樹突狀細(xì)胞靶向肽及編碼基因及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種樹突狀細(xì)胞靶向肽及編碼基因及應(yīng)用，樹突狀細(xì)胞靶向肽，命名為NP，是序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。本發(fā)明以樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞，對噬菌體隨機肽庫進行消減篩選，從眾多短肽中篩選出一個高效靶向樹突狀細(xì)胞的靶向肽。本發(fā)明以樹突狀細(xì)胞靶向肽與腫瘤相關(guān)抗原MUC1的融合，顯著提高了樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力和對大多數(shù)腫瘤如宮頸癌，乳腺癌的等的殺傷能力。在大多數(shù)癌癥的診療中有具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】樹突狀細(xì)胞靶向肽及編碼基因及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞靶向肽、編碼基因、包含樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽、重組 表達載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是全球?qū)е滤劳龅闹饕蛑唬?007年全球死于癌癥的人數(shù)達到790萬， 約占所有死亡人數(shù)的13%，發(fā)病率呈逐年上升趨勢。其治療主要以手術(shù)、化療和放療為主， 但放化療副作用大，療效都不是很理想。目前，免疫細(xì)胞治療正在成為一種新的癌癥治療手 段。
[0003] 隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的飛速發(fā)展，對腫瘤的研究日益深入，特別 是近十幾年來，多種與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的腫瘤抗原被發(fā)現(xiàn)，這些抗原可以作為癌 癥免疫治療的靶標(biāo)。腫瘤特異性的抗原可以通過樹突狀細(xì)胞遞呈給T細(xì)胞，啟動T細(xì)胞的 特異性殺傷腫瘤的能力。（Banchereau，J.，andSteinman，R.M.(l998)Dendriticcells andthecontrolofimmunity.Nature392, 245 - 2522.Palucka,K. ,Banchereau,J. ,and Mellman,I. (2010)Designingvaccinesbasedonbiologyofhumandendritic cellsubsets.Immunity33, 464 - 478)。如何讓抗原準(zhǔn)確高效的到達樹突狀細(xì)胞，是腫瘤免 疫治療的關(guān)鍵。噬菌體展示技術(shù)為我們提供了一種篩選樹突狀細(xì)胞靶向分子的方法。
[0004] 噬菌體展示技術(shù)，在1985年首次被Smith闡述，原理是通過將外源蛋白或肽段 的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使 該外源分子呈現(xiàn)于噬菌體表面。該技術(shù)的主要特點是將特定分子的基因型和表型統(tǒng)一在 同一噬菌體顆粒內(nèi)，即在噬菌體表面表達特定蛋白，而在噬菌體核心DNA中含有該蛋白 的結(jié)構(gòu)基因，通過表型篩選就可以獲得其編碼基因，因此噬菌體展示技術(shù)是一種強有 力的基因表達篩選技術(shù)。噬菌體展不膚庫技術(shù)具有_庫容、_效方便及靈活的篩選技術(shù) 等特點，近幾年已經(jīng)廣泛用于抗腫瘤疫苗，藥物，及腫瘤診斷標(biāo)志物的篩選研發(fā)（Johnson DH.Targetedtherapyinnon-smallcelllungcancer,mythandreality[J].lung Cancer, 2003, 41(suppl1):S3-S8)
[0005]MUC1又稱附膜蛋白，是由mucl基因表達的一種高分子量，高糖基化蛋白，它 一種是跨膜分子。它在上皮更新與分化，維持上皮完整性和癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等方面都起到 重要的作用(MoniauxN,EscandeF,PorchetN,etalStructuralorganizationand classificationofthehumanmucingenes〔J〕FrontBiosci,2001 ;6 (1):D1192 206)。 正常情況下，MUC1可在多種組織、器官中的上皮細(xì)胞如消化道、呼吸道、乳腺、胰腺、生殖道 中表達，主要分布于腺細(xì)胞頂膜或以分泌形式存在于腺腔內(nèi)，不被免疫系統(tǒng)識別。而在惡性 腫瘤細(xì)胞中，乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種癌組織中，MUC1表達量可達正常時的10倍以上， 且結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使MUC1的核心蛋白暴露出新的蛋白表位或新的糖抗原，分布于整個癌細(xì) 胞表面，作為腫瘤特異的抗原，成為免疫細(xì)胞攻擊祀點（MilesDW，TaylorPapadimitriou JTherapeuticaspectsofpolymorphicepithelialmucininadenocarcinoma〔J〕 PharmacolTher,1999 ；82 (1):97 106),


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的提供一種高效靶向的樹突狀細(xì)胞靶向肽。
[0007] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種樹突狀細(xì)胞靶向肽的編碼基因。
[0008] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽。
[0009] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種包含編碼樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因的重組表達 載體。
[0010] 本發(fā)明的第五個目的是提供一種包含編碼樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞系。
[0011] 本發(fā)明的第六個目的是提供一種樹突狀細(xì)胞靶向肽的編碼基因的重組菌。
[0012] 本發(fā)明的第七個目的是提供一種樹突狀細(xì)胞靶向肽在預(yù)防和治療癌癥藥物中的 應(yīng)用。
[0013] 一種樹突狀細(xì)胞靶向肽，命名為NP，是序列表中SEQIDNO. 1所述的氨基酸序列。
[0014] 編碼上述樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因，是SEQIDN0. 2所述的核苷酸序列。
[0015] 包含上述樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽，融合肽是以Cys為linker將樹突狀細(xì)胞靶 向肽序列與MUCI腫瘤抗原多肽序列鏈接在一起，所述融合肽如SEQIDN0. 3所示。
[0016] 包含編碼樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因的重組表達載體，所述重組表達載體為重組噬 菌體。
[0017] 包含編碼樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，所述細(xì)胞系為導(dǎo)入重組表達 載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0018] 含有樹突狀細(xì)胞靶向肽的編碼基因的重組菌，所述重組菌為導(dǎo)入重組表達載體的 重組菌。
[0019] 上述一種樹突狀細(xì)胞靶向肽在制備預(yù)防和治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0021] (1)靶向性和DC細(xì)胞富集能力：篩選出的樹突狀細(xì)胞靶向肽可以與樹突狀細(xì)胞靶 向結(jié)合，將腫瘤特異性抗原（例如MUC1)與靶向肽融合之后，靶向肽就可以精確的將腫瘤特 異性抗原定位并富集到DC細(xì)胞表面。
[0022] (2)高效抗原遞呈能力：本發(fā)明中采用特殊的柔性Linker設(shè)計將靶向肽與腫瘤抗 原融合在一起，這樣使腫瘤抗原的表達相對獨立，從而使DC細(xì)胞能高效遞呈腫瘤抗原，進 而提_對腫瘤的殺傷能力。
[0023] (3)安全性：本發(fā)明中篩選的樹突狀細(xì)胞靶向肽是一個七肽，與病毒載體相比較， 不包含對細(xì)胞有害的轉(zhuǎn)染試劑和病毒成分，不存在外源基因污染的問題，不會引起不良免 疫反應(yīng)以及不存在致突變風(fēng)險。因此，與病毒載體靶向技術(shù)相比，本發(fā)明中的靶向技術(shù)安全 性極高。
[0024] (4)本發(fā)明以樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞，對噬菌體隨機肽庫進行消減篩選，從眾多短肽 中篩選出一個高效靶向樹突狀細(xì)胞的靶向肽。本發(fā)明以樹突狀細(xì)胞靶向肽與腫瘤相關(guān)抗原 MUC1的融合，顯著提高了樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力和對大多數(shù)腫瘤如宮頸癌，乳腺癌的 等的殺傷能力。在大多數(shù)癌癥的診療中有具有廣泛的應(yīng)用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1樹突狀細(xì)胞靶向的噬菌體篩選。
[0026] 圖2噬菌體克隆結(jié)合樹突狀細(xì)胞的能力。
[0027] 圖3靶向融合肽結(jié)合樹突狀細(xì)胞的能力。
[0028] 圖4激光共聚焦顯微鏡觀察DC細(xì)胞吸收能力。
[0029] 圖PH-TdR摻入實驗。
[0030] 圖6CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）體外殺傷MUC1陽性腫瘤實驗。

【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明通過噬菌體展示技術(shù)從隨機七肽庫中篩選得到了一種可以高效靶向樹突 狀細(xì)胞的多肽，并與MUC1腫瘤特異性多肽抗原融合，利用多肽固相合成方法合成了 "樹突 狀細(xì)胞靶向融合肽"。并對其樹突狀細(xì)胞靶向能力、樹突狀細(xì)胞致敏能力和激活CTL(細(xì)胞 毒性T淋巴細(xì)胞）細(xì)胞腫瘤殺傷能力進行了評價。
[0032] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)的闡述。
[0033] 實施例1
[0034] 以樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞篩選獲得本發(fā)明的樹突狀細(xì)胞靶向肽，本發(fā)明利用商品化 的噬菌體展示七肽庫（NewEnglandBioLabs公司），來篩選獲得祀向樹突狀細(xì)胞的革巴向 肽：
[0035] 1.以樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞進行篩選：
[0036] (1)獲取樹突狀細(xì)胞：
[0037] 從健康人的外周血中分離單個核細(xì)胞（peripheralblood mononuclearcell，PBMC)，經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取成熟樹突狀細(xì)胞，方法：
[0038] ①取健康人新鮮外周血，加入淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)密度梯度離心法分離，獲得單 個核細(xì)胞。
[0039] @在含10%胎牛血清的1?^1-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng).置371：、5%〇) 2培養(yǎng)箱內(nèi)靜 直培養(yǎng)2h后除去懸浮細(xì)胞。
[0040] ③培養(yǎng)液中加入rhGM-CSF和rhIL-4繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞5d，然后加入TNF-a促 進其分化成熟。
[0041] ④倒置顯微鏡下觀察樹突狀細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀（flowcytometer,FCM)對其進 行表型鑒定。
[0042] ⑤在顯微鏡到觀察樹突狀細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，表面有大量的毛刺狀突起；越成熟的 樹突狀細(xì)胞表面⑶83、⑶80分子表達明顯增高。
[0043] (2)以樹突狀細(xì)胞為固相篩選目標(biāo)來篩選：
[0044] 噬菌體隨機七肽庫的體外消減篩選，樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞，進行3輪消減篩選，并 逐漸增加篩選強度。所得噬菌體經(jīng)擴增、滴定。具體步驟如下：選擇生長狀態(tài)良好的樹突狀 細(xì)胞一瓶（細(xì)胞總數(shù)約5X106個）；傾去原有的培養(yǎng)基，然后用洗脫液PBST充分洗脫3遍， 去除雜蛋白的的干擾；加入用PBST稀釋到10n/ml的噬菌體隨機七肽庫約lml后繼續(xù)孵育 lh。用PBST充分洗脫3遍，去除未結(jié)合的噬菌體；再次用PBST強力洗脫3遍，去除特異性 結(jié)合但結(jié)合不緊密的噬菌體；后采用細(xì)胞刮刀收集貼壁的細(xì)胞以及結(jié)合在上面的候選噬菌 體；收集物加入預(yù)先準(zhǔn)備好的感受態(tài)細(xì)菌（大腸桿菌）中進行擴增，然后采用常規(guī)的純化方 法擴增后進行第三輪的篩選；將擴增好的洗脫物重復(fù)淘洗3次，獲得與樹突狀細(xì)胞緊密特 異性結(jié)合的噬菌體克隆。實驗結(jié)果如圖1所示。
[0045] 2?陽性噬菌體克隆的ELISA鑒定：
[0046] 噬菌體肽庫經(jīng)過3輪減性篩選后，隨機挑選10個噬菌體的單克隆，用常規(guī)ELISA 法來鑒定噬菌體克隆對樹突狀細(xì)胞的親和力。具體步驟如下：將樹突狀細(xì)胞按IX105/孔 的密度接種于96孔板上，放到37°C、5%C02培養(yǎng)箱中；對細(xì)胞進行營養(yǎng)饑餓處理lh;用4% 的多聚甲醛固定20min，0. 1%的TritonX-100處理lOmin;用3%的BSA封閉lh，加入一定 濃度的噬菌體（大于1〇12) 37°C孵育2h;用PBST洗3次，加入抗體HRP-antiM13抗體，37°C 孵育lh;PBST洗5遍，之后每孔加入lOOul的TMB顯色作用2min;用150ul，2M的H2S04終 止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液的A450值。隨機挑取噬菌體原庫斑作為對照，以排除非特異 性吸附的隱性噬菌體克隆對實驗結(jié)果的影響，結(jié)果見圖2。
[0047] 由圖2可知，其中8號噬菌體單克隆對樹突狀細(xì)胞的親合力最強，0D值為 (1.832±0. 008)，8號高于對照（空心柱為對照組）同時高于其他，對照為原庫隨機噬菌體 克隆，0D值為（0? 664±0. 02)P< 0? 05,n= 8。
[0048] 3.陽性噬菌體克隆的測序及靶向樹突狀細(xì)胞的靶向肽的合成：
[0049] 我們將篩選所得的8號噬菌體克隆進行測序，根據(jù)測序結(jié)果推出氨基酸序列為： GinTrpTyrLeuProLysLeu，用SEQIDNO. 1 所不。
[0050] 編碼上述樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因，序列為：CAAUAGUACUUGCCAAAGUUG，用SEQID NO. 2所示。
[0051] 實施例2:包含樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽的獲得
[0052] 1 ?包含樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽（簡稱NP-MUC1)合成：
[0053] 將實施例1篩選到的樹突狀細(xì)胞靶向肽與MUC1腫瘤抗原多肽中間通過柔性 linker(Cys)相連接，合成包含樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽，所述融合肽如SEQIDN0. 3所 示。同時制備熒光素FITC標(biāo)記的該融合肽備用。
[0054] 2?融合肽與樹突狀細(xì)胞的結(jié)合能力鑒定：
[0055] 以樹突狀細(xì)胞為靶細(xì)胞對制備出來的融合肽NP-MUC1進行結(jié)合能力鑒定，以Hela 細(xì)胞作對照，具體步驟如下：
[0056] 將樹突狀細(xì)胞按1X105/孔的密度接種于96孔板上，放到37°C、5%C02培養(yǎng)箱中； 細(xì)胞進行營養(yǎng)脅迫處理2h;無水甲醇固定20min, 0. 1%的TritonX-100處理10min;5%的 脫脂牛奶封閉lh，以50ug/mL的濃度加入剛制備的融合肽NP-MUC1，37°C孵育2h;PBST洗5 次，加入MUC1的抗體，37°C孵育lh;PBST洗8遍，之后每孔加入100ul的TMB顯色作用2min; 150ul，2M的H2S04終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測定反應(yīng)液的A450值。
[0057] 結(jié)果如圖3所示，與HeLa細(xì)胞相比，融合肽NP-MUC1能特異靶向樹突狀細(xì)胞并與 其相結(jié)合。
[0058] 實施例3:融合肽效果評價
[0059] 1.抗原遞呈細(xì)胞即樹突狀細(xì)胞對融合肽NP-MUC1的吸收
[0060] 利用激光共聚焦顯微鏡觀察融合肽進入樹突狀細(xì)胞的效率。具體步驟如下：
[0061] 將樹突狀細(xì)胞接種于含有小玻片的六孔板中，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；然后加 入熒光素（FITC)標(biāo)記的MUC1多肽或者FITC標(biāo)記的融合肽NP-MUC1。孵育6小時后，洗去 培養(yǎng)基；4%多聚甲醛固定后10分鐘，0. 1%Triton-xlOO打孔5分鐘；然后加入DAPI染色 后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察抗原遞呈細(xì)胞對MUC1多肽以及靶向融合肽NP-MUC1的吸收 效率。實驗結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明抗原呈遞細(xì)胞對融合肽NP-MUC1的吸收效率顯著高 于對MUC1多肽的吸收效率。（圖4中A為抗原呈遞細(xì)胞對MUC1多肽的吸收圖；B為抗原呈 遞細(xì)胞對融合肽NP-MUC1的吸收圖）
[0062] 2.混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（allo-MLR)測定抗原遞呈細(xì)胞的抗原遞呈能力
[0063] 分離和體外培養(yǎng)單核吞噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC)。然后用多肽（MUC1多肽、 NP-MUC1融合肽，對照多肽（對照肽序列為：LLLTVLTVV))體外致敏抗原遞呈細(xì)胞（DC)， 不加多肽致敏的樹突狀細(xì)胞（DC)，共四組：①只有DC細(xì)胞②DC細(xì)胞+靶向融合肽 NP-MUC1③DC細(xì)胞+MUC1④DC細(xì)胞+陰性對照肽。
[0064] 取正常人外周血，常規(guī)分離單個核細(xì)胞（PBMC)，加入rhIL2培養(yǎng)5天，作為同種 異體效應(yīng)細(xì)胞。
[0065] 向四組中分別加入絲裂霉素使?jié)舛葹?5yg/ml，去增殖后，按各個組的細(xì)胞數(shù)與 效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的比例為1 : 10的比例，加入效應(yīng)細(xì)胞，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 天，收獲前12小時加入3H-TdR(3H標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷），1yCi/孔。用細(xì)胞收集器收集 細(xì)胞，液體閃爍計數(shù)器檢測3H摻入的cpm值，以下為四組中3H摻入的cpm值（圖5)。結(jié) 果表明與其他對照肽相比，NP-MUC1融合肽顯著更強地刺激了效應(yīng)細(xì)胞的增殖。
[0066] 3.CTL(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞）體外殺傷MUC1陽性腫瘤的實驗
[0067] 分離和體外培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞（DC)。然后用上述多肽（對照多肽、MUC1多肽、 NP-MUC1融合肽）體外致敏抗原遞呈細(xì)胞（即DC細(xì)胞）。
[0068] 取正常人外周抗凝血，常規(guī)分離PBMC，作為同種異體效應(yīng)細(xì)胞。將各組誘導(dǎo)培養(yǎng) 的DC細(xì)胞，加入25yg/ml絲裂霉素，去增殖后作為刺激細(xì)胞。將刺激細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞 以1 : 10比例，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，收集細(xì)胞作為CTL細(xì)胞。選用生 長良好的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞（HLAclassA2. 1和MUC1陽性）加入Na251Cr041mCi/ ml，37°C，5%C02培養(yǎng)4小時后收集細(xì)胞作為靶細(xì)胞。將上述制備的CTL細(xì)胞與靶細(xì)胞以 5 : 1效靶比加入96孔圓底板中培養(yǎng)6小時，培養(yǎng)結(jié)束后，收集全部上清，用Y2能譜儀 測量上清中51Cr放射性含量（cpm)。
[0069]如圖6所示，與其他多肽相比較，NP-MUC1融合肽刺激的CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力 顯著最強。
【權(quán)利要求】
1. 一種樹突狀細(xì)胞靶向肽，其特征是序列表中SEQ ID NO. 1所述的氨基酸序列。
2. 編碼權(quán)利要求1樹突狀細(xì)胞靶向肽的基因，其特征是SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序 列。
3. 包含權(quán)利要求1樹突狀細(xì)胞靶向肽的融合肽，所述融合肽是以Cys為linker將樹 突狀細(xì)胞靶向肽序列與MUCI腫瘤抗原多肽序列鏈接在一起，所述融合肽如SEQ ID NO. 3所 /_J、i 〇
4. 包含權(quán)利要求2所述基因的重組表達載體，其特征是所述重組表達載體為重組噬菌 體。
5. 包含權(quán)利要求2所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞系為導(dǎo)入權(quán)利要求4 的重組表達載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
6. 含有權(quán)利要求2所述基因的重組菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌，其特征是所述重組菌為導(dǎo)入權(quán)利要求4重組表達載 體的重組菌。
8. 權(quán)利要求1的一種樹突狀細(xì)胞靶向肽在制備預(yù)防和治療癌癥藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K7/06GK104387453SQ201410746503
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】曹捷, 楊姍姍, 陳紅波 申請人:深圳市同康生物醫(yī)藥有限公司