具有her2親和性的新多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明揭示了HER2結合多肽，其包含氨基酸序列EX1 RNAYWEIA LLPNLTNQQK RAFIRKLYDD PSQSSELLX2E AKKLNDSQ，其中位置2的X1是M、I或者L；位置39的X2是S或者C(SEQ ID NO:1)。此外，本發(fā)明揭示了包含螯合環(huán)境的這種肽。本發(fā)明還揭示了包含螯合環(huán)境和放射性核素的肽形成的放射性標記的多肽。本發(fā)明還揭示了患有或者懷疑患有特征在于HER2過表達的癌癥的哺乳動物對象身體的體內成像方法，所述方法包括給予這種放射性標記的多肽，隨后使用醫(yī)學成像設備獲得身體圖像；本發(fā)明還揭示了治療這種癌癥的方法。此外，本發(fā)明還揭示了這種放射性標記的多肽在診斷和治療特征在于HER2過表達的癌癥中的應用。本發(fā)明還揭示了編碼所述多肽的核酸、包含所述核酸的表達載體以及包含所述表達載體的宿主細胞。
【專利說明】具有HER2親和性的新多肽
[0001] 本申請是申請日為2008年12月22日，申請?zhí)枮?00880126835. 4,發(fā)明名稱為"具 有HER2親和性的新多肽"的申請的分案申請。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及結合人表皮生長因子受體2 (在后文稱作HER2)的新多肽。本發(fā)明還 涉及這種HER2結合多肽作為診斷劑和/或藥物的應用，特別是其作為診斷和/或治療特 征在于HER2過表達的癌癥的診斷劑和/或藥物的應用。
[0003] 置量
[0004]HER2及其在癌癥疾病中的作用
[0005]HER2原癌基因編碼已知產(chǎn)生稱作HER2蛋白或者受體的185kDa細胞表面受體蛋 白（HynesNEetal(1994)BiochimBiophysActa1198:165-184)。這個基因有時也稱 作neu、HER2/neu或者c-erbB-2。Neu首先在已經(jīng)用乙基亞硝基脲治療的大鼠中發(fā)現(xiàn)，并 表現(xiàn)為這個基因突變（ShihCetal(1981)Nature290:261-264)。突變形式的neu導致 組成型活性形式的受體產(chǎn)生，且組成可在低拷貝數(shù)轉化細胞的強力致癌基因（HynesNEet al,supra)〇
[0006] 正常細胞以組織特異性方式在其漿膜上表達少量HER2蛋白。目前沒有已知的 HER2配體；然而，HER2已經(jīng)示出與HERl(表皮生長因子受體，EGFR)、HER3和HER4形成異 源二聚體，與這些受體的配體復合。這種異源二聚體形成使得激活的HER2受體從細胞外部 向細胞核傳遞生長信號，因此控制正常細胞生長和分化（SundaresanSetal(1999)Curr OncolRepl:16-22)。
[0007] 在腫瘤細胞中，DNA復制系統(tǒng)中的錯誤可導致一個染色體上存在多個基因拷貝， 這是已知稱作基因擴增的現(xiàn)象。HER2基因的擴增導致這個基因的轉錄增加。這樣提高了 HER2mRNA水平及增加伴隨的HER2蛋白合成增加，由此導致HER2蛋白在這些腫瘤細胞表面 上過表達。這種過表達可導致HER2蛋白水平與在相鄰的正常細胞中的發(fā)現(xiàn)的那些表達水 平高10-100倍。由此導致細胞分化增加及伴隨的較高的細胞生長速度。HER2基因的擴增 參與正常細胞轉化為癌癥表型（HynesNEetal,supra;SundaresanSetal,supra)。
[0008] 據(jù)認為HER2蛋白的過表達導致HER2的同源二聚體形成，這導致組成型活性受體 形成（SliwkowskiMXetal(1999)SeminOncol26(4Suppll2) :60-70)。在這些條件下， 生長促進信號在不存在配體的情況下可以持續(xù)地傳遞進細胞中。因此，多個細胞內信號轉 導途徑被激活，導致不受控制的細胞生長，以及在一些情況中出現(xiàn)致癌轉化（HynesNEet al，supra)。因此，由生長因子受體介導的信號轉導機制是抑制細胞復制和腫瘤生長的重要 靶位。
[0009] 乳腺癌在美國是女性最常見的惡性腫瘤，在2001年新增病例已經(jīng)是192200 例（GreenleeRetal(2001)CACancerJClin51:15-36)。在大約 25 % 的所有乳 腺癌患者中，均存在HER2基因由于其擴增而過表達（SlamonDJetal(1989)Science 244:707-712)。HER2蛋白的這種過表達與一些陰性預后變量相關，包括雌激素受體陰性 狀態(tài)、高s-期細胞比值（highs-phasefraction)、陽性淋巴結轉移（positivenodal status)、突變的p53 以及高核級別（highnucleargrade)(SjogrenSetal(1998)JClin Oncol16(2) :462-469)。根據(jù)Slamon等（如前）所述，發(fā)現(xiàn)HER2基因的擴增與淋巴結陽 性轉移患者的縮短的無疾病存活期和縮短的整體存活期明顯相關。
[0010] 為此，重要的目標是繼續(xù)進一步研究HER2在乳腺癌的發(fā)病機制和治療中的作用。 與HER2相互作用的分子的鑒別是這項研究的一部分。
[0011] 臨床前體外研究檢驗了HER2活性抑制是否能影響腫瘤細胞生長。用4D5, 一些鼠 抗HER2單克隆抗體之一，治療過表達HER2蛋白的SK-BR-3乳腺癌細胞，與用對照的單克隆 抗體治療相比，確實抑制腫瘤細胞增殖。給予具有過表達HER2的人乳腺癌和卵巢癌（異種 移植）的小鼠4D5延長其無腫瘤存活時間。相似的研究證實在小鼠中人胃癌異種移植物的 生長被抗-HER2 單克隆抗體抑制（PietrasRJetal(1994)Oncogene9:1829-1838)。
[0012] 在抑制腫瘤細胞表面大量存在的HER2蛋白的方法中，一種治療方法在近年來已 經(jīng)可商購。因此，單克隆抗體4D5的人源化變體或者trastuzumab為此由F Hoffman-La Roche和Genentech以Herceptill?商標銷售。
[0013] 因此已經(jīng)針對乳腺癌描述了HER2的過表達。其與卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺 癌、肺癌（Holbroetal·，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 2004. 44:195-217)以及食管癌 (Ekmanetal·，Oncologist2007 ;12 ;1165-1177,具體參見第 1170-1171 頁）也相關。
[0014] 盡管抗體在治療特征在于HER2蛋白過表達的癌癥中顯示了明顯優(yōu)勢，但是仍 存在各種因素具有降低抗體效力的可能性的事實（見例如ReillyRMetal(1995)Clin Pharmacokinet28:126-142)。這些因素包括：（1)所述抗體穿透大的實體腫瘤或者穿透 重要區(qū)域如腦的通透性有限；（2)所述抗體由于血管通透性降低而外滲進靶位點的能力降 低；（3)抗體與正常組織的交叉反應性和非特異性結合降低靶效應；(4)異質腫瘤吸收導致 未得治療帶；（5)注射的抗體代謝增加降低治療效力；以及^)HAM與人抗人抗體的快速形 成使治療性抗體失活。
[0015] 此外，毒性作用在癌癥的治療性抗體的開發(fā)中具有很大障礙（Carter P(2001) Nat Rev Cancer 1: 118-129 ；Goldenberg DM(2002)J Nucl Med43:693-713 ；Reichert JM(2002)Curr Opin Mol Ther 4:110-118)。與健康組織的交叉反應性可導致未綴合的 (裸）抗體的副作用，這種副作用在抗體與毒素或者放射性同位素綴合時可額外增強。免疫 介導的并發(fā)癥包括肺毒性反應的呼吸困難，偶爾的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，以及肝功 和腎功衰退。有時可以見到預料之外的毒性并發(fā)癥，如HER2祀向抗體trastuzumab相關的 心臟毒性反應（Schneider JW et al (2002) Semin Oncol 29 (3suppl 11) :22-28).使用同位 素綴合的抗體進行的放射性免疫治療也可以導致骨髓抑制。
[0016] 盡管近年來目前使用的抗癌抗體取得了臨床和商業(yè)上的成功，但是關于抗體使用 前景仍存在許多重要問題。因此，繼續(xù)提供具有相當HER2親和性的制劑以及提供這種分子 在診斷和治療疾病中的應用仍是本領域的一個重要議題。
[0017]HER2結合Z變體分子
[0018] 使用不同的相互作用靶位，從這種分子的隨機化文庫中選擇衍生自金黃色 葡萄球菌A蛋白（SPA)的B結構域的蛋白質Z相關的分子（NilssonBetal(1987) ProteinEngineering1,107-133)(見例如W095/19374;NordKetal(1997) NatureBiotechnology15, 772-777 ；W02005/000883 ；W02005/075507 ；W02006/092338 ；W02007/065635)。
[0019] 在W02005/003156中，揭示了具有與HER2相互作用的能力的大量Z變體。
[0020] 發(fā)明福示
[0021] 本發(fā)明的一個目的是通過提供特征在于與HER2特異性結合的多肽滿足持續(xù)提供 具有HER2親和性的物質的需求。
[0022] 本發(fā)明的一個相關目的是HER2結合多肽，其顯示較少或者無非特異性結合。
[0023] 本發(fā)明的另一目的是提供HER2結合多肽，其可易于用作融合多肽中的一部分。
[0024] 本發(fā)明的另一目的是提供HER2結合多肽，其解決了與現(xiàn)有抗體試劑相關的一或 多個已知問題。
[0025] 本發(fā)明的另一目的是提供HER2結合多肽，其適用于治療性應用中。
[0026] 本發(fā)明的另一目的是提供HER2結合多肽，其適用于診斷性應用中。
[0027] 本發(fā)明的一個相關目的是在特征在于HER2蛋白過表達的癌癥疾病的臨床背景中 發(fā)現(xiàn)治療、抑制和/或靶向的新形式。
[0028] 本發(fā)明的另一方面是提供HER2結合多肽，其易于由化學肽合成方法合成。
[0029] 本發(fā)明的一個相關目的是發(fā)現(xiàn)HER2結合多肽，其與已知的HER2結合劑相比呈現(xiàn) 出改良的穩(wěn)定性。
[0030] 本發(fā)明的再一目的是獲得HER2結合多肽，其在體內用于哺乳動物時呈現(xiàn)出低抗 原性。
[0031] 本發(fā)明的另一目的是提供HER2結合多肽，其在給予哺乳動物時具有改良的生物 分布性。
[0032] 本發(fā)明的這些及其它目的由所附權利要求所要求的本發(fā)明的不同方面符合。因 此，第一方面，本發(fā)明提供了多肽，其具有包含如下序列的氨基酸序列：
[0033]EX1RNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0034] 其中位置2的X1是Μ、I或者L，位置39的X2是S或者C(SEQIDNO: 1)，
[0035] 或者在一些情況中，更優(yōu)選
[0036]YAKEX1RNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0037] 其中位置5的X1是11或者L，位置42的X2是S或者C(SEQIDNO:2)，
[0038] 或者在一些情況中，更優(yōu)選
[0039]AeaKYAKEX1RNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSEL·LX2EAKKLNDSQ
[0040] 其中位置9的X1是Μ、I或者L，位置46的X2是S或者C(SEQIDNO: 3)，
[0041] 或者在一些情況中，更優(yōu)選
[0042]EseKYAKEX1RNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0043] 其中位置9的X1是Μ、I或者L，位置46的X2是S或者C(SEQIDNO:4)。
[0044] 據(jù)此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)例如與在W02005/003156中揭示的HER2結合多肽相比，包含 SEQIDNO: 1-4任一序列的多肽呈現(xiàn)出令人驚奇的優(yōu)勢，同時保留這些前述描述的多肽的 結合靶HER2的能力。由本發(fā)明的多肽的一或多個實施方案呈現(xiàn)出的這些優(yōu)勢的非限制性 實例如下所述：
[0045] ?本發(fā)明的多肽包含更少的在多肽序列的化學合成中可導致如低產(chǎn)量和成功率等 問題的氨基酸，如天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸和甲硫氨酸。
[0046] ?本發(fā)明的多肽包含更少的賦予表面疏水性的氨基酸殘基，因此與先前描述的相 關的HER2結合多肽相比具有更親水性譜。這意味著具有更少的低溶解性和聚集的問題。不 受理論的限制，目前也認為更親水性特性作用于在給予宿主時改變多肽的生物分布性，從 肝膽途徑（通過肝臟排泄）轉向更希望的腎排泄途徑（通過腎排泄）。
[0047] ?本發(fā)明的多肽包含更少的與多肽穩(wěn)定性問題相關的氨基酸殘基，如甲硫氨酸、 天冬酰胺和二肽天冬酰胺-脯氨酸。甲硫氨酸易于氧化，天冬酰胺易于去酰胺化，天冬酰 胺-脯氨酸鍵易于裂解，因此其導致終產(chǎn)物的非均質性。
[0048] ?本發(fā)明的多肽缺少在相似的序列中已發(fā)現(xiàn)增加與含有VH3重鏈可變結構域的免 疫球蛋白相互作用的氨基酸殘基（SilvermanG.J.，Int.Rev.Immunol. 1992 ;9 (I) : 57-78)。 不受理論的限制，目前認為本發(fā)明的多肽中這些氨基酸殘基的置換在將該多肽給予宿主時 降低了多肽的抗原性。
[0049] 本發(fā)明的多肽具有替代HER2抗體的不同的應用。作為非限制性的例子，它們可用 于治療特征在于HER2過表達的癌癥、通過結合細胞表面上的HER2而用于抑制細胞發(fā)信號、 用于在體內和體外診斷特征在于HER2過表達的癌癥、用于將藥劑靶向過表達HER2的細胞、 用于檢測HER2的組織化學方法中，以及用于分離及其它應用方法中。本發(fā)明的多肽可用于 依賴于試劑的HER2親和性的任何方法中。因此，所述多肽在這種方法中可用作檢測試劑、 捕獲試劑或者分離試劑，用作診斷劑以在體內或者在體外進行診斷，或者自身用作治療劑 或者用作靶向HER2蛋白的其它治療劑或者診斷劑的工具。在體外應用本發(fā)明的多肽的方 法可以不同形式進行，如在微滴定平板中、在蛋白質陣列中、在生物傳感器表面上、在組織 切片上等。
[0050] 在不偏離本發(fā)明范圍的條件下，可以對本發(fā)明的多肽進行不同的修飾和/或添 力口，以使所述多肽適于特定用途。這種修飾和添加在下文更詳細描述，包括在相同多肽鏈中 包含的額外氨基酸，或者與本發(fā)明的多肽化學綴合的或者另外方式結合的標記和/或治療 劑。
[0051] 短語"HER2結合親和性"、"HER2結合"等是指多肽的通過例如使用表面等離子共 振技術如Biacore?'設備（GEHealthcare)可以檢測的性質。HER2結合親和性可以在實驗 中檢測，其中HER2或者其片段如胞外結構域或者其融合蛋白固定在該設備的傳感器芯片 上，使含有待檢測的多肽的樣品經(jīng)過該芯片?；蛘?，將待檢測的多肽固定在該設備的傳感器 芯片上，使含有HER2或者其片段如胞外結構域的樣品經(jīng)過該芯片。然后技術人員解釋獲得 的傳感圖，以確定該多肽的HER2結合親和性的至少定性測量。如果嘗試定量測量，例如為 了確定相互作用的某KD值，也可以使用表面等離子共振技術。結合值可例如在Biacore? 2000設備（GEHealthcare)中限定。HER2或者其片段如胞外結構域固定在設備的傳感器 芯片上，通過系列稀釋制備待確定其親和性的多肽樣品并以隨機順序注射。然后從結果中 計算KD值，使用例如由設備生產(chǎn)商提供的BIAevaluation3. 2軟件的I:ILangmuir結合模 式進行。
[0052] 本發(fā)明還涵蓋了這樣的多肽，其中上述HER2結合多肽以HER2結合結構域形式存 在，在其每一末端已經(jīng)添加額外的氨基酸殘基。這些額外的氨基酸殘基在該多肽與HER2的 結合中可起作用，但是在一些其它目的中可以相同地起作用，例如多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定 化、偶聯(lián)或者檢測等一或多個目的中。這些額外的氨基酸殘基可包含為了進行化學偶聯(lián)而 添加的一或多個氨基酸殘基。一個實例是在多肽鏈的第一位或者最后一位即在N末端或 者C末端添加半胱氨酸殘基。用于化學偶聯(lián)的半胱氨酸殘基也可通過置換該蛋白質結構域 表面上的另一氨基酸而導入，優(yōu)選在不參與靶向結合的表面部分。這種額外的氨基酸殘基 也可包含"標記"以純化或者檢測所述多肽，如六組氨酸（His6)標記，或者"myc"標記或者 "FLAG"標記以與特異于該標記的抗體相互作用。本領域技術人員知道其它選擇。
[0053] 在具有額外的氨基酸殘基的多肽的一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了包含如下 氨基酸序列的HER2結合多肽：
[0054]AEAKYAKEMRNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPKVD C(SEQIDNO:5) 〇
[0055] 在具有額外的氨基酸殘基的多肽的另一個具體實施方案中，本發(fā)明提供了包含如 下氨基酸序列的HER2結合多肽：
[0056] ESEKYAKEMR NAYffEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPK(SEQ ID N0:6)。
[0057] 上述"額外的氨基酸殘基"也組成具有任何希望功能的一或多個多肽結構域，如與 第一個HER2結合結構域相同的結合功能，或者另一種結合功能，或者酶功能，或者熒光功 能，或者其混合物。
[0058] 因此，本發(fā)明涵蓋了包含SEQIDNO: 1-6所示任何序列的多肽的多聚體。令人感 興趣地是例如當使用本發(fā)明的多肽診斷或者治療癌癥或者用于純化HER2的方法中時，獲 得更強于本發(fā)明的一種多肽與HER2的結合。在這種情況中，所述多肽的多聚體如二聚體、 三聚體或者四聚體可提供必要的親和性作用。所述多聚體可由適當數(shù)目的本發(fā)明的多肽組 成。在本發(fā)明的多聚體中連接的多肽"單位"可以通過使用已知的有機化學方法共價結合 連接，或者在多肽重組表達系統(tǒng)中表達為一或多個融合蛋白，或者以任何其它方式直接或 者通過接頭如氨基酸接頭結合。
[0059] 此外，本發(fā)明還涉及"異種"融合多肽，其包含在本發(fā)明范圍內，其中包含SEQID NO: 1-6所示任意序列的多肽組成第一個結構域或者第一部分，第二部分以及其它部分具 有除了結合HER2之外的其它功能。所述融合多臺的第二部分及其它部分可包含具有除了 HER2之外另一靶分子親和性的結合結構域。結果是融合多肽具有至少一個HER2結合結構 域以及具有所述其它靶分子親和性的至少一個結構域。這使得可以產(chǎn)生可用于不同生物技 術應用中的多特異性的試劑，如用作治療劑或者用作捕獲、檢測或者分離試劑。其中至少 一個多肽結構域包含SEQIDNO: 1-6所示任意序列的這種多特異性多肽多聚體的制備，可 以如上文針對一些HER2結合"單位"的多聚體所述實現(xiàn)。所述第二部分或者其它部分可以 是衍生自金黃色葡萄球菌蛋白質A的結構域的變體，如"Z結構域"或者"蛋白質Z"的變體 (NilssonBetal(1987)，supra),或者包含具有祀親和性的不相關的天然發(fā)生的或者重組 的蛋白質（或者其保留天然發(fā)生的或者重組蛋白質的結合能力的片段）。具有人血清白蛋 白親和性及可用作本發(fā)明多肽的融合配體這種結合蛋白的實例是鏈球菌菌株G148(Nygren P-Aetal(1988)MolRecogn1:69-74)的蛋白質G的白蛋白結合結構域之一，如GA1、GA2 或者GA3結構域。蛋白質G的GA3結構域也稱作ABD，即白蛋白結合結構域。包含SEQID NO: 1-6所示任意序列的HER2結合多肽與鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域之間的融合 多肽因此包含在本發(fā)明范圍內。當將本發(fā)明的多肽作為診斷劑、治療劑或者靶向劑給予人 時，其與結合血清白蛋白的部分的融合蛋白在體內半衰期方面可提供益處，這種融合蛋白 與分離的HER2結合部分相比其半衰期延長（這個原理已經(jīng)在例如W091/01743中描述）。 同樣，根據(jù)在W02005/097202中闡釋的原理，所述融合多肽可以呈現(xiàn)出比分離的HER2結合 部分低的免疫原性。
[0060] 本發(fā)明也涵蓋了產(chǎn)生融合多肽的其它可能性。因此，根據(jù)本發(fā)明第一方面的多肽 可以與第二部分或者其它部分共價結合，其除了靶向結合之外還呈現(xiàn)出其它功能，或者代 替靶向結合而呈現(xiàn)出其它功能。一個實例是包含SEQIDNO: 1-6所示任意序列的一或多個 多肽與作為報道或者效應部分的酶活性多肽之間的融合蛋白?？梢耘c包含SEQIDNO: 1-6 所示任一序列的多肽偶聯(lián)形成融合蛋白的報道酶的實例為本領域技術人員已知，包括如 β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、羧肽酶。本發(fā)明的融合多肽的第二部分及其 它部分的其它選項包括熒光多肽，如綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶及其變體。
[0061] 本發(fā)明的融合多肽的第二部分及其它部分的其它選項包括治療性應用部分。在治 療性應用中，其它分子也可以通過其它方式與本發(fā)明多肽共價或者非共價偶聯(lián)。非限制性 實例包括酶的ADEPT(抗體定向的酶前藥治療）應用，使用本發(fā)明的多肽定向效應酶（例 如羧肽酶）；蛋白質，用于補充免疫系統(tǒng)的效應細胞及其它成分；細胞因子，如IL-2、IL-12、 TNFa、IP-10 ;促凝因子，如組織因子、v〇nWillebrand因子；毒素，如蓖麻毒素A、假單胞菌 外毒素、calcheamicin、maytansinoid;毒性小分子，如auristatin類似物、阿霉素。
[0062] 關于上文對于摻入本發(fā)明的HER2結合多肽的融合蛋白的描述，應注意第一部分、 第二部分及其它部分的名稱是為了清晰起見而命名，用以一方面在HER2結合部分之間加 以區(qū)分，以及另一方面區(qū)分呈現(xiàn)其它功能的部分。這些名稱不是指融合蛋白的多肽鏈中不 同結構域的實際順序。因此，例如所述第一部分不限于在融合蛋白的N末端、中間或者在C 末端。
[0063] 本發(fā)明涵蓋了這樣的多肽，其中為上述HER2結合多肽提供標記基團，如至少一個 熒光團、生物素或者放射性同位素，例如用以檢測所述多肽。特別地，本發(fā)明涵蓋了放射性 標記的多肽，其由上述HER2結合多肽與放射性核素如放射性金屬的放射性螯合物組成。 [0064] 大多數(shù)放射性核素具有金屬性質，且金屬與蛋白質和肽中存在的元素典型不能形 成穩(wěn)定共價鍵。為此，使用螯合劑、多配位基配體（multidentateligand)，用放射性金屬標 記靶向蛋白質，與該金屬形成稱作螯合物的非共價化合物。在本發(fā)明多肽的一個實施方案 中，摻入放射性核素可以通過提供螯合環(huán)境使得該放射性核素可以與所述多肽配位、螯合 或者復合。
[0065] 本發(fā)明多肽的一個具體的實施方案中，其包含特征為N3S螯合劑的四配位基螯合 環(huán)境。術語N3S是指這個螯合劑的四個附著的基團由三個氮原子和一個硫原子形成。在N3S螯合劑中，N和S原子在空間上排列為提供合適的" 口袋"，用于放射性金屬的復合或者附 著。
[0066]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的HER2結合多肽可進一步包含與其N末端偶聯(lián)的 巰基乙酰基，其中通過N末端的前三個連續(xù)肽鍵的氮原子以及巰基乙酰基的SH基團一起提 供了由N3S螯合劑基序組成的螯合環(huán)境。
[0067]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的HER2結合多肽的N末端的前三個連續(xù)肽鍵可由 殘基ESE的氨基基團提供。
[0068] N3S螯合劑可以通過適當選擇多肽的氨基酸序列中的氨基酸殘基而提供。
[0069]例如，N3S螯合環(huán)境可以通過巰基乙?；c本發(fā)明多肽的N末端偶聯(lián)而提供。在 這個實施方案中，巰基乙?；峁┝吮匦璧腟原子，而肽主鏈中前三個N原子組成四配位基 螯合劑的三個N原子。優(yōu)選地，巰基乙?；c包含SEQIDNO:4所示氨基酸序列為大多數(shù) N-末端氨基酸序列的多肽偶聯(lián)，產(chǎn)生包含如下氨基酸序列的多肽：
[0070] IiiaESEKYAKEX1RNAYWEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLX2EAKKLNDSQ
[0071] 其中ma是巰基乙酰基，位置9的X1是11或者L，位置46的X2是S或者C。在特 別優(yōu)選的實施方案中，所述多肽具有如下序列：
[0072]maESEKYAKEMRNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
[0073] 其中ma是巰基乙酰基（SEQIDN0:7)。
[0074] 在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的HER2結合多肽可包含半胱氨酸殘基，所述半胱 氨酸殘基已經(jīng)存在于序列中或者作為額外的氨基酸殘基或者通過置換不參與HER2結合的 表面暴露的氨基酸殘基。優(yōu)選地，所述半胱氨酸殘基可位于SEQIDN0:5的C末端，或者所 述額外的半胱氨酸可位于SEQIDN0:l-4或者6-7任一序列的C末端，其中所述半胱氨酸 殘基任選隨后是一或多個其它氨基酸殘基，且由半胱氨酸和兩個前面的氨基酸殘基組成的 一段氨基酸殘基序列的三個連續(xù)肽鍵的氮原子以及半胱氨酸殘基的SH基團一起提供了由 N3S螯合劑基序組成的螯合環(huán)境。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的HER2結合多肽可包含由通過硫醇 基團與所述多肽偶聯(lián)的聚氨基聚羧酸酯螯合劑提供的螯合環(huán)境。更優(yōu)選地，所述聚氨基聚 羧酸酯螯合劑可以是1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸或者其衍生物。更優(yōu) 選地，所述聚氨基聚羧酸酯螯合劑可以是二乙烯三胺五乙酸或者其衍生物。
[0075] 在另一個實施方案中，三個N基團可以由多肽鏈中三個連續(xù)肽鍵的N原子提供，最 后一個是半胱氨酸殘基，其包含在其側鏈上的SH基團。半胱氨酸側鏈的S原子組成N3S螯 合劑中的S原子。換句話說，N3S螯合劑是三肽序列XXC形式，其中X是任何氨基酸殘基。 這種三肽序列可最初包含于本發(fā)明的多肽中或者作為一或多個額外的氨基酸添加而包含 于本發(fā)明的多肽中。優(yōu)選半胱氨酸殘基位于SEQIDN0:5的C末端或者一額外的半胱氨酸 直接位于SEQIDNO: 1-4或者6-7任一序列的C末端。所述半胱氨酸殘基也可以后接一或 多個其它氨基酸殘基。
[0076] 本發(fā)明的多肽包含特征為N3S螯合劑的四配位基螯合環(huán)境，由與N末端偶聯(lián)的 巰基乙?；腿齻€連續(xù)肽鍵的氮原子提供，或者由三個連續(xù)肽鍵的氮原子與在多肽C末 端的半胱氨酸殘基提供，所述多肽可用于提供由HER2結合多肽與放射性核素的放射性 螯合物組成的放射性標記的多肽，所述放射性核素適于醫(yī)學成像，例如是99mTc(Engfeldt etal(2007)Eur.J.Nucl.Med.Mol.Imaging34 (5) : 722-22；Engfeldtetal(2007)Eur. J.Nucl.Med.Mol.Imaging34(11) :1843-53),或者所述放射性核素適于治療，選自186Re和 188Re。在一些實施方案中，放射性核素通過螯合環(huán)境與HER2結合多肽復合。
[0077] 當本發(fā)明的多肽包含兩個、三個或者更多個XXC三肽時，優(yōu)選末端那個用于與放 射性核素復合。當所述多肽以此方式放射性標記時，其它XXC三肽優(yōu)選被保護。
[0078] 本發(fā)明的放射性標記的多肽的一個特別優(yōu)選的實施方案是具有如下氨基酸序列 的HER2結合多肽與99mTc的放射性螯合物：
[0079]maESEKYAKEMRNAYffEIALLPNLTNQQKRAFIRKLYDDPSQSSELLSEAKKLNDSQAPK
[0080] 其中ma是巰基乙?；⊿EQIDN0:7)。
[0081] 使用多肽在N末端的maESE-或者在C末端的-VDC螯合的99mTc的假定結構分別 是：
[0082]
【權利要求】
1. HER2結合多肽，其包含氨基酸序列 EX^NAYWEIA LLPNLTNQQK RAFIRKLYDD PSQSSELLX2E AKKLNDSQ, 其中位置2的乂1是11或者L，位置39的&是3或者C(SEQ ID N0:1)。
2. 權利要求1的HER2結合多肽，其包含氨基酸序列 YAKEXiRNAYff EIALLPNLTN QQKRAFIRKL YDDPSQSSEL LX2EAKKLNDS Q 其中位置5的乂1是11或者L，位置42的&是3或者C(SEQ ID N0:2)。
3. 權利要求1或2的HER2結合多肽，其包含氨基酸序列 AEAKYAKEXiR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLX2EAKK LNDSQ 其中位置9的乂1是11或者L，位置46的&是3或者C(SEQ ID N0:3)。
4. 權利要求1或2的HER2結合多肽，其包含氨基酸序列 ESEKYAKEXiR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLX2EAKK LNDSQ 其中位置9的Xi是1 I或者L，位置46的X2是S或者C(SEQ ID N0:4)。
5. 權利要求3的HER2結合多肽，包含氨基酸序列 AEAKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQ SSELLSEAKK LNDSQAPKVD C(SEQ ID NO:5)〇
6. 權利要求4的HER2結合多肽，其包含氨基酸序列 ESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLSEAKK LNDSQAPK (SEQ ID NO:6)〇
7. 權利要求1-6任一項的HER2結合多肽，其進一步包含與其N末端偶聯(lián)的巰基乙酰 基，其中通過N末端的前三個連續(xù)肽鍵的氮原子以及巰基乙酰基的SH基團一起提供了由 N3S螯合劑基序組成的螯合環(huán)境。
8. 權利要求7的HER2結合多肽，其中N末端的前三個連續(xù)肽鍵由殘基ESE的氨基基團 提供。
9. 權利要求6-8任一項的HER2結合多肽，其具有序列：maESEKYAKEMR NAYWEIALLP NLTNQQKRAF IRKLYDDPSQSSELLSEAKK LNDSQAPK 其中ma是巰基乙?；⊿EQ ID NO:7)。
10. 權利要求1-6任一項的HER2結合多肽，其包含半胱氨酸殘基，所述半胱氨酸殘基已 經(jīng)存在于序列中或者作為額外的氨基酸殘基或者通過置換不參與HER2結合的表面暴露的 氨基酸殘基。
11. 權利要求10的J1ER2結合多肽，其中所述半胱氨酸殘基位于SEQ ID N0:5的C末 端，或者所述額外的半胱氨酸位于SEQ ID N0:l-4或者6-7任一序列的C末端，其中所述半 胱氨酸殘基任選隨后是一或多個其它氨基酸殘基，且其中螯合環(huán)境由N3S螯合劑基序組成， 所述基序由半胱氨酸和兩個前面的氨基酸殘基組成的一段氨基酸殘基序列的三個連續(xù)肽 鍵的氮原子以及半胱氨酸殘基的SH基團一起提供。
12. 權利要求10的HER2結合多肽，其包含由通過硫醇基團與所述多肽偶聯(lián)的聚氨基聚 羧酸酯螯合劑提供的螯合環(huán)境。
13. 權利要求12的HER2結合多肽，其中所述聚氨基聚羧酸酯螯合劑是1，4, 7, 10-四氮 雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四乙酸或者其衍生物。
14. 權利要求13的HER2結合多肽，其中所述1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7, 10-四 乙酸衍生物是1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7-三-乙酸-10-馬來酰亞胺乙基乙酰胺。 15. HER2結合多肽，其由與1，4, 7, 10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4, 7-三-乙酸-10-馬來酰 亞胺乙基乙酰胺偶聯(lián)的SEQ ID NO:5組成。
16. 權利要求12的HER2結合多肽，其中所述聚氨基聚羧酸酯螯合劑是二乙烯三胺五乙 酸或者其衍生物。
17. 由權利要求7-9和11任一項的HER2結合多肽的放射螯合物（radiochelate)和放 射性核素組成的放射標記的多肽，其中所述放射性核素適于醫(yī)學成像、是"mTc，或者所述放 射性核素適于治療、選自186Re或者188Re。
18. 由權利要求9的HER2結合多肽的放射螯合物與99mTc組成的放射標記的多肽。
19. 由權利要求12-16任一項的HER2結合多肽的放射螯合物與放射性核素組成的放射 標記的多肽，其中所述放射性核素適于醫(yī)學成像，選自61Cu、64CU、 66Ga、67Ga、68Ga、n°mIn、 mIn、44Sc和86Y，或者所述放射性核素適于治療，選自225AC、 212Bi、213Bi、67Cu、166H〇、 mLu、212Pb、149Pm、153Sm、227Th和9°Y，其中所述放射性核素通過螯合環(huán)境與HER2結合多肽復合。
20. 由權利要求15的HER2結合多肽的放射螯合物與mIn組成的放射標記的多肽。
21. 由通過接頭分子與放射性核素連接的權利要求10的HER2結合多肽組成的放射標 記的多肽，所述放射性核素適于醫(yī)學成像和/或治療，選自211At、76Br、18F和碘同位素組成的 組。
22. 患有或者懷疑患有特征在于HER2過表達的癌癥的哺乳動物包括人對象的身體的 體內成像方法，包括如下步驟： -將權利要求17-21任一項的放射性標記的多肽給予哺乳動物對象身體內，其中所述 放射性核素適于成像； -在給予所述放射性標記的多肽1-72小時內，使用醫(yī)學成像設備獲得對象身體至少一 部分的一或多個圖像，所述圖像示出身體內所述放射性核素的存在。
23. 權利要求22的方法，包括在給予步驟之前制備權利要求17-21任一項的放射性標 記的多肽的步驟，其中所述放射性核素適于成像，所述步驟包括混合權利要求10-16任一 項的多肽與合適的放射性核素。
24. 權利要求22的方法，包括在給予步驟之前制備權利要求18的放射性標記的多肽的 步驟，所述步驟包括混合權利要求9的多肽與99mTc。
25. 權利要求22的方法，包括在給予步驟之前制備權利要求20的放射性標記的多肽的 步驟，所述步驟包括混合權利要求15的多肽與mIn。
26. 權利要求22-25任一項的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、 唾液腺癌、肺癌和食管癌（cancer in the esophagus)。
27. 權利要求17-21任一項的放射性標記的多肽，其中所述放射性核素適于成像，所述 放射性標記的多肽用于診斷。
28. 權利要求17-21任一項的放射性標記的多肽，其中所述放射性核素適于成像，所述 放射性標記的多肽用于診斷屬于特征在于HER2過表達頻繁出現(xiàn)的癌癥的組的癌癥。
29. 權利要求17-21任一項的放射性標記的多肽，其中所述放射性核素適于成像，用于 癌癥的診斷和/或分子學鑒定，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺 癌和食管癌。
30. 權利要求17-21任一項的放射性標記的多肽用于制備對哺乳動物包括人對象的身 體進行體內成像的診斷劑的應用，其中所述放射性核素適于成像。
31. 治療患有特征在于HER2過表達的癌癥的哺乳動物對象包括人的方法，所述方法包 括將治療有效量的權利要求17、19或者21的放射性標記的多肽給予對象身體內，其中所述 放射性核素適于治療。
32. 權利要求31的方法，包括在給予步驟之前制備權利要求17、19或者21的放射性標 記的多肽的步驟，其中所述放射性核素適于治療，包括混合權利要求10-16任一項的多肽 與合適的放射性核素。
33. 權利要求31或者32的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液 腺癌、肺癌和食管癌。
34. 權利要求17、19或者21的放射性標記的多肽，其中所述放射性核素適于治療，所述 放射性標記的多肽用于治療中。
35. 權利要求17、19或者21的放射性標記的多肽，其中所述放射性核素適于治療，所述 放射性標記的多肽用于治療特征在于HER2過表達的癌癥。
36. 權利要求17、19或者21的放射性標記的多肽，其中所述放射性核素適于治療，所述 放射性標記的多肽用于治療選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌以及食管癌 的癌癥。
37. 權利要求17、19或者21的放射性標記的多肽在制備治療特征在于HER2過表達的 癌癥的藥物中的應用，其中所述放射性核素適于治療。
38. 權利要求17、19或者21的放射性標記的多肽在制備治療癌癥的藥物中的應用，其 中所述放射性核素適于治療，所述癌癥選自乳腺癌、卵巢癌、胃癌、膀胱癌、唾液腺癌、肺癌 以及食管癌。
39. 編碼權利要求1-6或者10任一項的多肽的核酸。
40. 包含權利要求39的核酸的表達載體。
41. 包含權利要求39的表達載體的宿主細胞。
【文檔編號】C07K14/485GK104327179SQ201410529294
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2008年12月22日 優(yōu)先權日:2007年12月21日
【發(fā)明者】L·亞伯拉罕森, N·赫內, J·費爾德維施, C·倫德爾, V·托爾馬切夫 申請人:阿菲博迪公司