一種酶解魔芋精粉制備低聚甘露糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種酶法結(jié)合超濾工藝從魔芋精粉中制備低聚甘露糖的方法。利用重組β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)對(duì)魔芋精粉進(jìn)行酶解得到低聚甘露糖。該方法所用關(guān)鍵酶的催化活力較高，酶的生產(chǎn)和使用成本較低，生產(chǎn)周期短，無(wú)污染，純化、分離步驟簡(jiǎn)便，極大地提高魔芋精粉的附加值，為進(jìn)一步精制低聚甘露糖奠定理論基礎(chǔ)，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種酶解魔芋精粉制備低聚甘露糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用生物酶水解魔芋精粉制備低聚甘露糖的方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]低聚甘露糖(Mannooli go saccharide, M0S)是由2?10個(gè)單糖分子通過(guò)β -1, 4或β -1，3糖苷鍵連接而形成的低聚糖，主要通過(guò)嗜堿性芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等細(xì)菌產(chǎn)生的甘露聚糖酶水解甘露聚糖(從魔芋、角豆膠及瓜爾豆膠等植物中提取)制得。研究表明，低聚甘露糖可有效促進(jìn)雙歧桿菌、乳酸桿菌等腸道有益菌群的特異性增殖，降低腸道pH以抑制有害菌的生長(zhǎng)；并可以通過(guò)提高腸粘膜局部免疫力、增強(qiáng)動(dòng)物非特異性免疫、促進(jìn)肝臟分泌甘露糖結(jié)合蛋白來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫力；還具有改善血清脂質(zhì)、降低膽固醇和三酸甘油酯含量、不增加血糖濃度等特點(diǎn)，是新一代功能性食品。
[0003]魔芋是廣泛分布在我國(guó)云南、四川、貴州等地區(qū)的特有經(jīng)濟(jì)作物，目前在國(guó)內(nèi)主要作為一種粗纖維食物或食品添加劑使用。魔芋的主要成分是由葡萄糖和甘露糖殘基組成的葡甘露聚糖(glucomannan),其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)是由葡萄糖和甘露糖按一定的摩爾比以β -1，4糖苷鍵相結(jié)合形成主鏈，在主鏈的甘露糖C-3的位置上以β -1，3糖苷鍵形成分支。利用酶法水解魔芋制成的低聚葡甘露糖，可極大拓寬魔芋的應(yīng)用范圍，大幅度提高原料的附加值，具有重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。目前低聚甘露糖的制備通常都是利用高溫水解、酸水解或者堿水解，酶法水解雖然也有報(bào)道，但條件還不夠成熟。酶法生產(chǎn)低聚甘露糖主要受制于生產(chǎn)所用的關(guān)鍵酶的催化效率較低、酶的生產(chǎn)和使用成本較高，以及底物的粘度過(guò)大難以實(shí)現(xiàn)高濃度的生產(chǎn)等。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種酶法結(jié)合超濾工藝從魔芋精粉中制備低聚甘露糖的方法，具有酶活力高、周期短、操作簡(jiǎn)易及純化、分離步驟簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，為低聚甘露糖的酶法生產(chǎn)及精制奠定理論基礎(chǔ)。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案:以底物魔芋精粉的水解率為指標(biāo)，通過(guò)研究酶液添加量、酶解溫度、底物濃度及酶解時(shí)間四個(gè)因素對(duì)魔芋精粉水解率的影響，確定酶法制備低聚甘露糖的最佳酶解條件。在優(yōu)化條件下利用重組甘露聚糖酶(reAuMan26A)對(duì)魔芋精粉進(jìn)行酶法水解，測(cè)定魔芋精粉中總糖含量及其釋放的還原糖含量。酶解液經(jīng)滅活、冷卻、離心、過(guò)0.45 μ m水膜后移至超濾裝置，收集超濾透過(guò)液并濃縮凍干。溶解凍干粉至所需濃度，利用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)酶解產(chǎn)物的組分構(gòu)成。
[0006]所涉及到的具有表達(dá)重組β -甘露聚糖酶(reAuMan26A)能力的工程菌株GS115/Auman26A(專利申請(qǐng)?zhí)?CN201310666414.3)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。
[0007]所述的魔芋精粉總糖含量的測(cè)定方法:
[0008]采用DNS試劑法測(cè)定魔芋精粉中魔芋甘露聚糖(KGM)總糖含量，該總糖僅指KGM粗提液被酸完全水解后所有還原糖之和(本發(fā)明中所有還原糖均以甘露糖計(jì))。
[0009]所述的魔芋精粉酶法水解條件的初步研究:
[0010]本發(fā)明中分別對(duì)影響魔芋精粉酶法水解的4個(gè)因素(酶液添加量、酶解溫度、底物濃度和酶解時(shí)間)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，每確定一因素將作為下一單因素實(shí)驗(yàn)的固定條件，最終獲得的最佳條件用于低聚甘露糖的制備研究。
[0011]所述的魔芋精粉水解產(chǎn)物的色譜分析:
[0012]本發(fā)明利用高效液相色譜(HPLC)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行分析，色譜條件:色譜柱Sugarparl (6.5mmidX300mm),柱溫 85°C,流速 0.4mL.mirT1,進(jìn)樣量為 10 μ L,流動(dòng)相:純水，檢測(cè)器:示差折光。根據(jù)保留時(shí)間定性，色譜峰面積歸一化法定量。
[0013]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供了一種酶法結(jié)合超濾法制備低聚甘露糖的工藝。該方法所用關(guān)鍵酶的催化活力較高，酶的生產(chǎn)和使用成本較低，純化、分離步驟簡(jiǎn)便，生產(chǎn)周期短，有較大的工業(yè)化生產(chǎn)、應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:魔芋精粉酶解產(chǎn)物組分的HPLC色譜圖

【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明的操作方法。但是這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0016]實(shí)施例1魔芋精粉總糖含量的測(cè)定方法
[0017]總糖是指樣品被酸完全水解后所有還原性單糖之和。測(cè)定方法:準(zhǔn)確稱取0.2g魔芋精粉，置于25mL具塞試管內(nèi)，依次加入去離子水1mL和0.5mL H2SO4,于100°C水解2h，冷卻后用NaOH溶液中和。將中和液轉(zhuǎn)移并定容至10mL,濾紙過(guò)濾，取清液ImL用DNS法測(cè)定還原糖(以甘露糖計(jì))量，計(jì)算總糖量取上清液ImL用DNS法測(cè)定還原糖的量，計(jì)算出魔芋精粉中KGM的總糖含量為87.1 %。
[0018]實(shí)施例2魔芋精粉酶法水解條件的初步研究
[0019](I)酶液添加量:以去離子水構(gòu)建反應(yīng)體系在45°C條件下，分別用不同的酶量(30?80U.g—1魔芋)將20g.L—1的魔芋精粉溶液水解4h，然后用DNS法測(cè)定水解產(chǎn)物中還原糖的含量并計(jì)算魔芋精粉的水解率。結(jié)果顯示隨著酶液添加量的增加，魔芋精粉的水解率逐漸增加，當(dāng)酶液添加量達(dá)到60U -g-1魔芋精粉時(shí)，最高水解率為40.5%，后逐漸降低。
[0020](2)酶解溫度:以去離子水構(gòu)建反應(yīng)體系在不同溫度下(30?50°C)，分別用60U.g—1魔芋精粉的酶液添加量將20g.L—1的魔芋精粉溶液水解4h，然后用DNS法測(cè)定水解產(chǎn)物中還原糖的含量并計(jì)算魔芋精粉的水解率。結(jié)果顯示魔芋精粉的水解率隨溫度升高而升高，當(dāng)水解溫度為40°C時(shí)，魔芋精粉的水解率最高可達(dá)41.4% ;溫度高于50°C時(shí)，酶解能力迅速下降。
[0021](3)底物濃度:以去離子水配制不同質(zhì)量濃度的魔芋精粉(5?60g.L-1)作為研究對(duì)象，分別用60U.g—1魔芋精粉的酶液添加量在40°C下水解4h，然后用DNS法測(cè)定水解產(chǎn)物中還原糖的含量并計(jì)算魔芋精粉的水解率。隨著魔芋精粉濃度的增加，其水解率逐漸增加，在質(zhì)量濃度為30g.L—1時(shí)，魔芋精粉水解率最高為42.7%，隨后魔芋精粉的水解率明顯下降。
[0022](4)酶解時(shí)間:以去離子水構(gòu)建反應(yīng)體系在40°C條件下，用eOU.g—1魔芋精粉的酶液添加量將30g.Γ1的魔芋膠溶液水解不同的時(shí)間(3?10h)，然后用DNS法測(cè)定水解產(chǎn)物中還原糖的含量并計(jì)算魔芋精粉的水解率。結(jié)果顯示隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，魔芋精粉的水解率逐漸增加，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6h時(shí)，水解率最高可達(dá)60.1%，后趨于平緩。
[0023]實(shí)施例3超濾法制備魔芋精粉低聚甘露糖
[0024]以優(yōu)化過(guò)的反應(yīng)條件進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)完畢在沸水中將酶滅活、冷卻，酶解液離心過(guò)0.45 μ m水膜后移至超濾裝置，在0.2MPa的壓力下使用截留分子量為2000kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，截取分子量〈2000左右的低聚糖，收集超濾透過(guò)液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮糖液后凍干，取樣用于高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)酶解產(chǎn)物的組分構(gòu)成。
[0025]實(shí)施例4魔芋精粉水解產(chǎn)物組分分析
[0026]稱取低聚甘露糖凍干粉末溶解到濃度為4mg.πι?Λ用HPLC檢測(cè)酶解產(chǎn)物中組分的含量及組成。色譜條件:色譜柱Sugarparl (6.5mmidX 300mm),柱溫85 °C,流速0.4mL.mirT1，進(jìn)樣量為10 μ L，流動(dòng)相:純水，檢測(cè)器:示差折光。根據(jù)M0S保留時(shí)間定性，色譜峰面積歸一化法定量。結(jié)果如圖1所示，比較圖中出峰的保留時(shí)間可知，各種糖是按照相對(duì)分子質(zhì)量從小到大規(guī)律出峰，HPLC色譜圖中自左向右分別是低聚甘露糖、葡萄糖和甘露糖。其中單糖含量占9.83%，二糖以上的甘露低聚糖占90.17%。
【權(quán)利要求】
1.利用實(shí)驗(yàn)室自主構(gòu)建的畢赤酵母工程菌GS115/Auman26A所產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶對(duì)魔芋精粉進(jìn)行水解制備低聚甘露糖。
2.酶法結(jié)合超濾工藝制備低聚甘露糖:以底物魔芋精粉的水解率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定酶法制備低聚甘露糖的酶解條件；優(yōu)化條件如下:加酶量60U.g—1魔芋精粉，酶解溫度40°C，魔芋精粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)30g.L—1，酶解時(shí)間5h ;以優(yōu)化過(guò)的反應(yīng)條件進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)完畢在沸水中將酶滅活、冷卻，酶解液離心過(guò)0.45 μ m水膜后移至超濾裝置，在0.2MPa的壓力下使用截留分子量為2000kDa的超濾膜進(jìn)行超濾，截取分子量〈2000左右的低聚糖。
【文檔編號(hào)】C07H3/06GK104404109SQ201410758066
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】李劍芳, 趙梅, 唐詩(shī)涵, 鄔敏辰, 王春娟, 董運(yùn)海 申請(qǐng)人:江南大學(xué)