一種海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于它包括以下步驟：（1）取海膽體腔液，經(jīng)離心后取上清，獲得體腔液上清；（2）以體腔液上清為樣品進(jìn)行非變性非還原的透析電泳；（3）透析電泳后再進(jìn)行非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳；（4）根據(jù)非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳后海膽多功能肌動(dòng)蛋白條帶的特有顏色，對(duì)多功能肌動(dòng)蛋白條帶進(jìn)行切膠，并通過凝膠破碎溶釋法回收凝膠中的蛋白，得到純化的海膽多功能肌動(dòng)蛋白。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：①純化樣品制備簡(jiǎn)單、快捷；②試劑和設(shè)備要求簡(jiǎn)單、易操作、步驟少、時(shí)間短；③純化的樣品具有高純度和高蛋白活性。
【專利說明】-種海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的分離純化方法，具體涉及一種海膽體腔液中多功能肌動(dòng) 蛋白的分離純化方法，屬于棘皮動(dòng)物生理學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 海膽屬于無脊椎動(dòng)物的最高等類群一棘皮動(dòng)物門，其生理活動(dòng)的完成要依賴眾多 生理因子的參與。肌動(dòng)蛋白（actin)是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞骨架的主要成分之一，參與多 種細(xì)胞機(jī)能，包括細(xì)胞變形和收縮、細(xì)胞激化和細(xì)胞分裂等，同時(shí)也與損傷修復(fù)等免疫功能 密切相關(guān)。
[0003] 酚氧化酶（PO)是無脊椎動(dòng)物體內(nèi)最重要的免疫因子之一，通過氧化酚類底物的反 應(yīng)，參與到病原異物的限制和隔離、傷口愈合、病原體的殺傷和抑制、調(diào)理作用、包囊作用和 結(jié)節(jié)形成等多種免疫應(yīng)答過程。此外，無脊椎動(dòng)物PO還廣泛應(yīng)用于催化合成高分子材料 (如無甲醛污染的新型樹脂材料和人造板材、光電材料等)、工業(yè)和生活染色、造紙過程中的 制漿漂白、環(huán)境中芳香類有機(jī)污染物的降解與生物修復(fù)、食品工業(yè)中的健康添加劑(增加葡 萄酒和果汁等的穩(wěn)定性和耐存性）以及生物檢測(cè)等。亞鐵氧化酶（ion oxidase)是無脊椎 動(dòng)物體內(nèi)與鐵代謝相關(guān)的氧化還原酶，主要參與鐵的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)等代謝過程，而鐵是體內(nèi) 諸多氧化還原酶的輔因子，因此亞鐵氧化酶對(duì)無脊椎動(dòng)物的生長(zhǎng)和免疫至關(guān)重要。無脊椎 動(dòng)物體內(nèi)的部分蛋白同時(shí)具有多種生物功能，這種現(xiàn)象稱為"兼職"。同時(shí)具有肌動(dòng)蛋白、 酚氧化酶、亞鐵氧化酶功能的蛋白（簡(jiǎn)稱多功能肌動(dòng)蛋白，multifunctional actin, MA)尚 未在無脊椎動(dòng)物中報(bào)道，是一種新蛋白。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)北方近海養(yǎng)殖的重要 經(jīng)濟(jì)物種光棘球海膽iro /--?/5·和奸夷馬奠海膽iro 中存在ΜΑ，具有極小分子量(約0. 67kDa)，且嗜熱、耐高溫（100°C )。海膽MA與 單一 PO功能的酶相比，具有以下潛在應(yīng)用優(yōu)點(diǎn)：①海膽MA同時(shí)具有PO功能和亞鐵氧化酶 功能，可以完成單一 PO功能的酶所無法實(shí)現(xiàn)的一些高分子材料合成、染色、有機(jī)污染物降 解和生物檢測(cè)等；②海膽MA的極小分子量使該蛋白具有比其他酶更好的擴(kuò)散性和滲透性， 保證了該蛋白在工業(yè)和生活應(yīng)用中具有更高的效率，同時(shí)也保證了該蛋白在基因工程表達(dá) 上具有更高的效率；③海膽MA的嗜熱、耐熱特性保證了該蛋白具有更好的適應(yīng)性。因此，開 發(fā)一種可快速分離純化海膽M的方法，一方面對(duì)研究海膽的生長(zhǎng)與免疫、促進(jìn)海膽的健康 養(yǎng)殖具有重要意義；另一方面對(duì)促進(jìn)和開發(fā)海膽M在工業(yè)和生活上的應(yīng)用具有重要價(jià)值。
[0004] 目前分離純化蛋白的方法主要有超濾、鹽析、凝膠過濾層析、離子交換層析、高效 液相色譜等。針對(duì)某一蛋白的純化往往需要上述2種或多種方法的聯(lián)用，步驟多、操作復(fù) 雜、時(shí)間長(zhǎng)且不利于蛋白活性保持。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡(jiǎn)便、高效的海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方 法。
[0006] 本發(fā)明通過非變性非還原的透析電泳和凝膠電泳分離海膽中同時(shí)具有肌動(dòng)蛋白、 酚氧化酶、亞鐵氧化酶功能的多功能肌動(dòng)蛋白（MA)，通過凝膠破碎溶釋技術(shù)回收MA，通過 液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用確定純化蛋白的純度與屬性，最后通過生化方法確定M的酶學(xué) 特性。
[0007] 非變性非還原電泳可快速、簡(jiǎn)便、高效的分離具有不同生化特性的蛋白質(zhì)，同時(shí)可 以最大限度保持蛋白在天然狀態(tài)下所具有的生物活性。凝膠破碎溶釋技術(shù)(用勻漿器將膠 條在超純水中勻漿使膠條中的蛋白溶釋到水中）可快速回收凝膠電泳中分離的特定蛋白條 帶。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下具體步驟：（1)取海膽體腔液，離心后取上清，獲得 體腔液上清；（2)將體腔液上清裝入IOkDa的透析袋中，封口后再將IOkDa的透析袋放入 0. IkDa的透析袋中，IOkDa透析袋與0. IkDa透析袋之間填充電泳緩沖液后，封口；再將 0. IkDa透析袋放入電泳緩沖液中進(jìn)行非變性非還原的透析電泳；（3)非變性非還原透析電 泳后以透析袋之間填充液體為樣品進(jìn)行非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳；（4)根據(jù)非變 性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳后M條帶的特有顏色對(duì)M條帶進(jìn)行切膠，通過勻漿器將膠 條在超純水中勻漿使膠條中的M溶釋到水中(凝膠破碎溶釋)，從而得到純化的海膽MA。
[0009] 所述電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液。
[0010] 所述非變性非還原透析電泳條件為30V恒壓電泳Ih。
[0011] 所述非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為28mA恒流電泳7h。
[0012] 按所述的海膽MA分離純化方法分離純化光棘球海膽和蝦夷馬糞海膽中的MA， 得到結(jié)果如下：蝦夷馬糞海膽和光棘球海膽M在非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳條 件下分子量與指示劑溴酚藍(lán)的分子量非常接近，約〇. 67kDa，；液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用 (Nano LC-MS/MS)檢測(cè)結(jié)果顯示，光棘球海膽MA的純度為98. 3%，蝦夷馬糞海膽MA的純度 為99. 5% ;P0活性檢測(cè)結(jié)果顯示，海膽MA和沸水浴處理IOmin的海膽MA均可氧化左旋多巴 (L-D0PA)、多巴胺、鄰苯二酚、對(duì)苯二酚等PO底物，但不能氧化酪氨酸，表明兩種海膽MA具 有漆酶型PO活性，且具有耐高溫的特性；亞鐵氧化酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，海膽MA和沸水浴 處理IOmin的海膽MA均可氧化亞鐵離子，表明兩種海膽MA均具有亞鐵氧化酶活性，且具有 耐高溫的特性。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：①使用海膽體腔液上清為樣品，樣品制備簡(jiǎn)單、快捷；②通過 非變性非還原電泳和凝膠破碎溶釋實(shí)現(xiàn)海膽M的純化，純化試劑和設(shè)備要求簡(jiǎn)單，純化過 程簡(jiǎn)單易行、步驟少、時(shí)間短（7小時(shí)）；③純化的MA具有高純度（98%以上)，高蛋白活性（以 多巴胺為底物時(shí)活力高于3900U/mg ;以硫酸亞鐵為底物時(shí)活力高于1200U/mg)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為本發(fā)明分離海膽M的非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
[0015] 其中，（A)為光棘球海膽MA凝膠電泳分離結(jié)果；（B)為蝦夷馬糞海膽MA凝膠電泳 分離結(jié)果。
[0016] 圖2為本發(fā)明純化的海膽MA的PO活性檢測(cè)圖。
[0017] 圖3為本發(fā)明純化的海膽M的亞鐵氧化酶活性檢測(cè)圖。

【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面結(jié)合附圖并通過具體實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0019] 實(shí)施例1 :非變性非還原電泳-凝膠破碎溶釋法分離純化光棘球海膽MA (1)制備體腔液上清 用滅菌注射器穿透光棘球海膽的圍口膜抽取體腔液，離心（4°C，3500rpm，IOmin)，取上 清作為體腔液上清。
[0020] (2)以體腔液上清為樣品進(jìn)行非變性非還原的透析電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳 ①配制Tris-甘氨酸緩沖液（12. OgTris, 60. Og甘氨酸，4L超純水)，預(yù)冷至4°C。
[0021] ②將體腔液上清裝入IOkDa透析袋中，用橡皮筋封口，再將IOkDa透析袋放入 0. IkDa透析袋中，IOkDa透析袋與0. IkDa透析袋之間填充電泳緩沖液，將0. IkDa透析袋用 透析夾封口，30V恒壓電泳Ih (4°C )后，快速取出透析袋之間的填充液，作為粗提MA暫存于 4。。。
[0022] ③配制丙烯酰胺濃度為28%的分離膠和濃度為10%的濃縮膠，丙烯酰胺凝膠中不 含有任何變性劑和還原劑。聚丙烯酰胺凝膠配方和規(guī)格如表1所示： 表1聚丙烯酰胺凝膠配方和規(guī)格

【權(quán)利要求】
1. 一種海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于它包括以下步驟：（1)取海 膽體腔液，經(jīng)離心后取上清，獲得體腔液上清；（2)將體腔液上清裝入lOkDa的透析袋中， 封口后再將l〇kDa的透析袋放入0. lkDa的透析袋中，lOkDa透析袋與0. lkDa透析袋之間 填充電泳緩沖液后，封口；再將〇. lkDa透析袋放入電泳緩沖液中進(jìn)行非變性非還原的透析 電泳；（3)透析電泳后以透析袋之間填充液體為樣品進(jìn)行非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電 泳；（4)根據(jù)海膽多功能肌動(dòng)蛋白非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳后的特有顏色，對(duì)多 功能肌動(dòng)蛋白條帶進(jìn)行切膠，并通過凝膠破碎溶釋法回收凝膠中的蛋白，從而得到純化的 海膽多功能肌動(dòng)蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟（1) 所述的海膽為光棘球海膽或蝦夷馬糞海膽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟（2) 所述的電泳緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟（2) 所述的非變性非還原透析電泳條件為30V恒壓電泳lh。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟（3) 所述的非變性非還原聚丙烯酰胺凝膠電泳條件為28mA恒流電泳7h。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海膽多功能肌動(dòng)蛋白的分離純化方法，其特征在于步驟（4) 所述的凝膠破碎溶釋法是通過勻漿器將膠條在超純水中勻漿使膠條中的海膽多功能肌動(dòng) 蛋白溶釋到水中。
【文檔編號(hào)】C07K1/26GK104404008SQ201410753306
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】蔣經(jīng)偉, 董穎, 陳仲, 高杉, 關(guān)曉燕, 姜北, 周遵春 申請(qǐng)人:遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院