從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應(yīng)用；所述方法包括如下步驟：步驟一、調(diào)整楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液pH為4～10；步驟二、預(yù)冷pH調(diào)整后的楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液至預(yù)冷溫度為0～4℃；步驟三、在保持晶核存在的情況下對步驟二所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液進行緩慢降溫至結(jié)冰；步驟四、繼續(xù)緩慢降溫結(jié)冰，直至剩余液態(tài)發(fā)酵液的體積縮至設(shè)定值，停止降溫，收集未結(jié)冰的液體部分，即得楸靈素濃縮液。本發(fā)明將楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃縮到原體積的十分之一以下，同時保證90％以上的楸靈素收率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不僅可以更有效的保證原料中楸靈素的穩(wěn)定、確保較高的濃縮收率，而且不添加任何有機溶劑，保證濃縮液質(zhì)量。
【專利說明】從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]內(nèi)生真菌是指那些生活在于植物組織內(nèi)部并不會使植物產(chǎn)生明顯病害的真菌。內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的生物活性物質(zhì)，具有巨大的潛在價值，可以成為新型抗癌藥物的來源。本課題組已從胡桃楸里分離提取了一株具有很強抗癌活力的內(nèi)生真菌(CCTCC M 208102)，初步鑒定該菌為半知菌亞門，絲孢綱，叢梗孢目，木霉菌屬，其發(fā)酵提取液對肝癌細胞有很強的抑制作用。這是一個本實驗室獨有的全新菌種，其具有抗癌能力的發(fā)酵液制備方法已經(jīng)獲得專利保護(ZL200810041214.8)。由于發(fā)酵液中生物活性成分楸靈素的濃度較低，需要濃縮后才能進行有效的后期精細分離。但楸靈素對溫度敏感，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等操作造成楸靈素大量降解，反相吸附又由于楸靈素不能有效洗脫而造成濃縮收率底下。
[0003]針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明開發(fā)了一種對楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的高效濃縮方法，在保證楸靈素收率的情況下降發(fā)酵液濃縮10倍以上，能大幅度改善后續(xù)的楸靈素精細分離過程，是高效分離純化楸靈素的基礎(chǔ)和關(guān)鍵技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法及其應(yīng)用，是一種利用結(jié)冰從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，該方法不僅可以實現(xiàn)楸靈素的濃縮分離，也可用于其他物質(zhì)溶液的濃縮分離。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0006]本發(fā)明涉及一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，所述方法包括以下步驟:
[0007]步驟一、調(diào)整楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液pH為4?10 ;
[0008]步驟二、預(yù)冷pH調(diào)整后的楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液至預(yù)冷溫度為O?4°C ;
[0009]步驟三、在保持晶核存在的情況下對步驟二所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液進行緩慢降溫至結(jié)冰；
[0010]步驟四、繼續(xù)緩慢降溫結(jié)冰，直至未結(jié)冰發(fā)酵液體積與發(fā)酵液總體積比為設(shè)定值；停止降溫，收集未結(jié)冰的發(fā)酵液，即得楸靈素濃縮液。
[0011]優(yōu)選地，所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液按照專利ZL200810041214.8所述方法制備。
[0012]優(yōu)選地，步驟一中，所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的pH為8?10。
[0013]優(yōu)選地，步驟二中，所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的預(yù)冷溫度為1°C。
[0014]優(yōu)選地，步驟三中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于6°C ；
[0015]更優(yōu)選地，所述緩慢降溫中的傳熱溫差為2?6°C。
[0016]優(yōu)選地，步驟四中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于4°C ；
[0017]更優(yōu)選地，所述緩慢降溫中的傳熱溫差為1?4°C。
[0018]優(yōu)選地，步驟三、四中，所述緩慢降溫的方式包括持續(xù)加入晶核。
[0019]更優(yōu)選地,所述晶核包括0 °C碎冰。
[0020]優(yōu)選地，步驟三、四中，所述緩慢降溫的操作具體為:每次加入1毫升0°C的碎冰，當(dāng)碎冰完全融化后再次加入1毫升o°c的碎冰。
[0021]步驟四中，所述設(shè)定值可根據(jù)技術(shù)人員實際需求而定；具體為:技術(shù)人員可根據(jù)實驗需求，控制發(fā)酵液結(jié)冰量，從而獲得一定體積的未結(jié)冰發(fā)酵液的體積。
[0022]第二方面，本發(fā)明涉及一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法的應(yīng)用，所述應(yīng)用具體為，用于溶液中溶質(zhì)的濃縮、分離。
[0023]優(yōu)選地，所述溶液的溶劑包括水。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0025](1)本發(fā)明所述方法濃縮比較大，可實現(xiàn)發(fā)酵液10倍以上濃縮，并且所需時間短，無需持續(xù)加熱，操作過程安全；
[0026](2)所有操作都在低溫下操作，保證了楸靈素的穩(wěn)定；
[0027](3)本發(fā)明所述方法收率高，活性成分楸靈素的收率可以達到90%以上；
[0028](4)本發(fā)明采用物理方法，通過天然結(jié)冰機制完成，整個操作過程中不使用任何有機溶劑，有效防止有機溶劑污染，保留發(fā)酵液原有成分，保證楸靈素純度，并對操作人員無毒害。

【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0030]下述實施例中楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的制備包括如下步驟:
[0031]一、內(nèi)生真菌的分離:分裂內(nèi)生真菌并且采用菌絲尖端切割法進行純化；
[0032]二、誘導(dǎo)孢子產(chǎn)生:將長枝木霉CCTCC Μ 208102接種到PDA培養(yǎng)基上，將長有菌絲的PDA培養(yǎng)基切下一塊，放于CMX培養(yǎng)基上，室溫下培養(yǎng)，1到3天后有孢子長出；
[0033]三、液體發(fā)酵培養(yǎng):挑取孢子轉(zhuǎn)接到裝有PDA液體培養(yǎng)基中，26?28°C，180rpm搖床震蕩培養(yǎng)，1?8天后終止發(fā)酵，即得。
[0034]實施例1
[0035]本實施例涉及一種楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃縮分離楸靈素的方法，包括如下步驟:
[0036](1)調(diào)整發(fā)酵液pH為4 ;
[0037](2)發(fā)酵液預(yù)冷到1°C ；
[0038](3)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為4°C冷凍發(fā)酵液，每次加入1毫升0°C的碎冰，當(dāng)碎冰完全融化后再次加入1毫升o°c的碎冰，直到發(fā)酵液開始結(jié)冰為止；
[0039](4)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為2°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的十分之一，實現(xiàn)10倍濃縮，停止冷凍。
[0040]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為90% ；
[0041]本實施例方法在90%收率情況下實現(xiàn)了楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液10倍濃縮。
[0042]實施例2
[0043]本實施例涉及一種楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃縮分離楸靈素的方法，包括如下步驟:
[0044](I)調(diào)整發(fā)酵液pH為8 ;
[0045](2)發(fā)酵液預(yù)冷到4°C ；
[0046](3)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為6°C冷凍發(fā)酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，當(dāng)碎冰完全融化后再次加入I毫升0°C的碎冰，直到發(fā)酵液開始結(jié)冰為止。
[0047](4)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為4°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的十五分之一，實現(xiàn)15倍濃縮，停止冷凍。
[0048]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為93% ；
[0049]本實施例方法在93%收率情況下實現(xiàn)了楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液15倍濃縮。
[0050]實施例3
[0051]本實施例涉及一種楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃縮分離方法，包括如下步驟:
[0052](I)調(diào)整發(fā)酵液pH為10 ;
[0053](2)發(fā)酵液預(yù)冷到1°C ；
[0054](3)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為2°C冷凍發(fā)酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，當(dāng)碎冰完全融化后再次加入I毫升o°c的碎冰，直到發(fā)酵液開始結(jié)冰為止。
[0055](4)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為1°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的十五分之一，實現(xiàn)15倍濃縮，停止冷凍。
[0056]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為96% ；
[0057]本實施例方法在96%收率情況下實現(xiàn)了楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液15倍濃縮。
[0058]實施例4
[0059]本實施例涉及一種楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃縮分離方法，包括如下步驟:
[0060](I)調(diào)整發(fā)酵液pH為8 ;
[0061](2)發(fā)酵液預(yù)冷到1°C ；
[0062](3)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為2°C冷凍發(fā)酵液，每次加入I毫升0°C的碎冰，當(dāng)碎冰完全融化后再次加入I毫升o°c的碎冰，直到發(fā)酵液開始結(jié)冰為止。
[0063](4)設(shè)定發(fā)酵液和冷阱之間的傳熱溫差為1°C繼續(xù)冷凍發(fā)酵液，直到液態(tài)發(fā)酵液體積縮小為原來的二十分之一，實現(xiàn)20倍濃縮，停止冷凍。
[0064]去除冰塊，收集發(fā)酵液，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為96% ；
[0065]本實施例方法在96%收率情況下實現(xiàn)了楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液20倍濃縮。
[0066]實施例5
[0067]本實施例涉及一種楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液濃縮分離方法，技術(shù)方案與實施例4相同，不同之處在于，步驟(2)中預(yù)冷溫度為0°C。采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為92%。
[0068]對比例1
[0069]本對比例是實施例4的對比例，技術(shù)方案與實施例4相同，不同之處在于參數(shù)設(shè)置，即在步驟(1)中，發(fā)酵液的pH為3;采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為62%。
[0070]對比例2
[0071]本對比例是實施例4的對比例，技術(shù)方案與實施例4相同，不同之處在于參數(shù)設(shè)置，即在步驟(1)中，發(fā)酵液的pH為11 ;采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為80%。
[0072]對比例3
[0073]本對比例是實施例4的對比例，技術(shù)方案與實施例4相同，不同之處在于參數(shù)設(shè)置，即在步驟(2)中，發(fā)酵液的預(yù)冷溫度為_1°C;采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為64%。
[0074]對比例4
[0075]在60°C和0.07大氣壓真空條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮1升的內(nèi)生真菌發(fā)酵液到100毫升，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液顏色加深，采用HPLC方法測定發(fā)酵液中楸靈素濃度，計算楸靈素含收率為36% ;本對比例在36%收率情況下實現(xiàn)了楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液10倍濃縮。
[0076]綜上所述，本發(fā)明所述通過冷凍結(jié)冰過程濃縮分離楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的方法可以實現(xiàn)10倍以上的濃縮比，同時保證90%以上的活性成分楸靈素含量?？朔溯^高溫度的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮內(nèi)生真菌發(fā)酵液時發(fā)生的或形成成分楸靈素降解和收率下降問題，可以實現(xiàn)楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中楸靈素的高效濃縮，為后續(xù)精細分離奠定基礎(chǔ)，是楸靈素分離的關(guān)鍵技術(shù)之一。
[0077]以上對本發(fā)明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: 步驟一、調(diào)整楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液pH為4?10 ; 步驟二、預(yù)冷PH調(diào)整后的楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液至預(yù)冷溫度O?4°C ; 步驟三、在保持晶核存在的情況下對步驟二所得楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液進行緩慢降溫至結(jié)冰； 步驟四、繼續(xù)緩慢降溫結(jié)冰，直至未結(jié)冰發(fā)酵液體積與發(fā)酵液總體積比為設(shè)定值；停止降溫，收集未結(jié)冰的發(fā)酵液，即得楸靈素濃縮液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟一中，所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的pH為8?10。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟二中，所述楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液的預(yù)冷溫度為IV。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟三中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于6°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟四中，所述緩慢降溫中的傳熱溫差不大于4°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，步驟三、四中，所述緩慢降溫的方式包括持續(xù)加入晶核。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法，其特征在于，所述晶核包括O V碎冰。
8.一種從楸樹內(nèi)生真菌發(fā)酵液中濃縮分離楸靈素的方法的應(yīng)用，所述應(yīng)用具體為，用于溶液中溶質(zhì)的濃縮、分離。
【文檔編號】C07G99/00GK104387425SQ201410532262
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】苗志奇, 朱閃爍, 胡郁楠, 馮婷婷, 胡丹 申請人:上海交通大學(xué)