一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液及提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白質組學研究領域，公開了一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液及提取方法。在研磨成粉末的油棕葉片中添加本發(fā)明所述的油棕專用提取液，進行油棕葉片的總蛋白質提取，經(jīng)過定量測定，提取得到的上清液量、蛋白質濃度均有明顯增加。每2g油棕葉片，可得3mg以上的總蛋白質；提取得到的蛋白質溶液顏色澄清，沒有或只有極少粘稠，純度大大提高，極大的方便后續(xù)研究的進行。
【專利說明】一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液及提取方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質組學研宄領域，特別是指一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液 及提取方法。

【背景技術】
[0002] 在蛋白質組學的研宄中，植物中蛋白質的提取是所有研宄的基礎，也直接影響后 續(xù)實驗的結果。目前，植物蛋白質的提取中常用的方法有三氯乙酸-丙酮沉淀（TCA)法、 E-TCA法和酚（Phe)抽法。以上方法雖然可以從不同方面除去植物組織中的多糖、酯類和酚 類等干擾蛋白質分析結果的雜質，但是在熱帶作物蛋白質的提取效果并不理想。中國發(fā)明 專利CN1908007A公開了一種植物總蛋白的提取方法及其專用提取液，提出了一種植物總 蛋白的提取方法，適用于大部分植物，尤其是鹽生植物中總蛋白質的提取。由于提取過程中 所需三種重要的化學成分四硼酸鈉（Borax)、聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP)和酚（Phenol)，所 以命名為BPP法。運用BPP法提取熱帶作物，如椰子、檳榔、香蕉、橡膠，木著等植物葉片總 蛋白質的提取，也取得了較好的效果。
[0003] 油棕（Elaeis guineensis)屬多年生單子葉植物，油棕的果肉、果仁中含油豐富， 在各種油料作物中，有"世界油王"之稱。利用BPP法提取其葉片總蛋白，提取過程中上清液 較為粘稠，用移液器吸取上清液極為困難，造成油棕葉片提取效率降低，總蛋白純度不高， 嚴重影響了后續(xù)實驗的進行。這種現(xiàn)象在夏天氣溫較高是尤為嚴重，往往導致總蛋白提取 失敗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提出了一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液及提取方法，可有效除去上清 液中的粘桐物質，提尚總蛋白提取廣率和純度。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：
[0006] 一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液，以所述油棕葉片總蛋白質專用提取液的總 體積記，包括以下質量濃度的組份：絡合劑35-40g/L，四硼酸鈉15-20g/L，還原劑20-40g/ L，蔗糖200-400g/L ;所述油棕總蛋白質的專用提取液PH值為4-7。
[0007] 進一步，所述絡合劑為ENTA或EDTA-2Na。
[0008] 進一步，所述還原劑為維生素 C和β -巰基乙醇的混合物。
[0009] 進一步，維生素C的質量濃度為5-10g/L，β -巰基乙醇的質量濃度為15-28g/L。
[0010] 進一步，所述油棕葉片總蛋白質的專用提取液PH值為4-5。
[0011] 進一步，所述PH值調(diào)節(jié)所用的試劑為鹽酸。
[0012] 一種油棕葉片總蛋白質的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片研磨成粉末后，加入 所述油棕葉片總蛋白質專用提取液，室溫漩渦震蕩4-6min，離心后去掉上清液，然后按照 BPP法進行總蛋白質的提取。
[0013] 進一步，以葉片質量記，所述油棕葉片總蛋白質專用提取液加入的量為4-6 (V/W) 倍量。
[0014] 進一步，所述離心過程中，溫度為3-5 °C、離心力10000-17000RCF，離心時間為 8_12min〇
[0015] 本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明所述的油棕專用提取液，在油棕葉片研磨粉碎后加入到粉末中，可以有效 除去上清液中的粘稠物，大大降低了實驗操作的難度，并且提取過程不受溫度的影響，夏 天或冬天都可進行實驗操作，操作簡便，為油棕葉片蛋白質的研宄提供了基礎。提取得到 的蛋白質溶液顏色澄清，沒有或只有極少量粘稠物質，純度大大提高。經(jīng)Bradford法對 提取的蛋白質溶液進行定量檢測，采用BPP法提取的油棕葉片的總蛋白，所得蛋白質提取 液濃度一般為5-7 yg · μΓ1，而采用本發(fā)明所述的提取方法，所得總蛋白濃度一般可達 8 yg · μΓ1以上，多數(shù)濃度在IOyg · μΡ左右。同時，經(jīng)檢測，通過添加本發(fā)明所述的油 棕專用提取液進行油棕葉片總蛋白的提取，總蛋白質提取產(chǎn)量大大提高。

【具體實施方式】
[0017] 下面將結合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然， 所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施 例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于 本發(fā)明保護的范圍。
[0018] 實施例1
[0019] 一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液，以所述油棕葉片總蛋白質專用提取液的總 體積記，包括以下質量濃度的組份：EDTA 35g/L，四硼酸鈉15g/L，維生素C 5g/L，β-巰基 乙醇15g/L，蔗糖200g/L ;加入濃鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4。
[0020] 一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片 研磨成粉末后，加入本發(fā)明所述的油棕葉片總蛋白質專用提取液；以葉片質量記，所述油棕 葉片總蛋白質專用提取液加入的量為4(V/W)倍量，室溫漩渦震蕩4min，離心后去掉上清 液，然后按照BPP法進行葉片總蛋白質的提取。具體操作步驟如下：
[0021] (1)取油棕葉片2g，液氮研磨成粉末，轉入50mL離心管；
[0022] (2)加入8mL油棕葉片總蛋白質專用提取液，室溫漩渦震蕩4min，在溫度3°C、離心 力10000RCF條件下離心8min后去上清，重復此步驟1次；
[0023] (3)加IOmL預冷提取液、ImL 10% SDS，室溫漩渦震蕩5min ;
[0024] (4)加等體積Tris平衡酚（pH7. 8)，室溫漩渦震蕩IOmin ;
[0025] (5) 4°C、17000RCF、離心15min，上層酷相轉至IOmL離心管；
[0026] (6)加等體積預冷提取液，室溫游禍震蕩IOmin ;
[0027] (7)4°C、17000RCF、離心15min，上層酚相轉至新管；
[0028] (8)加 5倍體積含過飽和硫酸銨的預冷甲醇，混勾，置-20°C沉淀蛋白質6h以上或 過夜。
[0029] (9)離心（4°C、17000RCF、10min)后去上清，蛋白質沉淀用預冷甲醇溶液重懸2 次；
[0030] (10)離心（4°C、17000RCF、IOmin)后去上清，用預冷丙酮溶液重懸2次；
[0031] (11)離心（4°C、17000RCF、10min)，沉淀風干后加適量裂解液，室溫溶解2h以上。
[0032] (12)離心（4°C、17000RCF、30min)，吸取上清至 I. 5mL 離心管備用。
[0033] 實施例2
[0034] -種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，以所述油棕葉片總蛋白質專用提取液 的總體積記，包括以下質量濃度的組份：EDTA-2Na 37g/L，四硼酸鈉18g/L，維生素C 8g/L， β -巰基乙醇22g/L，蔗糖300g/L ;加入醋酸調(diào)節(jié)PH值至5. 5。
[0035] 一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片 研磨成粉末后，加入本發(fā)明所述的油棕葉片總蛋白質專用提取液；以葉片質量記，所述油棕 葉片總蛋白質專用提取液加入的量為5(V/W)倍量，室溫漩渦震蕩5min，離心后去掉上清 液，然后按照BPP法進行葉片總蛋白質的提取。
[0036] 其具體操作步驟與實施例1不同之處在于，步驟（2)油棕葉片總蛋白質專用提取 液的加入量為10mL，室溫漩渦震蕩5min ;在溫度4°C、離心力13000RCF條件下離心IOmin后 去除上清液，其余操作與實施例1相同。
[0037] 實施例3
[0038] 一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，以所述油棕葉片總蛋白質專用提取 液的總體積記，包括以下質量濃度的組份：EDTA 40g/L，四硼酸鈉20g/L，維生素C 10g/L， β -巰基乙醇28g/L，蔗糖400g/L ;加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至7。
[0039] 一種油棕葉片總蛋白質的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片研磨成粉末后，加入 本發(fā)明所述的油棕葉片總蛋白質專用提取液；以葉片質量記，所述油棕葉片總蛋白質專用 提取液加入的量為8 (V/W)倍量，室溫漩渦震蕩6min，離心后去掉上清液，然后按照BPP法進 行葉片總蛋白質的提取。
[0040] 其具體操作步驟與實施例1不同之處在于，步驟（2)加入16mL油棕葉片總蛋白質 專用提取液，室溫漩渦震蕩5min，在溫度5°C、離心力17000RCF條件下離心12min后去除上 清液，重復此步驟1次；其余操作與實施例1相同。
[0041] 實施例4
[0042] 一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，以所述油棕葉片總蛋白質專用提取 液的總體積記，包括以下質量濃度的組份：EDTA 35g/L，四硼酸鈉18g/L，維生素C 5g/L， β -巰基乙醇28g/L，蔗糖300g/L ;加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至5。
[0043] 一種油棕葉片總蛋白質的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片研磨成粉末后，加入 本發(fā)明所述的油棕葉片總蛋白質專用提取液；以葉片質量記，所述油棕葉片總蛋白質專用 提取液加入的量為6 (V/W)倍量，室溫漩渦震蕩6min，離心后去掉上清液，然后按照BPP法進 行葉片總蛋白質的提取。
[0044] 其具體操作步驟與實施例1不同之處在于，步驟（2)加入12mL油棕葉片總蛋白質 專用提取液，室溫漩渦震蕩6min，在溫度5°C、離心力10000RCF條件下離心12min后去除上 清液，重復此步驟1次；其余操作與實施例1相同。
[0045] 實施例5
[0046] 一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，以所述油棕葉片總蛋白質專用提取 液的總體積記，包括以下質量濃度的組份：EDTA 37g/L，四硼酸鈉19g/L，維生素C 10g/L， β -巰基乙醇22g/L，蔗糖200g/L ;加入鹽酸調(diào)節(jié)PH值至4. 5。
[0047] -種油棕葉片總蛋白質的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片研磨成粉末后，加入 本發(fā)明所述的油棕葉片總蛋白質專用提取液；以葉片質量記，所述油棕葉片總蛋白質專用 提取液加入的量為5 (V/W)倍量，室溫漩渦震蕩5min，離心后去掉上清液，然后按照BPP法進 行葉片總蛋白質的提取。
[0048] 其具體操作步驟與實施例1不同之處在于，步驟（2)加入IOmL油棕葉片總蛋白質 專用提取液，室溫漩渦震蕩5min，在溫度3°C、離心力17000RCF條件下離心IOmin后去除上 清液；其余操作與實施例1相同。
[0049] 以上實施例中，如果上清液中粘稠物質較多，可將步驟（2)重復1-2次。本發(fā)明所 述的油棕葉片總蛋白的專用提取液及提取方法效果考察
[0050] 分別取2g油棕葉片，分別按照本發(fā)明三個實施例的提取方法和常規(guī)的BPP法提取 葉片總蛋白質，每個處理重復10次操作。對提取得到蛋白質提取液采用Bradford法進行 定量測定，計算其平均值，結果如表1所示。
[0051] 表1本發(fā)明所述的提取方法提取效果比較
[0052]

【權利要求】
1. 一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液，其特征在于，以所述油棕葉片總蛋白質專用 提取液的總體積記，包括以下質量濃度的組分：絡合劑35-40g/L，四硼酸鈉15-20g/L，還原 劑20-40g/L，蔗糖200-400g/L ;所述油棕總蛋白質的專用提取液PH值為4-7。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，其特征在于：所 述絡合劑為ENTA或EDTA-2Na。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，其特征在于：所 述還原劑為維生素 C和0-巰基乙醇的混合物。
4. 根據(jù)權利要求3所述的一種油棕葉片總蛋白質提取的專用提取液，其特征在于：維 生素 C的質量濃度為5-10g/L，0 -巰基乙醇的質量濃度為15-28g/L。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液，其特征在于：所述油 棕總蛋白質的專用提取液PH值為4-5。
6. 根據(jù)權利要求1所述的一種油棕葉片總蛋白質的專用提取液，其特征在于：調(diào)節(jié)PH 值所用的試劑為鹽酸。
7. -種油棕葉片總蛋白質的提取方法，包括以下步驟：油棕葉片研磨成粉末后，加入 權利要求1-6任一權利要求所述油棕葉片總蛋白質專用提取液，室溫漩渦震蕩4-6min，離 心后去掉上清液，然后按照BPP法進行葉片總蛋白質的提取。
8. 根據(jù)權利要求7所述的一種油棕總蛋白質的提取方法，其特征在于：所述油棕葉片 總蛋白質專用提取液的加入的體積量為油棕葉片質量4-6倍（V/W)。
9. 根據(jù)權利要求7所述的一種油棕葉片總蛋白質提取方法，其特征在于：所述離心過 程中，溫度為3-5°C、離心力10000-17000RCF，離心時間為8-12min。
【文檔編號】C07K1/14GK104478987SQ201410657130
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權日:2014年11月18日
【發(fā)明者】楊耀東, 吳翼, 肖勇, 李靜, 周立霞, 夏薇, 沈雁 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院椰子研究所