一種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法，包括如下步驟：1)準備原料：將含三尖杉寧堿的紫杉醇粗品溶解于有機溶劑中制成溶液A；將高錳酸鉀溶解于有機溶劑中制成溶液B；2)反應：溶液A與溶液B反應，并將反應后的溶液過濾；3)一次結(jié)晶：將步驟2)所得濾液結(jié)晶；4)柱層析：將步驟3)所得產(chǎn)物過濾干燥后進行柱層析，收集含紫杉醇的有效段，濃縮干燥；5)二次結(jié)晶：將步驟4)得到的干燥物進行結(jié)晶處理，得到紫杉醇含量在98.5wt％以上的紫杉醇純品。該方法三尖杉寧堿去除效果好，對紫杉醇本身無影響，紫杉醇純度和回收率均較高，并且該方法操作靈活簡便，反應及處理條件溫和，降低了精制步驟的難度，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】一種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法

【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及紫杉醇的分離純化【技術(shù)領域】，尤其涉及一種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]紫杉醇是近二十年來世界上發(fā)現(xiàn)的最有希望的抗癌藥物，于1967年首次從短葉紅豆杉樹皮中分離獲得，已被美國FDA批準用于卵巢癌、乳腺癌以及非小細胞肺癌等的治療。
[0003]紫杉醇屬于二萜類生物堿，在紅豆杉屬植物中含量都很低，只有0.0004%至
0.01% (w/w)，如此低的含量使從原料中提取和純化紫杉醇以達到純品的要求非常困難。天然紅豆杉資源極為有限，且紅豆杉生長緩慢，無法滿足紫杉醇生產(chǎn)的需要。因此，純化紫杉醇的方法顯得尤為重要。
[0004]三尖杉寧堿是與紫杉醇共生的一種天然紫杉烷類化合物和紫杉醇在化學結(jié)構(gòu)上只有酰胺基側(cè)鏈有所不同。由于三尖杉寧堿和紫杉醇在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上極其相似，從而造成紫杉醇與三尖杉寧堿的分離十分困難，反復多次分離是必需的。此外，作為一種生物大分子物質(zhì)，紫杉醇受溫度、有機溶劑、酸、堿等環(huán)境條件的影響，容易發(fā)生降解或異構(gòu)而生成其他紫杉烷類物質(zhì)。作為臨床使用中的藥品，紫杉醇在實際應用中其純度要求很高。紫杉醇資源珍貴、價格居高不下，分離的純度和收率成為制約藥用紫杉醇成本的關(guān)鍵因素?；谏鲜鰩讉€方面，使得開發(fā)更加高效、廉價的分離純化技術(shù)以及新型的生產(chǎn)分離純化工藝，成為紫杉醇研究中的焦點問題。
[0005]目前常用的分離純化紫杉醇與紫杉醇類似物的方法主要有柱層析法、薄層色譜法、沉淀法、膠束動電色譜法、膜分離法、樹脂吸附分離法、化學反應法等。但是，這些方法尚不能夠有效地分離紫杉醇和三尖杉寧堿。
[0006]除了上述方法之外，研究人員還提出了一些除去紫杉醇中的三尖杉寧堿的方法，如專利US5334732和US5336648中介紹了用臭氧氧化三尖杉寧堿側(cè)鏈的方法；專利CN96193149中介紹了用鹵素加成在三尖杉寧堿側(cè)鏈上，再由正相硅膠柱分離的方法。但是，這兩種方法也存在缺點:用臭氧氧化粗提物時，將會產(chǎn)生許多副反應，臭氧分解反應是很強的、而且是無選擇性的，能將紫杉醇和三尖杉寧堿中的許多官能團發(fā)生不希望的氧化反應，例如同紫杉醇分子中的酮，醇，胺等反應，或者同紫杉醇及三尖杉寧堿的紫杉烷環(huán)上的雙鍵反應，此外，臭氧發(fā)生器設備也很昂貴，生產(chǎn)成本高；鹵素加成的方法對反應的條件要求比較苛刻，需要在0-5°C左右，避光，反應曝光太長或鹵素過量會造成紫杉醇降解，并且溴作為一種低沸點液體鹵素并且毒性較大的情況下，對于生產(chǎn)條件有較高的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法，該方法能夠在不影響紫杉醇性質(zhì)的情況下高效地除去紫杉醇中的三尖杉寧堿，所得紫杉醇純度較高，并且反應及處理條件溫和,紫杉醇回收率高。
[0008]為達此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0009]—種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法，包括如下步驟:
[0010]I)準備原料:將含三尖杉寧堿的紫杉醇粗品溶解于有機溶劑中制成溶液A ;將高錳酸鉀溶解于有機溶劑中制成溶液B ;
[0011]2)反應:在溶液A中加入溶液B進行反應,并將反應后的溶液過濾；
[0012]3) 一次結(jié)晶:將步驟2)所得濾液結(jié)晶，過濾和干燥后得到三尖杉寧堿含量在Iwt %以下的紫杉醇粗品；
[0013]4)柱層析:將步驟3)所得紫杉醇粗品進行柱層析，收集含紫杉醇的有效段，濃縮干燥；
[0014]5) 二次結(jié)晶:將步驟4)得到的干燥物進行結(jié)晶處理，將結(jié)晶物過濾和干燥后得紫杉醇含量在98.5wt%以上的紫杉醇純品。
[0015]本發(fā)明所述方法將含三尖杉寧堿的紫杉醇粗品有機溶液加入有機溶劑溶解的高錳酸鉀，使三尖杉寧堿與高錳酸鉀反應生成三尖杉寧堿絡合物，由于高錳酸鉀在溶劑中的溶解度不大，本發(fā)明所述方法將紫杉醇粗品和高錳酸鉀分別配制成溶液，有效提高了高錳酸鉀與紫杉醇粗品溶液中三尖杉寧堿的接觸，從而提高了反應效率和三尖杉寧堿從紫杉醇中分離的效率；反應完全之后將反應液過濾、一次結(jié)晶并在50?60°C干燥后得到三尖杉寧堿含量低于lwt%以下的紫杉醇粗品；再經(jīng)柱層析、二次結(jié)晶后得到98.5wt%以上的紫杉醇純品，有效地解決了目前紫杉醇分離提純難的問題。
[0016]步驟I)所述有機溶劑為丙酮，丙酮對紫杉醇的溶解度相對較大，且有利于后道工序的處理。
[0017]步驟I)所述溶液A的溶質(zhì)質(zhì)量kg與溶劑的體積L比為1:6?10，如1:6.5、1:7.0、1:7.5、1:8.0、1:8.5、1:9.0 或 1:9.5，優(yōu)選為 1:7 ?9，進一步優(yōu)選為 1:7 ?8。
[0018]步驟I)所述高錳酸鉀與所述紫杉醇粗品中的三尖杉寧堿的重量比為1:2?7，如1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、1:5、1:5.5 或 1:6，優(yōu)選為 1:3 ?6，進一步優(yōu)選 1:3 ?5，所述重量比為根據(jù)生產(chǎn)過程確定的最佳重量比。
[0019]步驟I)所述溶液B中有機溶劑的體積L與紫杉醇粗品的質(zhì)量kg比為2?5:1，如2.5:1、3.0:1、3.5:1、4.0:1 或 4.5:1，優(yōu)選為 2 ?4:1，進一步優(yōu)選 2 ?3:1。
[0020]步驟I)所述紫杉醇粗品紫杉醇含量為45?
49wt %、50wt %、51wt %、52wt %、53wt % 或 54wt % ;三尖杉寧堿含量是任意的，如 5wt%、10wt%、20wt%、30wt%、40wt% 或 50wt%。
[0021]步驟2)所述反應時間為 3 ?8h,如 3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h、6h、6.5h、7h 或 7.5，
優(yōu)選為3?6h,進一步優(yōu)選為4?5h。
[0022]步驟2)所述反應的溫度為常溫。
[0023]步驟3)所述結(jié)晶使用的溶劑為純化水，經(jīng)過步驟2)的反應之后的濾液為紫杉醇、高錳酸鉀和三尖杉寧堿等雜質(zhì)的混合液，紫杉醇不溶于水，高錳酸鉀為水溶性試劑，因此，采用純化水作為結(jié)晶溶劑可除去過量的高錳酸鉀。所述純化水與所述濾液的體積比為1:0.5 ?1.8，如 1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1: 1.2、1: 1.3、1: 1.5、1: 1.6 或 1:1.7，優(yōu)選為1:0.5?1.5，進一步優(yōu)選為1:0.5?1.2，采用如上所述的純化水與濾液的體積比能夠使得紫杉醇晶體析出的效果最佳。
[0024]步驟3)所述晶體干燥溫度為 50 ?60°C，如 52°C、54°C、55°C、57°C、58°C、或 59°C。
[0025]步驟4)所述柱層析流動相為乙酸乙酯和二氯甲烷的混合液，所述乙酸乙酯和二氯甲烷的體積比為 2:8 ?3:7，如 2.1:7.9,2.2:7.8,2.3:7.7,2.4:7.6,2.5:7.5,2.6:7.4、2.7:7.3、2.8:7.2或2.9:7.1。本發(fā)明所述柱層析操作條件為:用二氯甲烷將待測物制成濕樣，在50 X 500玻璃柱內(nèi)加入硅膠裝柱，用二氯甲烷潤柱，再將濕樣加入柱頭，用乙酸乙酯的體積百分比為30%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑作為流動相進行洗脫，收集主分段。由于紫杉醇與雜質(zhì)在乙酸乙酯和二氯甲烷中的溶解度不同，采用乙酸乙酯和二氯甲烷作為流動相，能夠有效地分離紫杉醇與其他雜質(zhì)。
[0026]步驟5)所述二次結(jié)晶的溶劑為丙酮和純化水，所述丙酮用于將步驟4)所述干燥物溶解，所述純化水用于紫杉醇的結(jié)晶，所述丙酮和純化水的體積比為1:0.7?1.4，如1:0.8、1:0.9、1: 1.0、1: 1.1、1: 1.2 或 1:1.3，優(yōu)選為 1:0.8 ?1.2，進一步優(yōu)選為 1:0.9 ?1.1。
[0027]步驟5)所述晶體干燥溫度為 50 ?60°C，如 52°C、54°C、55°C、57°C、58°C、或 59°C。
[0028]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0029]I)本發(fā)明的方法三尖杉寧堿去除效果好，制得的紫杉醇純度和回收率高，且對紫杉醇本身無影響；
[0030]2)本發(fā)明的方法操作靈活簡便，反應及處理條件溫和，降低了精制步驟的難度，適宜于大規(guī)模生產(chǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為本發(fā)明所述的紫杉醇㈧與三尖杉寧堿⑶結(jié)構(gòu)式；
[0032]圖2為本發(fā)明的生產(chǎn)工藝流程圖；
[0033]圖3為本發(fā)明實施例2所用的紫杉醇粗品高效分離制備的液相色譜圖；
[0034]圖4為本發(fā)明實施例2 —次結(jié)晶之后得到的紫杉醇粗品高效分離制備的液相色譜圖；
[0035]圖5為本發(fā)明實施例3得到的紫杉醇含量為99.8wt%的紫杉醇純品高效分離制備的液相色譜圖。

【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0037]如圖1所示為本發(fā)明所述的紫杉醇與三尖杉寧堿結(jié)構(gòu)式，從圖中可以看出三尖杉寧堿和紫杉醇在結(jié)構(gòu)上極其相似，由于結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，紫杉醇和三尖杉寧堿在性質(zhì)上也很相似，從而造成紫杉醇與三尖杉寧堿的分離十分困難。紫杉醇屬于不穩(wěn)定物質(zhì)，其受溫度、有機溶劑、酸、堿等環(huán)境條件的影響，容易發(fā)生降解或異構(gòu)而生成其他紫杉烷類物質(zhì)，增加了分離提純紫杉醇的難度。
[0038]如圖2所示為本發(fā)明制備紫杉醇純品的生產(chǎn)工藝流程圖，將含三尖杉寧堿的紫杉醇粗品的有機溶液加入高錳酸鉀的有機溶液，經(jīng)反應后將反應液過濾、一次結(jié)晶并干燥后得到三尖杉寧堿含量低于1%以下的紫杉醇粗品，再經(jīng)柱層析和二次結(jié)晶后得到98.5wt%以上的紫杉醇純品。
[0039]實施例1
[0040](I)取紫杉醇粗品50g(紫杉醇含量47.6wt%，三尖杉寧堿含量10.lwt% )用300ml丙酮溶解后加入高錳酸鉀溶液(2.5g加入10ml丙酮溶解)進行反應。反應3h后進行過濾，得濾液約450ml，加入純化水250ml結(jié)晶，晶體干燥得31.3g，HPLC檢測，紫杉醇含量74.2 %，三尖杉寧堿含量0.44%，紫杉醇收率為97.6%。
[0041](2)將上步產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后得濕樣，在50X500玻璃柱內(nèi)加入360g硅膠裝柱，用二氯甲烷潤柱，再將濕樣加入柱頭，用乙酸乙酯的體積百分比為30%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑作為流動相進行洗脫，收集主分段，共1.5L，濃縮干燥后得干燥物23.3g，加入200ml丙酮溶解后，再加入140ml純化水進行析晶，晶體干燥后得干燥物19.4g，HPLC檢測紫杉醇含量為99.1 %，主收率為82.8 %，一次總收率為80.8 %。
[0042]實施例2
[0043](I)取紫杉醇粗品300g (紫杉醇含量52.8wt%，三尖杉寧堿含量16.1wt %，其高效分離制備的液相色譜圖如圖3所示，48.6處的峰是紫杉醇的特征峰，42.4處的峰是三尖杉寧堿的特征峰)用3000ml丙酮溶解后加入高錳酸鉀溶液(7g加入900ml丙酮溶解)進行反應。反應8h后進行過濾，得濾液約4000ml，加入純化水7000ml結(jié)晶，晶體干燥得203.2g，HPLC檢測，檢測結(jié)果如圖4所示，48.1處的峰是紫杉醇的特征峰，42.1處的峰是三尖杉寧堿的特征峰，分析后得到紫杉醇含量為76.7 %，三尖杉寧堿含量為0.58%，紫杉醇收率為98.4%。
[0044](2)將上步產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后得濕樣，在300X600玻璃柱內(nèi)加入18kg硅膠裝柱，用二氯甲烷潤柱，再將濕樣加入柱頭，用乙酸乙酯的體積百分比為20%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑作為流動相進行洗脫，收集主分段，共245L，濃縮干燥后得干燥物141.2g，加入1400ml丙酮溶解后，再加入1960ml純化水進行析晶，晶體干燥后得干燥物132.5g，HPLC檢測，得到紫杉醇含量為99.2%，主收率為84.3%，一次總收率為83.0%。
[0045]實施例3
[0046](I)取紫杉醇粗品100g(紫杉醇含量50.1wt%，三尖杉寧堿含量19.8wt% )用8L丙酮溶解后加入高錳酸鉀溶液^Og加入2L丙酮溶解)進行反應。反應5h后進行過濾，得濾液約10.5L，加入純化水1L結(jié)晶，晶體干燥得690.3g，HPLC檢測，紫杉醇含量71.2%,三尖杉寧堿含量0.67%，紫杉醇收率為98.1 %。
[0047](2)將上步產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后得濕樣，在400X1000不銹鋼柱內(nèi)加入45kg硅膠裝柱，用二氯甲烷潤柱，再將濕樣加入柱頭，用乙酸乙酯的體積百分比為20%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑作為流動相進行洗脫，收集主分段，共660L，濃縮干燥后得干燥物431.5g，加入4.5L丙酮溶解后，再加入4.5L純化水進行析晶，晶體干燥后得干燥物411.1g,HPLC檢測，檢測結(jié)果如圖5所示，47.6處的峰是紫杉醇的特征峰，沒有檢測到三尖杉寧堿的特征峰，分析后得到紫杉醇含量為99.8%，主收率為83.5%，一次總收率為81.9%。
[0048]實施例4
[0049](I)取紫杉醇粗品2000g(紫杉醇含量55wt%，三尖杉寧堿含量15.8wt% )用14L丙酮溶解后加入高錳酸鉀溶液￠3.2g加入8L丙酮溶解)進行反應。反應6h后進行過濾，得濾液約22.5L，加入純化水12.5L結(jié)晶，晶體干燥得1406g，HPLC檢測，紫杉醇含量76.8%,三尖杉寧堿含量0.66%，紫杉醇收率為98.2 %。
[0050](2)將上步產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后得濕樣，在400X1000不銹鋼柱內(nèi)加入45kg硅膠裝柱，用二氯甲烷潤柱，再將濕樣加入柱頭，用乙酸乙酯的體積百分比為20%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑作為流動相進行洗脫，收集主分段，共1450L，濃縮干燥后得干燥物1000.9g，加入9.5L丙酮溶解后，再加入8.55L純化水進行析晶，晶體干燥后得干燥物923g，HPLC檢測，分析后得到紫杉醇含量為98.9%，主收率為84.5%，一次總收率為83.0%。
[0051]實施例5
[0052](I)取紫杉醇粗品600g(紫杉醇含量45wt%，三尖杉寧堿含量21.2wt% )用5.4L丙酮溶解后加入高錳酸鉀溶液(21.2g加入3L丙酮溶解)進行反應。反應4h后進行過濾，得濾液約8.5L，加入純化水17L結(jié)晶，晶體干燥得357g，HPLC檢測，紫杉醇含量74.6%，三尖杉寧堿含量0.54%，紫杉醇收率為98.6 %。
[0053](2)將上步產(chǎn)物用二氯甲烷溶解后得濕樣，在400X1000不銹鋼柱內(nèi)加入45kg硅膠裝柱，用二氯甲烷潤柱，再將濕樣加入柱頭，用乙酸乙酯的體積百分比為25%的乙酸乙酯和二氯甲烷的混合溶劑作為流動相進行洗脫，收集主分段，共500L，濃縮干燥后得干燥物244.2g，加入2.7L丙酮溶解后，再加入3.0L純化水進行析晶，晶體干燥后得干燥物225.1g,HPLC檢測，分析后得到紫杉醇含量為99.5%，主收率為84.1%，一次總收率為83.0%。
[0054] 申請人:聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬【技術(shù)領域】的技術(shù)人員應該明了，對本發(fā)明的任何改進，對本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種除去紫杉醇中三尖杉寧堿的方法，其特征在于，包括如下步驟: . 1)準備原料:將含三尖杉寧堿的紫杉醇粗品溶解于有機溶劑中制成溶液A;將高錳酸鉀溶解于有機溶劑中制成溶液B ； .2)反應:在溶液A中加入溶液B進行反應,并將反應后的溶液過濾； . 3)—次結(jié)晶:將步驟2)所得濾液結(jié)晶，過濾和干燥處理后得到三尖杉寧堿含量在1%以下的紫杉醇粗品； . 4)柱層析:將步驟3)所得粗品進行柱層析，收集含紫杉醇的有效段，濃縮干燥； .5)二次結(jié)晶:將步驟4)得到的干燥物進行結(jié)晶處理，過濾和干燥后得紫杉醇含量在.98.5wt%以上的紫杉醇純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟I)所述有機溶劑為丙酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟I)所述溶液A的溶質(zhì)質(zhì)量kg與溶劑的體積L比為1:6?10，優(yōu)選為1:7?9，進一步優(yōu)選為1:7?8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步驟I)所述高錳酸鉀與所述紫杉醇粗品中的三尖杉寧堿的重量比為1:2?7，優(yōu)選為1:3?6，進一步優(yōu)選1:3?5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步驟I)所述溶液B中有機溶劑的體積L與紫杉醇粗品的質(zhì)量kg比為2?5:1，優(yōu)選為2?4:1，進一步優(yōu)選為2?3:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的方法，其特征在于，步驟I)所述紫杉醇粗品中紫杉醇含量為45?55wt%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6之一所述的方法，其特征在于，步驟2)所述反應時間為3?8h，優(yōu)選為3?6h,進一步優(yōu)選為4?5h ; 優(yōu)選地，步驟2)所述反應的溫度為常溫。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之一所述的方法，其特征在于，步驟3)所述結(jié)晶使用的溶劑為純化水，所述純化水與所述濾液的體積比為1:0.5?1.8，優(yōu)選為1:0.5?1.5，進一步優(yōu)選為.1:0.5 ?1.2 ; 優(yōu)選地，步驟3)所述晶體干燥溫度為50?60°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8之一所述的方法，其特征在于，步驟4)所述柱層析流動相為乙酸乙酯與二氯甲烷的混合液，所述乙酸乙酯與二氯甲烷體積比為2:8?3:7。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9之一所述的方法，其特征在于，步驟5)所述結(jié)晶的溶劑為丙酮和純化水，所述丙酮用于將步驟4)所述干燥物溶解，所述純化水用于紫杉醇的結(jié)晶，所述丙酮與所述純化水的體積比為1:0.7?1.4，優(yōu)選為1:0.8?1.2，進一步優(yōu)選為1:0.9?.1.1 ; 優(yōu)選地，步驟5)所述晶體干燥溫度為50?60°C。
【文檔編號】C07D305/14GK104262300SQ201410522893
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】胡立, 丁正飛, 任莉, 喻瓊林 申請人:江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司