最強(qiáng)的洗脫液組分CF2a在真空度為8Pa，溫度為_52°C的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥Ilh得到粉末，即為河蜆抗氧化肽CF2a。
[0034]實(shí)施例3
1、速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按l:4(w/w)的料液比加水，采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)PH至7.2，添加河蜆肉質(zhì)量的1.2%復(fù)合蛋白酶(中性蛋白酶:風(fēng)味蛋白酶=2:1)，在微波功率800W，60°C條件下酶解25min，酶解完成，100°C下滅酶20min，冷卻到室溫，4000r/min離心25min,取出上清液。
[0035]2、步驟I得到的上清液經(jīng)超濾膜切割分子量為3KD的杯式過濾器過濾，取濾過液。
[0036]3、將步驟2得到的濾過液通過裝有葡聚糖凝膠G-50的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為lmL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,共收集400管，分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tlnm值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有5個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到5個(gè)不同的組分，分別命名為CF1、CF2、CF3、CF4和CF5，將總抗氧化能力最強(qiáng)的CF2繼續(xù)通過裝有葡聚糖凝膠G-25的玻璃層析柱，以蒸懼水為洗脫液，流速為lmL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管，每管3mL，共收集300管，分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tlnm值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有3個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到3個(gè)不同的組分；分別命名為CF2a、CF2b、CF2c。分別測定3個(gè)組分羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，組分CF2a、CF2b、CF2c清除羥自由基能力分別為88.79%,60.63%、18.94%，清除DPPH自由基的能力分別為66.54%,34.78%、17.81%。
[0037]4、收集清除自由基能力最強(qiáng)的洗脫液組分CF2a在真空度為10Pa，溫度為_51°C的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥1h得到粉末，即為河蜆抗氧化肽CF2a。
[0038]實(shí)施例4
與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本實(shí)施例中，取新鮮河蜆肉或速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按重量比1:2的料液比加水，進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至6，添加河蜆肉質(zhì)量的0.7%復(fù)合蛋白酶，在微波功率700W，55 V條件下酶解20min。其中，復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比3:1得到的混合物。
[0039]本實(shí)施例所制備得到的河蜆抗氧化肽具有分子量小，容易被機(jī)體吸收；抗氧化活性高，lmg/mL的反應(yīng)體系羥基自由基清除率達(dá)87.55%,超過lmg/mL BHT的羥自由基清除能力(84%)。在亞油酸脂質(zhì)過氧化體系中的抗氧化能力為63.61%，高于同樣條件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0040]實(shí)施例5
與實(shí)施例1相比，區(qū)別點(diǎn)僅在于，本實(shí)施例中，取新鮮河蜆肉或速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按重量比1:6的料液比加水，進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至8，添加河蜆肉質(zhì)量的1.5%復(fù)合蛋白酶，在微波功率900W，60°C條件下酶解35min，復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比2.5:1得到的混合物。
[0041]本實(shí)施例所制備得到的河蜆抗氧化肽具有分子量小，容易被機(jī)體吸收；抗氧化活性高，lmg/mL的反應(yīng)體系羥基自由基清除率達(dá)89.79%,超過lmg/mL BHT的羥自由基清除能力(84%)。在亞油酸脂質(zhì)過氧化體系中的抗氧化能力為64.76%，高于同樣條件下BHT的抗氧化性(60%)。
[0042]對比例I
CN 102160594A公開的實(shí)施例1，其所制備得到的河蜆蛋白粉是一種含有多肽的混合物，純度低；分子量大，不易被機(jī)體吸收；且活性低，其羥基自由基清除率和DPPH自由基清除率分別為46.64%和32.46%ο
[0043] 上述實(shí)施例中的實(shí)施方案可以進(jìn)一步組合或者替換，且實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的構(gòu)思和范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)思想的前提下，本領(lǐng)域中專業(yè)技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變化和改進(jìn)，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種河蜆抗氧化肽的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)微波協(xié)同復(fù)合酶協(xié)同酶解河蜆肉，得酶解物； (2)超濾去除酶解物中大分子蛋白； (3)將濾過液依次通過葡萄糖凝膠G-50和G-25進(jìn)行分離純化，冷凍干燥，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)具體為:取新鮮河蜆肉或速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按重量比1:2-1:6的料液比加水，進(jìn)行勻衆(zhòng)，調(diào)節(jié)pH至6~8，添加河蜆肉質(zhì)量的0.7%~1.5%復(fù)合蛋白酶，在微波功率70(T900W，55~60°C條件下酶解2(T35min，酶解完成后滅酶，離心，取上清液，得酶解物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:步驟(1)具體為:取新鮮河蜆肉，或速凍河蜆肉經(jīng)流水解凍浙干后，按重量比1:4的料液比加水，采用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀進(jìn)行勻漿，調(diào)節(jié)pH至6.8~7.2，添加河蜆肉質(zhì)量的1.0%~1.2%復(fù)合蛋白酶，在微波功率800W，55~60°C條件下酶解25~30min，酶解完成后100°C下滅酶15~20min，冷卻到室溫，4000r/min離心2(T25min，取上清液，得酶解物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于:所述的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按質(zhì)量比2~3:1得到的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于:步驟(2)采用超濾膜切割分子量為3KD的杯式過濾器過濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 -5任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)具體為: 將步驟(2)得到的濾過液通過裝有葡聚糖凝膠G-50的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.5~lmL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集,每5min收集一管,每管3mL,分別測定每管的A280nm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A280nm值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有5個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到5個(gè)不同的組分，將總抗氧化能力最強(qiáng)的組分繼續(xù)通過裝有葡聚糖凝膠G-25的玻璃層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速為0.5^1mL/min,通過自動(dòng)部分收集器分管收集，每5min收集一管,每管3mL,分別測定每管的A28tlnm值，以管數(shù)為橫坐標(biāo)，每管的A28tol值為縱坐標(biāo)作圖，得到含有3個(gè)峰值的洗脫曲線，合并同一分離峰的洗脫液，得到3個(gè)不同的組分；分別測定3個(gè)組分羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力，收集清除自由基能力最強(qiáng)的洗脫液組分冷凍干燥，即為河蜆抗氧化肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于:所述的玻璃層析柱為Φ2.0X 100cm，洗脫液的體積為4BV。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的冷凍干燥為:在真空度為5~10Pa，溫度為-51~_53°C的條件下進(jìn)行真空冷凍干燥l(Tl2h。
9.權(quán)利要求1-8任一方法所制備的的河蜆抗氧化肽。
【文檔編號(hào)】C07K1/16GK104131060SQ201410383112
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】劉晶晶, 韓曜平, 王雪鋒, 戴陽軍, 金林烽 申請人:常熟理工學(xué)院