一種促性腺激素純化的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種純化尿促性腺激素的方法，包括以下四個步驟：(1)將去除好熱原的尿促性腺激素供試品用pH7.0溶劑攪拌溶解；(2)用截留分子量5萬的Millipore超濾膜進(jìn)行超濾，截留產(chǎn)品中大分子，超濾過程中，不停補(bǔ)加pH7.0溶劑，直至超出液OD＜0.2為止；(3)超出液加入5倍量的藥用乙醇沉淀、離心取固體；(4)真空干燥、粉碎、過篩既得尿促性腺激素原料藥。本發(fā)明所述的純化尿促性腺激素的方法，有效的去除了個別引發(fā)疼痛或者紅疹等等不良反應(yīng)的成分，制備出一種更加安全和適合臨床使用的尿促性腺激素。
【專利說明】一種促性腺激素純化的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種促性腺激素的純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 促性腺激素（gonadotropin，gonadotropic hormone)是指能夠促進(jìn)雌雄兩種性 腺的發(fā)育，增加性激素分泌的一類激素，如腦垂體前葉分泌的黃體生成激素（LH)和卵泡刺 激素（FSH)，人胎盤絨毛膜分泌的絨毛膜促性腺激素（HCG)。其中，F(xiàn)SH和LH的主要作用是 促進(jìn)卵巢或睪丸生成和分泌留體性激素，它們與HCG合用，可治療性腺激素分泌不足所致 的原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)，無排卵性稀發(fā)月經(jīng)所致的不孕癥等。絕經(jīng)期婦女由于雌性激素和 孕激素缺乏，從而反饋調(diào)節(jié)垂體，分泌大量FSH和LH，由尿中排出。因此，目前以FSH和LH 為主要成分的促性腺激素生產(chǎn)方法多以絕經(jīng)期婦女的尿液作為原料，經(jīng)過高嶺土吸附、酒 精抽提得到> 3iu/mg的尿促性腺激素粗品，再從促性腺激素粗品開始生產(chǎn)，通過硅酸鋁層 析、陰離子交換樹脂層析、除熱原等工序而得尿促性腺激素原料。
[0003] 在本發(fā)明中，"尿促性腺激素粗品"是指以絕經(jīng)期婦女的尿液作為原料，經(jīng)過高嶺 土吸附、酒精抽提得到效價為大于3iu/mg的尿促性腺激素，作為進(jìn)一步純化的起始物。
[0004] 在本發(fā)明中，"尿促性腺激素原料"是"尿促性腺激素粗品"經(jīng)過進(jìn)一步的純化工 藝，得到的效價高于180iu/mg的尿促性腺激素。
[0005] 根據(jù)臨床使用反饋得到的資料，個別批次的尿促性腺激素原料制成注射用制劑 后，在肌肉注射時容易造成某些過敏體質(zhì)群體的疼痛或者紅瘆等不良反應(yīng)，嚴(yán)重的不良反 應(yīng)可能會危及患者的生命；而其他批次的尿促性腺激素原料制成注射用制劑后并沒有如此 的不良反應(yīng)。在排除了尿促性腺激素注射制劑使用中，因個體差異造成不同的后果外，人們 發(fā)現(xiàn)這些不良反應(yīng)的發(fā)生與尿促性腺激素注射制劑所使用不同批次尿促性腺激素原料藥 相關(guān)。
[0006] 我們對于不同批次尿促性腺激素原料藥留樣按照國家和企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了詳 細(xì)的檢測，在目前的注射用尿促性腺激素國家藥典標(biāo)準(zhǔn)中，只有"酸堿度、效價、無菌、異常 毒性與熱源、細(xì)菌內(nèi)毒素、干燥失重"及注射劑常規(guī)檢查的指標(biāo)，并沒有發(fā)現(xiàn)按照現(xiàn)行質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)的尿促性腺激素原料藥存在有差別，現(xiàn)有檢驗(yàn)項(xiàng)目無法檢驗(yàn)出造成不良反應(yīng)的原 因。
[0007] 因此，我們發(fā)現(xiàn)按照國家和企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢測標(biāo)準(zhǔn)，在排除個體差異的影響后， 發(fā)生不良反應(yīng)與沒有不良反應(yīng)的尿促性腺激素原料藥沒有差異。
[0008] 尿促性腺激素是從人尿中提取而得，存在較多的異源化學(xué)成分，如尿蛋白等。并且 現(xiàn)在除了對尿促性腺激素粗品的效價有一定的行業(yè)規(guī)定外（要求高于3iu/mg)，對于其中 其他的成分并沒有嚴(yán)格的規(guī)定，導(dǎo)致工廠生產(chǎn)所使用的尿促性腺激素粗品的具體成分千差 萬別，企業(yè)得到的尿促性腺激素粗品按照統(tǒng)一的純化工藝處理得到的尿促性腺激素原料批 與批之間成分也存在著細(xì)微的差異。但是這些差異在現(xiàn)行的國家和企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)并沒有被 體現(xiàn)出來。經(jīng)過大量的資料和文獻(xiàn)檢索，也并沒有發(fā)現(xiàn)對此相應(yīng)的報道。
[0009] 我們猜測，這些沒有被體現(xiàn)出來的尿促性腺激素原料批與批之間成分細(xì)微的差 異，導(dǎo)致了個別尿促性腺激素注射制劑部分會發(fā)生疼痛或者紅瘆等等不良反應(yīng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 針對以上問題，本發(fā)明的目的就是尋找造成個別不良反映的原因。
[0011] 更進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種純化尿促性腺激素的方法。本發(fā)明所述的純化尿促 性腺激素的方法，有效的去除了個別引發(fā)疼痛或者紅瘆等等不良反應(yīng)的成分，制備出一種 更加安全和適合臨床使用的尿促性腺激素。
[0012] 依據(jù)常規(guī)的科研思路，去除活性成分以外的異源化學(xué)成分，是避免注射時不良反 應(yīng)的一般手段。但是尿促性腺激素原料批與批之間存在細(xì)微的差異，而且尿促性腺激素的 活性成分本身就包括了 FSH和LH兩種大分子化學(xué)物質(zhì)，在不知到引發(fā)不良反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì) 信息情況下，確定其成分進(jìn)而采取合適的純化工藝需要耗費(fèi)大量人力和時間。
[0013] 根據(jù)現(xiàn)有的公開資料，我們發(fā)現(xiàn)在造成過敏等不良反應(yīng)的原因中，住往是因?yàn)榇?在大分子物質(zhì)。因此我們嘗試對尿促性腺激素原料進(jìn)行大分子物質(zhì)的對照分析，希望能夠 尋找出造成個別不良反映的原因。
[0014] 電泳圖譜的分析（尋找出造成個別不良反映的原因）
[0015] 照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（中國藥典2010年版二部附錄V F)
[0016] 實(shí)驗(yàn)1 :尿促性腺激素供試品與純LH和FSH的電泳圖比較
[0017] 1號樣品為Mark;
[0018] 2號樣品為尿促性腺激素供試品，來自上海麗珠制藥有限公司，選擇臨床用有不良 反應(yīng)的批號，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為10 μ 1 ;
[0019] 3號樣品為純LH樣品，來自雅培制藥有限公司，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為 10μ1 ;
[0020] 4號樣品為純FSH樣品，來自上海麗珠制藥有限公司制備，樣品溶液濃度為lmg/ ml，上樣量為10 μ 1 ;
[0021] 電泳結(jié)果見圖1。
[0022] 從電泳圖譜中可以看出，F(xiàn)SH純品的分子量分布范圍為21KD?28KD，LH純品的分 子量為23KD和31KD ;HMG的分子量分布范圍為18KD?35KD，但是在尿促性腺激素的原料 圖譜中，可以看到在55KD的位置有蛋白條帶。
[0023] 實(shí)驗(yàn)2 :不良反應(yīng)的尿促性腺激素供試品與未出現(xiàn)不良反應(yīng)的尿促性腺激素供試 品的電泳圖比較
[0024] 1 號樣為 Mark ;
[0025] 2號樣為尿促性腺激素供試品1，來自上海麗珠制藥有限公司，選擇臨床用有不良 反應(yīng)的批號，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為10 μ 1 ;
[0026] 3號樣為尿促性腺激素供試品2,來自上海麗珠制藥有限公司，選擇臨床用有不良 反應(yīng)的批號，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為10 μ 1 ;
[0027] 4號樣為尿促性腺激素供試品3,來自上海麗珠制藥有限公司，選擇臨床用未有不 良反應(yīng)的批號，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為10 μ 1 ;
[0028] 5號樣為尿促性腺激素供試品4,來自上海麗珠制藥有限公司，選擇臨床用有不良 反應(yīng)的批號，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為10 μ I ;
[0029] 6號樣為尿促性腺激素供試品5,來自上海麗珠制藥有限公司，選擇臨床用未有不 良反應(yīng)的批號，樣品溶液濃度為lmg/ml，上樣量為10 μ 1 ;
[0030] 電泳結(jié)果見圖2。
[0031] 從電泳圖譜中可以看出，尿促性腺激素供試品1、2、4的圖譜以及尿促性腺激素供 試品3、5的18-35KD位置條帶出現(xiàn)位置類似；但是在55KD位置時，尿促性腺激素供試品1、 2、4出現(xiàn)蛋白條帶，而尿促性腺激素供試品3、5的未出現(xiàn)該蛋白條帶。
[0032] HPLC圖譜分析（尋找出造成個別不良反映的原因）
[0033] 利用高純尿促卵泡素的有關(guān)物質(zhì)檢查方法："儀器及工作條件：采用凝膠色譜柱 Superdex 75 ;以磷酸鹽緩沖液（取 85%H3P046.74ml，加水 800ml，再加 Na2S0414.2g，用 50% NaOH調(diào)pH至6. 7,用水定容為1000ml);柱溫30°C;流速0. 5ml/min ;檢測波長214nm ; 進(jìn)樣量100 μ 1。
[0034] 測定法：本品適量，加水制成每Iml中約含100單位的溶液作為供試品溶液。照高 效液相色譜法（中國藥典2010版二部附錄V D)試驗(yàn)，檢測圖譜。"
[0035] 根據(jù)圖3和圖4的圖譜來看，發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)的尿促性腺激素在保留時間小于20分 鐘出現(xiàn)吸收峰。
[0036] 根據(jù)兩種分析方法來看，造成臨床不良反應(yīng)的原因應(yīng)該是大分子造成的，分子量 在55KD左右。
[0037] 根據(jù)上述的分析結(jié)果，我們將解決個別尿促性腺激素過敏不良反應(yīng)的方法定位為 去除尿促性腺激素原料中分子量為55KD左右大分子。
[0038] 基于促性腺激素是一種高分子的蛋白生物制品，去除尿促性腺激素原料中分子量 為55KD左右大分子，我們考慮使用分子篩層析技術(shù)。在實(shí)驗(yàn)室研發(fā)階段，我們對于分子篩 層析技術(shù)要素進(jìn)行了探索，但是在層析過程中很難進(jìn)行中間控制，促性腺激素本身的混合 物特性，以及在不同批次促性腺激素的具體成分種類及其含量存在差異，導(dǎo)致使用這一技 術(shù)，重復(fù)性較差，無法滿足產(chǎn)品批次間穩(wěn)定性的要求。同時由于實(shí)驗(yàn)條件篩選涉及的要素過 多，容易造成高分子去除不徹底，或者產(chǎn)品回收率低的問題。分子篩層析不能有效解決所述 的問題。
[0039] 經(jīng)過反復(fù)篩選和嘗試，我們意外發(fā)現(xiàn)一種有效去除尿促性腺激素原料中分子量為 55KD左右大分子的方法。
[0040] 本發(fā)明目的在于一種純化尿促性腺激素的方法，具體為采用超濾法去除尿促性腺 激素原料中分子量為55KD左右大分子的方法，該方法步驟包括：
[0041] (1)將去除好熱原的尿促性腺激素供試品用pH7. 0溶劑攪拌溶解；
[0042] (2)用截留分子量5萬的Millipore超濾膜進(jìn)行超濾，截留產(chǎn)品中大分子，超濾過 程中，不停補(bǔ)加pH7. 0溶劑，直至超出液OD < 0. 2為止；
[0043] (3)超出液加入5倍量的藥用乙醇沉淀、離心取固體；
[0044] (4)真空干燥、粉碎、過篩既得尿促性腺激素原料藥。
[0045] 步驟⑴和⑵中，所述pH7. 0溶劑選自pH7. 0的醋酸鈉緩沖液、pH7. 0的磷酸氫 二鈉緩沖液、純化水。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046] 圖1為尿促性腺激素與FSH、LH的電泳圖；
[0047] 圖2為尿促性腺激素供試品的電泳圖；
[0048] 圖3為未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)的HMG樣品HPLC圖譜；
[0049] 圖4為發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)的HMG樣品HPLC圖譜；
[0050] 圖5為5萬分子量超濾膜超濾后的圖譜；
[0051] 圖6為10萬分子量超濾膜超濾后的圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 去除好熱原的尿促性腺激素按照中國專利201010132785. X所述的技術(shù)方案進(jìn)行 操作。
[0053] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0054] 實(shí)施例1不同型號的超濾膜對不良反應(yīng)的影響
[0055] 試驗(yàn)1 (5萬分子量超濾膜超濾）
[0056] (1)將去除好熱原的尿促性腺激素供試品a，選擇臨床用有不良反應(yīng)的批號，用 pH7. 0的醋酸鈉緩沖液攪拌溶解；
[0057] (2)用截留分子量5萬的Millipore超濾膜進(jìn)行超濾，截留產(chǎn)品中大分子，超濾過 程中，不停補(bǔ)加pH7. 0的醋酸鈉緩沖液，直至超出液OD < 0. 2為止；
[0058] (3)超出液加入5倍量的藥用乙醇沉淀、離心取固體；
[0059] (4)真空干燥、粉碎、過篩既得尿促性腺激素原料藥d。
[0060] 試驗(yàn)2 (10萬分子量超濾膜超濾）
[0061] (1)將去除好熱原的尿促性腺激素供試品b，選擇臨床用有不良反應(yīng)的批號，用 pH7. 0的醋酸鈉緩沖液攪拌溶解；
[0062] (2)用截留分子量10萬的Millipore超濾膜進(jìn)行超濾，截留產(chǎn)品中大分子，超濾過 程中，不停補(bǔ)加pH7. 0的醋酸鈉緩沖液，直至超出液OD < 0. 2為止；
[0063] (3)超出液加入5倍量的藥用乙醇沉淀、離心取固體；
[0064] (4)真空干燥、粉碎、過篩既得尿促性腺激素原料藥e。
[0065] 試驗(yàn)3 (4萬分子量超濾膜超濾）
[0066] (1)將去除好熱原的尿促性腺激素供試品c，選擇臨床用有不良反應(yīng)的批號，用 pH7. 0的醋酸鈉緩沖液攪拌溶解；
[0067] (2)用截留分子量4萬的Millipore超濾膜進(jìn)行超濾，截留產(chǎn)品中大分子，超濾過 程中，不停補(bǔ)加pH7. 0的醋酸鈉緩沖液，直至超出液OD < 0. 2為止；
[0068] (3)超出液加入5倍量的藥用乙醇沉淀、離心取固體；
[0069] (4)真空干燥、粉碎、過篩既得尿促性腺激素原料藥f。
[0070] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0071] 不同型號的超濾膜對不良反應(yīng)的影響如下表所述：
[0072] 表格1 :不同型號超濾膜對不良反應(yīng)的作用
[0073]

【權(quán)利要求】
1. 一種純化尿促性腺激素的方法，該方法包括以下步驟： (1) 將去除好熱原的尿促性腺激素供試品用PH7. 0溶劑攪拌溶解； (2) 用截留分子量5萬的Mi 11 ipore超濾膜進(jìn)行超濾，截留產(chǎn)品中大分子，超濾過程中， 不停補(bǔ)加 PH7. 0溶劑，直至超出液0D < 0. 2為止； (3) 超出液加入5倍量的藥用乙醇沉淀、離心取固體； (4) 真空干燥、粉碎、過篩既得尿促性腺激素原料藥； 其特征在于，所述方法可以去除尿促性腺激素原料中分子量為55KD左右大分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種純化尿促性腺激素的方法，其特征在于步驟⑴和步驟 (2)中，所述pH7. 0溶劑選自pH7. 0的醋酸鈉緩沖液、pH7. 0的磷酸氫二鈉緩沖液、純化水。
【文檔編號】C07K14/59GK104479005SQ201410460423
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】萬龍巖, 陳嵐, 王林鵬, 陳輝, 丁公才 申請人:上海麗珠制藥有限公司