一種磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的制備方法。本發(fā)明公開一種制備磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過(guò)戊二醛將磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞卵；提取雞卵卵黃中的磺胺二甲基嘧啶抗體。利用本發(fā)明公開的方法制備磺胺二甲基嘧啶抗體具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)量高等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在磺胺二甲基嘧啶殘留檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種磺胺二甲基嘧啶抗體的制備方法；特別涉及一種磺胺二甲基嘧啶 卵黃抗體的制備方法，屬于抗體制備領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine，SMZ)為廣譜抗菌劑，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌 和革蘭氏陰性菌都具有抑制作用，臨床上主要用于治療各種溶血性鏈球菌、腦膜炎球菌、肺 炎球菌等感染所引發(fā)的呼吸道感染、腸道感染等細(xì)菌性疾病，因而在畜牧養(yǎng)殖中廣泛使用， 在動(dòng)物性食品中的殘留現(xiàn)象較為嚴(yán)重。由于磺胺二甲基嘧啶在體內(nèi)作用和代謝時(shí)間較長(zhǎng)， 通過(guò)任何途徑攝入的磺胺二甲基嘧啶都有可能在人體內(nèi)蓄積，超過(guò)一定濃度時(shí)，就會(huì)對(duì)人 體造成損害，長(zhǎng)期或者過(guò)量使用可造成泌尿系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等的損傷，甚至有致 癌的可能性。我國(guó)、歐盟等國(guó)家和機(jī)構(gòu)均規(guī)定動(dòng)物性食品中磺胺類藥物總量及磺胺二甲基 嘧啶等單個(gè)藥物的最高殘留限量為IOOy g/kg。
[0003] 卵黃抗體（Egg yolk antibody，IgY)是從免疫禽蛋卵黃中提取的特異性抗體，為 禽類所特有。卵黃抗體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，生產(chǎn)制備過(guò)程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)量高，適合大規(guī)模生產(chǎn)， 并且制備時(shí)無(wú)需對(duì)動(dòng)物進(jìn)行采血，便于采集，不會(huì)對(duì)動(dòng)物造成損傷，符合動(dòng)物福利要求。但 是目前卵黃抗體在獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較少。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的制備方法。
[0005] 本發(fā)明提供一種制備磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過(guò)戊二 醛將磺胺二甲基嘧啶與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞 的雞卵；提取雞卵卵黃中的磺胺二甲基嘧啶抗體。
[0006] 上述方法中，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
[0007] 上述任一所述的方法中，所述用免疫原免疫蛋雞的方法如下：將所述免疫原用等 體積的弗氏完全佐劑乳化后首次免疫蛋雞，再將首次免疫中所用的免疫原劑量減半，并用 等體積的弗氏不完全佐劑乳化后對(duì)首次免疫的蛋雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
[0008] 上述任一所述的方法中，所述免疫的方式為背部多點(diǎn)免疫。
[0009] 上述任一所述的方法中，所述免疫原用PBS溶液溶解；
[0010] 所述PBS溶液的濃度具體為0? 01mol/L。
[0011] 上述任一所述的方法中，所述首次免疫的所述免疫原的劑量為300-400ug ;
[0012] 所述加強(qiáng)免疫的次數(shù)為7-8次，具體為7次；
[0013] 所述加強(qiáng)免疫具體為在首次免疫后第15天、29天、43天、55天、79天、91天以及 121天各進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述提取雞卵卵黃中的磺胺二甲基嘧啶抗體的方法為飽 和硫酸銨沉淀法，步驟如下：
[0015] 1)將免疫蛋雞的雞卵中的卵黃與純水混勻，調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液I ;
[0016] 2)將溶液1離心，收集上清，加入pH 7. 2-7. 4的飽和（NH4)2SO4水溶液，使飽和 (NH4) 2S04水溶液的體積占總體積的30-40%，放置，得溶液2 ;
[0017] 3)將溶液2離心，取沉淀即得。
[0018] 上述任一所述的方法中，所述卵黃和所述純水的體積比為1:5-6,具體為1:6 ;
[0019] 所述放置的條件為4°C -KTC放置12-20h,具體為4°C放置12-20h ;
[0020] 所述飽和（NH4) 2S04水溶液占總體積的體積百分含量為40% ;
[0021] 所述調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 2所用的試劑為鹽酸。
[0022] 由上述任一所述的方法制備得到的磺胺二甲基嘧啶抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。
[0023] 上述磺胺二甲基嘧啶抗體在制備具有結(jié)合磺胺二甲基嘧啶的活性的產(chǎn)品中的應(yīng) 用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；
[0024] 或，
[0025] 上述磺胺二甲基嘧啶抗體在制備檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 本發(fā)明的有益效果在于，利用本發(fā)明的方法制備的磺胺二甲基嘧啶抗體產(chǎn)量高， 在整個(gè)試驗(yàn)周期（43周）內(nèi)收集卵黃抗體的量大約為20g。在免疫后前10周，抗體效價(jià)上 升速度較快，然后趨向穩(wěn)定，抗體效價(jià)可在一個(gè)較高的水平維持20周以上，并且抗體的最 高效價(jià)達(dá)1 :218。抗體靈敏度較高，隨著免疫的進(jìn)行，各抗體靈敏度不斷提高，所制標(biāo)準(zhǔn)曲線 的IC5tl逐漸下降，直至低于15ng/mL，并且最低可降至7. 74ng/mL?？贵w特異性良好，除與磺 胺甲基嘧啶存在12. 63%的交叉反應(yīng)率，與其它磺胺類藥物均不存在交叉反應(yīng)。
[0027] 利用本發(fā)明提供的方法制備磺胺二甲基嘧啶抗體具有制備過(guò)程簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)，產(chǎn)量 高等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，在磺胺二甲基嘧啶殘留檢測(cè)中具有良好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為磺胺二甲基嘧啶免疫原結(jié)構(gòu)圖。
[0029] 圖2為磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體效價(jià)變化趨勢(shì)圖。
[0030] 圖3為磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體靈敏度變化趨勢(shì)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0032] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為S6256-25G。
[0034] 磺胺二甲基嘧啶類似物標(biāo)準(zhǔn)品（磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺間二甲氧嘧啶、 磺胺對(duì)二甲氧嘧啶、磺胺吡啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺喹惡啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺氯 咕嗪、磺胺醋酰、磺胺多辛、氨苯磺胺、磺胺胍、磺胺苯批唑、磺胺乙氧咕嗪）均購(gòu)自Sigma公 司。
[0035] 弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購(gòu)自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為F-5881和 F-5506。
[0036] 蛋雞購(gòu)自北京市西苑農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。
[0037] Proclin 300生物防腐劑購(gòu)自Sigma公司。
[0038] 0. 05 M的碳酸鹽緩沖液（pH 9. 6)的組成成分及含量為：
[0039] Na2CO3 I. 59g
[0040] NaHCO3 2. 93g
[0041] 純水 1000mL。
[0042] PBST緩沖液（pH 7. 2)的組成成分及含量為：
[0043] Na2HPO4 ? 12H20 3. 12g
[0044] NaH2PO4 ? 2H20 I. 76g
[0045] Tween-20 500 U L
[0046] 蒸餾水 lOOOmL。
[0047] 封閉液的組成成分及含量為：
[0048]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備磺胺二甲基嘧啶卵黃抗體的方法，包括如下步驟：通過(guò)戊二醛將磺胺二甲 基嘧啶與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到免疫原；用免疫原免疫蛋雞，得到免疫蛋雞的雞卵；提取 雞卵卵黃中的磺胺二甲基嘧啶抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述載體蛋白為牛血清白蛋白。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述用免疫原免疫蛋雞的方法如下： 將所述免疫原用等體積的弗氏完全佐劑乳化后首次免疫蛋雞，再將首次免疫中所用的免疫 原劑量減半，并用等體積的弗氏不完全佐劑乳化后對(duì)首次免疫的蛋雞進(jìn)行加強(qiáng)免疫。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述免疫的方式為背部多點(diǎn)免疫。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述免疫原用PBS溶液溶解； 所述PBS溶液的濃度具體為0. Olmol/L。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述首次免疫的所述免疫原的劑 量為 300-400ug ; 所述加強(qiáng)免疫的次數(shù)為7-8次，具體為7次。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述提取雞卵卵黃中的磺胺二甲 基嘧啶抗體的方法為飽和硫酸銨沉淀法，步驟如下： 1) 將免疫蛋雞的雞卵中的卵黃與純水混勻，調(diào)節(jié)pH至5. 0-5. 2,放置，得溶液1 ; 2) 將溶液1離心，收集上清，加入pH7. 2-7. 4的飽和（NH4) 2S04水溶液，使飽和（NH4) 2S04 水溶液的體積占總體積的30-40%，放置，得溶液2 ; 3) 將溶液2離心，取沉淀即得。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述卵黃和所述純水的體積比為 1:5-6,具體為 1:6 ; 所述放置的條件為4°C -10°C放置12-20h，具體為4°C放置12-20h ; 所述飽和（NH4) 2S04水溶液占總體積的體積百分含量為40%。
9. 由權(quán)利要求1-8任一所述的方法制備得到的磺胺二甲基嘧啶抗體。
10. 權(quán)利要求9所述的磺胺二甲基嘧啶抗體在制備具有結(jié)合磺胺二甲基嘧啶的活性的 產(chǎn)品中的應(yīng)用； 或， 權(quán)利要求9所述的磺胺二甲基嘧啶抗體在制備檢測(cè)磺胺二甲基嘧啶的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/02GK104277108SQ201410535638
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】王戰(zhàn)輝, 沈建忠, 史為民, 張素霞, 江海洋, 溫凱, 盛雅潔, 張會(huì)艷 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)