一種以Pro-BDNF的形式制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種以Pro-BDNF的形式制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法。人工合成pro-hBDNF序列后克隆入載體得到含有pro-hBDNF的重組載體；再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到工程菌；包涵體表達；包涵體的復性：包涵體裂解、洗滌、溶解、復性；的分離純化；質(zhì)量比pro-rhBDNF：胰蛋白酶=250:1的胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前導肽獲得rhBDNF成熟肽；rhBDNF成熟肽的純化；最后獲得純度超過95%的重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。利用胰蛋白酶酶切pro-rhBDNF，在該比例下可以完全消化pro-rhBDNF的導肽，而不會消化rhBDNF成熟肽。同時該方法制備簡單易行，便于實施。
【專利說明】-種以Pro-BDNF的形式制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種以Pro-BDNF的形式制備人腦源性神經(jīng) 營養(yǎng)因子的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是 1982 年 Barde等首先在豬腦中發(fā)現(xiàn)的一種具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的蛋白質(zhì)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其 受體在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達。一種小分子二聚體蛋白質(zhì)BDNF結(jié)構(gòu)、分布及信號轉(zhuǎn)導BDNF分 子單體是由119個氨基酸殘基組成的分泌型成熟多肽，蛋白等電點為9. 99,主要由β折疊 和無規(guī)則卷曲二級結(jié)構(gòu)組成，含有3個二硫鍵，為一種堿性蛋白質(zhì)。BDNF分布在中樞神經(jīng)系 統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、骨和軟骨組織等廣泛區(qū)域內(nèi)，但主要是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi) 表達，其中海馬和皮質(zhì)的含量最高。BDNF不僅有可以和Trk家族這樣有著強親和力的受體 (TrkA、TrkB、TrkC)結(jié)合還可以和分子量為75 kD的腫瘤壞死因子家族中的成員一神經(jīng)營 養(yǎng)素受體（P75 neurotrophin receptor)作用，發(fā)揮相應的生物學效應。目前腦源性神經(jīng) 營養(yǎng)因子對運動神經(jīng)元病，周圍神經(jīng)病，基底神經(jīng)節(jié)病，缺血性腦損傷，癲癇等疾病均有治 療效果。
[0003] 基于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在臨床上的廣闊應用前景，而現(xiàn)今的BDNF產(chǎn)品存在潛 在的瑕疵：第一，BDNF由豬腦組織中提取的蛋白質(zhì)，具有潛在的免疫原性。第二，隨著需求 的擴大，需要大量的合格的豬腦組織，成為大規(guī)模生產(chǎn)的瓶頸。因此，對重組人腦源性神經(jīng) 營養(yǎng)因子的開發(fā)迫在眉睫。近年來，已成功在不同表達系統(tǒng)中重組表達β-hBDNF的報道， 包括原核表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲細胞表達系統(tǒng)、哺乳動物細胞等表達系統(tǒng)，但仍未 有研究成果應用于產(chǎn)業(yè)化。究其原因，其中大部分表達策略是直接將編碼119aa的成熟肽 基因直接進行重組表達，而沒有考慮到成熟肽形成過程中，N端上游的導肽在成熟肽的表達 過程中具有促進其正確折疊的作用，從而影響其產(chǎn)業(yè)化的進程。
[0004] 通常所說的β-hBDNF是119個氨基酸成熟肽。在人體內(nèi)，從編碼基因到成熟 肽經(jīng)歷下列過程：① prepro-hBDNF編碼序列（744bp )翻譯成prepro-hBDNF (247aa )， prepro-hBDNF包括信號膚（prepeptide, aa: 1-18)、導膚（propeptide, aa: 19-131)、 成熟肽（口6口1:丨(16，33:132-247);@口代口1'〇-11130即在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上被信號肽酶水解形 成pro-hBDNF，pro-hBDNF包括導肽和成熟肽。導肽末端帶有4個氨基酸殘基（aa: 128-131) Arg-Val-Arg-Arg，該4個氨基酸序列為哺乳動物前體蛋白加工酶（proprotein convatases)的識別位點，導肽可被高爾基體中的前體蛋白加工酶-弗林蛋白酶（furin)識 別并切除，形成hBDNF (119aa)。
[0005] 因此，本領(lǐng)域中迫切需要開發(fā)利用剔除信號肽后的pro-hBDNF (導肽+成熟肽）進 行原核表達制備重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種剔除信號肽后的pro-hBDNF (導肽+成熟肽）進行原 核表達制備重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在 于，包括如下步驟， 表達載體及工程菌的構(gòu)建：人工合成pro-hBDNF序列，將其序列克隆入載體得到含有 pro-hBDNF的重組載體；再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到工程菌； pro-rhBDNF的包涵體表達； pro-rhBDNF包涵體的復性：pr〇-rhBDNF包涵體裂解、洗漆、溶解、復性； pro-rhBDNF的分離純化； rhBDNF成熟肽的分離純化：胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前導肽獲得rhBDNF成熟 肽；rhBDNF成熟肽的純化。
[0008] 所述表達載體及工程菌的構(gòu)建為，人工合成SEQ ID NO: 1序列，并且在序列上下 游分別引入g酶切位點和Mil酶切位點；利用限制性內(nèi)切酶Λ^Ι和&ΜΠ 對含目的 片段的質(zhì)粒和pETlla空載體分別進行雙酶切；然后將酶切產(chǎn)物分別用乙醇沉淀純化；用Τ4 DNA Ligase將純化后的酶切產(chǎn)物和原核表達載體進行連接反應；將構(gòu)建好的融合表達載 體pETlla-pro-hBDNF轉(zhuǎn)化到萬.coB T0P10中，經(jīng)菌液PCR鑒定和測序鑒定后，鑒定正確的 pET-lla-pro-hBDNF 的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 Rosetta (DE3)或 Rosetta (DE3)pLysS 表達菌株中即得到工程菌。
[0009] 所述pro-rhBDNF的包涵體表達為，按1:50的比例將工程菌轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB 培養(yǎng)基中，37° C，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)至0D6Q(i~1.0-1.2,加入IPTG至終濃度為ImM， 37° C，250rpm條件下誘導表達4h，8000 rpm，4。C離心20 min收集菌體。
[0010] 所述pro-rhBDNF包涵體的復性為，按5 ml buffer/g菌體的比例添加 Lysis buffer,重懸菌體；添加10 μ g/mL DNase, 3 mM MgCl2;在冰水浴中進行超聲波破碎菌體， 超聲波處理1 s，停止2 s，共處理10 min;加入1/2體積的Triton buffer,室溫振蕩 30 min ;12000 rpm 4° C離心10 min,去上清；用Lysis buffer重懸沉淀，添加1/2體 積 Triton buffer，室溫振蕩 30 min; 12000 rpm 4。C 離心 10 min，去上清；用 IB wash buffer重懸沉淀，12000 rpm 4° C離心10 min,去上清；重復洗漆包涵體3-4次；再按5 mL/g包涵體的比例添加溶解buffer (6M鹽酸胍，100 mM DTT)，室溫溶解包涵體，待沉淀全 部溶后，12000 rpm, 4° C離心10 min,取上清；使用6 Μ鹽酸胍溶液透析包涵體溶液，可室 溫透析3 h后更換透析緩沖液，于4 ° C透析過夜；再緩慢添加至復性液中，逐滴添加，每 30 min添加500 μ L ;使鹽酸胍終濃度降至200 mM，于4 ° C中過夜；所述Lysis buffer 為0· 1M Tris-HCl，lmM EDTA，pH 7.0 ;Triton buffer為6% Triton X-100，L5M NaCl，60mM EDTA;IB wash buffer 為 0.1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0;溶解 buffer 為 6M 鹽酸胍，100 mM DTT;復性液為0. 1M Tris-HCl，1M L-精氨酸，5mM EDTA，0. 61g/L氧化型谷光氨肽， 1. 53 g/L還原型谷光氨肽。
[0011] 所述pro-rhBDNF的分離純化為采用陽離子交換層析和疏水作用層析。
[0012] 所述rhBDNF成熟肽的分離純化中，胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前導肽獲得 rhBDNF 成熟肽為按 250 mg hpro-BDNF 添加 1 mg Trypsin 的比例，添加 Trypsin 后，4 ° C 處理14-16 h，50 rpm緩慢攪拌。
[0013] 所述rhBDNF成熟肽的分離純化中，rhBDNF成熟肽的純化為使用AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)來進行rhBDNF成熟肽進行再次純化，色譜柱為SP Sepharose Fast Flow 5 mL 本發(fā)明的目的在于提供一種重組制備pro-hBDNF的編碼基因，其中含有信號肽、導肽 和hBDNF成熟肽序列。其序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 含有信號肽、導肽和hBDNF成熟肽序列，其序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0015] SEQ ID NO: 1 1 ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCC 61 ATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCAT 121 GGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCT 181 GACACTTTCGAACACATGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAAT 241 GAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTG 301 CCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGACGCTGCA 361 AACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTG 421 TGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCG 481 GGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATAC 541 TTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGAC 601 AAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATG 661 GATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACA 721 TTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG 〇
[0016] 本發(fā)明的目的之二在于提供了一種利用原核大腸桿菌表達系統(tǒng)制備重組人腦源 性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法。
[0017] 本發(fā)明的目的之三在于提供了一種純化rhBDNF的策略，其策略包括第一步陽離 子層析純化pro-rhBDNF、第二步疏水層析純化pro-rhBDNF、第三步陽離子純化hBDNF。
[0018] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種利用廉價的胰蛋白酶按照一定的酶底物比例 (1:250)酶切 pro-rhBDNF 制備 rhBDNF 的方法。
[0019] 本發(fā)明所述的制備包括基因修飾、三次純化包括兩次離子交換層析和一次疏水層 析、活性檢測。
[0020] 本發(fā)明利用大腸桿菌密碼子偏好性修飾后的pro-rhBDNF(包括導肽）的編碼基 因，連接pETlla載體，在大腸桿菌表達菌株Rosetta (DE3)中進行包涵體形式表達。通過 多次的洗滌，初步獲得pro-rhBDNF。在導肽的作用下，體外對rhBDNF成熟肽進行復性。利 用陽離子交換層析對復性獲得的pro-rhBDNF進行第一次純化。接著再利用疏水層析對 pro-rhBDNF進行第二次純化，進一步提高濃度。按照一定的比例(質(zhì)量比pro-rhBDNF :胰蛋 白酶=250:1)，利用胰蛋白酶酶切pro-rhBDNF在該比例下可以完全消化pro-rhBDNF的導 肽，而不會消化rhBDNF成熟肽。最后再通過陽離子層析純化獲得純度超過95%的重組人腦 源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。該方法制備簡單易行，便于實施。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是SDS-PAGE檢測不同IPTG濃度下誘導重組pro-rhBDNF在大腸桿菌Rossta 上清及包涵體的表達情況圖。
[0022] 圖2是AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)陽離子交換純化pro-rhBDNF圖（第一步純 化)。
[0023] 圖3是AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)疏水層析純化pro-rhBDNF圖（第二步純化)。 使用的色譜柱為 HiTrapCapto Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub)。
[0024] 圖4是AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)陽離子交換以及疏水層析偶聯(lián)純化后收集的 pro-rhBDNF 樣品的 SDP-PAGE 電泳圖。
[0025] 圖5是AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)陽離子交換層析純化rhBDNF成熟肽圖（第三 次純化)。
[0026] 圖6是SDS-PAGE檢測獲得的rhBDNF成熟肽。
[0027] 圖7是PC12神經(jīng)瘤細胞突觸檢測法檢測rhBDNF的生物活性圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明 書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0029] 實施例1 :pETlla-pr〇-rhBDNF表達載體及工程菌的構(gòu)建和包涵體表達 1.表達載體及工程菌的構(gòu)建 化學合成SEQ ID N0:1序列（合成廠家：invitrogen),并且在序列上下游分別引入 Mel酶切位點和Mil酶切位點，并將其克隆入T載體中。合成的序列表達的氨基酸 序列如SEQ ID N0:2所示；利用限制性內(nèi)切酶和對含化學合成的目的基因 的Τ載體和pETlla空載體分別進行雙酶切；然后將酶切產(chǎn)物分別用乙醇沉淀純化；用 T4 DNA Ligase將純化后的酶切產(chǎn)物和原核表達載體進行連接反應；將構(gòu)建好的融合表達 載體（pETlla-pro-hBDNF)轉(zhuǎn)化到萬.coh· T0P10中，經(jīng)菌液PCR鑒定和測序鑒定(測序廠 家：invitrogen)后，鑒定正確的pETlla-pro-hBDNF的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)(或Rosetta (DE3)pLysS)表達菌株中，工程菌保存于-80° C。
[0030] SEQ ID NO:2 ： 1 MTILFLTMVI SYFGCMKAAP MKEANIRGQG GLAYPGVRTH GTLESVNGPK AGSRGLTSLA 61 DTFEHMIEEL LDEDQKVRPN EENNKDADLY TSRVMLSSQV PLEPPLLFLL EEYKNYLDAA 121 NMSMRVRRHS DPARRGELSV CDSISEWVTA ADKKTAVDMS GGTVTVLEKV PVSKGQLKQY 181 FYETKCNPMG YTKEGCRGID KRHWNSQCRT TQSYVRALTM DSKKRIGWRF IRIDTSCVCT 241 LTIKRGR。
[0031] 2. pro-rhBDNF的包涵體表達 (1) 用滅菌接菌環(huán)刮取-80° C凍存的甘油菌，劃線于瓊脂板上，在37° C恒溫箱中倒 置培養(yǎng)過夜，活化菌株； (2) 挑取單菌落接種于100mL液體LB培養(yǎng)基(含50yg/mL Amp)中，37° C，180rpm條 件下振蕩培養(yǎng)約10-12h ; (3) 按1:50的比例轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37° C，250rpm條件下振蕩培養(yǎng)至 OD601. 0-1. 2 (約 3hr); (4) 立即加入IPTG至終濃度分別為為0、0. 05、0. 1、0. 5、lmM，37° C，250rpm條件下誘 導表達4h，8000 rpm，4 ° C離心20 min收集菌體，菌體可保存于-80 ° C冰箱中。
[0032] 實施例2 :pr〇-rhBDNF包涵體的復性 1. pro-rhBDNF包涵體裂解 (1) 按 5 ml buffer/g 菌體的比例添加 Lysis buffer (0· 1M Tris-HCl，lmM EDTA，pH 7.0)，重懸菌體； (2) 添加 10 μ g/mL DNase，3 mM MgCl2 ; (3) 在冰水浴中進行超聲波破碎菌體，超聲波處理1 s，停止2 s，共處理10 min。裂解 的沉淀中可見pro-rhBDNF，結(jié)果見圖1，其中泳道1-5為菌體超聲破碎后的上清，IPTG誘導 濃度分別為0、0.05、0. 1、0. 5、1 mmol/L;泳道6-10為菌體超聲破碎后的沉淀，IPTG誘導濃 度分別為〇、〇. 05、0. 1、0. 5、1 mmol/L ;pr〇-hBDNF大小約為27 KDa，對比上清和沉淀的條帶 可知，在各濃度的IPTG的誘導下，均能以包涵體的形式表達pro-hBDNF，如圖中箭頭所示， 大小也與預期吻合。
[0033] 2. pro-rhBDNF 包涵體洗漆 (1) 往超聲裂解后的菌體中加入1/2體積的Triton buffer (6% Triton X-100，L5M NaCl，60mM EDTA)，室溫振蕩 30 min ; (2) 12000 rpm 4° C 離心 10 min，去上清； (3) 用 Lysis buffer (0· 1M Tris-HCl，lmM EDTA，pH 7.0)重懸沉淀（可使用超聲波破 碎儀進行），添加 1/2 體積 Triton buffer (6% Triton X-100，L5M NaCl，60mM EDTA)，室 溫振蕩30 min ; (4) 12000 rpm 4° C 離心 10 min，去上清； (5) 用 IB wash buffer(0. 1M Tris-HCl，20mM EDTA，pH7.0)重懸沉淀，12000 rpm 4。C 離心10 min,去上清； (6) 重復洗滌包涵體3-4次，包涵體可保存于-80 ° C中。
[0034] 3. pro-rhBDNF 包涵體溶解 (1) 按5 mL/g包涵體的比例添加溶解buffer (6M鹽酸胍，100 mM DTT)，室溫溶解包 涵體，可使用超聲波破碎儀輔助溶解； (2) 待沉淀全部溶(渾濁狀)，12000 rpm，4° C離心10 min，取上清(會有白色沉淀）； (3) 使用6 Μ鹽酸胍溶液透析包涵體溶液，可室溫透析3 h后更換透析緩沖液，于4 ° C 透析過夜。
[0035] 4. pro-rhBDNF 包涵體復性 (1) 準備可使蛋白樣品中鹽酸胍終濃度降至200 mM體積的Refording buffer (0.1M Tris-HCl，1ML-精氨酸，5mMEDTA，0.61g/L氧化型谷光氨肽，1.53g/L還原型谷光 氨肽）； (2) 緩慢添加包涵體溶液至復性液中，逐滴添加，每30 min添加500 μ L ; (3) 將添加包涵體溶液的復性液置于4 ° C過夜。
[0036] 實施例3 :pr〇-rhBDNF的分離純化 1.陽離子交換層析初步純化pro-rhBDNF (1) 使用buffer A (50 mM PBS，pH=7)透析上述復性液，更換buffer 3-4次； (2) 使用AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)來進行hpro-BDNF的初步純化，色譜柱為SP Sepharose Fast Flow 5 mL ； (3) 儀器操作完全按照protocol進行，A1泵為buffer A (50 mM PBS，pH=7)，Bl泵為 buffer B (50 mM PBS, 1 M NaCl，pH=7);更換之前，先用純水洗泵（每次換buffer均要進 行此操作)，換上buffer A、B后，A1、B1分別進行洗泵，管路走100%A1相； (4) 基線沖平后，buffer A至少平衡5個柱體積后開始上樣，流速設置：上樣為10 mL/ min,上完樣后，buffer A沖洗至無紫外吸收； (5) 設置梯度洗脫，0-100% buffer B，梯度長度為20個柱體積，收集相應吸收峰下的餾 分。洗脫緩沖液流速設置為5 mL/min。
[0037] 該步驟純化色譜圖見圖2,使用的填料為SP Sepharose Fast Flow,橫縱坐標分別 是mAU、ml。SDS-PAGE檢測圖見圖4。其中泳道1為純化前樣品，泳道2為陽離子交換層析 純化樣品。
[0038] 2.疏水作用層析二次純化pro-rhBDNF (1) 使用AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)進行疏水層析純化，色譜柱為：HiTrapCapto Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub) 5 mL ； (2) A1 泵為 buffer AMS(50 mM PBS，1M 硫酸銨，pH=7)，Bl 泵為 buffer A(50 mM PBS, pH=7);更換之前，先用純水洗泵(每次換buffer均要進行此操作)，換上buffer AMS、buffer A (50 mM PBS，pH=7)后，A1、B1分別進行洗泵，管路走100% A1相； (3) 添加硫酸銨至步驟1分離收集得到的蛋白樣品中，使其終濃度為1 Μ?；€沖平 后，buffer AMS至少平衡5個柱體積后開始上樣，流速設置：上樣為10 mL/min,上完樣后， buffer AMS沖洗至無紫外吸收； (4) 設置梯度洗脫，0-100%，梯度長度為6個柱體積。收集相應吸收峰下的餾分。
[0039] 該步驟純化色譜圖見圖3,使用的色譜柱為HiTrapCapto Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (High Sub)，SDS-PAGE檢測圖見圖4。其中泳道1為純化前樣品，泳道2為陽離 子交換層析純化樣品；泳道3為經(jīng)疏水層析后獲得純度較高的pro-rhBDNF。對比泳道2、3 可知，經(jīng)過疏水層析純化后，pro-rhBDNF的濃度得到提升，其他雜帶可在后續(xù)的酶切步驟中 去除。
[0040] 實施例4 :rhBDNF成熟肽的分離純化及生物學活性檢測 1.胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前導肽獲得rhBDNF成熟肽 (1) 使用buffer A (50 mM PBS, pH=7)透析疏水層析分離得到的蛋白樣品，或使用3 KD的超濾濃縮管置換樣品緩沖液為buffer A，使樣品濃度約為0.5 mg/mL。使用紫外吸收 法測定蛋白濃度，計算公式為1. 45*A280 - 0. 74*A260 ; (2) 按 250 mg hpro-BDNF 添加 1 mg Trypsin 的比例，添加 Trypsin，4。C 處理 14-16 h，可緩慢攪拌（50 rpm)。Trypsin可切割去除Mature-BDNF上游的導肽。
[0041] 2. rhBDNF成熟肽的純化 (1)使用AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)來進行rhBDNF成熟肽進行再次純化，色譜柱為 SP Sepharose Fast Flow 5 mL ； (2) 儀器操作完全按照protocol進行，A1泵為buffer A (50 mM PBS，pH=7)，B1泵為 buffer B (50 mM PBS, 1 M NaCl，pH=7);更換之前，先用純水洗泵（每次換buffer均要進 行此操作)，換上buffer A、B后，Al、B1分別進行洗泵，管路走100%A1相； (3) 基線沖平后，buffer A至少平衡5個柱體積后開始上樣，流速設置：上樣為10 mL/ min,上完樣后，buffer A沖洗至無紫外吸收； (4) 設置梯度洗脫，0-100% buffer B，梯度長度為20個柱體積，收集相應吸收峰下的 餾分。洗脫緩沖液流速設置為5 mL/min。收集相應吸收峰下的餾分； (5) 使用buffer A透析分離得到的蛋白樣品，或使用3 KD的超濾濃縮管置換樣品 buffer為buffer A，紫外吸收法測定濃度，冷凍離心濃縮并保存于-20 ° C。
[0042] 該步驟純化色譜圖見圖5,使用的填料為SP S印harose Fast Flow。SDS-PAGE檢 測圖見圖6，從圖中可知，經(jīng)過三步純化獲得的rhBDNF純度可達95%。
[0043] 3. rhBDNF成熟肽生物學活性檢測 正常細胞培養(yǎng)條件下（RPMI1640含10%馬血清）以25 ng/ml神經(jīng)生長因子處理PC12 神經(jīng)瘤細胞使其具備對神經(jīng)營養(yǎng)因子家族致敏活性；通過胰酶消化PC12細胞并接種至12 孔板中按實驗組所示濃度添加標準濃度神經(jīng)生長因子以及純化的重組人腦源性神經(jīng)營養(yǎng) 因子（rhBDNF)，經(jīng)37°C培養(yǎng)48h培養(yǎng)后在倒置顯微解剖鏡觀察PC12神經(jīng)瘤細胞的突觸生 長情況。檢測結(jié)果見圖7,其中1組為陰性對照(第二天及第五天）；2組為125AU恩經(jīng)復標 準品處理后第二天及第五天結(jié)果，3組為40 ug/ml rhBDNF處理后第二天及第五天結(jié)果。結(jié) 果表明利用本方案表達、純化獲得的rhBDNF成熟肽與恩經(jīng)復具有相當?shù)纳锘钚浴?br> [0044] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例 性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨 的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1. 一種制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，包括如下步驟， 表達載體及工程菌的構(gòu)建：人工合成pro-hBDNF序列，將其序列克隆入載體得到含有 pro-hBDNF的重組載體；再將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，得到工程菌； pro-rhBDNF的包涵體表達； pro-rhBDNF包涵體的復性：pro_rhBDNF包涵體裂解、洗漆、溶解、復性； pro-rhBDNF的分離純化； rhBDNF成熟肽的分離純化：胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前導肽獲得rhBDNF成熟 肽；rhBDNF成熟肽的純化。
2. 權(quán)利要求1所述制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，所述表達載體及 工程菌的構(gòu)建為，人工合成SEQ ID NO: 1序列，并且在序列上下游分別引入g酶切位點 和Mil酶切位點；利用限制性內(nèi)切酶和feMlI對含目的片段的質(zhì)粒和pETlla空載 體分別進行雙酶切；然后將酶切產(chǎn)物分別用乙醇沉淀純化；用!\ DNA Ligase將純化后的酶 切產(chǎn)物和原核表達載體進行連接反應；將構(gòu)建好的融合表達載體pETlla-pro-hBDNF轉(zhuǎn)化 到萬.coB T0P10中，經(jīng)菌液PCR鑒定和測序鑒定后，鑒定正確的pET-lla-pro-hBDNF的重 組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta (DE3)或Rosetta (DE3)pLysS表達菌株中即得到工程菌。
3. 權(quán)利要求1所述制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF 的包涵體表達為，按1:50的比例將工程菌轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37° C，250rpm 條件下振蕩培養(yǎng)至00_~1.0-1.2，加入1?了6至終濃度為1禮，37°(：，250印111條件下誘導 表達4h，8000 rpm，4 ° C離心20 min收集菌體。
4. 權(quán)利要求1所述制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF 包涵體的復性為，按5 ml buffer/g菌體的比例添加 Lysis buffer,重懸菌體；添加10 μ g/ mL DNase，3 mM MgCl2;在冰水浴中進行超聲波破碎菌體，超聲波處理1 s，停止2 s，共處理 10 min;加入 1/2 體積的 Triton buffer，室溫振蕩 30 min ;12000 rpm 4。C 離心 10 min, 去上清；用Lysis buffer重懸沉淀，添加1/2體積Triton buffer,室溫振蕩30 min ;12000 rpm 4。C 離心 10 min，去上清；用 IB wash buffer 重懸沉淀，12000 rpm 4。C 離心 10 min，去上清；重復洗滌包涵體3-4次；再按5 mL/g包涵體的比例添加溶解buffer (6M鹽 酸胍，100 mM DTT)，室溫溶解包涵體，待沉淀全部溶后，12000 rpm，4° C離心10 min，取上 清；使用6 Μ鹽酸胍溶液透析包涵體溶液，可室溫透析3 h后更換透析緩沖液，于4 ° C透 析過夜；再緩慢添加至復性液中，逐滴添加，每30 min添加500 μ L ;使鹽酸胍終濃度降至 200 mM，于 4 ° C 中過夜；所述 Lysis buffer 為 0· 1Μ Tris-HCl，lmM EDTA，pH 7.0 ;Triton buffer 為 6% Triton X-100，L5M NaCl，60mM EDTA;IB wash buffer 為 0.1M Tris-HCl， 20mM EDTA，pH7. 0 ;溶解 buffer 為 6M 鹽酸胍，100 mM DTT ;復性液為 0· 1M Tris-HCl, 1M L_精氨酸，5mM EDTA，0.61g/L氧化型谷光氨肽，1.53 g/L還原型谷光氨肽。
5. 權(quán)利要求1所述制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，所述pro-rhBDNF 的分離純化為采用陽離子交換層析和疏水作用層析。
6. 權(quán)利要求1所述制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，所述rhBDNF成 熟肽的分離純化中，胰蛋白酶酶切去除pro-rhBDNF前導肽獲得rhBDNF成熟肽為按250 mg hpro-BDNF添加 1 mg Trypsin 的比例，添加 Trypsin后，4。C 處理 14-16 h，50 rpm緩慢 攪拌。
7.權(quán)利要求1所述制備人腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的方法，其特征在于，所述rhBDNF成熟 肽的分離純化中，rhBDNF成熟肽的純化為使用AKTA Purifer 100層析系統(tǒng)來進行rhBDNF 成熟肽進行再次純化，色譜柱為SP Sepharose Fast Flow 5 mL。
【文檔編號】C07K1/18GK104195160SQ201410387234
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】張文宇, 阮卡, 章永壘, 陳星 , 黃奮飛, 白羊, 陳勝亮 申請人:廈門北大之路生物工程有限公司