固相片段法制備豬o型口蹄疫合成肽抗原2700的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，以樹脂為起始原料，依次連接具有9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸，制備保護(hù)的肽段片段，期間依次脫去Fmoc基團(tuán)，用縮合劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，以稀酸或弱酸切斷得到保護(hù)的肽段片段；將片段逐步連接上4-(4’-二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基)-苯氧甲基類樹脂，再與T輔助細(xì)胞表位連接；以濃酸或強(qiáng)酸切除保護(hù)基團(tuán)及樹脂，得到合成肽抗原2700粗肽；經(jīng)過離子交換樹脂以及切向流膜包系統(tǒng)純化、濃縮系統(tǒng)去除小分子及鹽后得到合成肽抗原2700。本發(fā)明的方法具有工藝穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短、原輔料來源方便、三廢少、生產(chǎn)成本低、收率高等特點(diǎn)。
【專利說明】固相片段法制備豬O型口蹄疫合成肽抗原2700的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到一種固相片段法制備豬〇型口蹄疫合成肽抗原2700的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬0型口蹄疫合成肽抗原2700結(jié)構(gòu)式如下：

【權(quán)利要求】
1. 一種固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特征在于，所述方法 包括如下步驟： 步驟1、將2-氯-3-苯甲基氯樹脂、三苯甲基醇樹脂或4-羥甲基-3-甲氧基丁酸樹脂 置于二氯甲烷、Ν，Ν-二甲基甲酰胺或Ν-甲基-2-吡咯烷酮中10?120min，充分溶脹，所得 溶脹樹脂溶液中樹脂的濃度為〇. 05?0. 2g/ml ; 步驟2、向步驟1所得溶脹樹脂溶液中加入9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸與二異丙基乙 基胺或9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸與縮合劑，于10?45°C反應(yīng)15?60min ;抽干，加入封 閉試劑反應(yīng)15?30min以封閉未反應(yīng)的基團(tuán)，以N，N-二甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷 酮洗滌樹脂數(shù)次，加入脫除試劑脫除9-芴甲氧羰基保護(hù)基保護(hù)的氨基酸上的9-芴甲氧羰 基保護(hù)基，洗滌后加入接肽試劑進(jìn)行接肽反應(yīng)，得肽樹脂鏈，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修 飾、羧基端連接樹脂如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5; 步驟3、將步驟2所得肽樹脂鏈加入到稀酸或弱酸溶液中，于10?45°C反應(yīng)60? 90min，加入2, 4, 6-三甲基吡啶或二異丙基乙基胺中和，過濾；濾液濃縮，加入醇類、醚類或 烷類析出溶劑析出保護(hù)肽固體，過濾收集濾餅真空干燥得到肽段，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰 基修飾的如下序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5; 步驟4、將4-(4'_二甲氧基-9-芴甲氧胺甲基）-苯氧甲基樹脂置于二氯甲烷、N，N-二 甲基甲酰胺或N-甲基-2-吡咯烷酮中30?60min，充分溶脹，溶脹樹脂溶液中樹脂的重量 體積濃度為〇· 05?0· 2g/ml ; 步驟5、在步驟4所得溶脹樹脂溶液中加入脫除試劑，于10?45°C反應(yīng)15?30min， 用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌數(shù)次，加入9-芴甲氧羰基保 護(hù)的的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙基胺的接肽試劑全溶物連接第一個(gè)氨基酸到樹脂上，于 10?45°C反應(yīng)0. 5?3. Oh，抽干，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮 洗滌樹脂數(shù)次，加入脫除試劑進(jìn)行脫除反應(yīng)脫除Fmoc保護(hù)基，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲 酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌后，加入9-芴甲氧羰基保護(hù)基保護(hù)的氨基酸、縮合劑、二異 丙基乙基胺的接肽試劑進(jìn)行接肽反應(yīng)得到肽樹脂，即氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾、羧基端 連接樹脂的SEQ ID No:2 ; 步驟6、將肽樹脂用溶脹劑充分溶脹后，加入脫除試劑脫除9-芴甲氧羰基，于10? 45°C反應(yīng)15?30min，用二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌數(shù)次， 再依次加入氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID N〇:3、縮合劑、二異丙基乙基胺的N-甲 基-2-吡咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No:4、縮合劑、二異丙基乙 基胺的N-甲基-2-批咯烷酮全溶物；氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID N〇:5、縮合劑、 二異丙基乙基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮全溶物；于10?45°C反應(yīng)0. 5?3. 0h，抽干，每加 入一個(gè)肽段都要用N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮洗滌樹脂數(shù)次，加入脫除試劑 脫除保護(hù)基，得如下全保護(hù)肽樹脂，即羧基末端連接樹脂的依次包括SEQ ID No:5、SEQ ID No: 4、SEQ ID No: 3 和 SEQ ID No: 2 的序列； 步驟7、向步驟6所得全保護(hù)肽樹脂中加入T輔助細(xì)胞表位、縮合劑的全溶物，于10? 45°C反應(yīng)0. 5?6. 0h，抽干，依次以二氯甲烷、Ν-甲基-2-吡咯烷酮、甲醇洗滌樹脂數(shù)次得 到全保護(hù)的抗原肽2700樹脂，即氨基端經(jīng)T輔助細(xì)胞表位修飾、羧基末端連接樹脂的依次 包括 SEQ ID No:5、SEQ ID No:4、SEQ ID No:3 和 SEQ ID No:2 的序列； 步驟8、將預(yù)冷的-10?10°C的切斷液加入到步驟7的抗原肽2700樹脂中切除所有保 護(hù)基團(tuán)及樹脂載體，于10?45°C反應(yīng)1?4h，過濾，濃縮濾液后加入甲基叔丁基醚析出沉 淀，用甲基叔丁基醚洗滌沉淀數(shù)次后干燥得到未環(huán)化的抗原肽2700粗品，即氨基端經(jīng)T輔 助細(xì)胞表位修飾的SEQ ID No:l ; 步驟9、將步驟8所得抗原肽2700粗品溶于二甲亞砜溶液，調(diào)節(jié)pH值至6. 0?8. 0的 條件下進(jìn)行完全環(huán)化，即得環(huán)化合成肽抗原2700。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其 特征在于，步驟2中，所述9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸的摩爾數(shù)為溶脹樹脂溶液中樹脂的 1?3倍； 所述二異丙基乙基胺的摩爾數(shù)為溶脹樹脂溶液中樹脂的1?7. 5倍； 所述的縮合劑包括2-(1H-苯并三唑-1-)-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、0-(7-氮 雜苯并三唑-H-1，1，3,3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、2-(1Η-苯并三唑-1-)-1, 1，3,3-四甲 基脲鎗四氟硼酸鹽、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎗六氟磷酸鹽中的一種；所述縮合劑的摩 爾量是溶脹樹脂溶液中樹脂的1?5倍； 所述封閉試劑為體積比為5:4:1的二氯甲烷、甲醇、二異丙基乙基胺混合溶液或9:1的 甲醇、二異丙基乙基胺混合溶液； 所述脫除試劑為六氫吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮的混合溶液，二者的體積比為1:2? 10 ;所述脫除試劑加入溶脹樹脂溶液后的濃度為5?15ml/g ;所述脫除試劑的反應(yīng)溫度為 0?45°C，時(shí)間為10?60min ; 優(yōu)選地，步驟2中，所述接肽試劑為9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙 基胺的N-甲基-2-吡咯烷酮或N，N-二甲基甲酰胺全溶物；所述接肽試劑與溶脹樹脂溶液 中樹脂的用量比為5?15ml/g ;所述接肽試劑接肽反應(yīng)溫度為10?45°C，時(shí)間為0. 5? 3h。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其 特征在于，步驟3中，所述稀酸或弱酸溶液包括三氟乙酸和二氯甲烷、三氟乙醇和二氯甲 烷、乙酸和甲醇和二氯甲烷中的一種組合；所述稀酸或弱酸溶液與肽樹脂的用量比為6? 20ml/g ； 所述中和稀酸或弱酸溶液用的2, 4, 6-三甲基吡啶或二異丙基乙基胺與稀酸或弱酸的 摩爾比為1?2. 5 ; 所述醇類包括甲醇、乙醇或異丙醇；所述醚類包括乙醚、甲基叔丁基醚或石油醚；所述 烷類包括正己烷或正庚烷。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其 特征在于，步驟5中，接肽試劑為9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸、縮合劑、二異丙基乙基胺的 N-甲基-2-吡咯烷酮或N，N-二甲基甲酰胺的全溶物；所述二異丙基乙基胺的摩爾數(shù)為溶 脹樹脂溶液中樹脂的2. 25?7. 5倍；所述接肽試劑與溶脹樹脂溶液中樹脂的用量比為5? 15ml/g ;接肽反應(yīng)溫度為10?45°C，時(shí)間為0. 5?3h ; 所述9-芴甲氧羰基保護(hù)的氨基酸的摩爾數(shù)為溶脹樹脂溶液中樹脂的1?3倍； 所述縮合劑包括2-(1H-苯并三唑-1-)-1，1，3, 3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、0-(7-氮雜 苯并三唑-H-1，1，3,3-四甲基脲鎗六氟磷酸鹽、2-(1Η-苯并三唑-1-)-1, 1，3,3-四甲基 脲鎗四氟硼酸鹽、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎗六氟磷酸鹽中的一種；所述縮合試劑的摩 爾量是溶脹樹脂溶液中樹脂的1?5倍； 所述脫除試劑包括六氫吡啶和N-甲基-2-吡咯烷酮的混合液，二者體積比為1:2? 10 ;所述脫除試劑與溶脹樹脂溶液中樹脂的用量比為5?15ml/g ;所述脫除試劑的反應(yīng)溫 度為0?45°C，時(shí)間為10?60min。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特 征在于，步驟6中，所述溶脹劑包括二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮中 的一種或幾種的混合物； 所述氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No: 3、氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No:4、氨基端經(jīng)9-芴甲氧羰基修飾的SEQ ID No: 5的摩爾數(shù)均為肽樹脂的1?1. 5倍； 所述縮合劑包括二異丙基碳二亞胺和1-羥基-1H苯并三唑、二異丙基碳二亞胺和 1-羥基-7-氮雜-1H-苯并三唑中的一個(gè)組合，或2- (1H-苯并三唑-1-) -1，1，3, 3-四甲基 脲鐵六氟磷酸鹽、〇-(7_氮雜苯并二唑-1-)-1, 1，3, 3-四甲基脲鐵六氟磷酸鹽、2-(1H-苯并 三唑-1-)-1，1，3, 3-四甲基脲鎗四氟硼酸鹽、苯并三唑-1-氧三吡咯烷膦鎗六氟磷酸鹽中 的一種；所述縮合劑的摩爾量是肽樹脂的1?5倍； 所述二異丙基乙基胺的摩爾數(shù)為肽樹脂的1. 5?7. 5倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特 征在于，步驟7中，所述T輔助細(xì)胞表位的摩爾數(shù)為肽樹脂的1. 0?2. 0倍； 所述縮合劑包括二異丙基碳二亞胺和1-羥基-1H苯并三唑、二異丙基碳二亞胺和 1-羥基-7-氮雜-1H-苯并三唑中的一個(gè)組合；所述縮合劑的摩爾量是樹脂的1?5倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法， 其特征在于，步驟8中，所述切斷液試劑為三氟乙酸：三異丙基硅烷：苯酚：水質(zhì)量比為 90:5:4:1的混合物；所述切斷液與抗原肽2700樹脂的用量比為5?50ml/g。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特 征在于，步驟9中，所述二甲亞砜水溶液中二甲亞砜的體積分?jǐn)?shù)為5?15% ; 所述調(diào)節(jié)pH用氨水、乙酸；所述氨水溶液的濃度為0. 5?5% ;所述乙酸溶液濃度為 0· 5 ?5%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相片段法制備豬0型口蹄疫合成肽抗原2700的方法，其特 征在于，所述方法還包括使用強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂對環(huán)化抗原肽2700進(jìn)行脫鹽處理；使 用正切向流超濾系統(tǒng)在適宜溫度下對環(huán)化多肽進(jìn)行超濾；高效液相測得合成肽抗原2700 的純度。
【文檔編號(hào)】C07K1/04GK104277097SQ201410568334
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年10月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月22日
【發(fā)明者】張震, 姬明放 申請人:申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）有限公司