一種葛根蛋白及其納米顆粒制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種葛根蛋白及其納米顆粒制備方法。經(jīng)過Tris-HCl緩沖液抽提、乙醇分級(jí)沉降、離子交換色譜分離，獲得了葛根蛋白，序列為DFVYDMCGNVLN。該葛根蛋白的水溶液在蛋白濃度為1mg/mL，pH6.05條件下，經(jīng)過100℃加熱60min后，制備得到葛根蛋白納米顆粒，葛根蛋白納米顆粒在體外均顯示了較低的細(xì)胞毒性。葛根蛋白納米顆粒凍干品流動(dòng)性佳，易于穩(wěn)定保存。本發(fā)明涉及的葛根蛋白來源于食品，安全性高。其納米顆粒的制備方法不涉及任何交聯(lián)劑，且其成品廣泛存在于各類使用葛根的湯劑中，為廣大人群服用多年，安全性高。本發(fā)明涉及的葛根蛋白納米顆粒有望應(yīng)用于多種藥物的體內(nèi)遞送。
【專利說明】 一種葛根蛋白及其納米顆粒制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】中的蛋白藥物新劑型和制劑技術(shù)，具體涉及到一種葛根蛋白及其納米顆粒制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]依據(jù)美國(guó)國(guó)家納米科技啟動(dòng)計(jì)劃(Nat1nalNanotechnology Initiative, NNI)中的定義，粒徑在1-100 nm尺度范圍內(nèi)的顆粒稱為納米顆粒。近幾十年來,納米顆粒被大量應(yīng)用于藥物運(yùn)輸體系的開發(fā)研究中，其中包括金屬聚集體、無機(jī)顆粒、超支化聚合物、聚合物膠束等各種不同材料制備的納米藥物載體。在各種納米藥物載體在逐漸展現(xiàn)靶向性和穿透性等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，也暴露出在生物相容性、細(xì)胞毒性和可降解性方面的缺點(diǎn)。經(jīng)過材料的納米化后，納米材料的物化性質(zhì)(光學(xué)、電學(xué)、表面活性等)均會(huì)呈現(xiàn)與原始材料截然不同的性質(zhì)。目前應(yīng)用與納米藥物載體研究的生物大分子(如血清白蛋白、絲蛋白等)皆沒有可以參照的天然研究模型，獲得納米顆粒的物化性質(zhì)及其相關(guān)生物安全性也需要長(zhǎng)期的觀測(cè)，才能得到全面評(píng)估。納米藥物載體發(fā)展帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn)引起了科學(xué)界廣泛的擔(dān)憂。
[0003]“湯”給生物大分子自組裝納米顆粒提供了豐富的研究模型:從食品到中藥，許多湯中都存在膠體體系，河蜆湯的膠體顆粒較為均一，平均粒徑為78 nm;苦瓜湯中的膠體顆粒組成較為復(fù)雜，平均粒徑分布范圍較大，其中間值為347 nm ;對(duì)幾十種中藥湯劑的膠體學(xué)調(diào)查也表明納米尺度的顆粒在中藥湯劑中的廣泛存在。這些在湯中存在的天然納米顆粒與蛋白質(zhì)，特別是非酶促糖基化的蛋白質(zhì)的自組裝行為密切相關(guān)。各種湯在人類歷史上飲用的時(shí)間之長(zhǎng)、受眾之廣，從風(fēng)險(xiǎn)管理的角度可以被認(rèn)為是安全的(Generally Recognizedas Safe，GRAS)。對(duì)湯的煎煮過程中自組裝形成的納米顆粒的研究可以解決現(xiàn)階段納米藥物載體研究缺乏研究原型和對(duì)安全性擔(dān)憂方面的問題。
[0004]葛根是一種我國(guó)人民長(zhǎng)期使用的食品原料和中藥藥材，在中藥湯劑，特別是中藥復(fù)方湯劑中具有非常重要的用途。葛根具有升陽(yáng)止瀉，解肌退熱，生津透疹的作用，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上具有降血糖、抗氧化自由基、降血壓、抗腫瘤、抗心律失常、降低血脂等效用，在方劑“葛根芩連湯”中，葛根作為“君藥”發(fā)揮方劑中主要藥效。但是到目前為止，有關(guān)葛根蛋白納米顆粒的研究國(guó)內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種葛根蛋白及其納米顆粒制備方法，對(duì)湯的煎煮過程中自組裝形成的納米顆粒的研究可以解決現(xiàn)階段納米藥物載體研究缺乏研究原型和對(duì)安全性擔(dān)憂方面的問題。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種葛根蛋白，氨基酸序列為DFVYDMCGNVLN。
[0007]所述蛋白的制備方法為經(jīng)過Tris-HCl緩沖液水相抽提，離子交換色譜Macro-Prep? High-Q,從葛根中藥飲片中分離得到一個(gè)電泳純的葛根蛋白。
[0008]一種葛根蛋白在制備葛根蛋白納米顆粒上的應(yīng)用。
[0009]所述納米顆粒的制備方法為將該葛根蛋白配制為I mg/mL的Tris-鹽酸鹽溶液，經(jīng)過60-100°C加熱I小時(shí)，經(jīng)過6000 g超濾5 min，即獲得葛根蛋白納米顆粒溶液；并應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)動(dòng)態(tài)光散射、多角度激光光散射和電子掃描顯微鏡對(duì)葛根蛋白納米顆粒進(jìn)行性質(zhì)研究。
[0010]葛根蛋白粗提液的制備:葛根飲片經(jīng)小型高速粉碎機(jī)粉碎。以質(zhì)量比1:5將葛根粉末和含0.1 mol/L Tris-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、pH7.2)混合均勻，置于4 °C，攪拌浸提12 h。用二層紗布過濾得到的葛根浸提液，棄去濾渣。將濾液在4 °C下經(jīng)10，000 g離心15 min，收集上清液。將上清液置于4°C下，邊攪拌邊緩慢預(yù)冷的無水乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到20%。靜置4 h，以10，000 g離心15 min，收集沉淀。沉淀用Tris-鹽酸緩沖液(0.02mol/L、pH8.1)充分溶解后以相同濃度Tris-鹽酸緩沖液透析過夜，得到的溶液即為葛根蛋白粗提液。
[0011]葛根蛋白的離子交換色譜分離:將100 mL葛根蛋白粗提液流加至以TriS-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、pH8.1)平衡Macro-Pi^p? High-Q色譜柱(B1-RAD 公司，柱體積:10*250mm),以同樣濃度Tris-鹽酸緩沖液繼續(xù)平衡3倍柱體積后，再以含O?0.3 mol/L NaCl的Tris-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、ρΗ8.I)線性梯度洗脫200 mL，最后用含0.3 mol/L NaCl的Tris-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、pH8.I)洗脫I個(gè)柱體積。流速0.8 mL/min,紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)為280 nm，經(jīng)過色譜分離的組分以自動(dòng)分布收集儀收集，后以SDS-PAGE進(jìn)行蛋白成分鑒定。
[0012]葛根蛋白的基本性質(zhì)表征:以MALD1-T0F質(zhì)譜測(cè)定該經(jīng)純化得到的葛根蛋白的分子量大小，以等點(diǎn)聚焦測(cè)定該葛根蛋白的等電點(diǎn)，以Edman degradat1n測(cè)定該葛根蛋白的N-端一級(jí)結(jié)構(gòu)序列。
[0013]葛根蛋白納米顆粒的制備:將該葛根蛋白配制為I mg/mL的Tris-鹽酸鹽溶液，經(jīng)過60-100°C加熱I小時(shí)，經(jīng)過6000 g超濾5 min，即可獲得葛根蛋白納米顆粒溶液。并應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)動(dòng)態(tài)光散射、多角度激光光散射和電子掃描顯微鏡對(duì)葛根蛋白納米顆粒進(jìn)行性質(zhì)研究，本發(fā)明制備得到的葛根蛋白納米顆粒平均粒徑為150±1.0 nm，表面電荷呈負(fù)性，zeta電位值為-23±0.5 mV。
[0014]以該葛根蛋白為載體制備的小檗堿-葛根蛋白納米顆粒，裝載率為44.2%，平均粒徑為150±1.0 nm。葛根蛋白納米顆粒在體外均顯示了較低的細(xì)胞毒性。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明涉及的葛根蛋白來源于食品，安全性高。其納米顆粒的制備方法不涉及任何交聯(lián)劑，且其成品廣泛存在于各類使用葛根的湯劑中，為廣大人群服用多年，安全性高。本發(fā)明涉及的葛根蛋白納米顆粒有望應(yīng)用于多種藥物的體內(nèi)遞送。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]附圖1葛根蛋白粗提液離子交換色譜。其中0D280為在280nm下的OD值，Time為時(shí)間，C(NaCl)為NaCl的濃度。
[0017]附圖2葛根蛋白SDS-PAGE電泳圖。其中M為Maker。
[0018]附圖3葛根蛋白納米顆粒粒徑分布圖。
[0019]附圖4葛根蛋白納米顆粒細(xì)胞毒性。其中L02為正常肝細(xì)胞，Hep_G2為人肝癌細(xì)胞。

【具體實(shí)施方式】
[0020]實(shí)施例1:葛根蛋白的提取
葛根飲片經(jīng)小型高速粉碎機(jī)粉碎。以質(zhì)量比1:5將葛根粉末和含0.1 mol/L Tris-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、pH7.2)混合均勻，置于4 °C，攪拌浸提12 h。用二層紗布過濾得到的葛根浸提液，棄去濾渣。將濾液在4 °C下經(jīng)10，000 g離心15 min，收集上清液。將上清液置于4°C下，邊攪拌邊緩慢預(yù)冷的無水乙醇，使乙醇終濃度達(dá)到20%。靜置4 h，以10，000g離心15 min,收集沉淀。沉淀用Tris-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、pH8.1)充分溶解后以相同濃度Tris-鹽酸緩沖液透析過夜，得到的溶液即為葛根蛋白粗提液。
[0021]將100 mL葛根蛋白粗提液流加至以Tris-鹽酸緩沖液(0.02 mol/L、ρΗ8.I)平衡Macro-Prep? High-Q色譜柱(B1-RAD公司，柱體積:10 X 250 mm),以同樣濃度Tris-鹽酸緩沖液繼續(xù)平衡3倍柱體積后，再以含O?0.3 mol/L NaCl的Tris-鹽酸緩沖液(0.02mol/L、pH8.1)線性梯度洗脫200 mL，最后用含0.3 mol/L NaCl的Tris-鹽酸緩沖液(0.02mol/L、pH8.1)洗脫I個(gè)柱體積。葛根蛋白粗提液High-Q色譜圖及各組分SDS-PAGE電泳圖見附圖1。
[0022]葛根蛋白基本生化性質(zhì)，其特征為分子量為20731.6 Da、等電點(diǎn)為6.34，N-端一級(jí)結(jié)構(gòu)序列為DFVYDMCGNVLN。
[0023]實(shí)施例2:葛根蛋白納米顆粒的制備
將該葛根蛋白配制為I mg/mL的Tris-鹽酸鹽溶液,經(jīng)過60-100°C加熱I小時(shí),經(jīng)過6000 g超濾5min后，即可獲得葛根蛋白納米顆粒。
[0024]用激光粒度儀測(cè)定其粒度及表面電位，測(cè)得其粒徑為150±1.0 nm，表面電位為-23±0.5 mV。葛根蛋白納米顆粒粒度分布圖見附圖3.實(shí)施例3:葛根蛋白納米顆粒的體外細(xì)胞毒性測(cè)定
采用了正常肝細(xì)胞(L-02)、人肝癌細(xì)胞(Hep-G2)、測(cè)定葛根蛋白納米顆粒的體外細(xì)胞毒性。細(xì)胞皆使用含20%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，于37°C，5% C02培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。測(cè)定時(shí)，細(xì)胞按4X 14個(gè)/mL接于96孔板，200 μ? /孔，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)24小時(shí)，棄去培養(yǎng)基，將已倍比稀釋后的樣品以每孔100 μ L量加入。同時(shí)加不含血清的培養(yǎng)基100KL，用做空白對(duì)照。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后以MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率，計(jì)算公式如下:
存活率=(A590加樣組-A590空白組)/A590空白組X 100%
葛根蛋白納米顆粒細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明，納米顆粒濃度低于89 ug/mL對(duì)并不會(huì)抑制并不會(huì)抑制細(xì)胞的增值，而對(duì)人正常肝細(xì)胞L-02的無毒性更明顯。葛根蛋白納米顆粒的體外細(xì)胞毒性見附圖4。
[0025]實(shí)施例5:葛根蛋白納米顆粒裝載小檗堿能力測(cè)定
精確配制10 mg/mL的小檗堿標(biāo)準(zhǔn)液(溶于色譜純的甲醇),取50 μ?標(biāo)準(zhǔn)液加入1.995mL葛根蛋白樣品中，使得小檗堿終濃度為0.25 mg/mL。取含有0.25 mg/mL小檗堿和不含小檗堿的葛根蛋白液體各1.6 mL,于100°C下保溫60 min。取含小檗堿(0.25 mg/mL)的葛根蛋白I mL,加入100 kDa超濾管25°C, 5000 g離心60 min。加入Tris-鹽酸(0.02 mol/L，pH8.1)1 mL，反復(fù)沖洗超濾管上部樣品池后，5000 g離心60min，待液體完全透過超濾膜后，測(cè)定小檗堿含量，即為游離小檗堿含量。藥物裝載率計(jì)算公式如下:
裝載率=(總AST含量-游離AST含量)/總AST含量經(jīng)測(cè)定，在上述實(shí)驗(yàn)條件下葛根蛋白對(duì)小檗堿裝載率為44.8%。
[0026]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種葛根蛋白，其特征在于:所述蛋白的氨基酸序列為DFVYDMCGNVLN。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葛根蛋白，其特征在于:所述蛋白的制備方法為經(jīng)過Tris-HCl緩沖液水相抽提,離子交換色譜Macro-Prep High-Q,從葛根中藥飲片中分離得到一個(gè)電泳純的葛根蛋白。
3.—種如權(quán)利要求1所述的一種葛根蛋白在制備葛根蛋白納米顆粒上的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種葛根蛋白的應(yīng)用，其特征在于:所述納米顆粒的制備方法為將該葛根蛋白配制為1 mg/mL的Tris-鹽酸鹽溶液，經(jīng)過60-100°C加熱1小時(shí)，經(jīng)過.6000 g超濾5 min，即獲得葛根蛋白納米顆粒溶液；并應(yīng)用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)動(dòng)態(tài)光散射、多角度激光光散射和電子掃描顯微鏡對(duì)葛根蛋白納米顆粒進(jìn)行性質(zhì)研究。
【文檔編號(hào)】C07K7/08GK104341487SQ201410541087
【公開日】2015年2月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】劉樹滔, 饒平凡, 柯李晶, 周建武, 林岱, 高觀禎 申請(qǐng)人:福州大學(xué)