一種枸杞葉黃素hsccc分離制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種枸杞葉黃素HSCCC分離制備方法，主要包括如下步驟：枸杞果破碎提取、提取液濃縮、皂化、洗脫溶解、HSCCC分離，得到枸杞葉黃素溶液，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到葉黃素純品，經(jīng)HPLC分析檢測(cè)純度達(dá)90.6％以上。本發(fā)明采用甲醇與四氫呋喃復(fù)合溶劑超聲波提取，結(jié)合皂化工藝，并與HSCCC協(xié)同作用，成功解決了枸杞中主要類胡蘿卜素葉黃素和玉米黃素屬同分異構(gòu)體，分離困難的問(wèn)題。利用秋果枸杞作為原料，大大降低了生產(chǎn)成本，通過(guò)在逆流色譜分離純化階段，反復(fù)調(diào)整溶劑比例，成功實(shí)現(xiàn)了葉黃素和玉米黃素的有效分離，獲得了較高純度的葉黃素單體，為實(shí)現(xiàn)從枸杞中分離提純?nèi)~黃素，實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。
【專利說(shuō)明】一種枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分離提純【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography,簡(jiǎn)稱 HSCCC)是一 種能實(shí)現(xiàn)連續(xù)有效的分配分離功能的液一液分配技術(shù)，具有樣品無(wú)損失、無(wú)污染、高效、快 速和大制備量分離等優(yōu)點(diǎn)。HSCCC技術(shù)自發(fā)明以來(lái)，由于其獨(dú)特的分離優(yōu)勢(shì)，得到了不斷的 推廣和發(fā)展，目前已被廣泛應(yīng)用在中藥成分分離、保健食品、生物化學(xué)、生物工程、天然產(chǎn)物 化學(xué)、有機(jī)合成等領(lǐng)域。目前，我國(guó)應(yīng)用HSCCC技術(shù)在天然藥物有效成分的分離純化方面處 于國(guó)際領(lǐng)先地位。世界上許多國(guó)家，尤其是墨西哥和西班牙早在60年代就開展了萬(wàn)壽菊植 物中天然葉黃素資源的專項(xiàng)研究，我國(guó)葉黃素的應(yīng)用尚處于研究開發(fā)階段，目前國(guó)內(nèi)外葉 黃素加工主要以萬(wàn)壽菊和金盞菊花瓣為原料，采用有機(jī)溶劑提取、樹脂皂化、精制、重結(jié)晶 制備。
[0003] 申請(qǐng)?zhí)?2100125. 1的中國(guó)發(fā)明《葉黃素的分離制備方法》涉及一種用高速逆流色 譜法從萬(wàn)壽菊粗提物中分離制備出高純度單體葉黃素的方法。其特點(diǎn)是所用的溶劑可為正 構(gòu)、烷烴、齒代烴、脂肪醇、脂肪酮、脂肪酯、醚類、水等溶劑，其溶劑的兩相組合可由其中的 三個(gè)、四個(gè)或二個(gè)組分構(gòu)成，其適用于對(duì)各種途徑獲得的萬(wàn)壽菊花粗提物提純，純度可達(dá)到 98%以上，用各種型號(hào)的逆流色譜儀分離制備葉黃素單體，能直接進(jìn)大量粗品或合成混合 物，分離效果能達(dá)到很高的純度。
[0004] 枸杞是我國(guó)重要的"藥食同源"功能性特色植物資源，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為枸杞具有"滋 肝明目，清肺補(bǔ)腎"之功效，枸杞富含類胡蘿卜素，其中速凍枸杞葉黃素含量達(dá)65mg/100g， 居世界水果之首。葉黃素在延緩人體衰老、預(yù)防視網(wǎng)膜黃斑退化、抑制癌癥、抗心腦血管疾 病等方面有顯著功效。葉黃素是人眼視網(wǎng)膜黃斑色素的主要組成部分，流行病學(xué)研究表明， 經(jīng)常食用富含類胡蘿卜素尤其是含葉黃素和玉米黃色素的食品，能夠有效預(yù)防眼球視網(wǎng)膜 黃斑退化引起的視力下降。作為一種優(yōu)良的葉黃素來(lái)源，枸杞的開發(fā)利用也正日益受到關(guān) 注。但是，作為中藥材的枸杞果實(shí)價(jià)格昂貴，導(dǎo)致從枸杞中分離制備葉黃素生產(chǎn)成本十分高 昂，限制了從枸杞中分離提純?nèi)~黃素的研究和應(yīng)用，更重要的是，枸杞中不僅富含葉黃素， 同時(shí)富含玉米黃素，而兩者不易分離，傳統(tǒng)采用的柱色譜法和HPLC法制備量小，難以實(shí)現(xiàn) 大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。如何降低生產(chǎn)成本，從枸杞中有效分離提純?nèi)~黃 素，是我們要解決的問(wèn)題。而有關(guān)采用HSCCC技術(shù)從枸杞中分離葉黃素的研究未見(jiàn)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，以枸杞為原 料，采用HSCCC分離技術(shù)，分離制備葉黃素，所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法包括如下 步驟：
[0006] 枸杞果破碎提取、類胡蘿卜素提取液濃縮、皂化、洗脫溶解、HSCCC分離得到枸杞葉 黃素溶液，再經(jīng)濃縮、冷凍干燥，得到葉黃素純品，采用HPLC分析檢測(cè)產(chǎn)品純度。
[0007] 所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法主要步驟如下：
[0008] (1)提?。悍Q取枸杞鮮果，研磨后加入甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶劑提取，料液比1:15， 超聲功率300w，超聲提取30min，過(guò)濾得提取液，濾渣按以上操作再提取2次，合并提取液； [0009] 所述復(fù)合溶劑為體積比1 :1的甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶液，其中含有以混合溶液總 體積計(jì)0. 1 %質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)的BHT。
[0010] (2)濃縮：35°C條件下避光濃縮至提取液體積的四十分之一至四十五分之一，得 粗濃縮物，加入粗濃縮物8-12倍體積的石油醚和5-8倍體積10%的NaCL水溶液于分液漏 斗中，有機(jī)層用粗濃縮物8-10倍體積的純水洗至無(wú)色，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉脫水，濃 縮至與粗濃縮物同體積，得到濃縮物。
[0011] ⑶皂化：加入濃縮物8-10倍10% KOH-甲醇溶液，充入N2，避光條件下在室溫皂 化8-12h，得皂化液。
[0012] (4)洗脫溶解：加入濃縮物8-10倍體積的石油醚和5-8倍體積10%的NaCl溶液， 有機(jī)層用純水洗至中性，避光濃縮蒸干，殘?jiān)促|(zhì)量體積比1:50加入二氯甲烷溶解，得葉 黃素二氯甲烷溶液。
[0013] (5)HSCCC分離：采用高速逆流色譜儀，選用體積比為4:3:1的正己烷-乙醇-水 兩相溶劑體系，流動(dòng)相流速lmL/min，離心轉(zhuǎn)速1800r/min，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，根據(jù)紫外譜圖， 接收目標(biāo)成分。
[0014] (6)葉黃素 HPLC檢測(cè)：
[0015] 采用48丨16拉1260高效液相色譜系統(tǒng)，￥1?：-030分析柱（4.6\250_，5 4 111);流 動(dòng)相A相：質(zhì)量體積百分比為0. 1%的三乙胺甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇與水的 體積比為75:25 ;B相：體積比為70:5:25的丙酮/二氯甲烷/甲醇溶液；梯度洗脫程序： 0min-5min，0 % B-25 % B ; 10-15min，50 % -85 % B，35-45min，100 % B-O % B ;流速 lmL/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)450nm ;柱溫25°C，進(jìn)樣量25 μ L。
[0016] 本發(fā)明通過(guò)以上技術(shù)手段成功地從枸杞原料中分離制備得到了葉黃素，產(chǎn)品經(jīng) HPLC分析檢測(cè)純度達(dá)90. 6%以上。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)選秋果枸杞為原料。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.采用超聲波提取法，超聲波的空化效應(yīng)可強(qiáng)化萃取，加速萃取過(guò)程，且條件溫 和，耗能少。
[0020] 2.提取溶劑的選擇：選用甲醇與四氫呋喃復(fù)合溶劑提取，目標(biāo)提取物葉黃素在四 氫呋喃中的溶解度最大，為8000mg/L，而且所選用復(fù)合溶劑安全性較高。
[0021] 3.皂化過(guò)程對(duì)提取效果有著至關(guān)重要的影響。枸杞中的葉黃素大部分以酯化形式 存在，經(jīng)過(guò)了有機(jī)溶劑萃取后，它們的存在形式并沒(méi)有發(fā)生改變，因此，在進(jìn)一步純化前必 須要經(jīng)過(guò)皂化處理，將葉黃素還原為單體形式。皂化處理可以使枸杞鮮果中的酯化葉黃素 最大限度釋放出來(lái)，皂化完全的程度直接影響提取效果。時(shí)間短，皂化不完全，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部 分葉黃素在堿性條件下會(huì)發(fā)生降解，反而會(huì)降低葉黃素的提取率。同時(shí)，KOH-甲醇溶液的 質(zhì)量濃度也影響著皂化效果，濃度過(guò)高會(huì)使葉黃素在強(qiáng)堿環(huán)境發(fā)生分解。本發(fā)明通過(guò)大量 試驗(yàn)，研究了不同KOH-甲醇溶液濃度和皂化時(shí)間對(duì)提取效果的影響，最終確定最佳KOH-甲 醇溶液濃度為10%，皂化時(shí)間為8-12h。本發(fā)明采用特定的提取、皂化工藝為HSCCC分離純 化奠定了基礎(chǔ)，并與HSCCC協(xié)同作用，與未經(jīng)皂化直接經(jīng)HSCCC分離相比，枸杞果實(shí)中的葉 黃素提取量提高了近4倍。具體見(jiàn)表1和表2。
[0022] 4.葉黃素和玉米黃素是枸杞中的主要類胡蘿卜素，由于兩者屬同分異構(gòu)體，將兩 者成功的分離存在很大困難。本發(fā)明通過(guò)在逆流色譜分離純化階段，反復(fù)調(diào)整溶劑比例，成 功實(shí)現(xiàn)了葉黃素和玉米黃素的有效分離。
[0023] 5.秋果枸杞也即9月中旬-10月底采摘的枸杞果實(shí)，由于枸杞樹前期消耗大量營(yíng) 養(yǎng)，果實(shí)表現(xiàn)為果形小，果皮厚，種子顆粒大，出汁率低，苦味和生藥味加重，不適宜加工利 用，因而價(jià)格低廉，干果每千克售價(jià)僅10-15元。發(fā)明人分析發(fā)現(xiàn)，秋果枸杞類胡蘿卜素總 量是夏果枸杞的75 % -80 % %，但其中葉黃素含量較夏果高5 % -8 %，作為制備葉黃素的原 料非常適宜，擴(kuò)大了資源的有效開發(fā)利用，又大大提升了枸杞的附加值。而且，制備葉黃素 過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物枸杞籽是枸杞籽油的主要原料，可實(shí)現(xiàn)二次增值。本發(fā)明利用秋果枸 杞作為制備葉黃素的原料，大大降低了生產(chǎn)成本，采用HSCCC技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了葉黃素和玉米黃 素的有效分離，成功的獲得了較高純度的葉黃素單體，為實(shí)現(xiàn)從枸杞中分離提純?nèi)~黃素，實(shí) 現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路。
[0024] 表I :Κ0Η-甲醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)葉黃素提取效果的影響單位：μ g/100g

【權(quán)利要求】
1. 一種枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，包括如下步驟： (1) 提取：稱取枸杞鮮果，研磨后加入甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶劑提取，料液比1:15,超聲 功率300w，超聲提取30min，過(guò)濾得提取液，濾渣按以上操作再提取2次，合并提取液； 所述復(fù)合溶劑為體積比1 :1的甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶液，其中含有以混合溶液總體積 計(jì)0. 1%質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)的BHT ; (2) 濃縮：35°C條件下避光濃縮至提取液體積的四十分之一至四十五分之一，得粗濃 縮物，加入粗濃縮物8-12倍體積的石油醚和5-8倍體積10%的NaCl水溶液于分液漏斗中， 有機(jī)層用粗濃縮物8-10倍體積的純水洗至無(wú)色，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉脫水，濃縮至 與粗濃縮物同體積，得到濃縮物； (3) 皂化：加入濃縮物8-10倍10% KOH-甲醇溶液，充入N2，避光條件下在室溫皂化 8-12h，得皂化液； (4) 洗脫溶解：加入濃縮物8-10倍體積的石油醚和5-8倍體積10%的NaCl溶液，有機(jī) 層用純水洗至中性，避光濃縮蒸干，殘?jiān)促|(zhì)量體積比1:50加入二氯甲烷溶解，得葉黃素 二氯甲烷溶液； (5) HSCCC分離：采用高速逆流色譜儀，選用體積比為4:3:1的正己烷-乙醇-水兩相 溶劑體系，流動(dòng)相流速lmL/min，離心轉(zhuǎn)速1800r/min，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm，根據(jù)紫外譜圖，接收 目標(biāo)成分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，還包括葉黃素 HPLC檢測(cè)步 驟： 采用Agilent 1260高效液相色譜系統(tǒng)，YMC-C30分析柱（4. 6X250mm，5iim);流動(dòng) 相A相：質(zhì)量體積百分比為0. 1%的三乙胺甲醇水溶液，所述甲醇水溶液中甲醇與水的體 積比為75:25 ;B相：體積比為70:5:25的丙酮/二氯甲烷/甲醇溶液；梯度洗脫程序：0min-5min，0 % B-25 % B ; 10-15min，50 % -85 % B，35-45min，100 % B-0 % B ;流速 lmL/min ; 檢測(cè)波長(zhǎng)450nm ;柱溫25°C，進(jìn)樣量25 ii L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，其特征在于，所述枸杞鮮 果為秋果構(gòu)祀。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，包括如下步驟： (1) 提?。悍Q取枸杞鮮果l〇g，研磨后加入甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶劑提取，料液比1:15， 超聲功率300w，超聲提取30min，過(guò)濾得提取液，濾渣按以上操作再提取2次，合并提取液； (2) 濃縮：35°C條件下避光濃縮至10mL，得粗濃縮物，加入100mL石油醚和50mL10%的 NaCl水溶液于分液漏斗中，有機(jī)層用100mL的純水洗至無(wú)色，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉脫 水，濃縮至10mL，得到濃縮物； (3) 皂化：加入80mL10% K0H-甲醇溶液，充入N2，避光條件下在室溫皂化8h，得皂化 液； (4) 洗脫溶解：加入100mL的石油醚和50mL10%的NaCl溶液，有機(jī)層用純水洗至中性， 避光濃縮蒸干，殘?jiān)?mL二氯甲烷溶解，得葉黃素二氯甲烷溶液； (5) 枸杞葉黃素 HSCCC分離： 選取正己烷-乙醇-水在半制備逆流色譜儀上分離純化枸杞提取物中的葉黃素，按 4:3:1的體積比將上述溶劑組分超聲15min，配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層；待平 衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開，取下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相；采用半制備高 速逆流色譜儀，配有CF-80泵，手動(dòng)進(jìn)樣閥，柱容積為500mL，UV3000UV-vis紫外檢測(cè)器， BSZ-100-LCD自動(dòng)餾分收集器；取步驟（4)葉黃素二氯甲烷溶液lmL溶解于流動(dòng)相中待用； 進(jìn)樣前，先用固定相裝滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為1800rpm，儀器反轉(zhuǎn)，以1. OmL/min的流 速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系達(dá)到靜態(tài)平衡后，進(jìn)樣，根據(jù)紫外譜圖，接收目標(biāo)成分，得 到純化的枸杞葉黃素，HPLC純度達(dá)93. 6%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，包括如下步驟： ⑴提取：稱取枸杞鮮果l〇g，研磨后加入甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶劑提取，料液比1:15， 超聲功率300w，超聲提取30min，過(guò)濾得提取液，濾渣按以上操作再提取2次，合并提取液； (2) 濃縮：35°C條件下避光濃縮至11. 25mL，得粗濃縮物，加入90mL石油醚和70mL10% 的NaCl水溶液于分液漏斗中，有機(jī)層用90mL的純水洗至無(wú)色，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉 脫水，濃縮至11. 25mL，得到濃縮物； (3) 皂化：加入112mL10% K0H-甲醇溶液，充入N2，避光條件下在室溫皂化10h，得皂化 液； ⑷所述洗脫溶解：加入l〇〇mL的石油醚和70mL10%的NaCl溶液，有機(jī)層用純水洗至 中性，避光濃縮蒸干，殘?jiān)?mL二氯甲烷溶解，得葉黃素二氯甲烷溶液； (5)枸杞葉黃素 HSCCC分離： 選取正己烷-乙醇-水在半制備逆流色譜儀上分離純化枸杞提取物中的葉黃素，按 4:3:1的體積比將上述溶劑組分超聲15min，配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層；待平 衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開，取下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相；采用半制備高 速逆流色譜儀，配有CF-80泵，手動(dòng)進(jìn)樣閥，柱容積為500mL，UV3000UV-vis紫外檢測(cè)器， BSZ-100-LCD自動(dòng)餾分收集器；取步驟（4)葉黃素二氯甲烷溶液lmL溶解于流動(dòng)相中待用； 進(jìn)樣前，先用固定相裝滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為1800rpm，儀器反轉(zhuǎn)，以1. OmL/min的流 速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系達(dá)到靜態(tài)平衡后，進(jìn)樣，根據(jù)紫外譜圖，接收目標(biāo)成分，得 到純化的枸杞葉黃素，HPLC純度達(dá)92. 3%。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述枸杞葉黃素 HSCCC分離制備方法，包括如下步驟： (1) 提?。悍Q取枸杞鮮果l〇g，研磨后加入甲醇、四氫呋喃復(fù)合溶劑提取，料液比1:15， 超聲功率300w，超聲提取30min，過(guò)濾得提取液，濾渣按以上操作再提取2次，合并提取液； (2) 濃縮：35°C條件下避光濃縮至10. 5mL，得粗濃縮物，加入126mL石油醚和84mL10% 的NaCl水溶液于分液漏斗中，有機(jī)層用105mL的純水洗至無(wú)色，合并有機(jī)層，用無(wú)水硫酸鈉 脫水，濃縮至10. 5mL，得到濃縮物； (3) 皂化：加入84mL10% K0H-甲醇溶液，充入N2，避光條件下在室溫皂化12h，得皂化 液； (4) 洗脫溶解：加入95mL的石油醚和65mL10%的NaCl溶液，有機(jī)層用純水洗至中性， 避光濃縮蒸干，殘?jiān)?mL二氯甲烷溶解，得葉黃素二氯甲烷溶液； (5) 枸杞葉黃素 HSCCC分離： 選取正己烷-乙醇-水在半制備逆流色譜儀上分離純化枸杞提取物中的葉黃素，按 4:3:1的體積比將上述溶劑組分超聲15min，配置于分液漏斗中，搖勻后靜置分層；待平 衡一段時(shí)間后，將上相和下相分開，取下相作為固定相，上相作為流動(dòng)相；采用半制備高 速逆流色譜儀，配有CF-80泵，手動(dòng)進(jìn)樣閥，柱容積為500mL，UV3000UV-vis紫外檢測(cè)器， BSZ-100-LCD自動(dòng)餾分收集器；取步驟（4)葉黃素二氯甲烷溶液lmL溶解于流動(dòng)相中待用； 進(jìn)樣前，先用固定相裝滿整個(gè)柱子，調(diào)整主機(jī)轉(zhuǎn)速為1800rpm，儀器反轉(zhuǎn)，以1. OmL/min的流 速將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)；待整個(gè)體系達(dá)到靜態(tài)平衡后，進(jìn)樣，根據(jù)紫外譜圖，接收目標(biāo)成分，得 到純化的枸杞葉黃素，HPLC純度達(dá)90. 6%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一所述枸杞葉黃素 HSCCC分離方法制備得到的枸杞葉黃素。
【文檔編號(hào)】C07C403/24GK104447470SQ201410819646
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】劉蘭英, 曹有龍, 石志剛, 安巍 申請(qǐng)人:寧夏農(nóng)林科學(xué)院