一種精氨酸雙糖苷檢測方法及其醫(yī)用用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種精氨酸雙糖苷（AFG）半合成方法及一種新的檢測方法。AFG具有提高機體免疫力的作用,AFG能夠使由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù)恢復(fù)正常，提高淋巴細胞自然轉(zhuǎn)化、T細胞轉(zhuǎn)化和B細胞轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率，并且可以改善小鼠的體內(nèi)白細胞介素和腫瘤壞死因子水平，具有預(yù)防和改善免疫低下的潛質(zhì),AFG可應(yīng)用于癌癥患者恢復(fù)和提高機體免疫力。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（HPLC-ELSD）定量檢測AFG,建立了一種快速、簡潔、準(zhǔn)確的檢測精氨酸雙糖苷的方法。
【專利說明】-種精氨酸雙糖音檢測方法及其醫(yī)用用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種精氨酸雙糖巧(AFG)半合成及一種新檢測方法，及其在增強免疫 方面的應(yīng)用，屬化學(xué)分析及新藥開發(fā)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 紅參系五加科人參屬植物人參(化化?^:滬?nsi/w C. A. Meyer)根的加工品，屬于傳 統(tǒng)中藥材，其含有多種生理活性成分，如皂巧，多糖，氨基酸及氨基酸衍生物等，其中皂巧類 成分研究報道較多W，而鮮有對非皂巧類成分尤其是氨基酸衍生物的研究報道。
[0003] 精氨酸雙糖巧（Argin^-化uctos^-glucose，AFG)是一種精氨酸衍生物，由鄭毅 男等首次從紅參中分離得到，是鮮人參加工成紅參的蒸制和干燥過程中精氨酸與麥芽糖發(fā) 生美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖10.所示W(wǎng)。據(jù)報道，精氨酸雙糖巧在紅參中含 量非常豐富W，通常采用水提法提取紅參中的AFGW。鄭毅男等模擬紅參加工過程中精氨酸 與麥芽糖發(fā)生美拉德反應(yīng)的條件，W冰醋酸為反應(yīng)介質(zhì)，按照一定比例使精氨酸和麥芽糖 發(fā)生美拉德反應(yīng)，再用娃膠濕柱及生物膠柱進行分離純化本發(fā)明對該種合成和提取分 離方法進行了進一步優(yōu)化。對精氨酸雙糖巧體內(nèi)代謝W及各種藥理活性的研究表明，精氨 酸雙糖巧在抗氧化、擴張血管、促進微循環(huán)、增強免疫力、抗糖尿病、增強細胞膜滲透性、抗 炎、抗衰老、刺激一氧化氮產(chǎn)生等方面有著顯著效果精氨酸雙糖巧除了可W預(yù)防、治 療疾病，還可W作為護膚品使用，該在很大范圍上進一步擴展了精氨酸雙糖巧的使用范 圍。
[0004] 據(jù)報道，紅參具有維持體內(nèi)免疫系統(tǒng)平衡的作用，并能通過調(diào)節(jié)免疫機能來抵抗 疾病侵襲w，AFG在紅參中含量豐富，因此可能在紅參的免疫增強藥理活性中發(fā)揮了重要的 作用。
[0005] 精氨酸及其衍生物的檢測多采用柱前衍生化法該種方法本身要求衍生化反應(yīng) 選擇性強、定量進行，還需要對衍生化試劑，反應(yīng)條件及產(chǎn)物的穩(wěn)定性等進行考察，不利于 直接、快速地測定氨基酸W。此外，氨基酸自動分析儀的使用也較廣泛，該種方法析時間短 檢測成本更短，工作效率更高的優(yōu)點，但是與其他液相色譜儀相比，氨基酸自動分析儀管路 更細，原理及結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，受緩沖液PH影響更大的因素，即使配制出的相同的緩沖液在不 同的儀器上，由于受到分離柱反應(yīng)柱填充的緊密程度的影響，最終得到的氨基酸圖譜也可 能有明顯的差別為了更加快捷，準(zhǔn)確的檢測精氨酸及其衍生物，近年化，Gyeong Mi 等，建立了一種新的檢測氨基酸衍生物的方法一離子色譜，該種方法不僅可W快速檢測紅 參中美拉德反應(yīng)產(chǎn)物AFG，而且可W檢測出動物血液等生物樣本中AFG含量，可用于定量分 析。本專利報告，采用HPLC-LSD檢測精氨酸及其衍生物的方法操作更加簡單，檢測時 間更短，且靈敏度較高。
[000引
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明繼續(xù)優(yōu)化了 AFG的合成、分離方法，具有合成率高，試分離純化成本低，該 化合物具有藥用價值，并且適于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008] 本發(fā)明精氨酸糖巧的制備方法，包括W下步驟： 1) 將精氨酸與麥芽糖W 1:2的重量比例置入1:15 (精氨酸：冰醋酸，m:v)倍量的冰醋 酸中，在50-10(TC條件下，反應(yīng)10-60min得總反應(yīng)物； 2) 將總合成物過陽離子樹脂柱，0. 2-2%氨水洗脫，收集各流份，薄層色譜檢查，收集Rf 值為0. 2的洗脫液部分，低壓濃縮，冷凍干燥成粉末，溶于2倍量的0. 2%醋酸水溶液中，過 聚丙帰醜胺柱W 0.2%醋酸水溶液洗脫，收集各流份，薄層色譜檢查，收集Rf值為0.2的 洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥即得。
[0009] 3)本發(fā)明還披露液相色譜-蒸發(fā)光檢測器（HPLC-ELSD)檢測AFG的方法。
[0010] 4)本發(fā)明還公開了精氨酸糖巧及其組合物在制備治療環(huán)磯醜胺導(dǎo)致的免疫低下 的藥物中的新用途。
[0011] 本發(fā)明中的藥物，其中AFG含量為92-99%，還含有氨基酸、微量元素等。本領(lǐng)域技 術(shù)人員可W理解到，該些物質(zhì)的存在會維持或者增強本發(fā)明的藥物的作用。
[0012] 實驗例1精氨酸雙糖巧AFG的合成 1儀器與試劑 抑-1D-50真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）;EYELA-D陽2110系列旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會社）；2110化action Collector (USA) ;KQ-250DB型數(shù)控 超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）；SZ-93自動雙重純水蒸觸器(上海亞榮生化儀器 廠);Sarto;rius BP211D型電子分析天平(十萬分之一乂德國賽多利斯公司）;Smart-Ms 2021 磁力攬拌器（SCIF0畑）；電熱恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)。
[0013] k精氨酸（L-Arg)(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）;麥芽糖（北京奧博星生 物技術(shù)有限責(zé)任公司）；醋酸(北京化工廠，分析純）；己膳(美國Fisher公司，色譜純）；陽離 子樹脂、薄層層析娃膠H (青島海陽化工廠）；聚丙帰醜胺凝膠；實驗用水為二次蒸觸水。
[0014] 2.方法 2. 1精氨酸雙糖巧（AFG)的合成：按質(zhì)量比為1:2精確稱取精氨酸和麥芽糖，加冰醋 酸適量，分別溶解后，80° C磁力攬拌合成30min。反應(yīng)結(jié)束后，39° C水浴鍋上揮去冰醋 酸，既得AFG粗品。
[0015] 2. 2精氨酸雙糖巧（AFG)的分離及純化：將得到的AFG粗品加水稀釋后上陽離子 樹脂柱，用2%氨水洗脫后薄層跟蹤AFG，展開系統(tǒng)為；正下醇-冰醋酸-水（2:1:1);顯色劑 為；0. 2%巧H麗己醇溶液，8(TC烤板顯色，收集Rf值為0. 2的洗脫液。用低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 將收集到的洗脫液濃縮，經(jīng)真空冷凍干燥機凍干后，取凍干粉末W 0. 2%醋酸水配制成濃度 〇.5g/ml的溶液，過聚丙帰醜胺凝膠（Bio-gel P- II)柱純化后凍干即可。
[001引 實驗例2 HPLC-ELSD法測定紅參中精氨酸雙糖巧含量 1儀器與試劑 創(chuàng)新通恒高效液相色譜儀，Alltech 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，N2000色譜工作站。 [0017] 精氨酸對照品（美國Sigma公司），純度大于99. 0%。H氣己酸(Aladdin試劑有限 公司，GC)，走氣了酸（Aladdin試劑有限公司，GC)，己膳為色譜純(美國Fisher公司），水 為二次蒸觸水。
[001引 2方法 2. 1色譜條件 色譜柱；Prevail?Ci8(4. 6mmX250mm, 5 y m);流動相 A :己膳，流動相 B 點 Ommol ? L-1 走氣下酸的0. 7% H氣己酸溶液，流動相A與B比例；Omin為0:100, 5min為0:100, 8min 為15:85,25min為35:65;漂移管溫度；115°C ;氣體流量；3.化-min-i;柱溫35°C ;進樣 量：20 y L。
[0019] 2. 2標(biāo)準(zhǔn)品及供試品溶液的制備 精密稱取精氨酸及精氨酸雙糖巧(AFG)適量，分別置容量瓶中，用H重水定溶至刻度， 配置成Img/mL溶液，W 0. 45 y m微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，置4°C冰箱保存，備用。
[0020] 3方法學(xué)考察 3. 1線性關(guān)系和檢出限 稱取適量AFG，置容量瓶中，用H重水定容至刻度，制成Img/mL AFG溶液，并用此溶液 作為母液，分別稀釋出濃度為0. 8, 0. 6, 0. 4, 0. 2, 0. 002mg/mL的AFG水溶液，過0. 45 y m微 孔濾膜，備用。在上述色譜條件下分析，色譜圖如圖2所示，W各種氨基酸峰面積的對數(shù)值 Y為縱坐標(biāo)，氨基酸質(zhì)量濃度（g /L)的對數(shù)值X為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得到的線性 回歸方程 y = 0. 4996X + 12. 721(R2 = 0. 999)。
[0021] 當(dāng)信噪比為3時，測得AFG的最低檢測限約為0. 002 mg /血。
[0022] 3. 2方法的精密度和重復(fù)性考察 取Img/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液20 uL連續(xù)進樣5次，各組分色譜峰的保留時間波動小于 0. Imin,峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差化SD)為0. 471〇/〇。
[0023] 取同一批樣品按供試品溶液制備方法平行制備5份，分別進樣20 uL同時取不 同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液各20 UL進樣測定，按外標(biāo)兩點法分別取對數(shù)值，計算其含量 的 RSD，結(jié)果為 0. 439〇/〇。
[0024] 3. 3供試品溶液的穩(wěn)定性和加樣回收率考察 取同一供試品溶液，分別在保存0, 2, 4, 6, 8, 10 h后W新配制的標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液為對 照，按外標(biāo)兩點法分別取對數(shù)值計算，其RSD為0.491%,說明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定 性良好。
[00巧]精密稱取AFG樣品粗粉約25 mg置于錐形瓶中，加入一定量的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混 合溶液后，按供試品溶液制備方法制備后測定，其RSD為0. 441%，。
[002引 3. 4樣品分析 合成粗品用蒸觸水稀釋125倍，過0. 45 y m微孔濾膜，備用，進樣量為20 y L。
[0027] 4 討論 目前，氨基酸衍生物的測定方法有很多種，其中精氨酸雙糖巧(AFG)可W用氨基酸自動 分析儀柱前衍生法，離子交換色譜法及電噴霧電離質(zhì)譜法bu進行檢測，但未 見采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD)檢測AFG。
[0028] 本研究對精氨酸及人工合成精氨酸衍生物進行分析。研究中采用高效液相色 譜-蒸發(fā)光散射檢測器法對精氨酸及精氨酸雙糖巧進行定性和定量測定，樣品無需衍生 化可直接進樣分析，不需要繁瑣的前處理，減小了測定誤差，操作簡便，結(jié)果可靠。
[002引 試驗例3 AFG環(huán)磯醜胺（CT幻致免疫抑制小鼠免疫功能的影響 1材料與方法 1.1儀器、材料與試劑 離也機（Eppendo計，型號5430 R),酶標(biāo)儀（BIO-RAD, iMark),超凈工作臺（博訊，型號 操作皿-1360)，顯微鏡（蔡康型號XDS-200)，培養(yǎng)箱（美國化ermo公司，型號3100)。 刀豆蛋白A(ConA, Sigma,批號C-2010);脂多糖（LPS，Sigma,批號L2880);二苯基四 氮哇漠鹽（MTT，Sigma,批號0733);二甲基亞諷（DMS0,北京化工廠，批號20120210);小牛 血清(杭州四季青生物工程材料有限公司，140207) ;RPMI1640培養(yǎng)基（GIBC0, 795681);白 細胞介素2試劑盒（IL-2試劑盒，美國R&D，DZE20054);腫瘤壞死因子試劑盒（TNF-a試劑 盒，美國 R&D，DZE30223)。
[0030] 精氨酸雙糖AFG,由本實驗室自制，純度〉95%(HPLC) ;BALB/C小鼠（20±2g，吉林 大學(xué)實驗動物中也提供，SCXK(吉））；SPF級ICR小鼠（1擴22g，吉林省億斯實驗動物中也 提供，SCXK (吉）-2011-0004)，雌性。
[0031] 1.2實驗方法 1. 2. 1動物分組和給藥 80只ICR小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機分成8組，正常對照組，免疫抑制對照組，A1:免 疫抑制AFG高劑量組（50mg ? kg-i AFG)，A2 ;免疫抑制AFG中劑量組（30mg ? kg-i AFG)，A3 : 免疫抑制 AFG 低劑量組（lOmg ? kg-i AFG)，B1:AFG 高劑量組（50mg ? kg-i AFG)，B2 ;AFG 中 劑量組（30mg ? kg-i AFG), B3 ;AFG 低劑量組（lOmg ? kg-i AFG)。AFG 用生理鹽水溶解，W 10 血*kg-i的體積灌胃給藥，1次/d，連續(xù)30 d。模型組及A1，A2，A3組于第1、2、3、9、16和 23天腹腔注射環(huán)磯醜胺（CTX) 80 mg . kg-i。
[0032] 1. 2. 2小鼠免疫器官臟器指數(shù)測定 給藥30天后，小鼠眼球采血，分離血清，分裝后置-2(TC冰箱保存，待用。將小鼠頸 椎脫白處死，取其胸腺和脾臟用生理鹽水漂洗，濾紙吸干水分，稱量，計算脾臟指數(shù)和胸 腺指數(shù)。
[0033] 臟器指數(shù)佩=臟器重量（g) /體重（g) X 100 1.2.3體外淋己細胞增殖實驗 BALB/C小鼠，脫白處死，置體積分數(shù)為75%的酒精浸泡5 min,在無菌條件下取出 脾臟，去除被膜，用Hanks'液洗兩次，剪碎，把組織碎塊放入培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)研磨， 制成脾細胞息液，用200目網(wǎng)過濾脾細胞，然后進行細胞計數(shù)，配成2X 106細胞息液待 用。實驗分為空白組，陰性對照組，陽性對照組和樣品組（AFG6個濃度，分別為1、2、4、6、8、 10 y g ?血-1)。將調(diào)整好的細胞息液加入96孔細胞培養(yǎng)板中，每組3個復(fù)孔，空白組加入 100 uL培養(yǎng)基，其他各組每孔加100 uL細胞息液，置培養(yǎng)箱中比后取出?？瞻捉M和陰性 對照組各加入100 y L培養(yǎng)基，陽性對照組加入50 y g ? m。Con A 10 y L置37°C，5%C02 賠箱中培養(yǎng)4她，取出，每孔加入5mg*mL-i MTT溶液20uL繼續(xù)培養(yǎng)化后，取出培養(yǎng)板， 2000rmp.mirTi，離也lOmin，小也將上清液吸去，加入150UL DMS0,充分溶解結(jié)晶，用酶 標(biāo)儀比色，490nm測定各孔0D值。
[0034] 1.2. 4淋己細胞轉(zhuǎn)化實驗 小鼠分組同上，灌胃給藥，連續(xù)30天，末次給藥后Ih，將小鼠脫白處死，置體積 分數(shù)為75%的酒精浸泡5 min,在無菌條件下取出脾臟，去除被膜，用Hank s'液洗兩 次，剪碎，把組織碎塊放入培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)研磨，制成脾細胞息液，用200目網(wǎng)過濾脾 淋己細胞，然后進行細胞計數(shù)，配成2X106細胞息液待用。實驗分為空白孔，自然轉(zhuǎn)化 空，刀豆蛋白（Con A)刺激孔和脂多糖（LPS)刺激孔，每孔設(shè)3個復(fù)孔。將各組細胞分別加 入96孔板中，空白孔和自然轉(zhuǎn)化孔分別加入100 ill培養(yǎng)液，Con A刺激孔加入100 y L濃 度為 5. 0 y g ?血-1 Con A, LPS 刺激孔加入 100 y L 濃度為 y g ?血LPS.置 37°C，5%C〇2 賠箱中培養(yǎng)4她，取出，每孔加入5mg*mL-i MTT溶液20uL繼續(xù)培養(yǎng)化后，取出培養(yǎng)板， 2000rmp ? min4離也lOmin，小也將上清液吸去，加入150y LDMS0,充分溶解結(jié)晶，用酶標(biāo) 儀比色，490nm測定各孔0D值。 1. 2. 5腫瘤壞死因子TNF-a及白細胞介素IL-2的測定 取分裝好的小鼠血清，采用酶聯(lián)免疫試劑盒的測定，嚴(yán)格按照化ISA說明書操作。
[00巧]1. 2. 6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件，數(shù)據(jù)W(x±s)表示，統(tǒng)計方法應(yīng)用單因素方差分析t可X0.01， ##V<0. 01，SSS戶<0. 01表明具有極顯著性，可X0. 05, #V<〇. 05, SS戶<0. 05表明具有顯著性。
[0036] 2實驗結(jié)果 2. 1 AFG對小鼠臟器指數(shù)的影響 表1.可知與空白組相比模型組脾指數(shù)，胸腺指數(shù)均下降，且具有顯著性如<〇. 05)， 說明造模成功。但各給藥組脾指數(shù)，胸腺指數(shù)都明顯上升，與模型組相比有顯著性差異 (戶<0.05)，但與空白組相比并無顯著性差異。說明AFG對于免疫抑制小鼠的脾和胸腺具有 增重作用，可使脾和胸腺恢復(fù)正常水平，對正常小鼠無影響。
[0037] Tab. 1 Effects of AFG on thymus coefficient and spleen coefficient in mice (五 + s) 表1. AFG對免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)和脾指數(shù)的影響（7 ±s)

【權(quán)利要求】
1. 精氨酸雙糖苷(AFG)的制備方法，其具體制備方法如下： (1)精氨酸雙糖苷（AFG)的合成：按質(zhì)量比1:2精確稱取精氨酸和麥芽糖，加冰醋酸適 量，溶解后，在50-100° C條件下攪拌一種，反應(yīng)10-60min，得AFG粗品； ⑵精氨酸雙糖苷（AFG)的分離及純化：取AFG粗品上陽離子交換樹脂柱，用0. 2-2% 氨水洗脫，收集洗脫液，薄層色譜檢查(展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（2:1:1 )，以0. 2%茚三 酮乙醇溶液顯色，Rf值為0. 2)，收集Rf值為0. 2部分洗脫液，真空冷凍干燥，得粉末，溶于 水中，過聚丙烯酰胺柱，以0.2%醋酸水溶液洗脫，收集Rf值為0.2的洗脫液，減壓濃縮， 冷凍干燥即得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1，所得精氨酸雙糖苷用高效液相-蒸發(fā)光散射（HPLC-ELSD)檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1，所得精氨酸雙糖苷能使環(huán)磷酰胺所致免疫力低下的小鼠提高免疫 力，因此可用于人癌癥化療期間的輔助治療藥。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1，所得的精氨酸雙糖苷(AFG)能夠提高T淋巴細胞和B淋巴細胞的 轉(zhuǎn)化率，能顯著提高免疫抑制小鼠腫瘤壞死因子TNF- a含量，并使其保持在正常水平，可 用于抗炎及抗感染類藥物。
【文檔編號】C07H1/00GK104447892SQ201410461616
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年9月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月11日
【發(fā)明者】邵瑩, 鄭毅男, 孫榮花, 李慧萍, 丁傳波 申請人:鄭毅男