一種細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用，屬于分離領(lǐng)域和醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明提供的BMPs-糖鞘脂復(fù)合物，是先用表面活性劑去除BMPs表面蛋白，再將BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中，超聲或室溫反應(yīng)，孵育，使BMPs與糖鞘脂偶聯(lián)，即得到細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物。表面蛋白的去除有效避免引入無關(guān)蛋白，可以獲取與糖鞘脂相互作用的蛋白。本發(fā)明的復(fù)合物可以用于促進細胞對糖鞘脂的利用，同時復(fù)合物中的磁性顆粒可以起到靶向作用，引導(dǎo)復(fù)合物向病灶部位聚集，使得藥物靶向性更高。將復(fù)合物導(dǎo)入腫瘤區(qū)域后，還可引入磁性靶向熱療，進一步對病灶進行治療。
【專利說明】一種細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物及其制備方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物的制備方法，屬于分離領(lǐng)域和醫(yī) 藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖鞘脂（glycosphingolipids)是一類非常重要的糖脂（glycolipids)類分子，它 由一個神經(jīng)酰胺骨架（由鞘氨醇和脂肪鏈組成）與一個或多個糖鏈連接形成，其中鞘氨醇 的氨基被脂肪酸?；傻哪X酰胺（ceramide)構(gòu)成疏水部分，嵌入細胞膜脂雙層中，而糖 鏈與鞘氨醇的伯羥基相連形成的親水部分，伸向細胞質(zhì)膜外。糖鞘脂成簇排列于細胞膜上， 在免疫應(yīng)答、細胞發(fā)育、細胞黏附與識別、細胞增殖與分化及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有重要的作 用，是細胞表面具有生物活性的標(biāo)志；某些糖鞘脂還能參與到癌變的重要過程：上皮間質(zhì) 轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)中，并對EMT起到調(diào)節(jié)的作用，這引起了 人們對糖鞘脂靶向性免疫治療的熱情。以單唾液酸三己糖神經(jīng)節(jié)苷脂GM3和N-羥乙酰-GM 3 制成的腫瘤疫苗經(jīng)I期臨床試驗證實安全且能誘導(dǎo)出特異的抗體反應(yīng)，現(xiàn)II期臨床實驗 已開。
[0003] 然而，目前人們對糖鞘脂的認知還不完全，在探究糖鞘脂的功能及機理時，常因無 法得到與其相互作用的蛋白等，而無法確切的闡明其作用機制和結(jié)合位點。通過構(gòu)建的 BMPs-糖鞘脂復(fù)合物，可以方便的獲取與糖鞘脂相互作用的蛋白質(zhì)等，從而幫助闡明糖鞘脂 的生理機能與機制，是一種很好的研究手段及方法。此外，糖鞘脂可作為新型癌癥疫苗，所 構(gòu)建的細菌納米磁小體（BMPs)-糖鞘脂復(fù)合物具有很高的應(yīng)用價值。其表面包被的生物 膜使其在生物親和性和生物相容性方面具有其它人造納米材料不可比擬的優(yōu)越性，同時形 成了很好的緩釋體系，加之BMPs自身的靶向腫瘤熱療，使其具備靶向治療腫瘤及癌癥的潛 力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物，所述復(fù)合物是經(jīng)表面去蛋白處 理的細菌納米磁小體（BMPs)與糖鞘脂偶聯(lián)得到的復(fù)合物。
[0005] 所述細菌納米磁小體由趨磁細菌合成，磁小體表面有脂質(zhì)包被。在本發(fā)明的一 種實施方式中，是米用文獻 Xiang L, Wei J, Jianbo S et al. Purified and sterilized magnetosomes from MagnetospiriIIum gryphiswaldense MSR-I were not toxic to mouse fibroblasts in vitro [J]. Letters in Applied Microbiology, 2007, 45 (I) : 75-81 所述方法來制備磁小體。
[0006] 本發(fā)明還提供一種所述BMPs-糖鞘脂復(fù)合物的確認方法，是提取BMPs-糖鞘脂復(fù) 合物表面總脂，用顯色劑進行顯色，BMPs-糖鞘脂復(fù)合物較BMPs出現(xiàn)糖鞘脂條帶，即可認定 糖鞘脂成功偶聯(lián)于BMPs。
[0007] 本發(fā)明還提供一種制備所述細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物的方法，是先用表面 活性劑去除BMPs表面蛋白，再將BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中反應(yīng)，孵育，使BMPs與糖鞘脂偶 聯(lián)，即得到細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物。
[0008] 所述制備細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物的方法主要包括以下步驟：
[0009] (I)BMPs處理：配置一定濃度的表面活性劑溶液，加入與表面活性劑質(zhì)量比為 1:10-100:1的BMPs，使混合溶液中BMPs的終濃度在20mg/ml以下，通過表面活性劑去除 BMPs表面蛋白，收集BMPs，即得到處理好的BMPs。
[0010] (2)BMPs-糖鞘脂復(fù)合物的制備：將與糖鞘脂溶液中糖鞘脂質(zhì)量比為10:1至1:50 的處理好的BMPs重新懸浮于糖鞘脂為100 μ g/mL至20mg/mL的糖鞘脂溶液中混合反應(yīng)，孵 育2h以上，收集，即得到BMPs-糖鞘脂復(fù)合物。
[0011] 所述步驟1中，表面活性劑去除BMPs表面蛋白的處理，可以是將混合溶液在 60-100°C加熱處理5-20min或者室溫震蕩0. 5-4h。
[0012] 所述步驟2中，BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中的反應(yīng)，可以是超聲處理。
[0013] 所述BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中的反應(yīng)中，超聲處理是用50-150W的超聲處理10 至60min(有效超聲時間為50%至100%，即間歇時間與超聲時間的比值為0-0. 5)。
[0014] 所述表面活性劑是以下任意一種：十二烷基硫酸鈉（SDS)、十六烷基三甲基溴化 銨（CTAB)、3-[3-(膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS)、聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100)。
[0015] 所述制備得到的細菌納米磁小體與糖鞘脂復(fù)合物于牛血清白蛋白（BSA)中封閉、 保藏。
[0016] 所得制備得到的細菌納米磁小體與糖鞘脂復(fù)合物加入封閉液（ImM-IOOmM的PBS、 質(zhì)量分數(shù)為 1% -5%的 BSA、1% -4%的 PEG4000 和 1% -4%的 PEG6000)，4°C保存。
[0017] 所述制備細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物的方法的步驟中，步驟1、2收集得到的 處理好的BMPs或者復(fù)合物進行清洗以去除BMPs表面的的表面活性劑或者未結(jié)合的糖鞘 脂。
[0018] 所述步驟1中，表面活性劑與BMPs質(zhì)量比在一種實施方式中為10 :1至1 :10。
[0019] 所述步驟2中，BMPs與糖鞘脂質(zhì)量比在一種實施方式中為1 :1至10 :1。
[0020] 所述步驟2中，孵育在一種實施方式中中為避光孵育。
[0021] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述BMPs-糖鞘脂復(fù)合物獲取與該糖鞘脂相互作用的蛋 白的方法，是將BMPs-糖鞘脂復(fù)合物于緩沖液中超聲打散后，與蛋白反應(yīng)后目標(biāo)蛋白結(jié)合 在該BMPs-糖鞘脂復(fù)合物上，再用清洗緩沖液清洗該復(fù)合物，最后用洗脫緩沖液將目標(biāo)蛋 白洗脫下來。
[0022] 本發(fā)明還提供一種應(yīng)用所述BMPs-糖鞘脂復(fù)合物提高細胞對糖鞘脂吸收利用能 力的方法，是待細胞貼壁后，將BMPs-糖鞘脂復(fù)合物于緩沖液中超聲打散后，加入培養(yǎng)皿 中，混勻。
[0023] 本發(fā)明提供的BMPs-糖鞘脂復(fù)合物，是先用表面活性劑去除BMPs表面蛋白，再將 BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中，使BMPs與糖鞘脂偶聯(lián)，即得到細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物。 所述BMPs經(jīng)表面活性劑處理后，表面蛋白被去除、表面原脂質(zhì)層變得疏松，糖鞘脂的非極 性端段即脂端能夠插入到BMPs表面脂質(zhì)層中，并形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。表面蛋白的去除有效解決 了生物磁納米顆粒表面自身蛋白對其應(yīng)用的影響，避免引入無關(guān)蛋白，可以獲取與糖鞘脂 相互作用的蛋白。用超聲法形成的糖鞘脂質(zhì)包裹磁顆粒的形態(tài)處于亞穩(wěn)定狀態(tài)，避光孵育 可保證所形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定，磁顆粒偶聯(lián)脂質(zhì)的效率更高。本發(fā)明的復(fù)合物可以應(yīng)用 于細胞中，促進細胞對糖鞘脂的利用。同時復(fù)合物中的磁性顆?？梢云鸬桨邢蜃饔?，引導(dǎo)復(fù) 合物向病灶部位聚集，使得藥物靶向性更高。將復(fù)合物導(dǎo)入腫瘤區(qū)域后，還可引入磁性靶向 熱療，進一步對病灶進行治療。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024] 圖1 :不同方法富集A431細胞蛋白中表皮生長因子受體（EGFR)的SDS-PAGE圖；
[0025] 各泳道為：1，maker ;2, A431細胞蛋白；3,用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431細胞 蛋白后上清液；4,用BMPs-GM3富集A431細胞蛋白后上清液；5,用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集 A431細胞蛋白后洗脫液；6,用BMPs-GM3富集A431細胞蛋白后洗脫液。
[0026] 圖2 :不同方法富集A431細胞蛋白中表皮生長因子受體（EGFR)的WesternBlot 圖；
[0027] 各泳道為：1，A431細胞蛋白；2,用BMPs-GM3富集A431細胞蛋白后上清液；3,用 BMPs-GM3富集A431細胞蛋白后洗脫液；4,用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431細胞蛋白后洗 脫液。
[0028] 圖3 :不同方法處理YTS-I細胞后的激光共聚焦圖；（a)空白組（不添加 GM1及 BMPs-GM1) ; (b)添加 GM1 (100 μ g/mL) ; (c) BMPs-GM1 (10 μ g/mL)。

【具體實施方式】
[0029] 實施例I BMPs-GM3復(fù)合物的制備
[0030] BMPs 處理：秤取 Img BMPs 于 100 μ Ll % SDS 溶液中 100°C加熱 5min，以去除 BMPs 表面蛋白；磁力架收集BMPs，并用IOOmM磷酸鹽（PB, pH = 7. 5)緩沖液清洗3次。
[0031] BMPs-GM3復(fù)合物的制備：將處理后Img的BMPs重新懸浮于Iml的2mg/mL GM3 (單唾 液酸三己糖神經(jīng)節(jié)苷脂）溶液，100W超聲60min (超聲6s，間歇4s);避光孵育2h后，IOOmM 磷酸鹽（PB, pH = 7. 5)緩沖液清洗BMPs三次，即得到BMPs-GM3復(fù)合物。
[0032] 封閉及保存：將所得復(fù)合物加入封閉液（IOmM PBS含1 % BSA，并含有2% PEG4000, 2% PEG6000)，4°C 保存?zhèn)溆谩?br> [0033] 所述SDS溶液配制方法：秤取Ig SDS溶于IOOmL水中。所述緩沖液配制方法：取 170mmol Na2HPO4, 30mmol KH2PO4溶于水中。所述GM3溶液配制方法秤取2mg GM3溶于ImL 水中。
[0034] 實施例2 BMPs-GMi復(fù)合物的制備
[0035] (I)BMPs處理：秤取20mg BMPs，用lml20% SDS在室溫下震蕩2h，以去除BMPs表 面蛋白。收集BMPs，并用去離子水清洗3次，即得到處理好的BMPs。
[0036] (2) BMPs-GM1復(fù)合物的制備：將處理好的IOmg BMPs重新懸浮于Iml 20mg/mL GM1 (單唾液酸四已糖神經(jīng)節(jié)甘脂）溶液中，80W超聲lOmin，避光孵育3h后，用去離子水清 洗，即得到BMPs-GM1糖鞘脂復(fù)合物。
[0037] 實施例3 BMPs-GM3糖鞘脂復(fù)合物的制備
[0038] (1)原料 BMPs 的制備：參照文獻 Xiang L, Wei J, Jianbo S et al. Purified and sterilized magnetosomes from Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-I were not toxic to mouse fibroblasts in vitro[J].Letters in Applied Microbiology, 2007, 45 (I) : 75-81 所述方法來制備。
[0039] (2)810^處理：秤取1011^81^8，用111110.01%〇^601：處理2011^11，以去除81^8表 面蛋白。收集BMPs，并用去離子水清洗3次，即得到處理好的BMPs。
[0040] (3)BMPs-GM3復(fù)合物的制備：將IOmg處理好的BMPs重新懸浮于IOml 0· lmg/mL GM3溶液中，150W超聲15min (超聲5s，間隔5s)，靜置反應(yīng)a后，用去離子水清洗，即得到 BMPs-GM3糖鞘脂復(fù)合物。
[0041] 實施例4 BMPs-GM1糖鞘脂復(fù)合物的制備
[0042] (I)BMPs 處理：秤取 IOmg BMPs，用 ImlO. 01% CHAPS 80°C處理 12min，以去除 BMPs 表面蛋白。收集BMPs，并用去離子水清洗3次，即得到處理好的BMPs。
[0043] OBMPs-GM1復(fù)合物的制備：將Img BMPs重新懸浮于2. 5ml 20mg/mL GM1溶液中， 50W超聲60min (超聲8s，間隔2s)，靜置反應(yīng)12h以上，用去離子水清洗，即得到BMPs-GMi 糖鞘脂復(fù)合物。
[0044] 實施例5 BMPs-磷脂酰乙醇胺的制備方法
[0045] BMPs 處理：秤取 Img BMPs 于 100 μ Ll % SDS 溶液中 100°C加熱 5min，以去除 BMPs 表面蛋白；磁力架收集BMPs，并用IOOmM磷酸鹽（PB, pH = 7. 5)緩沖液清洗3次。
[0046] BMPs-磷脂酰乙醇胺復(fù)合物的制備：將處理后Img的BMPs重新懸浮于Iml的2mg/ mL磷脂酰乙醇胺溶液，100W超聲IOmin (超聲6s，間歇4s);避光孵育3h后，IOOmM磷酸鹽 (PB, pH = 7. 5)緩沖液清洗BMPs三次，即得到BMPs-磷脂酰乙醇胺復(fù)合物。
[0047] 封閉及保存：將所得復(fù)合物加入封閉液（IOmM PBS含1 % BSA，并含有2% PEG4000, 2% PEG6000)，4°C 保存?zhèn)溆谩?br> [0048] 實施例6應(yīng)用BMPs-GM3復(fù)合物獲取與GM3相互作用的蛋白
[0049] (1)制備BMPs-GM3復(fù)合物，并于封閉液（IOmM PBS含1 % BSA，并含有2 % PEG4000, 2% PEG6000)以阻斷非特異性結(jié)合位點，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0050] (2)培養(yǎng)人表皮癌細胞A431并提取蛋白：用含10%胎牛血清，100幾/1^青霉素 的DMEM培養(yǎng)基于37°C，5 % CO2條件下培養(yǎng)A431細胞，待細胞鋪滿皿底后，將培養(yǎng)皿至于 冰上，用 4°C預(yù)冷 PBS(137mM NaCL，2. 7mM KCL，10mM Na2HP04,2mM KH2PO4)緩沖液清洗皿底 3次，去除培養(yǎng)基，另取PBSL 5ml加入皿底，用刮鏟將細胞刮下于2ml離心管IOOOrpm離心 5min 去上清，添加 Iml RIPA裂解液（1% Triton X-100, 150mM NaCl, 25mM Tris ρΗ7· 4, 5mM EDTA，0.5%脫氧膽酸鈉，0.1%SDS，5mM焦磷酸四鈉，50mM氟化鈉，lmMNa3V0 4,2mM苯甲基 磺酰氟，0. 076U/ml抑肽酶），及IOmM苯甲基磺酰氟（PMSF)充分吹打，至于冰上30min后于 4°C 12000rpm離心15min，取上清即蛋白液于-80°C保存待用。
[0051] (3) A431細胞蛋白中富集與GMdg互作用的蛋白
[0052] 將Img BMPs-GM3復(fù)合物及Img BMPs-磷脂酰乙醇胺復(fù)合物分別溶于ImL TBS (+) 緩沖液（130mM NaCl, IOmM Tris-HCl (ρΗ8· 0)，0· 9mM CaCl2, 0· 5mM MgSO4, 0· ImMMnCl2)中，超 生打散。分別加入A431細胞蛋白（lmg/mL)于4°C搖床（80rpm)過夜。用磁力架將復(fù)合物 吸附后，吸去上清，用TBS (+)緩沖液清洗3次。此時將BMPs-GM3復(fù)合物及Img BMPs-磷脂 酰乙醇胺復(fù)合物分別于〇. 5mLl % SDS溶液中，沸水浴5min，使目的蛋白洗脫，并用SDS-PAGE 及Western Blot驗證實驗結(jié)果（各泳道均上樣30 μ L)，結(jié)果如圖1、圖2所示。通過以 BMPs-磷脂酰乙醇胺復(fù)合物作為空白對照，對BMPs-GM3與特異性蛋白富集能力進行驗證。由 圖1可知用BMPs-GM 3富集A431細胞蛋白后上清液較用BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431細 胞蛋白后上清液蛋白豐度低，且用BMPs-GM 3富集A431細胞蛋白后洗脫液較用BMPs-GM3富 集A431細胞蛋白后洗脫液蛋白豐度高，表明表明BMPs-GM 3復(fù)合物富集了更多的細胞蛋白。 因所合成復(fù)合物經(jīng)BSA封閉，因此在本實驗中60kd及40kd處兩條條帶較深，為實驗過程中 從復(fù)合物掉下的BSA。為進一步驗證BMPs-GM 3復(fù)合物富集蛋白為特異性蛋白，選取表皮生 長因子受體EGFR為對象進行蛋白印跡實驗，結(jié)果如圖2所示。已有大量文獻報道證明GM3 可特異性與EGFR結(jié)合，而PE與EGFR無特異性結(jié)合，實驗結(jié)果表明通過BMPs-GM 3復(fù)合物富 集前后A431細胞蛋白液中EGFR含量明顯減少，并且在BMPs-GM3富集A431細胞蛋白后洗 脫液中出現(xiàn)EGFR，而BMPs-磷脂酰乙醇胺富集A431細胞蛋白后洗脫液中未出現(xiàn)。結(jié)果表明 通過BMPs-GM 3復(fù)合物可有效的從A431細胞蛋白中富集EGFR等與GM3特異性結(jié)合的蛋白。
[0053] 實施例7 BMPs-GM1復(fù)合物促進膀胱癌細胞YTS-I細胞對GM1的利用
[0054] (1)制備 BMPs-GM1 復(fù)合物，并于封閉液（IOmM PBS (137mM NaCl, 2. 7mM KC1, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)含 1% BSA,并含有 2% PEG4000, 2% PEG6000)以阻斷非特異性結(jié)合位 點，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0055] (2)細胞處理：將直徑12mm的小玻片高溫滅菌后，放入24孔板中，每空加入每 孔加入50(^1^01^1培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1(^ 8/1^胰島素，100幾/1^青霉素）并接入 IX IO4個膀胱癌細胞YTS-1，于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)24h。待細胞黏附于玻片，分別加 入 GM1 (100 μ g/mL)及 BMPs-GM1 (10 μ g/mL)于控板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 48h。
[0056] (3)細胞染色及觀察：吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗兩次各5min，加入4%多聚甲 醛固定 20min，PBS 洗兩次后，加入 300yL5%BSA 的 PBS 溶液（137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)常溫封閉2h，PBS洗一次后，加入終濃度0. 4 μ g/mL異硫氰酸熒光素 FITC標(biāo)記的霍亂毒素 B亞基室溫孵育2h (注意避光），PBS溶液洗兩次各5min后，300 μ L PBS種加入5 μ g/ml終濃度的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI染核30min (注意避光），把 小玻片置于載玻片上，于激光共聚焦顯微鏡下分別于405nm波長激光及488nm波長激光觀 察拍照，并將照片重合，結(jié)果如圖3所示。DAPI及FITC可分別在405nm及488nm激發(fā)波長 下產(chǎn)生熒光，DAPI可直接與細胞核作用,產(chǎn)生熒光為細胞核所在位置；霍亂毒素 B亞基可以 特異性與GM1結(jié)合,而霍亂毒素 B亞基被FITC標(biāo)記，因此熒光處為細胞內(nèi)GM1位置,熒光強 度越強表明GM1含量越高。從結(jié)果中可知加入BMPs-GM 1的熒光強度遠大于空白對照組及僅 添加 GM1組，表明BMPs-GM1可促進細胞對GM1的吸收利用。
[0057] 實施例8 -種確認BMPs-糖鞘脂復(fù)合物的方法
[0058] 將合成后的BMPS-GM3復(fù)合物及未處理的BMPs各Img采用Bligh-Dyer法（參考 文獻 Bligh,E. G. and Dyer, W. J. 1959. A rapid method for total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917)提取復(fù)合物表面總脂，溶于 100 μ L 氯 仿：甲醇（2 :1，V/V)溶液中，于氯仿：甲醇：水（(30:60:8, V/V/V)展層劑中展開，用顯色劑 (0.02% (W/V)地衣酚，IMH2SO4)于95°C進行烘烤顯色。合成后的復(fù)合物中的總脂較原始 BMPs出現(xiàn)GM3條帶，由此可認定糖鞘脂GM3已成功偶聯(lián)于BMPs。
[0059] 雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。
【權(quán)利要求】
1. 一種細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物，其特征在于，所述復(fù)合物是將經(jīng)去除表面蛋 白的細菌納米磁小體與糖鞘脂偶聯(lián)得到的復(fù)合物。
2. -種制備權(quán)利要求1所述的細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物的方法，其特征在于， 是先用表面活性劑去除BMPs表面蛋白，再將BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中反應(yīng)，孵育，使BMPs 與糖鞘脂偶聯(lián)，即得到細菌納米磁小體-糖鞘脂復(fù)合物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：l)BMPs處理：配置表面活 性劑溶液，加入與表面活性劑質(zhì)量比為I :10-100 :1的BMPs，使混合溶液中BMPs的終濃度 為20mg/ml以下，通過表面活性劑去除BMPs的表面蛋白，收集BMPs，即得到處理好的BMPs ; 2)BMPs-糖鞘脂復(fù)合物的制備：將與糖鞘脂溶液中糖鞘脂質(zhì)量比為10:1至1:50的處理好 的BMPs重新懸浮于糖鞘脂濃度為100 μ g/mL至20mg/mL糖鞘脂溶液中混合反應(yīng)，孵育2h 以上，收集，即得到BMPs-糖鞘脂復(fù)合物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑去除BMPs表面蛋白， 是將混合溶液用60-10(TC加熱處理或者在室溫震蕩處理。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，BMPs懸浮于糖鞘脂溶液中的反應(yīng)，是 用超聲處理。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述孵育是避光孵育。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述表面活性劑是以下任意一種： 十二烷基硫酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨、3-[3-(膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽、聚 乙二醇辛基苯基醚。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述制備得到的細菌納米磁小體與糖 鞘脂復(fù)合物于牛血清白蛋白中封閉、保藏。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，去除BMPs表面蛋白后得到的BMPs、 得到的復(fù)合物進行清洗，去除BMPs表面的的表面活性劑或者未結(jié)合的糖鞘脂。
10. 權(quán)利要求1所述復(fù)合物在分離領(lǐng)域及醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/14GK104211753SQ201410466425
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月12日
【發(fā)明者】關(guān)鋒, 李想, 楊剛龍, 郭佳 申請人:江南大學(xué)