基于沉淀的蛋白質(zhì)制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供以融合蛋白質(zhì)的形式、高回收率地制造目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明涉及一種融合蛋白質(zhì)的制造方法，所述融合蛋白質(zhì)是具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)，所述制造方法包括下述(1)～(4)的步驟：(1)制備包含融合蛋白質(zhì)的溶液的步驟；(2)將步驟(1)中得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至使回收率達(dá)到10％以上的pH的步驟，其中，回收率通過下述計(jì)算公式計(jì)算：回收率(％)＝[步驟(4)中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的量/{步驟(4)中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量+步驟(3)的固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量}]×100；(3)從步驟(2)中得到的溶液分離固體的步驟；以及(4)將步驟(3)中分離出的固體溶解在溶液中的步驟，所述溶液具有12以下且比步驟(2)中得到的溶液的pH高0.1以上的pH。
【專利說明】基于沉淀的蛋白質(zhì)制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于沉淀的蛋白質(zhì)制造方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過對(duì)包含具有 自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的溶液的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)從而制造融合 蛋白質(zhì)及目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 具有多種多樣功能的蛋白質(zhì)被廣泛用于醫(yī)藥品、產(chǎn)業(yè)用酶這樣的商業(yè)用途乃至解 明各種生命現(xiàn)象的研究用途，是提高生活、科學(xué)進(jìn)步不可缺少的物質(zhì)。作為用于廉價(jià)、大量 且重現(xiàn)性好地制造所述各種蛋白的方法，開發(fā)了基于重組生物的蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)和蛋白質(zhì) 純化技術(shù)。
[0003] 基于重組生物的蛋白質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)利用了動(dòng)物細(xì)胞（非專利文獻(xiàn)1)、微生物（非專 利文獻(xiàn)1)，動(dòng)物細(xì)胞使用了 CHO細(xì)胞（非專利文獻(xiàn)2)、微生物使用了大腸桿菌、酵母（非 專利文獻(xiàn)3)等。例如，使用谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)(以下簡(jiǎn)稱為 C. glutamicum)作為微生物的蛋白分泌生產(chǎn)系統(tǒng)（專利文獻(xiàn)1)。
[0004] 作為對(duì)重組生物生產(chǎn)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化的主要方法有利用蛋白本身的性質(zhì)的方 法、對(duì)蛋白質(zhì)附加純化用序列并利用添加序列的性質(zhì)的方法。
[0005] 作為利用蛋白本身的性質(zhì)的方法，可以列舉出色譜法及固液分離法。
[0006] 色譜法中使用具有各種性質(zhì)的色譜用基體材料。色譜法中利用蛋白與色譜用基體 材料的相互作用、色譜基體材料所具有的分子篩效果（非專利文獻(xiàn)4)。作為蛋白與色譜用 基體材料的相互作用，可以列舉出靜電相互作用、氫鍵、疏水性相互作用、特異性相互作用 等（非專利文獻(xiàn)4以及5)。
[0007] 固液分離是通過改變?nèi)芤簵l件使處于可溶化狀態(tài)的蛋白不溶化（即固體化），然 后通過離心分離等簡(jiǎn)便方法獲得固體部分，并使其再次形成可溶化狀態(tài)，從而進(jìn)行分離的 方法。作為使蛋白不溶化的方法的具體例子，可以列舉出：等電點(diǎn)沉淀（非專利文獻(xiàn)6)、鹽 析（非專利文獻(xiàn)7)、利用有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀（非專利文獻(xiàn)8)、利用水溶性高分子進(jìn)行沉淀 (非專利文獻(xiàn)9)等。
[0008] 等電點(diǎn)沉淀利用了蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)溶解度最低的性質(zhì)。鹽析、利用有機(jī)溶劑進(jìn) 行的沉淀以及利用水溶性高分子進(jìn)行的沉淀是利用了蛋白的溶解度分別因高濃度的鹽、有 機(jī)溶劑和水溶性高分子的存在而降低的性質(zhì)。作為其他不溶化方法，可以列舉出蛋白質(zhì)凝 集（非專利文獻(xiàn)10以及非專利文獻(xiàn)11)。蛋白凝集在能夠選擇出使要純化的蛋白處于可溶 化狀態(tài)、而要純化的蛋白以外的蛋白處于發(fā)生凝集的條件的情況下，是特別有效的方法。
[0009] 作為對(duì)蛋白質(zhì)附加純化用序列并利用該添加序列的性質(zhì)的方法，可以列舉出利用 添加序列自身性質(zhì)的方法、利用添加序列與添加序列以外的物質(zhì)發(fā)生的相互作用的方法。 [0010] 作為利用添加序列本身的性質(zhì)的方法，有利用因溫度變化而引起相轉(zhuǎn)移、并發(fā)生 不溶化的彈性蛋白的方法（非專利文獻(xiàn)12)，利用因 pH變化而形成可溶性匯合體的MISTIC 的方法（專利文獻(xiàn)2)等。 toon] 在利用添加序列與添加序列以外的物質(zhì)發(fā)生的相互作用的方法中，多將添加序列 以外的物質(zhì)設(shè)置在色譜用基體材料上（非專利文獻(xiàn)13)。作為添加序列與添加序列以外的 物質(zhì)發(fā)生的相互作用，可以列舉出靜電相互作用、氫鍵、疏水性相互作用、特異性相互作用 坐 寸。
[0012] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0013] 專利文獻(xiàn)
[0014] 專利文獻(xiàn)1 :國(guó)際公開第2005/103278號(hào)
[0015] 專利文獻(xiàn)2 :歐洲專利申請(qǐng)公開第2423217號(hào)
[0016] 非專利文獻(xiàn)
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0030] 發(fā)明要解決的問題
[0031] 就利用蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)的方法而言，與目標(biāo)蛋白質(zhì)的性質(zhì)相應(yīng)的純化方法是個(gè) 別構(gòu)建的，因此，一般是不可能將某蛋白的純化方法直接應(yīng)用于其他蛋白的純化方法。
[0032] 另一方面，就給蛋白附加純化用序列并利用添加序列的性質(zhì)的方法而言，如果利 用相同的添加序列，大多可以對(duì)多種蛋白的純化采用相同或類似的純化方法，可以說是通 用性高的方法。
[0033] 但是，即使在利用添加序列的性質(zhì)的方法中也會(huì)存在如下問題：例如，利用彈性蛋 白的方法不能適用于易因熱而失活的目標(biāo)蛋白質(zhì)；利用MISTIC的方法難以對(duì)產(chǎn)生的匯合 體進(jìn)行分離等。
[0034] 解決問題的方法
[0035] 本發(fā)明人為解決上述問題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)了下述性質(zhì)：在使用 具有自組裝能力的蛋白作為添加序列的情況下，該添加序列與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白 質(zhì)在溶液中pH依賴性地在可溶化狀態(tài)與不溶化狀態(tài)之間可逆地變化。本發(fā)明正是基于上 述認(rèn)識(shí)而完成的。
[0036] gp，本發(fā)明涉及下述的[1]?[33]。
[0037] [1]. -種融合蛋白質(zhì)的制造方法，其是具有自組裝能力的蛋白與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成 的融合蛋白質(zhì)的制造方法，所述制造方法包括下述（1)?（4)的步驟：
[0038] (1)制備包含融合蛋白質(zhì)的溶液的步驟；
[0039] (2)將步驟（1)中得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至使回收率達(dá)到10%以上的pH的步驟， 其中，回收率通過下述計(jì)算公式計(jì)算：
[0040] 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的量/{:步驟⑷中得到的 溶液中融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量}] X100 ;
[0041] ⑶從步驟⑵中得到的溶液分離固體的步驟；以及
[0042] (4)將步驟（3)中分離出的固體溶解在溶液中的步驟，所述溶液具有12以下且比 步驟⑵中得到的溶液的pH高0. 1以上的pH。
[0043] [2].根據(jù)[1]所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白質(zhì)是細(xì)胞表層蛋白質(zhì)。
[0044] [3].根據(jù)[2]所述的方法，其中，細(xì)胞表層蛋白質(zhì)為CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部分。
[0045] [4]·根據(jù)[3]所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部分為下述（a)或（b):
[0046] (a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)；
[0047] (b)與SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性蛋白質(zhì)。
[0048] [5].根據(jù)[3]所述的方法，其中，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成 熟蛋白質(zhì)的N末端起的6?250個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列。
[0049] [6].根據(jù)[5]所述的方法，其中，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成 熟蛋白質(zhì)的N末端起的6、17、50或250個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列。
[0050] [7].根據(jù)[1]?[6]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)為 10 ?1000 個(gè)。
[0051] [8].根據(jù)[1]?[7]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo) 蛋白質(zhì)之間還包含用于酶切或化學(xué)切割的氨基酸序列。
[0052] [9].根據(jù)[8]所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間存 在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶識(shí)別序列、胰蛋白酶的識(shí)別序列或Factor Xa 蛋白酶的識(shí)別序列。
[0053] [10]·根據(jù)[1]?[9]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，其中，步驟（2)的pH為9以下。
[0054] [11].根據(jù)[1]?[10]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑵的pH調(diào)節(jié)使用選自 硫酸、鹽酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸進(jìn)行。
[0055] [12].根據(jù)[1]?[11]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（3)的分離利用離心分離 和/或膜過濾進(jìn)行。
[0056] [13].根據(jù)[1]?[12]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（1)中得到的溶液是具有 表達(dá)融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物的棒狀桿菌型細(xì)菌的培養(yǎng)液的上清。
[0057] [14].根據(jù)[1]?[13]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑵中指定的回收率為 30%以上。
[0058] [15]· -種目標(biāo)蛋白質(zhì)的制造方法，其包括下述（1)?（5)的步驟：
[0059] (1)制備包含具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的溶液的 步驟，該融合蛋白質(zhì)中，在具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間包含用于酶切或化 學(xué)切割的氨基酸序列；
[0060] (2)將步驟（1)中得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至使回收率為10%以上的pH的步驟，其 中，回收率通過下述計(jì)算公式計(jì)算：
[0061] 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的量/{:步驟⑷中得到的 溶液中融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量}] XlOO ;
[0062] (3)從步驟⑵中得到的溶液分離固體的步驟；以及
[0063] (4)將步驟（3)中分離出的固體溶解在溶液中的步驟，所述溶液具有12以下且比 步驟⑵中得到的溶液的pH高0. 1以上的pH ;
[0064] (5)與步驟⑷同時(shí)、或在步驟⑷中途、或在步驟⑷之后，位于具有自組裝能力 的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的氨基酸序列部位對(duì)融合蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切或化學(xué)切割的處理 的步驟。
[0065] [16].根據(jù)[15]所述的方法，其中，對(duì)所述融合蛋白質(zhì)進(jìn)行切割處理的步驟是進(jìn) 行酶切處理的步驟。
[0066] [17].根據(jù)[15]所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白是細(xì)胞表層蛋白質(zhì)。
[0067] [18].根據(jù)[17]所述的方法，其中，細(xì)胞表層蛋白質(zhì)是CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部 分。
[0068] [19].根據(jù)[18]所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部分是下述（a)或 (b)：
[0069] (a)由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)
[0070] (b)與SEQ ID N0:3所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性蛋白質(zhì)。
[0071] [20].根據(jù)[18]所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成熟蛋 白質(zhì)的N末端起的6?250個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列。
[0072] [21].根據(jù)[20]所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成熟蛋 白質(zhì)的N末端起的6、17、50或250個(gè)氣基酸殘基中的任意殘基構(gòu)成的序列。
[0073] [22].根據(jù)[15]?[21]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸殘 基數(shù)為10?1000個(gè)。
[0074] [23].根據(jù)[15]?[22]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是特立帕肽。
[0075] [24].根據(jù)[15]?[22]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是SEQ ID N0:93 所示的比伐盧定中間體。
[0076] [25].根據(jù)[15]?[24]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白與目 標(biāo)蛋白質(zhì)之間存在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶識(shí)別序列、胰蛋白酶的識(shí)別 序列或Factor Xa蛋白酶的識(shí)別序列。
[0077] [26].根據(jù)[15]?[25]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑵的pH為9以下。
[0078] [27].根據(jù)[15]?[26]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑵的pH調(diào)節(jié)使用選自 硫酸、鹽酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸來進(jìn)行。
[0079] [28].根據(jù)[15]?[27]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑶的分離利用離心分 離和/或膜過濾來進(jìn)行。
[0080] [29].根據(jù)[15]?[28]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑴中得到的溶液是具 有表達(dá)融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物的棒狀桿菌型細(xì)菌培養(yǎng)液的上清。
[0081] [30]·根據(jù)[15]?[29]中任一項(xiàng)所述的方法，其包括在步驟（4)和/或步驟（5) 之后進(jìn)行（6)對(duì)融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化的步驟。
[0082] [31].根據(jù)[30]所述的方法，其中，步驟（6)利用柱色譜來進(jìn)行。
[0083] [32].根據(jù)[15]?[31]中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑵中指定的回收率為 30%以上。
[0084] [33]. -種產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)的固體、并將其分離的方法，其包括將包含具有自組裝 能力的蛋白與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的溶液的pH調(diào)節(jié)至9以下，從而產(chǎn)生固體，然 后，對(duì)該固體進(jìn)行分離。
[0085] 發(fā)明效果
[0086] 如后述的實(shí)施例所示，通過本發(fā)明，能夠從包含該融合蛋白質(zhì)的溶液中，簡(jiǎn)便且高 回收率地得到包含目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0087]【圖1-A】圖I-A顯示實(shí)施例1中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB50TEV-特立帕肽（Proinsulin)(簡(jiǎn)稱50-Teri)的回收率之間的關(guān)系。
[0088] 【圖1-B】圖I-B顯示實(shí)施例1中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶部分 的照片、以及回收率。
[0089] 【圖1-2A】圖1-2A顯示實(shí)施例1-2中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白 質(zhì)50-Teri的回收率之間的關(guān)系。
[0090] 【圖1-2B】圖1-2B顯示實(shí)施例1-2中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀 溶解溶液"的各電泳圖、對(duì)融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶部分進(jìn)行抽提的照片。
[0091] 【圖1-2C】圖1-2C顯示對(duì)實(shí)施例1-2中調(diào)節(jié)至ρΗ4· 9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液的 上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"進(jìn)行反相HPLC而得到的色譜。
[0092] 【圖1-2D】圖1-2D顯示對(duì)由實(shí)施例1-2中調(diào)節(jié)至ρΗ4·9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng) 液"得到的"沉淀溶解溶液"、"酶切溶液"以及"標(biāo)準(zhǔn)品特立帕肽"進(jìn)行反相HPLC而得到的 色譜。
[0093] 【圖1-2E】圖1-2E顯示對(duì)由實(shí)施例1-2中調(diào)節(jié)至ρΗ4·9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng) 液"純化得到的"純化物質(zhì)"以及"標(biāo)準(zhǔn)品特立帕肽"進(jìn)行質(zhì)譜分析而得到的質(zhì)譜圖。
[0094] 【圖2-A】圖2-A顯示實(shí)施例2中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB50Lys_比伐盧定18(Bivalirudinl8)(簡(jiǎn)稱50_Bival8)的回收率之間的關(guān)系。
[0095] 【圖2-B】圖2-B顯示實(shí)施例2中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)50-Bival8的條帶 部分的照片、以及回收率。
[0096] 【圖2-C】圖2-C顯示對(duì)實(shí)施例2中調(diào)節(jié)至pH2. 9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上清" 以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"進(jìn)行反相HPLC而得到的色譜。
[0097] 【圖2-D】圖2-D顯示對(duì)實(shí)施例2中由調(diào)節(jié)至ρΗ2· 9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"得 到的"沉淀溶解溶液"以及"酶切溶液"進(jìn)行反相HPLC而得到的色譜。
[0098] 【圖2-E】圖2-E顯示根據(jù)Bival8的氨基酸序列計(jì)算的質(zhì)量（上左）以及對(duì)該計(jì) 算值進(jìn)行圖示而得到的理論質(zhì)譜（上右），以及，對(duì)由實(shí)施例2中調(diào)節(jié)至pH2. 9的"完成pH 調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"純化的得到"純化物質(zhì)"進(jìn)行質(zhì)譜分析而得到的質(zhì)譜圖（下）。
[0099] 【圖2-F】圖2-F顯示將由實(shí)施例2中調(diào)節(jié)至pH2. 9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"得 到的"酶切溶液"進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換樹脂色譜而得到的色譜。
[0100] 【圖2-G】圖2-G顯示對(duì)由實(shí)施例2中調(diào)節(jié)至pH2. 9的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"得 到的"酶切溶液"進(jìn)行強(qiáng)陰離子交換樹脂色譜而得到的洗脫液（95% B附近）進(jìn)行反相HPLC 而得到的色譜。
[0101]【圖3-A】圖3-A顯示實(shí)施例3中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB50TEV-特立帕肽（Proinsulin)(簡(jiǎn)稱50-PIns)的回收率之間的關(guān)系。
[0102] 【圖3-B】圖3-B顯示實(shí)施例3中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)50-Pins的條帶部 分的照片、以及回收率。
[0103] 【圖4-A】圖4-A顯示比較例1中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與胰島素原（簡(jiǎn) 稱PIns)的回收率之間的關(guān)系顯示。
[0104] 【圖4-B】圖4-B顯示比較例1中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的Pins的條帶部分的照片、以及 回收率。
[0105] 【圖5-A】圖5-A顯示實(shí)施例4中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB250TEV-特立帕肽（Proinsulin)(簡(jiǎn)稱250-PIns)的回收率之間的關(guān)系。
[0106] 【圖5-B】圖5-B顯示實(shí)施例4中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)250-Pins的條帶 部分的照片、以及回收率。
[0107] 【圖6-A】圖6-A顯示實(shí)施例5中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB17TEV-特立帕肽（Proinsulin)(簡(jiǎn)稱17-PIns)的回收率之間的關(guān)系。
[0108] 【圖6-B】圖6-B顯示實(shí)施例5中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)17-Pins的條帶部 分的照片、以及回收率。
[0109] 【圖7-A】圖7-A顯示實(shí)施例6中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB6TEV-特立帕肽（Proinsulin)(簡(jiǎn)稱6-PIns)的回收率之間的關(guān)系。
[0110] 【圖7-B】圖7-B顯示實(shí)施例6中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)6-Pins的條帶部 分的照片、以及回收率。
[0111] 【圖8-A】圖8-A顯示實(shí)施例7中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB50TEV-特立帕肽（簡(jiǎn)稱50-Teri)的回收率之間的關(guān)系顯示。
[0112] 【圖8-B】圖8-B顯示實(shí)施例7中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶部 分的照片、以及回收率。
[0113] 【圖9-A】圖9-A顯示實(shí)施例8中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與融合蛋白質(zhì) CspB50TEV-特立帕肽（Proinsulin)(簡(jiǎn)稱50-Teri)的回收率之間的關(guān)系。
[0114] 【圖9-B】圖9-B顯示實(shí)施例8中"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH、"完成pH調(diào)節(jié)的 培養(yǎng)液的上清"以及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中的融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶部 分的照片、以及回收率。
[0115] 【圖10-A】圖IO-A顯示對(duì)實(shí)施例9中"除去菌體的培養(yǎng)液"（相當(dāng)于"步驟⑴中 獲得的溶液"）以及沉淀溶解溶液（相當(dāng)于"步驟（4)中獲得的溶液"）進(jìn)行反相HPLC(測(cè) 定波長(zhǎng)：280nm)而得到的色譜。
[0116] 【圖10-B】圖IO-B顯示對(duì)實(shí)施例9中"除去菌體的培養(yǎng)液"（相當(dāng)于"步驟⑴中 得到的溶液"）以及沉淀溶解溶液（相當(dāng)于"步驟（4)中得到的溶液"）進(jìn)行反相HPLC(測(cè) 定波長(zhǎng)：220nm)而得到的色譜。
[0117] 發(fā)明的【具體實(shí)施方式】
[0118] 本發(fā)明的制造方法是在蛋白質(zhì)上附加用于進(jìn)行純化的序列（以下，也稱作"添加 序列"）、并在利用該添加序列性質(zhì)的方法中屬于利用添加序列本身的性質(zhì)的方法。本發(fā)明 中，使用具有自組裝能力的蛋白質(zhì)序列作為添加序列。
[0119] 本發(fā)明涉及一種融合蛋白質(zhì)的制造方法，其是具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋 白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的制造方法，其包括下述（1)?（4)的步驟：
[0120] (1)制備包含融合蛋白質(zhì)的溶液的步驟；
[0121] (2)將步驟（1)中得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至使回收率達(dá)到10%以上的pH的步驟， 其中，回收率通過下述計(jì)算公式來計(jì)算：
[0122] 回收率（％) =[步驟（4)中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量/{步驟（4)中 得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中的融合蛋白質(zhì)的 量}] XlOO ;
[0123] (3)從步驟⑵中得到的溶液分離固體的步驟；以及、
[0124] (4)將步驟（3)中分離出的固體溶解在溶液中的步驟，所述溶液具有12以下且比 步驟⑵中得到的溶液的pH高0. 1以上的pH。
[0125] 在本發(fā)明的制造方法的步驟（1)中，制備包含具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋 白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的溶液。
[0126] "融合蛋白質(zhì)"包含"具有自組裝能力的蛋白"及"目標(biāo)蛋白質(zhì)"。"具有自組裝能力 的蛋白質(zhì)"可以在"目標(biāo)蛋白質(zhì)的"上游（N末端側(cè)），也可以在下游（C末端側(cè)）。而且，如 后所述，融合蛋白質(zhì)中，在"具有自組裝能力的蛋白質(zhì)"的氨基酸序列與"目標(biāo)蛋白質(zhì)"的氨 基酸序列之間可以包含"用于切割的氨基酸序列"。
[0127] "自組裝能力"是指：在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下蛋白質(zhì)自身發(fā)生集合，形成生理上有意 義的某種高級(jí)結(jié)構(gòu)的能力。
[0128] "具有自組裝能力的蛋白"只要保持自組裝能力即可，可以是完整長(zhǎng)序列，也可以 是部分序列。
[0129] "具有自組裝能力的蛋白"只要保持自組裝能力即可，對(duì)其大小（氨基酸殘基數(shù)） 沒有特殊限制，氨基酸殘基數(shù)優(yōu)選5?1000個(gè)氨基酸、更優(yōu)選5?700個(gè)氨基酸、更優(yōu)選 5?500個(gè)氨基酸。
[0130] "具有自組裝能力的蛋白"只要保持自組裝能力即可，可以是天然蛋白質(zhì)的變體。 例如，可以是在天然蛋白的氨基酸序列中取代、缺失、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸而得到 的蛋白質(zhì)。所述"一個(gè)或多個(gè)"，雖然因氨基酸殘基在蛋白的立體結(jié)構(gòu)中的位置或氨基酸殘 基的種類而異，但優(yōu)選1?20個(gè)、更優(yōu)選1?10個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選1?5個(gè)。
[0131] 氨基酸的取代、缺失、插入或添加可以是能夠維持正常蛋白的自組裝能力的保守 突變。典型的保守突變是保守取代。保守取代是指在下述氨基酸之間進(jìn)行相互取代的突變： 當(dāng)取代部位為芳族氨基酸時(shí)，是指在Phe、Trp、Tyr之間相互取代的突變；當(dāng)取代部位為疏 水性氨基酸時(shí)，是指在Leu、Ile、Val之間相互取代的突變；當(dāng)取代部位為極性氨基酸時(shí)，是 指在Gin、Asn之間相互取代的突變；當(dāng)取代部位為堿性氨基酸時(shí)，是指在Lys、Arg、His之 間相互取代的突變；當(dāng)取代部位為酸性氨基酸時(shí)，是指在Asp、Glu之間相互取代的突變；當(dāng) 取代部位為帶有羥基的氨基酸時(shí)，是指在Ser、Thr之間相互取代的突變。作為可視作保守 取代的取代，具體地可以列舉：從Ala取代為Ser或Thr,從Arg取代為GlruHis或Lys,從 Asn取代為Glu、Gin、Lys、His或Asp,從Asp取代為Asn、Glu或Gln,從Cys取代為Ser或 Ala,從 Gln 取代為 Asn、Glu、Lys、His、Asp 或 Arg,從 Glu 取代為 Gly、Asn、Gln、Lys 或 Asp, 從 Gly 取代為 Pro,從 His 取代為 Asn、Lys、Gln、Arg 或 Tyr，從 Ile 取代為 Leu、Met、Val 或 Phe,從 Leu 取代為 Ile、Met、Val 或 Phe,從 Lys 取代為 Asn、Glu、Gln、His 或 Arg,從 Met 取 代為 lie、Leu、Val 或 Phe,從 Phe 取代為 Trp、Tyr、Met、Ile 或 Leu,從 Ser 取代為 Thr 或 Ala,從Thr取代為Ser或Ala,從Trp取代為Phe或Tyr,從Tyr取代為His、Phe或Trp,以 及從Val取代為Met、Ile或Leu。此外，氨基酸的取代、缺失、插入、或添加還包括通過基于 編碼該蛋白質(zhì)的基因所來源的微生物的個(gè)體差異、種間差異等情形等而天然產(chǎn)生的變體所 產(chǎn)生的氨基酸的取代、缺失、插入、或添加。
[0132] 天然蛋白的變體只要該變體具有自組裝能力即可，相對(duì)于天然蛋白質(zhì)的氨基酸序 列整體，可以具有95%以上的同源性，更優(yōu)選97%以上，特別優(yōu)選99%以上。而且，在本說 明書中，"同源性"（homology)是指"同一丨生"（identity)。
[0133] 此外，編碼"具有自組裝能力的蛋白質(zhì)"的基因只要所編碼的蛋白具有自組裝能力 即可，所述基因可以是與由公知的基因序列制備得到的探針，例如與上述堿基序列的整體 或一部分互補(bǔ)的序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交的DNA。"嚴(yán)謹(jǐn)條件"，是指形成所謂特異性雜 交體，但不形成非特異性雜交體的條件。舉例說明為下述條件：在具有高同源性的DNA之 間、例如具有80 %以上同源性的DNA之間發(fā)生雜交，優(yōu)選具有90 %以上，更優(yōu)選具有95 %以 上，進(jìn)一步優(yōu)選具有97%以上，特別優(yōu)選99%以上，而同源性低于上述的DNA之間則為不發(fā) 生雜交的條件；或者在與常規(guī)DNA印跡雜交（SouthernHybridization)的洗漆條件60°C、 1XSSC、0. 1% SDS相當(dāng)?shù)柠}濃度及溫度下，優(yōu)選在60°C、0. 1XSSC、0. 1% SDS下，更優(yōu)選在 68°C、0. I X SSC、0. 1 % SDS下，洗滌1次更優(yōu)選2?3次的條件。
[0134] 用于上述雜交的探針可以是基因的互補(bǔ)序列的一部分。這樣的探針可以通過PCR 制備，其中PCR以基于公知的基因序列制備的寡聚核苷酸為引物，以包含這些堿基序列的 DNA片段為模板。例如，當(dāng)使用300bp左右長(zhǎng)度的DNA片段作為探針時(shí)，雜交的洗滌條件可 以是例如 50°C、2XSSC、0. 1% SDS。
[0135] 編碼"具有自組裝能力的蛋白質(zhì)"的基因可以直接使用天然型的基因，也可以對(duì)其 進(jìn)行改造，使得所述編碼"具有自組裝能力的蛋白質(zhì)"的基因具有與所使用的宿主的密碼子 的使用頻率相應(yīng)的最適密碼子。
[0136] 作為"具有自組裝能力的蛋白質(zhì)"的具體例子，可以列舉出細(xì)胞表層蛋白質(zhì)、病毒 外殼蛋白質(zhì)、各種馬達(dá)蛋白質(zhì)等。
[0137] 細(xì)胞表層蛋白是細(xì)菌中常見的稱作S_layer(S層）的細(xì)胞表層結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)，已知其在生理?xiàng)l件下自組裝形成層狀的結(jié)構(gòu)（Ilk N，Egelseer EM, Sleytr UB.S-Iayer fusion proteins-construction principles and applications. Curr Opin Biotechnol. 2011 Dec ;22 (6) :824-31. Epub 2011 Jun 21.) 〇
[0138] 作為細(xì)胞表層蛋白的具體例子，可以列舉出：作為源自棒狀桿菌型細(xì)菌的谷氨酸 棒桿菌（C. glutamicum)的PSl以及CspB(PS2)(日本特表平6-502548號(hào)公報(bào)）、源自產(chǎn)氨 棒桿菌的SlpA(CspA)(特開平10-108675號(hào)公報(bào)）等。
[0139] 這其中，優(yōu)選CspB(PS2) (499個(gè)氨基酸殘基）。另外，CspB與PS2意義相同。
[0140] CspB是在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞表層蛋白（Peyret幾，Bayan N，JolifT G, Gulik-Krzywicki T， Mathieu L， Schechter E， Leblon G. ， Characterization of the cspB gene encoding PS2， an ordered surface-layer protein in Corynebacterium glutamicum. Mol Microbiol. 1993 Jul ；9 (I) :97-109.)〇
[0141] 關(guān)于CspB，在各種谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)當(dāng)使含表面活性劑十二烷基硫酸鈉 (SDS)的溶液作用于菌體時(shí)，自組裝的層狀結(jié)構(gòu)被破壞，從而CspB被提取到SDS溶液 中（Hansmeier N， Bartels FW, Ros R， Anselmetti D， Tauch A， Puhler A， Kalinowski J. Classification of hyper-variable Corynebacterium glutamicum surface-layer proteins by sequence analyses and atomic force microscopy. J Biotechnol. 2004 Aug 26 ；112(l-2) :177-93.) 〇
[0142] 作為CspB的具體例子，可以列舉出例如，谷氨酸棒桿菌ATCC13869的CspB。谷氨 酸棒桿囷ATCC13869的CspB基因的喊基序列不于SEQ ID NO: 1，CspB蛋白的氣基酸序列不 于SEQ ID NO :2。SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中，1?30位的氨基酸殘基相當(dāng)于信號(hào) 肽，31?499位的氨基酸殘基相當(dāng)于CspB成熟蛋白質(zhì)（以下也稱作"成熟CspB"或"CspB 成熟蛋白質(zhì)")。除去了信號(hào)肽部分30個(gè)氨基酸殘基的谷氨酸棒桿菌ATCC13869的CspB成 熟蛋白質(zhì)的氣基酸序列不于SEQ ID NO :3。
[0143] SEQ ID NO ：3
[0144] Gln Glu Thr Asn Pro Thr Phe Asn He Asn Asn Gly Phe Asn Asp Ala Asp Gly Ser Thr He Gln Pro Val Glu Pro Val Asn His Thr Glu Glu Thr Leu Arg Asp Leu Thr Asp Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Phe Gln Tyr Gly Asn Val Glu Glu He Val Glu Ala Tyr Leu Gln Val Gln Ala Ser Ala Asp Gly Phe Asp Pro Ser Glu Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Phe Glu Ala Ala Arg Val Arg Ala Ser Gln Glu Leu Ala Ala Ser Ala Glu Thr He Thr Lys Thr Arg Glu Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Ala Asp Arg Glu Ala Thr Ala Ala Phe Glu Ala Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Gln Val Ser Val lie Asn Asp Leu He Ala Asp Ala Asn Ala Lys Asn Lys Thr Asp Phe Ala Glu He Glu Leu Tyr Asp Val Leu Tyr Thr Asp Ala Asp He Ser Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ala Pro Ala Tyr Lys Glu Leu Lys Asp Leu Gln Ala Glu Val Asp Ala Asp Phe Glu Trp Leu Gly Glu Phe Ala He Asp Asn Asn Glu Asp Asn Tyr Val He Arg Thr His He Pro Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala Ala He Asp Ser Leu Val Asp Thr Val Glu Pro Leu Arg Ala Asp Ala He Ala Lys Asn lie Glu Ala Gln Lys Ser Asp Val Leu Val Pro Gln Leu Phe Leu Glu Arg Ala Thr Ala Gln Arg Asp Thr Leu Arg Val Val Glu Ala He Phe Ser Thr Ser Ala Arg Tyr Val Glu Leu Tyr Glu Asn Val Glu Asn Val Asn Val Glu Asn Lys Thr Leu Arg Gln His Tyr Ser Ser Leu He Pro Asn Leu Phe He Ala Ala Val Gly Asn He Asn Glu Leu Asn Asn Ala Asp Gln Ala Ala Arg Glu Leu Phe Leu Asp Trp Asp Thr Asp Leu Thr Thr Asn Asp Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Gln Ala Lys Leu Asp Phe Ala He Glu Thr Tyr Ala Lys lie Leu lie Asn Gly Glu Val Trp Gln Glu Pro Leu Ala Tyr Val Gln Asn Leu Asp Ala Gly Ala Arg Gln Glu Ala Ala Asp Arg Glu Ala Glu Arg Ala Ala Asp Ala Ala Tyr Arg Ala Glu Gln Leu Arg He Ala Gln Glu Ala Ala Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Asn Ala Gly Asn Asn Asp Asn Gly Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp Lys Gly Thr Gly Ser Ser Asp He Gly Thr Trp Gly Pro Phe Ala Ala He Ala Ala He He Ala Ala He Ala Ala He Phe Pro Phe Leu Ser Gly He Val Lys Phe
[0145] 本發(fā)明中所使用的CspB優(yōu)選CspB成熟蛋白質(zhì)、更優(yōu)選CspB成熟蛋白質(zhì)的一部 分。特別是，從融合蛋白質(zhì)的回收率方面出發(fā)，優(yōu)選由從CspB成熟蛋白質(zhì)的N末端起的6? 250個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列。"由N末端起的6?250氨基酸殘基構(gòu)成的序列"是指：從 N末端的第1位的氨基酸殘基開始到第6?250位（該N末端起第6?250位）的氨基酸 殘基為止的氨基酸序列。
[0146] 例如，在CspB成熟蛋白質(zhì)為由SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的情 況下，"由N末端起的6?250氨基酸殘基構(gòu)成的序列"是指：從SEQ ID NO :3的第1位（N 末端）的氨基酸殘基開始到第6?250位（該N末端起第6?250位）的氨基酸殘基為止 的氨基酸序列。
[0147] 更優(yōu)選地是由CspB成熟蛋白質(zhì)的N末端起的6、17、50或250個(gè)氨基酸殘基中的 任意殘基構(gòu)成的序列。
[0148] 而且，氨基酸序列中的"X位（X例如為6、17、50或250) "是指：從該氨基酸序列的 N末端起到第X位止，N末端的氨基酸殘基為第1位的氨基酸殘基。即，上述各氨基酸殘基 的位置表示相對(duì)位置，因氨基酸的缺失、插入、添加等，其位置有時(shí)前后變化。
[0149] 例如，在CspB成熟蛋白質(zhì)為由SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的情 況下，"N末端起的50位氨基酸殘基"是指：相當(dāng)于SEQ ID NO :3中的第50位的氨基酸殘 基，在比第50位更接近N末端的1個(gè)氨基酸殘基發(fā)生缺失的情況下，將從N末端起到第49 位止的氨基酸殘基作為"N末端起的50位的氨基酸殘基"。此外，在比50位更接近N末端 插入1個(gè)氨基酸殘基的情況下，將從N末端起到第51位止的氨基酸殘基作為"N末端起的 50位的氨基酸殘基"。
[0150] 因棒狀桿菌型細(xì)菌所屬的種或菌株，cspB基因的核酸序列有時(shí)存在差異。因此， cspB基因只要所編碼的蛋白具有自組裝能力即可，可以是上述核酸序列的變體。cspB基因 的變體包括該基因的同源物。CSPB基因的同源物，例如可以通過使用上述的谷氨酸棒桿菌 ATCCl3869 的 cspB 基因 （SEQ ID NO :1)作為查詢序列（query sequence)的 BLAST 檢索、 FASTA檢索容易從公開數(shù)據(jù)庫中獲得，此外，cspB基因的同源物也可以通過以棒狀桿菌型 細(xì)菌的染色體作為模板、使用基于這些公知基因序列制作的寡聚核苷酸作為引物的PCR來 獲取。
[0151] "目標(biāo)蛋白質(zhì)"沒有特殊限制，包含源自微生物、植物、動(dòng)物或病毒的所有天然蛋 白、人工設(shè)計(jì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
[0152] 此外，"目標(biāo)蛋白質(zhì)"在與產(chǎn)生該蛋白的宿主的關(guān)系方面，可以是同種蛋白質(zhì)，也可 以是異種蛋白質(zhì)。
[0153] 目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是單體蛋白，也可以是多聚體（multimer)蛋白。
[0154] 多聚體蛋白是指能夠以由2個(gè)或2個(gè)以上的亞基構(gòu)成的多聚體的形式存在的蛋 白。在多聚體中，各亞基可以通過二硫鍵等共價(jià)鍵連接，也可以通過氫鍵、疏水性相互作用 等非共價(jià)鍵連接，還可以通過上述連接的組合進(jìn)行連接。多聚體可以是由單一種類的亞基 構(gòu)成的同型多聚體，也可以是由2種或2種以上的亞基構(gòu)成的異源多聚體。而且，在多聚體 蛋白為異源多聚體的情況下，構(gòu)成多聚體的亞基中，可以至少1個(gè)亞基是異種蛋白。即，可 以是全部亞基源自異種，也可以是僅一部分的亞基源自異種。
[0155] 目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是天然分泌性的蛋白，也可以是天然非分泌性的蛋白，優(yōu)選天然 分泌性的蛋白。
[0156] 通過本發(fā)明制造的目標(biāo)蛋白質(zhì)可以僅為1種，也可以為2種以上。此外，目標(biāo)蛋白 質(zhì)為異源多聚體的情況下，可以僅生產(chǎn)1種亞基，也可以生產(chǎn)2種類以上的亞基。
[0157] 目標(biāo)蛋白質(zhì)只要在使用的宿主中能夠表達(dá)即可，對(duì)其大?。ò被釟埢鶖?shù)）沒有 特殊限制，氨基酸殘基數(shù)優(yōu)選10?1000、更優(yōu)選10?500、進(jìn)一步優(yōu)選10?300。
[0158] 目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是天然蛋白質(zhì)的變體。上述的關(guān)于"具有自組裝能力的蛋白質(zhì)"的 變體的記載也適用于目標(biāo)蛋白質(zhì)和編碼它的基因。
[0159] 此外，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因根據(jù)需要可以變換成適于宿主的密碼子使用頻率的 最適密碼子。
[0160] 作為目標(biāo)蛋白質(zhì)，可以列舉出例如，生理活性蛋白質(zhì)、受體蛋白質(zhì)、作為疫苗使用 的抗原蛋白質(zhì)、酶。
[0161] 作為生理活性蛋白，可以列舉出例如，生長(zhǎng)因子（增殖因子）、激素、細(xì)胞因子、抗 體關(guān)聯(lián)分子。
[0162] 作為生長(zhǎng)因子（增殖因子），具體例如表皮生長(zhǎng)因子（Epidermal growth factor ; EGF)可以列舉出，胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (Insulin-like growth factor-1 ;IGF_1)、轉(zhuǎn)化 生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor ;TGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（Nerve growth factor; NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor ;BDNF)、血管內(nèi)皮 細(xì)胞增殖因子（Vesicular endothelial growth factor ;VEGF)、粒細(xì)胞集落刺激因 子（Granulocyte-colony stimulating factor ;G_CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor ;GM_CSF)、血小板來源生長(zhǎng)因子 (Platelet-derived growth factor fDGF)、促紅細(xì)胞生成素 （Erythropoietin ;ΕΡ0)、血小 板生成素（Thrombopoietin;TPO)、酸性成纖維細(xì)胞增殖因子（acidic fibroblast growth factor ;aFGF或 FGF1)、喊性成纖維細(xì)胞增殖因子（basic fibroblast growth factor; bFGF 或 FGF2)、角質(zhì)細(xì)胞增殖因子（keratinocyto growth factor;KGF_l 或 FGF7，KGF_2 或 FGF10)、肝細(xì)胞增殖因子（Hepatocyte growth factor ;HGF)。
[0163] 作為激素，具體可以列舉出例如，胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)激素抑制素 (somatostatin)、人生長(zhǎng)激素 （human growth hormone ;hGH)、甲狀旁腺素 （parathyroid hormone ;PTH)、降血I丐素（calcitonin)。
[0164] 作為細(xì)胞因子，具體可以列舉出例如，白細(xì)胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor ;TNF) 〇
[0165] 而且，生長(zhǎng)因子（增殖因子）、激素、及細(xì)胞因子之間也可以不進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貐^(qū)分。例 如，生理活性蛋白質(zhì)可以屬于選自生長(zhǎng)因子（增殖因子）、激素、和細(xì)胞因子中任何一個(gè)組， 也可以屬于選自它們中的多個(gè)組。
[0166] 此外，生理活性蛋白可以是蛋白質(zhì)全長(zhǎng)，也可以是其一部分。作為蛋白質(zhì)的一部 分，可以列舉出例如，具有生理活性的部分。作為具有生理活性的部分，具體可以列舉出例 如，由甲狀旁腺素 （parathyroid hormone ;PTH)成熟體的N末端34個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的特 立帕肽（特立帕肽）。
[0167] 而且，目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是生理活性蛋白的一部分，但可以不具有生理活性。該情況 下，在獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)后，通過進(jìn)行必要的修飾（例如，氨基酸序列的添加），能夠使其成為 生理活性蛋白。作為具體例子可以列舉出，生理活性蛋白比伐盧定（Bivalirudin) (20個(gè)氨 基酸）的一部分（18 個(gè)氨基酸殘基）的肽（Bival8) (SEQ ID NO :93 :Arg Pro Gly Gly Gly Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu He Pro Glu Glu Tyr Leu) 〇
[0168] 作為抗體關(guān)聯(lián)分子，具體可以列舉出例如，完整抗體、Fab、F(ab'）、F(ab'）2、Fc、 由重鏈（Η鏈）和輕鏈（L鏈）構(gòu)成的二聚體、Fe融合蛋白質(zhì)、重鏈（Η鏈）、輕鏈（L鏈）。
[0169] 對(duì)于受體蛋白質(zhì)沒有特殊限制，可以是例如，生理活性蛋白、其他生理活性物質(zhì)的 受體蛋白質(zhì)。作為其他生理活性物質(zhì)，可以列舉出例如，多巴胺等神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)。此外，受 體蛋白可以是對(duì)應(yīng)配基未知的孤兒受:體。
[0170] 可作為疫苗使用的抗原蛋白質(zhì)能夠激起免疫應(yīng)答即可，沒有特殊限制，可以根據(jù) 假想的免疫應(yīng)答的對(duì)象進(jìn)行適宜選擇。
[0171] 作為酶，可以列舉出例如，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、蛋白酶、內(nèi)肽酶、外肽酶、氨基肽酶、羧基 肽酶、膠原酶、幾丁質(zhì)酶等。
[0172] 目標(biāo)蛋白質(zhì)可以是添加了前體結(jié)構(gòu)部分的蛋白（前蛋白）。在目標(biāo)蛋白質(zhì)為前蛋 白的情況下，通過切割其前體結(jié)構(gòu)部分可以成為成熟蛋白。
[0173] 前體結(jié)構(gòu)部分的切割可以與本發(fā)明的制造方法中的步驟（4)同時(shí)、在步驟（4)中 途、或在步驟（4)之后進(jìn)行。
[0174] "與步驟（4)同時(shí)"是指：在步驟（4)使用的"具有12以下且比步驟（2)中得到的 溶液的pH高0. 1以上的pH的溶液"中預(yù)先添加用于前體結(jié)構(gòu)部分的切割的試劑（例如，后 述的蛋白酶），使用該溶液同時(shí)進(jìn)行步驟（4)及前體結(jié)構(gòu)部分的切割。
[0175] "在步驟（4)中途"是指：不在步驟（4)使用的"具有12以下且比步驟（2)中得到 的溶液的pH高0. 1以上的pH的溶液"中添加用于前體結(jié)構(gòu)部分的切割的試劑而開始步驟 (4)，而在步驟（4)的中途添加所述試劑，進(jìn)行前體結(jié)構(gòu)部分的切割。
[0176] "在步驟（4)之后"是指：在步驟（4)結(jié)束后，使用用于前體結(jié)構(gòu)部分的切割試劑， 進(jìn)行前體結(jié)構(gòu)部分的切割。
[0177] 前體結(jié)構(gòu)部分的切割可以利用例如蛋白酶來進(jìn)行。在使用蛋白酶的情況下，從最 終得到的蛋白的活性的觀點(diǎn)出發(fā)，通常優(yōu)選前蛋白在與天然蛋白基本相同的位置進(jìn)行切 害I]，更優(yōu)選在與天然蛋白完全相同的位置進(jìn)行切割而得到與天然相同的成熟蛋白。因此，一 般地，最優(yōu)選在產(chǎn)生與天然產(chǎn)生的成熟蛋白相同蛋白質(zhì)的位置上用于對(duì)前蛋白進(jìn)行切割的 特異性蛋白酶。
[0178] 除了 proTEVprotease(Promega公司制造）這樣的可商業(yè)性地購(gòu)入的產(chǎn)品之外，蛋 白酶還包括從微生物的培養(yǎng)液、例如由放線菌的培養(yǎng)液等得到的那些蛋白酶。那樣的蛋白 酶可以以未純化的狀態(tài)使用，也可以根據(jù)需要純化到適當(dāng)純度后使用。
[0179] 具有自組裝能力的蛋白與目標(biāo)蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)可以通過將該融合蛋白質(zhì)的 表達(dá)用基因構(gòu)建物在宿主中表達(dá)來獲得。
[0180] 作為"宿主"只要能夠表達(dá)融合蛋白質(zhì)，就沒有特殊限制，可以使用所有種類的細(xì) 菌、細(xì)菌以外的微生物、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞等。
[0181] 在使用在菌體內(nèi)蓄積融合蛋白質(zhì)的宿主的情況下，為了制備步驟（1)的溶液，進(jìn) 行破碎菌體的處理。能夠?qū)⑷诤系鞍踪|(zhì)分泌至細(xì)胞外的宿主無需進(jìn)行相關(guān)破碎處理，故優(yōu) 選。
[0182] 作為細(xì)菌，可以使用例如，棒狀桿菌型細(xì)菌、大腸桿菌等。
[0183] 作為細(xì)菌以外的微生物，可以使用例如酵母等。
[0184] 作為昆蟲細(xì)胞，可以使用家蠶等，作為動(dòng)物細(xì)胞可以使用CHO細(xì)胞等。
[0185] 這其中，優(yōu)選棒狀桿菌型細(xì)菌。
[0186] "棒狀桿菌型細(xì)菌"是指需氧性戈蘭氏陽性桿菌。作為具體例子，可以列舉出棒桿 菌屬細(xì)菌、短桿菌屬細(xì)菌、和微桿菌屬細(xì)菌等。而且，棒狀桿菌型細(xì)菌還包括目前被分類在 短桿菌屬、現(xiàn)在被整合到棒桿菌屬的細(xì)菌（Int. J. Syst. Bacteriol. ,41,255(1991))。
[0187] 作為使用棒狀桿菌型細(xì)菌的優(yōu)點(diǎn)，可以列舉出：與目前用于分泌生產(chǎn)目標(biāo)蛋白質(zhì) 的絲狀真菌、酵母、芽孢桿菌屬（Bacillus)細(xì)菌等相比，本來分泌至菌體外的雜質(zhì)蛋白極 少，可以期待分泌生產(chǎn)融合蛋白質(zhì)時(shí)的純化步驟的簡(jiǎn)略化、省略化；此外，在含有糖、氨和無 機(jī)鹽等的簡(jiǎn)單培養(yǎng)基中即可良好地生長(zhǎng)繁育，在培養(yǎng)基費(fèi)用、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)生產(chǎn)率方面優(yōu) 越;等等。
[0188] 作為棒狀桿菌型細(xì)菌，具體可以列舉出如下述的菌種。
[0189] 嗜乙酸乙酸棒桿菌（Corynebacterium acetoacidophiIum)
[0190] 醋谷棒桿菌（Corynebacterium acetoglutamicum)
[0191] 解焼棒桿菌（Corynebacterium alkanolyticum)
[0192] 美棒桿菌（Corynebacterium callunae)
[0193] 谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum)
[0194] 百合花棒桿菌（Corynebacterium Iilium)
[0195] 棲糖蜜棒桿菌（Corynebacterium melassecola)
[0196] 熱產(chǎn)氛棒桿菌（有效棒桿菌）（Corynebacterium thermoaminogenes (Corynebacterium efficiens))
[0197] 力士棒桿菌（Corynebacterium herculis)
[0198] 叉開短桿菌（Brevibacterium divaricatum)
[0199] 黃短桿菌（Brevibacterium flavum)
[0200] 未成熟短桿菌（Brevibacterium immariophilum)
[0201] 乳糖發(fā)酵短桿菌（谷氨酸棒桿菌）（Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium Glutamicum))
[0202] 玫瑰色短桿菌（Brevibacterium roseum)
[0203] 解糖短桿菌（Brevibacterium saccharolyticum)
[0204] 硫殖短桿菌（Brevibacterium thiogenitalis)
[0205] 產(chǎn)氨短桿菌（Corynebacterium ammoniagenes)
[0206] 白色桿菌（Brevibacterium album)
[0207] 錯(cuò)狀短桿菌（Brevibacterium cerinum)
[0208] 嗜氨微桿菌（Microbacterium ammoniaphilum)
[0209] 作為棒狀桿菌型細(xì)菌，具體可以列舉出如下菌株。
[0210] 嗜乙酉先乙酸棒桿菌 ATCC13870 (Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870)
[0211] 醋谷棒桿菌 ATCC15806 (Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806)
[0212] 解焼棒桿菌 ATCC21511 (Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511)
[0213] 美棒桿菌 ATCC15991 (Corynebacterium callunae ATCC15991)
[0214] 谷氨酸棒桿菌 ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060(Corynebacterium glutamicumATCC13020, ATCC13032, ATCC13060)
[0215] 百合花棒桿菌 ATCC15990 (Corynebacterium lilium ATCC15990)
[0216] 棲糖蜜棒桿菌 ATCC17965 (Corynebacterium melassecola ATCC17965)
[0217] 嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌 FERM BP-1539 (Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539)
[0218] 力士棒桿菌 ATCC13868 (Corynebacterium herculis ATCC13868)
[0219] 叉開短桿菌 ATCC14020 (Brevibacterium divaricatum ATCC14020)
[0220] 黃色短桿菌 ATCC13826, ATCC14067, FERM BP-2205 (fcevibacterium flavum ATCC13826, ATCC14067,FERM BP-2205)
[0221] 未成熟短桿菌 ATCC14068 (Brevibacterium immariophi Ium ATCC14068)
[0222] 乳糖發(fā)酵短桿菌 ATCC13869 (Brevibacterium lactofermentum ATCC13869)
[0223] 玫瑰色短桿菌 ATCC13825 (Brevibacterium roseum ATCC13825)
[0224] 解糖短桿菌 ATCCl4O66 (Brevibacterium saccharolyticum ATCCl4O66)
[0225] 硫殖短桿菌 ATCC19240 (Brevibacterium thiogenitalis ATCC19240)
[0226] 產(chǎn)氨短桿菌 ATCC6871, ATCC6872 (Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872)
[0227] 白色棒桿菌 ATCC15111 (Brevibacterium album ATCC15111)
[0228] 錯(cuò)狀短桿菌 ATCC15112 (Brevibacterium cerinum ATCC15112)
[0229] 嗜氨微桿菌 ATCC15354 (Microbacterium ammoniaphiIum ATCC15354)
[0230] 從野生株谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)ATCC13869作為鏈霉素（Sm)抗性突變株 分離得到的谷氨酸棒桿菌FERM BP-734與其親本株（野生株）相比，推測(cè)參與蛋白的分泌 的功能基因中存在突變，異種蛋白的分泌生產(chǎn)能力極高，在最適培養(yǎng)條件下的蓄積量為約 2?3倍，適合作為宿主菌。
[0231] 將上述的棒狀桿菌型細(xì)菌作為親本株，利用突變法、基因重組法選擇蛋白的分泌 生產(chǎn)能力提高的株，可以用作宿主。例如，可以在用紫外線照射或N-甲基-Ν'-亞硝基胍等 化學(xué)突變劑進(jìn)行處理后，選擇蛋白的分泌生產(chǎn)能力提高的株。
[0232] 而且，如果將進(jìn)行了改造的菌株用作宿主，所述改造使得所述菌株不產(chǎn)生細(xì)胞表 層蛋白，則容易對(duì)分泌至培養(yǎng)基中或菌體表層的異種蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，故特別優(yōu)選。所述改 造可以通過采用突變法或基因重組法在染色體上的細(xì)胞表層蛋白的編碼區(qū)域或其表達(dá)調(diào) 節(jié)區(qū)域?qū)胪蛔儊磉M(jìn)行。作為進(jìn)行了改造而使得菌株不生產(chǎn)細(xì)胞表層蛋白的棒狀桿菌型細(xì) 菌，可以列舉出谷氨酸棒桿菌AJ12036(FERM ΒΡ-734)的細(xì)胞表層蛋白CspB(PS2)缺損株谷 氨酸棒桿菌（C. glutamicum)YDK010 株（W02004/029254)。
[0233] 在將具有自組裝能力的蛋白質(zhì)配置在目標(biāo)蛋白質(zhì)的上游的情況下，"融合蛋白質(zhì) 的表達(dá)用基因構(gòu)建物"包括：在宿主中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列、連接于該啟動(dòng)子序列下游的 對(duì)在宿主中發(fā)揮功能的信號(hào)肽進(jìn)行編碼的核酸序列、連接于該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游 的對(duì)具有自組裝能力的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸序列及連接于該編碼具有自組裝能力的蛋 白質(zhì)的核酸序列下游的對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸序列。此外，在將具有自組裝能力的 蛋白質(zhì)配置在目標(biāo)蛋白質(zhì)下游的情況下，"融合蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因構(gòu)建物"包括：在宿主 中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子序列、連接于該啟動(dòng)子序列下游的對(duì)在宿主中發(fā)揮功能的信號(hào)肽進(jìn)行 編碼的核酸序列、連接于該編碼信號(hào)肽的核酸序列下游的對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的核酸序 列及連接于該編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列下游的對(duì)具有自組裝能力的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的 核酸序列。而且，在使融合蛋白質(zhì)蓄積于菌體內(nèi)的情況下，不需要編碼信號(hào)肽的核酸序列。
[0234] 編碼信號(hào)肽的核酸序列可以連接在啟動(dòng)子序列的下游，并使得信號(hào)肽的表達(dá)受該 啟動(dòng)子的調(diào)控。
[0235] 在將具有自組裝能力的蛋白配置在目標(biāo)蛋白質(zhì)的上游的情況下，編碼具有自組裝 能力的蛋白質(zhì)的核酸序列可以連接在編碼信號(hào)肽的核酸序列的下游，使得該具有自組裝能 力的蛋白與該信號(hào)肽連續(xù)地表達(dá)即可。而且，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列可以連接在編碼 具有自組裝能力的蛋白的核酸序列的下游，使得該目標(biāo)蛋白質(zhì)與該具有自組裝能力的蛋白 連續(xù)地表達(dá)即可。
[0236] 在將具有自組裝能力的蛋白配置在目標(biāo)蛋白質(zhì)的下游的情況下，編碼目標(biāo)蛋白質(zhì) 的核酸序列可以連接在編碼信號(hào)肽的核酸序列的下游，并使得該目標(biāo)蛋白質(zhì)與該信號(hào)肽連 續(xù)地表達(dá)即可。而且，編碼具有自組裝能力的蛋白的核酸序列可以連接在編碼目標(biāo)蛋白質(zhì) 的核酸序列的下游，使得該具有自組裝能力的蛋白與該目標(biāo)蛋白質(zhì)連續(xù)地表達(dá)即可。
[0237] 為了使融合蛋白質(zhì)基因在宿主中表達(dá)基因構(gòu)建物可以具有有效的調(diào)控序列（操 縱子、終止子等），并位于它們能夠發(fā)揮功能的合適位置上。
[0238] "啟動(dòng)子"只要能夠在所使用的宿主中發(fā)揮功能，就沒有特殊限制，可以是宿主來 源的啟動(dòng)子，也可以是異種來源的啟動(dòng)子。
[0239] 例如，在使用棒狀桿菌型細(xì)菌作為宿主的情況下，啟動(dòng)子是在棒狀桿菌型細(xì)菌中 發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。
[0240] "在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子"是指在棒狀桿菌型細(xì)菌中具有啟動(dòng)子 活性的啟動(dòng)子。
[0241] 作為棒狀桿菌型細(xì)菌來源的啟動(dòng)子，可以列舉出例如，細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的PS1、 CspB(也稱PS2)、SlpA(也稱CspA)基因的啟動(dòng)子、或各種氨基酸生物合成系基因的啟動(dòng)子。
[0242] 作為各種氨基酸生物合成系基因的啟動(dòng)子，具體可以列舉出例如，谷氨酸生物合 成系的谷氨酸脫氫酶基因、谷氨酰胺合成系的谷氨酰胺合成酶基因、賴氨酸生物合成系的 天冬氨酸激酶基因、蘇氨酸生物合成系的高絲氨酸脫氫酶基因、異亮氨酸及纈氨酸生物合 成系的乙酰羥酸合成酶基因、亮氨酸生物合成系的2-異丙基蘋果酸合成酶基因、脯氨酸 和精氨酸生物合成系的谷氨酸激酶基因、組氨酸生物合成系的磷酸核糖基-ATP焦磷酸化 酶基因、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成系的脫氧阿拉伯庚酮糖磷 酸（DAHP)合成酶基因、肌苷酸和鳥苷酸這樣的核酸生物合成系中的磷酸核糖基焦磷酸酯 (PRPP)酰胺轉(zhuǎn)移酶基因、肌苷酸脫氫酶基因、和鳥苷酸合成酶基因的啟動(dòng)子。
[0243] 作為棒狀桿菌型細(xì)菌的異種的啟動(dòng)子，具體可以列舉出例如，tac啟動(dòng)子、Iac啟 動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、及araBAD啟動(dòng)子等E. coli來源的啟動(dòng)子。這其中，優(yōu)選tac啟動(dòng)子等 強(qiáng)力啟動(dòng)子，也優(yōu)選araBAD啟動(dòng)子等誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0244] 通過使用各種報(bào)告基因，可以獲得通常的啟動(dòng)子的高活性型并加以利用。例如， 通過使啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的-35、-10區(qū)域靠近共有序列，能夠提高啟動(dòng)子的活性（國(guó)際公開第 00/18935號(hào)）。啟動(dòng)子的強(qiáng)度評(píng)價(jià)方法以及強(qiáng)力啟動(dòng)子的例子記載于Goldstein等的論文 (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev. , 1,105-128 (1995)) 等中。而且，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)域、特別是起始密碼子 臨近上游的序列（5' -UTR)中多個(gè)核苷酸的取代或插入或缺失對(duì)mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率 有非常大的影響，可以對(duì)其進(jìn)行修飾。
[0245] 在本發(fā)明中，優(yōu)選宿主以分泌性蛋白質(zhì)（secretory protein)的形式產(chǎn)生融合蛋 白質(zhì)。
[0246] 已知分泌性蛋白質(zhì)一般以前蛋白（也稱前肽）或前蛋白原（也稱前肽原）的形式 被翻譯，然后通過加工而成為成熟蛋白（mature protein)。具體而言，分泌性蛋白一般以前 蛋白或前蛋白原的形式被翻譯后，作為前體部分的信號(hào)肽被蛋白酶（一般稱為信號(hào)肽酶） 切割而轉(zhuǎn)化為成熟蛋白或前蛋白被分泌，前蛋白原進(jìn)一步被蛋白酶切割除去前體部分而成 為成熟蛋白。
[0247] 因此，本發(fā)明中為了利用宿主進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的分泌生產(chǎn)而利用信號(hào)肽。需要說 明的是，在本說明書中，有時(shí)將分泌性蛋白的前蛋白和前蛋白原統(tǒng)稱為"分泌性蛋白前體"。
[0248] "信號(hào)肽"（以下也稱為"信號(hào)序列"）是指：存在于分泌性蛋白質(zhì)前體的N末端，且 通常在天然成熟蛋白中不存在的氨基酸序列。
[0249] 對(duì)本發(fā)明中使用的信號(hào)肽沒有特殊限制，只要是在宿主中發(fā)揮功能的信號(hào)肽即 可，可以是宿主來源的信號(hào)肽，也可以是異種來源的信號(hào)肽。
[0250] 例如，在使用棒狀桿菌型細(xì)菌作為宿主的情況下，信號(hào)肽是在棒狀桿菌型細(xì)菌中 發(fā)揮功能的信號(hào)肽。
[0251] "在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽"是指：連接于融合蛋白質(zhì)的N末端時(shí)， 使棒狀桿菌型細(xì)菌能夠分泌融合蛋白質(zhì)的肽。
[0252] 作為在棒狀桿菌型細(xì)菌中發(fā)揮功能的信號(hào)肽，優(yōu)選宿主棒狀桿菌型細(xì)菌的分泌 性蛋白質(zhì)的信號(hào)肽，更優(yōu)選棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)的信號(hào)肽。作為棒狀桿菌 型細(xì)菌的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)，可以列舉出源自谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)的PSl以及 CspB (PS2)(日本特表平 6-502548 號(hào)公報(bào)）、以及源自 C. ammoniagenes 的 SlpA (CspA)(日 本特開平10-108675號(hào)公報(bào)）。PSl的信號(hào)肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO :4, CspB (PS2) 的信號(hào)肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO :5，SlpA(CspA)的信號(hào)肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO :6。此外，根據(jù)美國(guó)專利第4965197號(hào)說明書，提到源自棒狀桿菌型細(xì)菌的DNase也有信 號(hào)肽，這樣的信號(hào)肽也可以在本發(fā)明中利用。
[0253] 信號(hào)肽具有跨越生物種的一定的共有序列上的特征，但并不是說某生物種中顯示 分泌功能的信號(hào)肽一定能夠在其他生物種中發(fā)揮分泌功能。因而，在利用異種來源的信號(hào) 肽的情況下，可以適宜地選擇在使用宿主中發(fā)揮功能的那些信號(hào)肽。某種信號(hào)肽是否在使 用的宿主中發(fā)揮功能，可以例如通過使目標(biāo)蛋白質(zhì)與該信號(hào)肽融合并表達(dá)、并考察該蛋白 是否分泌來確認(rèn)。
[0254] -般在翻譯產(chǎn)物被分泌至菌體外時(shí)，信號(hào)序列被信號(hào)肽酶切割。信號(hào)肽酶可以利 用宿主本來具有的那些信號(hào)肽酶，也可以將編碼能夠在所使用的宿主中發(fā)揮功能的信號(hào)肽 酶的基因?qū)胨拗髦小?br> [0255] 編碼信號(hào)肽的基因可以直接使用天然型的，也可以根據(jù)所使用的宿主的密碼子使 用頻率對(duì)所述基因進(jìn)行改造，使得所述基因具有最適密碼子。
[0256] 在分泌表達(dá)融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物中，在將具有自組裝能力的蛋白質(zhì)配置在目 標(biāo)蛋白質(zhì)的上游的情況下，在編碼信號(hào)肽的核酸序列與編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列之間插 入編碼具有自組裝能力的蛋白質(zhì)的核酸序列（添加序列）。在將具有自組裝能力的蛋白質(zhì) 配置在目標(biāo)蛋白質(zhì)下游的情況下，編碼具有自組裝能力的蛋白質(zhì)的核酸序列（添加序列） 插入編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列的下游。
[0257] 需要說明的是，編碼添加序列的核酸序列與編碼目標(biāo)蛋白質(zhì)的核酸序列之間，還 可以包含編碼用于酶切割或化學(xué)切割的氨基酸序列的核酸序列。通過將用于酶的或化學(xué)的 切割的氨基酸序列插入融合蛋白質(zhì)，可以對(duì)表達(dá)后的融合蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切割或化學(xué)切割， 從而得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。
[0258] 切割可以按照常規(guī)方法采用酶法或化學(xué)法進(jìn)行。
[0259] 切割步驟可以與步驟（4)同時(shí)進(jìn)行、或在步驟（4)中途進(jìn)行、或在步驟（4)之后進(jìn) 行。
[0260] "與步驟（4)同時(shí)"是指：在步驟（4)使用的"具有12以下且比步驟（2)中得到的 溶液的pH高0. 1以上的pH的溶液"中預(yù)先添加切割試劑（例如，后述的用于酶切的蛋白 酶），使用該溶液同時(shí)進(jìn)行步驟（4)與切割步驟。
[0261] "在步驟（4)期間中途"是指：不在步驟（4)使用的"具有12以下且比步驟（2)中 得到的溶液的PH高0. 1以上的pH的溶液"中添加切割試劑而開始步驟（4)，在步驟（4)中 途添加所述試劑來進(jìn)行切割步驟。
[0262] "在步驟（4)之后"是指：步驟（4)結(jié)束后，使用切割試劑來進(jìn)行切割步驟。
[0263] 切割步驟后，通過采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法，可以容易地從具有自組裝能 力的蛋白分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。此時(shí)，可以與步驟（2)同樣地進(jìn)行，對(duì)經(jīng)過切割步驟后的溶液的 PH進(jìn)行調(diào)節(jié)，僅使具有自組裝能力的蛋白質(zhì)沉淀，與步驟（3)同樣地僅將具有自組裝能力 的蛋白質(zhì)以固體的形式分離。
[0264] 對(duì)用于酶切的氨基酸序列沒有特殊限制，只要是被水解肽鍵的酶識(shí)別并切割的序 列即可，可以根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列適宜選擇可使用的序列。編碼用于酶切的氨基 酸序列的核酸序列基于該氨基酸序列適宜設(shè)定即可，此外，可以例如根據(jù)宿主的密碼子使 用頻率使用最適密碼子。
[0265] 用于酶切的氨基酸序列優(yōu)選是底物特異性高的蛋白酶的識(shí)別序列。作為這樣的氨 基酸序列，具體可以列舉出例如，F(xiàn)actor Xa蛋白酶的識(shí)別序列、proTEV蛋白酶的識(shí)別序列、 胰蛋白酶的識(shí)別序列。Factor Xa蛋白酶識(shí)別蛋白中的Ile-Glu-Gly-Arg( =IEGR) (SEQ ID NO :7)的氨基酸序列，proTEV蛋白酶識(shí)別蛋白中的Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln( = ENLYFQ) (SEQ ID NO :8)的氨基酸序列，特異性地對(duì)各序列的C末端進(jìn)行切割。胰蛋白酶對(duì)蛋白中 的Lys和Arg進(jìn)行識(shí)別，特異性對(duì)Lys和Arg的C末端進(jìn)行切割。
[0266] 對(duì)用于化學(xué)切割的氨基酸序列沒有特殊限制，只要采用能夠在化學(xué)反應(yīng)條件下被 切割的序列即可，可以根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列適宜選擇能夠使用的序列。編碼用于 化學(xué)切割的氨基酸序列的核酸序列可以基于該氨基酸序列適宜設(shè)定，此外，例如可以根據(jù) 宿主的密碼子使用頻率來使用最適密碼子。
[0267] 用于化學(xué)切割的氨基酸序列優(yōu)選發(fā)生高特異性切割的序列。作為這樣的氨基酸序 列的切割部位，具體地可以列舉出例如Met。若利用溴化氰分解法，則在Met的C末端側(cè)發(fā) 生切割。
[0268] "融合蛋白質(zhì)的表達(dá)用基因構(gòu)建物"可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法來構(gòu)建。
[0269] 對(duì)將基因構(gòu)建物導(dǎo)入宿主的方法沒有特殊限制，可以使用一般使用的方法，例 如原生質(zhì)體法（Gene，39, 281-286 (1985))、電穿孔法（Bio/Technology，7,1067-1070) (1989))等。
[0270] 在宿主為細(xì)菌的情況下，基因構(gòu)建物可以存在于像質(zhì)粒那樣地在染色體外自主增 殖的載體上，也可以整合在染色體上。
[0271] 例如，在將基因構(gòu)建物用載體導(dǎo)入作為宿主的棒狀桿菌型細(xì)菌的情況下，對(duì)載 體沒有特殊限制，只要載體能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制即可，例如，源自細(xì)菌質(zhì)粒 的載體、源自酵母質(zhì)粒的載體、源自噬菌體的載體、粘粒、噬菌粒等。作為載體，優(yōu)選源 自棒狀桿菌型細(xì)菌的質(zhì)粒。作為在棒狀桿菌型細(xì)菌中可自主復(fù)制的載體，具體地可以列 舉出，pHM1519 (Agric，Biol. Chem.，48, 2901-2903 (1984)) ;pAM330 (Agric. Biol. Chem.， 48,2901-2903(1984));對(duì)其進(jìn)行改造而得到的具有藥劑抗性基因的質(zhì)粒；日本特開平 3-210184號(hào)公報(bào)所述的質(zhì)粒pCRY30 ;日本特開平2-72876號(hào)公報(bào)以及美國(guó)專利5185262號(hào) 說明書公報(bào)所述的質(zhì)粒pCRY21、pCRY2KE、pCRY2KX、pCRY31、pCRY3KE以及pCRY3KX ;日本特 開平1-191686號(hào)公報(bào)所述的質(zhì)粒pCRY2和pCRY3 ;特開昭58-192900號(hào)公報(bào)所述的pAJ655、 PAJ611以及pAJ1844 ;日本特開昭57-134500號(hào)公報(bào)所述的pCGl ;特開昭58-35197號(hào)公報(bào) 所述的PCG2 ;特開昭57-183799號(hào)公報(bào)所述的pCG4和pCGll等。
[0272] 基因構(gòu)建物的導(dǎo)入也可以利用人工轉(zhuǎn)座子等。在使用轉(zhuǎn)座子的情況下，基因構(gòu)建 物通過同源重組或其自身的轉(zhuǎn)移能力被導(dǎo)入到染色體上。此外，作為利用同源重組的導(dǎo)入 法，可以列舉出例如，使用直鏈狀DNA、含溫度敏感型復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒、可接合轉(zhuǎn)導(dǎo)的質(zhì)粒、 在宿主內(nèi)不具有發(fā)揮功能的復(fù)制起點(diǎn)的自殺載體等的方法。而且，在融合蛋白質(zhì)基因被導(dǎo) 入染色體上的情況下，只要染色體上構(gòu)成基因構(gòu)建物即可，選自該基因構(gòu)建物中所包含的 啟動(dòng)子序列、編碼信號(hào)肽的核酸序列、以及編碼添加序列的核酸序列中的1個(gè)以上的序列 可以原本就存在于宿主的染色體上。例如，可以通過直接利用宿主的染色體上本來存在的 啟動(dòng)子序列以及連接于該啟動(dòng)子序列的下游的編碼信號(hào)肽的核酸序列，用編碼添加序列與 目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的核酸序列僅對(duì)連接于編碼該信號(hào)肽的核酸序列下游的基 因進(jìn)行取代，能夠在染色體上構(gòu)成基因構(gòu)建物。
[0273] 在制造 2種以上的目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，用于表達(dá)各蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物可以保 持在宿主中，使得各蛋白的表達(dá)能夠?qū)崿F(xiàn)。例如，用于表達(dá)各蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物可以全部 保持在單一表達(dá)載體上，也可以全部保持在染色體上。此外，各蛋白的表達(dá)用基因構(gòu)建物可 以分別保持在多個(gè)表達(dá)載體上，也可以分別保持在單一或多個(gè)表達(dá)載體上以及染色體上。 而且，2種以上的目標(biāo)蛋白質(zhì)包括異源多聚體蛋白。
[0274] 通過對(duì)導(dǎo)入了基因構(gòu)建物的宿主進(jìn)行培養(yǎng)、使之表達(dá)融合蛋白質(zhì)、并分泌至菌體 外或在菌體內(nèi)蓄積，能夠制備含融合蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液。
[0275] 宿主可以按照通常采用的方法和條件進(jìn)行培養(yǎng)。例如，在使用細(xì)菌作為宿主的情 況下，可以用含有碳源、氮源以及無機(jī)離子的通常的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。而且，為了獲得高增 殖，視需要還可添加維生素、氨基酸等有機(jī)微量營(yíng)養(yǎng)素。
[0276] 作為碳源，可以使用葡萄糖和蔗糖這樣的碳水化合物、乙酸這樣的有機(jī)酸、醇類、 或其他。作為氮源，可以使用氨氣、氨水、銨鹽、或其他。作為無機(jī)離子，視需要可以適宜使 用鈣離子、鎂離子、磷酸離子、鉀離子、鐵離子等。
[0277] 培養(yǎng)可以采用適合所使用的宿主的條件進(jìn)行。例如，在棒狀桿菌型細(xì)菌的的情況 下，可以在pH5. 0?8. 5、15°C?37°C的適合范圍內(nèi)在需氧條件下進(jìn)行，培養(yǎng)1?7天左右。 此外，可以采用棒狀桿菌型細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)中的培養(yǎng)條件，還可以采用使用了 Sec系、 Tat系的信號(hào)肽的蛋白的制造方法中記載的條件（參照W001/23591、W02005/103278)。
[0278] 在為了進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的表達(dá)而使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的情況下，也可以在培養(yǎng)基中 添加啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑來進(jìn)行培養(yǎng)。
[0279] 可以如下對(duì)生產(chǎn)了融合蛋白質(zhì)的事實(shí)進(jìn)行確認(rèn)：將含培養(yǎng)上清（融合蛋白質(zhì)在菌 體內(nèi)蓄積的情況下也包括細(xì)胞破碎物）的級(jí)分作為試樣，進(jìn)行SDS-PAGE，從分離出的蛋白 條帶的分子量。此外，可以將含培養(yǎng)上清（也包括所述的細(xì)胞破碎物）的級(jí)分作為試樣，通 過使用抗體的蛋白質(zhì)印跡來確認(rèn)（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor (USA)，2001))。此外，也可以通過使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì)產(chǎn)生蛋 白的N末端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定來確認(rèn)。而且，也可以通過使用質(zhì)譜儀產(chǎn)生蛋白質(zhì)的質(zhì)量 進(jìn)行測(cè)定來確認(rèn)。
[0280] 此外，根據(jù)情況，還可使用反相HPLC對(duì)融合蛋白質(zhì)（甚至目標(biāo)蛋白質(zhì)）進(jìn)行濃度 測(cè)定、純度測(cè)定。
[0281] 在融合蛋白質(zhì)被分泌至宿主菌體外的情況下，"包含融合蛋白質(zhì)的溶液"可以是前 述含融合蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液本身（含菌體的培養(yǎng)液），也可以是從所述培養(yǎng)液分離出宿主菌 體后的培養(yǎng)上清（除菌培養(yǎng)液）。即，"包含融合蛋白質(zhì)的溶液"（以下也稱"步驟（1)中得 到的溶液"）不僅包括從含融合蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液除去菌體后得到的培養(yǎng)上清，也包括含融合 蛋白質(zhì)的培養(yǎng)液本身。本發(fā)明中優(yōu)選使用培養(yǎng)上清。
[0282] 從培養(yǎng)液分離菌體可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】中公知慣用的方法例如，離心分離、膜過 濾等來實(shí)施。菌體分離步驟從提高融合蛋白質(zhì)（或目標(biāo)蛋白質(zhì)）的回收率以及純度的觀點(diǎn) 出發(fā)，通常在步驟（1)中實(shí)施。但是，根據(jù)其他事項(xiàng)而優(yōu)選在其他步驟中進(jìn)行的情況下，可 以在步驟⑴以外的任意步驟中進(jìn)行。
[0283] 融合蛋白質(zhì)在宿主菌體內(nèi)以可溶性蛋白的形式蓄積的情況下，通過對(duì)菌體進(jìn)行破 碎、并從破碎物分離出固形物，可以制備"步驟（1)中得到的溶液"。菌體的破碎可以采用該

【技術(shù)領(lǐng)域】的公知慣用的方法、例如勻漿法來實(shí)施。
[0284] 融合蛋白質(zhì)在宿主菌體內(nèi)以不溶性蛋白的形式蓄積的情況下，通過對(duì)菌體進(jìn)行破 碎、從破碎物收集固形物、對(duì)該固形物采用公知慣用的方法例如使用尿素、嘎胍等蛋白質(zhì)變 性劑、SDS等表面活性劑進(jìn)行可溶化處理后分離出固形物，可以得到"步驟（1)中得到的溶 液"。菌體的破碎可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法、例如勻漿法來實(shí)施。
[0285] 在本發(fā)明的制造方法的步驟（2)中，調(diào)節(jié)步驟（1)中得到的溶液的pH至按下述計(jì) 算公式計(jì)算的回收率為10%以上的pH :
[0286] 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量/{步驟⑷中得到 的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量}] X 100。
[0287] 需要說明的是，以下說明中使用的涉及"沉淀"的術(shù)語（例如"沉淀物"、"沉淀溶解 溶液"等）如無特殊說明，是以融合蛋白質(zhì)作為對(duì)象的。在沉淀以宿主菌體作為對(duì)象的情況 下，將做出說明。
[0288] 此外，涉及融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)的分析的描述針對(duì)的是除菌后的樣品。
[0289] 回收率的計(jì)算公式中的"步驟（4)中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量"以及"步驟 (3)中固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量"，可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的蛋白定量方 法，例如還原SDS-PAGE、反相HPLC等來測(cè)定。
[0290] 利用還原SDS-PAGE進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的定量可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方 法，例如實(shí)施例1記載的以還原SDS-PAGE后的融合蛋白質(zhì)的條帶濃度作為指標(biāo)來進(jìn)行。該 情況下，回收率的計(jì)算公式如下所述。
[0291] 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的條帶濃度/{步驟（4) 中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的條帶濃度+步驟（3)的固體分離后溶液中的融合蛋白質(zhì)的 條帶濃度}] X 100
[0292] 利用反相HPLC進(jìn)行融合蛋白質(zhì)的定量，可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法，例 如實(shí)施例1-2記載的基于反相HPLC所獲得色譜的融合蛋白質(zhì)的峰面積的定量方法來進(jìn)行。
[0293] 回收率可能因目標(biāo)蛋白質(zhì)的種類、用途、必要的量等而發(fā)生改變，可以是10%以 上、優(yōu)選20%以上、更優(yōu)選30%以上。
[0294] 需要說明的是，對(duì)用于實(shí)現(xiàn)10%以上回收率的pH上限值進(jìn)行確定，可以如后述實(shí) 施例1所示，改變實(shí)施步驟（2)的pH而進(jìn)行多個(gè)試驗(yàn)（各試驗(yàn)均包含步驟（1)?（4))，從 而計(jì)算出各試驗(yàn)的回收率，通過制作計(jì)算出的回收率與PH之間的關(guān)系圖，能夠容易地進(jìn)行 確定。
[0295] 根據(jù)上述計(jì)算公式確定的pH值是步驟（2)中可使用的pH(使回收率為10%以上 的pH)的上限值。因此，步驟（2)可以在上述確定的pH上限值以下的pH下實(shí)施。此外，對(duì) PH的下限值沒有特殊限制，不引起融合蛋白質(zhì)的不可逆酸變性即可，可以在考慮pH調(diào)節(jié)操 作的成本及希望的回收率的基礎(chǔ)上決定。
[0296] 步驟⑵中采用的pH值可能因目標(biāo)蛋白質(zhì)的種類、用途、必要的量等而變動(dòng)，優(yōu)選 9以下。例如-0. 5?9,優(yōu)選1. 5?9。
[0297] 對(duì)用于pH調(diào)節(jié)的物質(zhì)沒有特殊限制，可以使用任何種類的酸、堿。作為酸，可以列 舉出例如硫酸、鹽酸、乙酸、磷酸、三氟乙酸（TFA)等。這其中，優(yōu)選硫酸、鹽酸以及乙酸。酸 可以單獨(dú)使用1種，也可以組合使用2種以上。作為堿基，可以列舉出例如，氫氧化鈉、氨、 三羥基甲基氨基甲烷（Tris)等。堿基可以單獨(dú)使用1種，也可以組合使用2種以上。
[0298] 在步驟（2)中，對(duì)pH進(jìn)行調(diào)節(jié)后，溶液中產(chǎn)生固體。固體主要由融合蛋白質(zhì)構(gòu)成。 該融合蛋白質(zhì)實(shí)質(zhì)上未發(fā)生酸變性。為了促進(jìn)固體生成，優(yōu)選對(duì)PH調(diào)節(jié)后的溶液進(jìn)行攪拌 或靜置。
[0299] 而且，在步驟⑴中得到的溶液的pH已達(dá)到通過步驟⑵的pH調(diào)節(jié)操作應(yīng)該實(shí) 現(xiàn)的值的情況下，可以不進(jìn)行步驟（2)的pH調(diào)節(jié)操作，而對(duì)步驟（1)中得到的溶液進(jìn)行適 宜攪拌或靜置，然后用于步驟（3)。
[0300] 即，本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的制造方法變?yōu)榘率觯ˋ)?（C)的步驟：
[0301] (A)制備包含融合蛋白質(zhì)的溶液的步驟，該步驟中該溶液的pH為使按照下述計(jì)算 公式計(jì)算的回收率達(dá)到10%以上的pH :
[0302] 回收率（％) =[步驟（C)中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的量/{步驟（C)中得到的 溶液中融合蛋白質(zhì)的量+步驟（B)的固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量}] XlOO ;
[0303] (B)從步驟㈧中得到的溶液分離固體的步驟；以及
[0304] (C)將步驟⑶分離出的固體溶解在具有12以下、且比步驟㈧中得到的溶液的 pH高0. 1以上的pH的溶液中的步驟。
[0305] 需要說明的是，關(guān)于上述的步驟（1)和（2)的說明適用于步驟（A)。此外，關(guān)于后 述的步驟⑶以及⑷的說明適用于步驟⑶以及（C)。
[0306] 在本發(fā)明的制造方法的步驟（3)中，從步驟（2)中得到的溶液分離固體。
[0307] 步驟（2)中得到的溶液中殘存有源自融合蛋白質(zhì)以外的各種菌體的成分（例如色 素、脂質(zhì)、雜質(zhì)蛋白）、源自培養(yǎng)基的成分（例如色素、無機(jī)鹽類），通過步驟（3)可以將這些 除去，結(jié)果是能夠簡(jiǎn)便地提高融合蛋白質(zhì)的純度。
[0308] 分離可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法來實(shí)施。例如，可以使用離心分離、膜過 濾等。也可以對(duì)多個(gè)方法進(jìn)行組合（例如離心分離與膜過濾的組合）來實(shí)施。
[0309] 有些情況下，步驟（3)中得到的固體會(huì)附著有未除盡的液體（雜質(zhì)）。如果向該附 著有雜質(zhì)的固體添加具有能夠在步驟（2)中使用的pH的上限值（S卩，使融合蛋白質(zhì)的回收 率為10%的pH)以下的pH的溶液，則得到固體與溶液（含液體（雜質(zhì)））的混合物（懸濁 液）。通過從該懸濁液再次分離固體，能夠得到雜質(zhì)的附著量減少的固體。步驟（3)之后可 以對(duì)該操作進(jìn)行一次或多次。
[0310] 本發(fā)明的制造方法的步驟（4)中，將步驟（3)中分離出的固體溶解在具有12以下 且比步驟⑵中得到的溶液的pH高0. 1以上的pH的溶液中。
[0311] 步驟⑷使用的溶液的更優(yōu)選pH比使作為對(duì)象的融合蛋白質(zhì)的回收率為10%的 pH(即，步驟⑵中能夠使用的pH的上限值）高0. 1以上的pH、更優(yōu)選高0.2以上的pH、 進(jìn)一步優(yōu)選高1以上的pH。若采用這些優(yōu)選的pH,則融合蛋白質(zhì)能夠充分地溶解在該溶液 中。
[0312] 該優(yōu)選的pH可以根據(jù)具有自組裝能力的蛋白的種類與目標(biāo)蛋白質(zhì)的種類而變 動(dòng)，例如，在具有自組裝能力的蛋白為CspB成熟蛋白或其一部分的情況下，是優(yōu)選12以下、 更優(yōu)選11以下、進(jìn)一步與優(yōu)選10以下。
[0313] 對(duì)用于溶解步驟（3)中分離出的固體的溶液沒有特殊限制，只要具有上述的pH即 可，可以使用任何種類的物質(zhì)。作為具體例子，可以列舉出緩沖液。緩沖液優(yōu)選不易發(fā)生PH 的變化。作為緩沖液，可以列舉出使用Tris、HEPES、磷酸鈉、檸檬酸等的緩沖液，優(yōu)選Tris。
[0314] 通過實(shí)施步驟（4)，可以以溶液形式得到融合蛋白質(zhì)。通過對(duì)該步驟中使用的溶液 的量進(jìn)行增減，可以任意調(diào)節(jié)融合蛋白質(zhì)的濃度。此外，步驟（4)使用的溶液的構(gòu)成可以考 慮下面實(shí)施的步驟來確定。因此，通過進(jìn)行步驟（2)至步驟（4)，能夠簡(jiǎn)便地提高融合蛋白 質(zhì)的純度、和/或?qū)嵤┤诤系鞍踪|(zhì)溶液的濃縮、和/或更換溶劑。
[0315] 而且，有些情況下，當(dāng)步驟（2)的固體產(chǎn)生時(shí)，融合蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)會(huì)作為雜質(zhì) 卷入固體中，并夾帶至步驟（4)得到的溶液中。這樣的的情況下，通過將步驟（4)中得到的 溶液作為步驟（1)中得到的溶液進(jìn)行操作，再次實(shí)施步驟（2)至步驟（4)，能夠減少該雜質(zhì) 的量。在步驟（4)之后實(shí)施的該操作可進(jìn)行一次也可進(jìn)行多次。
[0316] 步驟⑷中得到的溶液中溶解有融合蛋白質(zhì)。
[0317] 通過從融合蛋白質(zhì)對(duì)具有自組裝能力的蛋白進(jìn)行切割，可以得到目標(biāo)蛋白質(zhì)。
[0318] 切割可以按照該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法來實(shí)施。作為切割方法，可以列舉出例 如，酶切、化學(xué)切割等。從切割的特異性優(yōu)異這點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選酶切。切割步驟可以針對(duì)步驟 (4)中得到的包含融合蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行，也可以在從步驟（4)中得到的溶液分離出融合 蛋白質(zhì)后進(jìn)行。在對(duì)步驟（4)中得到的包含融合蛋白質(zhì)的溶液進(jìn)行的情況下，切割步驟可 以與步驟（4)同時(shí)、在步驟（4)中途、或在步驟（4)之后進(jìn)行。
[0319] 酶切可以通過預(yù)先使具有自組裝能力的蛋白與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間包含底物特異性 高的蛋白酶的識(shí)別序列（例如，所述Factor Xa蛋白酶的識(shí)別序列、proTEV蛋白酶的識(shí)別 序列、胰蛋白酶識(shí)別序列）適宜實(shí)施。
[0320] 步驟（4)中得到的融合蛋白質(zhì)或通過融合蛋白質(zhì)的切割而得到的目標(biāo)蛋白質(zhì)可 以按照該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法從溶液中純化。
[0321] 例如，通過對(duì)含融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶液采用柱色譜（例如，高效液相色 譜（HPLC)、反相色譜（例如反相HPLC)、中高壓液相色譜、離子交換柱色譜、疏水色譜、凝膠 過濾色譜、親和色譜）、醇沉淀法、超濾膜法等已知的適合方法、或這些方法的組合，能夠?qū)?融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。
[0322] 而且，若對(duì)融合蛋白質(zhì)的切割步驟后得到的溶液進(jìn)行與步驟（2)同樣的步驟，則 具有自組裝能力的蛋白沉淀。通過進(jìn)行該步驟，能夠更有效地進(jìn)行目標(biāo)蛋白質(zhì)的純化。
[0323] 獲得了目標(biāo)蛋白質(zhì)這一事實(shí)可以按照該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的分析方法來確認(rèn)。 例如，可以通過將試樣進(jìn)行SDS-PAGE，并對(duì)分離的蛋白條帶的分子量進(jìn)行確認(rèn)來確認(rèn)。 此外，通過使用抗體的蛋白質(zhì)印跡也能確認(rèn)（Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。此外，通過使用蛋白質(zhì)測(cè)序儀對(duì) 目標(biāo)蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列進(jìn)行測(cè)定也能確認(rèn)。此外，通過使用質(zhì)譜儀對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì) 的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定也能確認(rèn)。而且，在目標(biāo)蛋白質(zhì)是酶、或具有某種可測(cè)定的生理活性的情況 下，以該酶活性或生理活性作為指標(biāo)也能進(jìn)行確認(rèn)。
[0324] 按照本發(fā)明所獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)可以直接使用，也可以進(jìn)一步進(jìn)行修飾。作為 修飾，可以列舉出通過化學(xué)合成法進(jìn)行的氨基酸添加、PEG化（Biotechnol J.，Jan ;5(1): 113(2010))等。例如，在制造了 Bival8(從生理活性蛋白比伐盧定（20個(gè)氨基酸）去掉N 末端側(cè)的2個(gè)氨基酸殘基（D-Phe-L-Pro)而得到的肽）作為目標(biāo)蛋白質(zhì)的情況下，通過在 Bival8的N末端采用化學(xué)合成法添加2個(gè)氨基酸殘基（D-Phe-L-Pro)，能夠得到具有生理 活性的全長(zhǎng)比伐盧定。具體而言，通過進(jìn)行使進(jìn)行了活化的特定氨基酸殘基對(duì)BivalS的N 末端發(fā)揮作用的化學(xué)合成反應(yīng)，能夠得到全長(zhǎng)比伐盧定。
[0325] 經(jīng)修飾的目標(biāo)蛋白質(zhì)可以采用該【技術(shù)領(lǐng)域】公知慣用的方法、例如離子交換色譜、 反相HPLC、疏水色譜等進(jìn)行純化。 實(shí)施例
[0326] 以下通過實(shí)施例和比較例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體地說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施 例。
[0327] 〔實(shí)施例1〕
[0328] 具有生理活性肽特立帕肽（teriparatide)的融合蛋白質(zhì)的制造
[0329] 實(shí)施例1中，使用生理活性肽特立帕肽（34個(gè)氨基酸殘基）（Teri)作為目標(biāo)蛋白 質(zhì)，使用由從CspB成熟蛋白的N末端起的50個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列（CspB50)作為具有 自組裝能力的蛋白，使用ProTEV蛋白酶識(shí)別序列作為用于酶切的氨基酸序列，使用棒狀桿 菌型細(xì)菌谷氨酸棒桿菌作為宿主。
[0330] (1)特立帕肽分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKK50TEV_Teri的構(gòu)建
[0331] (i)胰島素原的全基因合成、以及使用了谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum) ATCC13869的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的信號(hào)序列的胰島素原分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKPIns的構(gòu)建
[0332] 胰島素原（以下記作PIns)的氨基酸序列已經(jīng)被確定（Genbank Accession N〇.NP_000198. 1)。考慮該序列以及谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)的密碼子使用頻率，合 成了〈SEQ ID N0:9> ?〈SEQ ID N0:16> 所示的 DNA。以這些 DNA 作為模板，以〈SEQ ID NO: 17>及〈SEQ ID NO :18>所示的DNA作為引物，采用PCR法對(duì)編碼Pins的基因進(jìn)行了擴(kuò)增， 得到了〈SEQ ID NO :19>所示的DNA片段約0. 3kbp。
[0333] 通過將該DNA片段插入至克隆載體pHSG398 (TAKARABio公司制造）的Sma I部位 而得到了 pHSG-PIns。以該 pHSG-Pins 作為模板，以〈SEQ ID N0:17> 及〈SEQ ID N0:18> 所示的DNA作為引物，采用PCR法對(duì)PIns基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了 PIns基因片段約 0. 3kbp〇
[0334] 另一方面，編碼谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的基因的 堿基序列已經(jīng)被確定（Mol. Microbiol.，9,97-109 (1993))。參考該序列，以W001/23591所 述的pPKPTGl為模板，使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:21>所示的引物，采用PCR法對(duì) 編碼源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869株的CspB的啟動(dòng)子區(qū)域和信號(hào)肽的區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，得 到了 DNA片段約0. 7kbp，所述pPKPTGl是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原（帶前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺 酶）的分泌表達(dá)用載體，其具有下述基因：源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869株的cspB基因的 啟動(dòng)子；連接于該啟動(dòng)子的下游的編碼來自谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)ATCC13869株的 可表達(dá)的CspB的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基的DNA ;以及為了使與該信號(hào)肽該編碼信號(hào)肽一 起以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)而連接于編碼該信號(hào)肽DNA下游的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因，所述 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因來自放線菌茂原鏈輪絲菌（Streptoverticillium mobaraense)。
[0335] 而且，以進(jìn)行了擴(kuò)增的兩DNA片段（Pins基因片段、以及編碼啟動(dòng)子的區(qū)域與信號(hào) 肽的區(qū)域的片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :18>所述的DNA作 為引物的PCR法，得到了兩DNA片段進(jìn)行了融合的DNA片段約0. 9kbp。需要說明的是，〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :18>的引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí)別序列。PCR反應(yīng)中使用 Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn)行。通過 用限制酶Kpn I對(duì)該DNA片段進(jìn)行處理后插入至特開平9-322774所述的pPK4的KpnI部 位，得到了 pPKPIns。
[0336] 從插入片段的堿基序列測(cè)定的結(jié)果，確認(rèn)了構(gòu)建了如預(yù)想的融合基因。需要說 明的是，堿基序列的測(cè)定使用BigDye(注冊(cè)商標(biāo)）Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 公司制造）以及 3130 基因測(cè)序儀（Applied Biosystems 公司制 造）進(jìn)行。
[0337] (ii)融合了谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)ATCC13869的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的 成熟蛋白 N 末端的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、20、50、100、150、200、250、 300、350、400、440個(gè)氨基酸殘基的胰島素原的分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0338] 如上所述，編碼谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB的基因堿 基序列已經(jīng)被確定（Mol. Microbiol. ,9,97-109(1993))。在谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum) 中，CspB局限于細(xì)胞表層，并形成稱作S-Iayer的層，已知該局限與C末端側(cè)富含疏水性的 氨基酸殘基區(qū)相關(guān)聯(lián)（Mol. Microbiol.，9,97-109 (1993))。參考該序列，合成〈SEQ ID NO: 20>及〈SEQ ID NO :22>所述的引物，將按常規(guī)方法（齊藤、三浦的方法收〇(^111.8丨〇?1^· Act.，72,619 (1963)])制備的谷氨酸棒桿菌（Cglutamicum) ATCC13869的染色體DNA作為 模板，采用PCR法對(duì)以下區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增：包含CspB的基因的啟動(dòng)子的5'-上游區(qū)域（以下 也稱CspB啟動(dòng)子區(qū)域）、以及編碼CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基以及編碼CspB 成熟蛋白的N末端440個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域。需要說明的是，所謂CspB成熟蛋白的N末端 440個(gè)氨基酸殘基是從谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)ATCC13869的全長(zhǎng)469個(gè)氨基酸（SEQ ID NO :3)的CspB成熟蛋白除去C末端側(cè)的疏水性區(qū)域的29個(gè)氨基酸而得到的。PCR反應(yīng) 使用Pyobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn)行。
[0339] 然后，出于下述目的，S卩，構(gòu)建使分別融合了谷氨酸棒桿菌（C.glutamicum)的細(xì) 胞表層蛋白質(zhì) CspB 的成熟蛋白 N 末端的 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,17, 20， 50,100,150, 200, 250, 300, 350,400,440個(gè)氨基酸殘基的胰島素原分泌表達(dá)的質(zhì)粒的目的， 以上述擴(kuò)增得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，分別以〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:23>、 〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :24>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :25>、〈SEQ ID NO : 20> 及〈SEQ ID N0:26>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:27>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID NO :28>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :29>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :30>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :31>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :32>、〈SEQ ID NO :20> 及 〈SEQ ID NO :33>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :34>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO : 35〉、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :36>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :37>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:38>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:39>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:40>、〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:41>、〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:42>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :43>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :44>、〈SEQ ID NO :20> 及 〈SEQ ID NO :45>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :46>、〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO : 47〉、〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :48>所示的各合成DNA作為引物，采用PCR法分別對(duì) 編碼CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基及CspB成熟蛋白的 N 末端的 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,17, 20, 50,100,150, 200, 250, 300, 350， 400,440個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。另一方面，以所述（i)中構(gòu)建的質(zhì)粒pPKPIns作 為模板，以〈SEQ ID N0:17>及〈SEQ ID N0:49>所示的合成DNA作為引物，采用PCR法對(duì) PIns基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了 PIns基因片段。
[0340] 而且，進(jìn)行了擴(kuò)增的兩DNA片段（編碼CspB啟動(dòng)子區(qū)域、CspB信號(hào)肽、成熟CspB 的 N 末端的 1，2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,17, 20, 50,100,150, 200, 250, 300， 350,400,440個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域的片段，以及PIns基因片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :49>所述的DNA作為引物的PCR法，得到了兩DNA片段融合而成 的DNA片段。而且，〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:49>的引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的 識(shí)別序列，〈SEQ ID N0:23>?〈SEQ ID N0:48>的引物為了構(gòu)建編碼CspB成熟蛋白質(zhì)N末 端的區(qū)域與編碼CspB與PIns基因形成的融合基因而包含編碼Pins的N末端側(cè)的氨基酸序 列的基因。PCR反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase (TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè) 者推薦的方案進(jìn)行。通過將這些DNA片段用限制酶Kpn I處理后，插入至特開平9-322774 所述的 PPK4 的 Kpn I 部位，分別得到了 pPKKIPIns、pPKK2PIns、pPKK3PIns、pPKK4PIns、 pPKK5PIns、pPKK6PIns、pPKK7PIns、pPKK8PIns、pPKK9PIns、pPKKIOPIns、pPKKllPIns、 pPKK12PIns、pPKK13PIns、pPKK14PIns、pPKK15PIns、pPKK17PIns、pPKK20PIns、pPKK50PIns、 pPKKIOOPIns、pPKK150PIns、pPKK200PIns、pPKK250PIns、pPKK300PIns、pPKK350PIns、 pPKK400PIns、pPKK440PIns。由插入片段的堿基序列測(cè)定的結(jié)果，確認(rèn)了構(gòu)建了如預(yù)想的融 合基因。需要說明的是，堿基序列的測(cè)定使用了 BigDye (注冊(cè)商標(biāo)）Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 公司制造）以及 3130 基因測(cè)序儀（Applied Biosystems公司制造）進(jìn)行。
[0341] (iii)質(zhì)粒 pPKK17Xa-Pins 以及 pPKK50Xa-PIns 的構(gòu)建
[0342] 以所述（ii)中構(gòu)建的 pPKK17PIns 以及 pPKK50PIns 作為模板，以〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID N0:50>、〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:51>所示的各合成DNA作為引物，采用 PCR法分別對(duì)CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及在CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基及CspB成 熟蛋白的N末端的17或50個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域上再添加編碼能夠被Factor Xa蛋白酶識(shí) 別的IEGR的區(qū)域而成的片段進(jìn)行了擴(kuò)增。另一方面，以所述（i)中構(gòu)建的質(zhì)粒pPKPIns作 為模板，以〈SEQ ID N0:52> 及〈SEQ ID N0:49>、〈SEQ ID N0:53> 及〈SEQ ID N0:49> 所示 的各合成DNA作為引物，采用PCR法對(duì)PIns基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增而得到了 PIns基因片段。 而且，以擴(kuò)增得到的兩DNA片段（CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼CspB信號(hào)肽、成熟CspB的N 末端17或50個(gè)氨基酸殘基（QETNPT)、IEGR的區(qū)域構(gòu)成的片段，以及PIns基因片段）作為 模板，通過使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:49>所述的DNA作為引物的PCR法，得到了 兩DNA片段融合而成的DNA片段。需要說明的是，〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :49>的 引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID N0:50>及〈SEQ ID N0:51>的引物中設(shè) 計(jì)有編碼PIns的N末端側(cè)的氨基酸序列的序列，其用于構(gòu)建IEGR的堿基序列與PIns基因 形成的融合基因。PCR反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase (TAKARABio公司制造），反應(yīng)條 件按業(yè)者推薦的方案進(jìn)行。通過用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理后插入至特開平 9-322774所述的pPK4 的Kpn I 部位，分別得到了 pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns。從插入片 段的堿基序列測(cè)定的結(jié)果確認(rèn)了構(gòu)建了如預(yù)想的融合基因。需要說明的是，堿基序列的測(cè) 定使用 BigDye (注冊(cè)商標(biāo)）Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 公司制造）和3130基因測(cè)序儀（Applied Biosystems公司制造）進(jìn)行。
[0343] (iv)在CspB成熟蛋白的N末端氨基酸序列與胰島素原序列之間插入了 Factor Xa 蛋白酶或ProTEV蛋白酶的識(shí)別序列形成的融合胰島素原的分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0344] 已知在將某目標(biāo)蛋白質(zhì)以與該目標(biāo)蛋白質(zhì)以外的氨基酸序列融合的形式表達(dá) 的情況下簡(jiǎn)便地獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法，即，通過在目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與融合的 氨基酸序列之間配置特定的底物特異性高的蛋白酶識(shí)別序列，用特定的蛋白酶對(duì)表達(dá)的 融合蛋白質(zhì)進(jìn)行切割。另一方面，作為底物特異性高的蛋白酶，已知Factor Xa蛋白酶、 ProTEV蛋白酶等，其分別識(shí)別蛋白中的Ile-Glu-Gly-Arg( = IEGR) (SEQ ID NO :7)及 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe_Gln( = ENLYFQ) (SEQ ID N0:8)的序列，特異性地切割各序列的C末 端側(cè)。因而，例如，對(duì)于CspB融合Pins，構(gòu)建在編碼CspB成熟蛋白質(zhì)的N末端氨基酸殘基的 堿基序列與編碼胰島素原的堿基序列之間插入編碼Factor Xa蛋白酶的識(shí)別序列（IEGR) 或編碼ProTEV蛋白酶的識(shí)別序列（ENLYFQ)的堿基序列而成的融合PIns基因、并使融合 Pins分泌表達(dá)，通過使用這些蛋白酶可以簡(jiǎn)便地由融合Pins得到Pins。
[0345] 以所述（ii)中構(gòu)建的 pPKK6PIns 作為模板，以〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID NO: 54>、〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :55>所示的各合成DNA作為引物，采用PCR法分別對(duì) 編碼CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基以及在CspB成熟 蛋白的N末端6個(gè)氨基酸殘基（QETNPT)的區(qū)域上再添加編碼能夠被Factor Xa蛋白酶識(shí) 別的IEGR或能夠被ProTEV蛋白酶識(shí)別的ENLYFQ的區(qū)域而成的片段進(jìn)行了擴(kuò)增。另一方 面，以所述⑴中構(gòu)建的質(zhì)粒PPKPIns作為模板，以〈SEQ ID NO :52>及〈SEQ ID NO :49>、 〈SEQ ID N0:53>及〈SEQ ID N0:49>所示的各合成DNA作為引物，采用PCR法對(duì)PIns基因 區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了 PIns基因片段。而且，以擴(kuò)增的兩DNA片段（CspB啟動(dòng)子區(qū)域、編 碼CspB信號(hào)肽、成熟CspB的N末端6個(gè)氨基酸殘基（QETNPT)、以及編碼IEGR或ENLYFQ的 區(qū)域的片段，PIns基因片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :49>所 述的DNA作為引物的PCR法，得到了兩DNA片段融合而成的DNA片段。需要說明的是，〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:49>的引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID N0:54> 的引物設(shè)計(jì)有編碼PIns的N末端側(cè)的氨基酸序列的序列，其用于構(gòu)建編碼IEGR的堿基序 列與PIns基因形成的融合基因 ，〈SEQ ID NO :55>的引物中設(shè)計(jì)有編碼PIns的N末端側(cè)的 氨基酸序列的序列，其用于構(gòu)建編碼ENLYFQ的堿基序列與PIns基因形成的融合基因 。PCR 反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn) 行。用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理后，插入至特開平9-322774所述的pPK4的 Kpn I 部位，分別得到了 pPKK6Xa-PIns、pPKK6TEV-PIns。
[0346] 同樣地，以所述（ii)中構(gòu)建的pPKK17Pins及pPKK50PIns作為模板，以〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:50>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:51> 所示的各合成 DNA 作為 引物，采用PCR法分別對(duì)編碼CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及在編碼CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè) 氨基酸殘基和CspB成熟蛋白的N末端17或50個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域上再添加編碼能夠被 Factor Xa蛋白酶識(shí)別的IEGR的區(qū)域而成的片段進(jìn)行了擴(kuò)增。另一方面，以所述（i)中構(gòu) 建的質(zhì)粒 PPKPIns 作為模板，以〈SEQ ID NO :52> 及〈SEQ ID NO :49>、〈SEQ ID NO :53> 及 〈SEQ ID NO :49>所示的各合成DNA作為引物，采用PCR法對(duì)PIns基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，得 到了 PIns基因片段。而且，以擴(kuò)增的兩DNA片段（CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼CspB信號(hào)肽、 成熟CspB的N末端17或50個(gè)氨基酸殘基（QETNPT)、IEGR的區(qū)域的片段，PIns基因片段） 作為模板，通過使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:49>所述的DNA作為引物的PCR法，得 到了兩DNA片段融合而成的DNA片段。而且，〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:49>的引物 中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID N0:50>及〈SEQ ID N0:51>的引物設(shè)計(jì)有編 碼Pins的N末端側(cè)的氨基酸序列的序列，其用于構(gòu)建編碼IEGR的堿基序列與PIns基因的 融合基因。PCR反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase (TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè) 者推薦的方案進(jìn)行。用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理后，插入至特開平9-322774 所述的PPK4的Kpn I部位，分別得到了 pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns。從插入片段的堿 基序列測(cè)定的結(jié)果確認(rèn)了構(gòu)建了如預(yù)想的融合基因。需要說明的是，堿基序列的測(cè)定使用 BigDye (注冊(cè)商標(biāo)）Terminator v3. ICycle Sequencing Kit (Applied Biosystems 公司制 造）和3130基因測(cè)序儀（Applied Biosystems公司制造）來進(jìn)行。
[0347] (V)人生長(zhǎng)激素 hGH的全基因合成及谷氨酸棒桿菌中的人生長(zhǎng)激素 hGH分泌表達(dá) 質(zhì)粒的構(gòu)建
[0348] 人生長(zhǎng)激素 （human growth hormone ;hGH)的氨基酸序列已經(jīng)被確定（Genbank Accession No. CAA23779. 1)?？紤]了在該序列中除去N末端的信號(hào)序列26個(gè)殘基而成的 成熟型hGH的氨基酸序列以及谷氨酸棒桿菌（C. glutamicum)的密碼子使用頻率，合成了 〈SEQ ID N0:56>?〈SEQ ID N0:69>所示的DNA。以這些DNA作為模板，使用另行合成的 〈SEQ ID NO :70>及〈SEQ ID NO :71>所示的DNA作為引物，采用PCR法對(duì)hGH基因進(jìn)行進(jìn) 了擴(kuò)增，得到了〈SEQ ID N0:72>所示的約0. 6kbp的DNA片段。通過將該DNA片段插入至 克隆載體PHSG398 (TAKARABio公司制造）的SmaI部位，得到了 pHSG-hGH。以該pHSG-hGH 作為模板，以〈SEQ ID N0:70>及〈SEQ ID N0:71>所示的DNA作為引物，采用PCR法對(duì) hGH基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了約0.6kbp的hGH基因片段。然后，以W001/23591所述 的 pPKSPTGl 以及 W001/23591 所述的 pPKPTGl 作為模板，使用〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID N0:73>、或〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:74>所示的引物，采用PCR法對(duì)源自谷氨 酸棒桿菌ATCC13869的CspB的啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼源自產(chǎn)氨棒桿菌（C. ammoniagenes) ATCC6872株的CspA或編碼源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869株的CspB信號(hào)肽的區(qū)域進(jìn)行了 擴(kuò)增，分別得到了約〇. 7kbp的DNA片段，所述pPKSPTGl是具有下述基因的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 原（帶前體結(jié)構(gòu)部分的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的分泌表達(dá)用載體，所述基因?yàn)椋涸醋怨劝彼岚魲U菌 ATCC13869株的cspB基因的啟動(dòng)子；連接于該啟動(dòng)子下游的可表達(dá)的編碼源自編碼產(chǎn)氨棒 桿菌（C. ammoniagenes)ATCC6872 株的 CspA(SlpA)〈Genbank Accession No. BAB62413.1〉 的信號(hào)肽25個(gè)氨基酸殘基的DNA ;以及為了使與該信號(hào)肽一起以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)而 連接于編碼該信號(hào)肽DNA下游的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因，所述轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶原基因來自茂源 鏈輪絲菌（S. mobaraense)，所述pPKPTGl包含源自編碼谷氨酸棒桿菌ATCC13869株的CspB 的啟動(dòng)子區(qū)域以及編碼信號(hào)肽的DNA)。而且，以進(jìn)行了擴(kuò)增的兩DNA片段（hGH基因片段， CspB啟動(dòng)子區(qū)域以及編碼各信號(hào)肽的區(qū)域的片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID NO :20> 及〈SEQ ID NO :71>所述的DNA作為引物的PCR法，分別得到了兩DNA片段融合而成的DNA 片段約1.2kbp。需要說明的是，〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:71>的引物中設(shè)計(jì)有限制 酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID NO :73>、〈SEQ ID NO :74>的各引物中設(shè)計(jì)有編碼hGH的N 末端氨基酸殘基的序列，其用于構(gòu)建編碼各信號(hào)肽的區(qū)域與hGH基因形成的融合基因 。PCR 反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn) 行。用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理后，插入至特開平9-322774所述的pPK4的 Kpn I部位，分別得到了 pPS-hGH，pPK-hGH。從插入片段的堿基序列測(cè)定的結(jié)果，確認(rèn)了構(gòu)建 了如預(yù)想的融合基因。而且，堿基全序列測(cè)定使用了 BigDye (注冊(cè)商標(biāo)）Terminator v3. 1 Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 公司制造）和 3130 基因測(cè)序儀（Applied Biosystems公司制造）。
[0349] (vi)融合了谷氨酸棒桿菌（C. ammoniagenes)ATCC13869的細(xì)胞表層蛋白質(zhì)CspB 的信號(hào)肽及成熟蛋白N末端氨基酸殘基、以及Factor Xa蛋白酶識(shí)別序列的人生長(zhǎng)激素 hGH 的分泌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0350] 以分別所述（iv)中構(gòu)建的 pPKK6Xa-PIns、pPKK17Xa-PIns、pPKK50Xa-PIns 作為模 板，以〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:75>、〈SEQ ID N0:20> 及〈SEQ ID N0:76>、〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :77>分別所示的各合成DNA作為引物，采用PCR法擴(kuò)增了 CspB啟動(dòng) 子區(qū)域、編碼CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基、CspB成熟蛋白的N末端氨基酸殘基 (6、17、50個(gè)殘基）、以及編碼Factor Xa蛋白酶識(shí)別序列（IEGR)的區(qū)域。另一方面，以所述 (V)中構(gòu)建的質(zhì)粒pPS-hGH作為模板，以〈SEQ ID NO :70>及〈SEQ ID NO :71>所示的合成 DNA作為引物，采用PCR法擴(kuò)增了 hGH基因區(qū)域。而且，以進(jìn)行了擴(kuò)增的兩DNA片段（CspB 啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼CspB信號(hào)肽、成熟CspB的N末端氨基酸殘基、以及IEGR的區(qū)域的各 片段；hGH基因片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:71>所述的DNA 作為引物的PCR法，得到了兩DNA片段融合而成的DNA片段。需要說明的是，〈SEQ ID NO: 20>及〈SEQ ID N0:71>的引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID N0:75>、〈SEQ ID N0:76>、〈SEQ ID N0:77>的各引物中設(shè)計(jì)有編碼hGH的N末端氨基酸殘基的序列，其用 于構(gòu)建編碼Factor Xa蛋白酶識(shí)別序列（IEGR)的區(qū)域與hGH基因形成的融合基因。PCR反 應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase(TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn) 行。用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理后，插入特開平9-322774所述的pPK4的Kpn I 部位，分別得到了 pPKK6Xa-hGH，pPKK17Xa-hGH，pPKK50Xa-hGH。
[0351] (vii)特立帕肽分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKK6Xa_Teri的構(gòu)建
[0352] 人甲狀旁腺激素 PTH的成熟體的氨基酸序列已經(jīng)被確定（Genbank Accession No. AAA60215. 1)。已知該人的甲狀旁腺激素 PTH的N末端的第1個(gè)殘基至第34個(gè)殘基形成 的肽即肽特立帕肽作為骨質(zhì)疏松癥藥物具有生理活性?？紤]該特立帕肽的氨基酸序列與谷 氨酸棒桿菌（C. ammoniagenes)的密碼子使用頻率，合成了〈SEQ ID N0:78>及〈SEQ ID NO: 79>所示的DNA。以該DNA作為模板，以另行合成的〈SEQ ID N0:80>及〈SEQ ID N0:81>所示 的DNA作為引物，采用PCR法對(duì)〈SEQ ID NO :82>所示的特立帕肽基因進(jìn)行了擴(kuò)增。通過將該 DNA片段插入至克隆載體pHSG398(TAKARABio公司制造）的Sma I部位，得到了 pHSG-Teri。 以該pHSG-Teri作為模板，使用〈SEQ ID N0:80>及〈SEQ ID N0:81>所示的DNA作為引物， 采用PCR法對(duì)特立帕肽基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。然后，以W001-23591所述的pPKSPTGl (包含 源自谷氨酸棒桿菌（C. ammoniagenes) ATCC13869株的CspB的啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼源自產(chǎn) 氨短桿菌（C. ammoniagenes)ATCC6872 株的 CspA(SlpA)信號(hào)肽的 DNA)、以及 W001/23591 所述的PPKPTG1 (包含源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869株來源的CspB的啟動(dòng)子區(qū)域、以及編 碼信號(hào)肽的DNA)作為模板，使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:83>、或者〈SEQ ID NO: 20>及〈SEQ ID NO :84>所示的引物，采用PCR法對(duì)源自谷氨酸棒桿菌（C. ammoniagenes) ATCC13869的CspB的啟動(dòng)子區(qū)域、以及編碼源自產(chǎn)氨短桿菌（C. ammoniagenes) ATCC6872株 的CspA或編碼源自谷氨酸棒桿菌ATCC13869株的CspB的信號(hào)肽的區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。而且， 以擴(kuò)增的兩DNA片段（特立帕肽基因片段、以及CspB啟動(dòng)子區(qū)域、編碼各信號(hào)肽的區(qū)域的 片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:81>所述的DNA作為引物的PCR 法，分別得到了兩DNA片段融合而成的DNA片段約0. 8kbp。而且，〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID N0:81>的引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID N0:83>及〈SEQ ID N0:84> 的各引物中設(shè)計(jì)有N末端氨基酸殘基的序列，其用于構(gòu)建編碼各信號(hào)肽的區(qū)域與特立帕肽 基因形成的融合基因的編碼特立帕肽。PCR反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase (TAKARABio 公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn)行。用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理 后，插入至特開平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位，分別得到了 pPS-Teri，pPK-Teri。
[0353] 然后，以上述pHSG-Teri作為模板，使用〈SEQ ID NO :85>及〈SEQ ID NO :81>所示 的DNA作為引物，采用PCR法對(duì)特立帕肽基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。此外，以所述（vi)中構(gòu)建 的pPKK6Xa-hGH作為模板，使用〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:86>所示的引物，采用PCR 法對(duì)CspB啟動(dòng)子區(qū)域、編碼CspB的N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基、CspB成熟蛋白的N 末端6個(gè)氨基酸殘基、以及Factor Xa蛋白酶識(shí)別序列（IEGR)的區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。而且， 以擴(kuò)增的兩DNA片段（特立帕肽基因片段；編碼CspB啟動(dòng)子區(qū)域、以及CspB信號(hào)肽、CspB 成熟蛋白的N末端6個(gè)氨基酸殘基、和IEGR的區(qū)域的片段）作為模板，通過使用了〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :81>所述的DNA作為引物的PCR法，得到了兩DNA片段融合而成的 DNA片段約0. 8kbp。需要說明的是，〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :81>的引物中設(shè)計(jì)有 限制酶Kpn I的識(shí)別序列，〈SEQ ID NO :85>的引物中設(shè)計(jì)有編碼Factor Xa蛋白酶識(shí)別序 列（IEGR)的序列，其用于構(gòu)建編碼Factor Xa蛋白酶識(shí)別序列（IEGR)的區(qū)域與特立帕肽基 因形成的融合基因。PCR反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase (TAKARABio公司制造），反應(yīng) 條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn)行。用限制酶Kpn I對(duì)這些DNA片段進(jìn)行處理后，插入至特開平 9-322774所述的pPK4的Kpn I部位，得到了 pPKK6Xa-Teri。從插入片段的堿基序列測(cè)定的 結(jié)果，確認(rèn)了構(gòu)建了如預(yù)想的融合基因。而且，堿基全序列測(cè)定使用了 BigDyeR Terminator ν3· ICycle Sequencing Kit(Applied Biosystems公司制造）和3130基因測(cè)序儀（Applied Biosystems公司制造）。
[0354] (viii)特立帕肽分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKK50TEV_Teri的構(gòu)建
[0355] 以所述（iii)中構(gòu)建的質(zhì)粒pPKK50Xa-PIns作為模板，以〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :87>所示的各合成DNA作為引物，采用PCR法對(duì)含CspB的啟動(dòng)子區(qū)域的5'-上游區(qū) 域、編碼N末端的信號(hào)肽30個(gè)氨基酸殘基的區(qū)域、編碼成熟細(xì)胞表層蛋白的N末端側(cè)50個(gè) 殘基的區(qū)域、以及編碼ProTEV蛋白酶所識(shí)別的氨基酸序列ENLYFQ的區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。另一 方面，以所述（vii)中構(gòu)建的質(zhì)粒pPKK6Xa-Teri作為模板，以〈SEQ ID NO :88>及〈SEQ ID NO :89>所示的合成DNA作為引物，采用PCR法對(duì)特立帕肽基因區(qū)域進(jìn)行了擴(kuò)增。而且，以進(jìn) 行了擴(kuò)增的各DNA片段（CspB啟動(dòng)子、編碼CspB信號(hào)肽、CspB的N末端氨基酸序列50個(gè) 殘基、氨基酸序列ENLYFQ的區(qū)域的片段；特立帕肽基因片段）作為模板，通過使用〈SEQ ID NO :20>及〈SEQ ID NO :89>所述的DNA作為引物的PCR法，得到了各DNA片段融合而成的 DNA片段。而且，〈SEQ ID N0:20>及〈SEQ ID N0:89>的引物中設(shè)計(jì)有限制酶Kpn I的識(shí) 別序列，〈SEQ ID NO :88>的引物中設(shè)計(jì)有編碼特立帕肽的N末端側(cè)的氨基酸序列的序列， 其用于構(gòu)建編碼ENLYFQ的堿基序列與特立帕肽的融合基因。PCR反應(yīng)使用Pyrobest DNA polymerase (TAKARABio公司制造），反應(yīng)條件按業(yè)者推薦的方案進(jìn)行。通過用限制酶Kpn I 對(duì)這些DNA片段進(jìn)行了處理后，插入至特開平9-322774所述的pPK4的Kpn I部位，得到了 質(zhì)粒pPKK50TEV-Teri。從插入片段的堿基序列測(cè)定的結(jié)果，確認(rèn)了構(gòu)建了如預(yù)想的融合基 因。而且，堿基序列的測(cè)定使用了 BigDye(注冊(cè)商標(biāo)）Terminator v3. ICycle Sequencing Kit(Applied Biosystems 公司制造）和 3130 基因測(cè)序儀（Applied Biosystems 公司制 造）。
[0356] (2)使用 pPKK50TEV-Teri 的融合蛋白質(zhì) CspB50TEV-特立帕肽（Teriparatide) (簡(jiǎn)稱50-Teri)的分泌表達(dá)
[0357] 使用（1)中構(gòu)建的pPKK50TEV-Teri，轉(zhuǎn)化了 W001/23591所述的谷氨酸棒桿菌 (C. ammoniagenes) YDKOlO株。用含25mg/l的卡那霉素的MM液體培養(yǎng)基（葡萄糖120g、七 水硫酸鎂〇. 4g、硫酸銨30g、磷酸二氫鉀lg、七水硫酸鐵0. Olg、五水硫酸錳0. Olg、硫胺鹽酸 鹽200 μ g、生物素 500 μ g、DL-甲硫氨酸0. 15g、碳酸鈣50g、用水IL調(diào)節(jié)至pH7. 5)分別對(duì) 得到的轉(zhuǎn)化株在30°C下培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將對(duì)各培養(yǎng)液進(jìn)行了離心分離而得到的 培養(yǎng)上清進(jìn)行還原SDS-PAGE后，用CBB R-250 (Bio-Rad公司制造）進(jìn)行染色，確認(rèn)了目標(biāo) 融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶。
[0358] 另一方面，將含25mg/l的卡那霉素的300mL MMTG液體培養(yǎng)基（葡萄糖120g、氯化 鈣2g、七水硫酸鎂3g、硫酸銨3g、磷酸二氫鉀I. 5g、七水硫酸鐵0. 03g、五水硫酸錳0. 03g、 硫胺鹽酸鹽450 μ g、生物素450 μ g、DL-甲硫氨酸0. 15g、碳酸鈣50g、用水調(diào)整成IL調(diào)節(jié) 至pH6. 7)裝入到IL容量的發(fā)酵罐中，添加氨氣，保持pH6. 7,在30°C下對(duì)所得轉(zhuǎn)化株進(jìn)行 通氣攪拌培養(yǎng)3天。
[0359] (3)從培養(yǎng)液除去菌體、以及除去菌體的培養(yǎng)液的保存
[0360] 培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至微型管中，使用離心機(jī)以12000G離心分離菌體10分 鐘。用微孔徑〇. 22 μ m的除菌濾膜對(duì)得到的離心上清進(jìn)行過濾，將所得濾液作為"除去菌體 的培養(yǎng)液"（相當(dāng)于"步驟（1)中得到的溶液"），在_80°C下冷凍保存。
[0361] (4)伴隨pH變化的融合蛋白質(zhì)（50-Teri)的沉淀以及可溶化
[0362] 將冷凍保存的除去菌體的培養(yǎng)液在25°C下解凍，用離心機(jī)以12000G離心1分鐘， 對(duì)冷凍保存中生成的主要由無機(jī)鹽構(gòu)成的沉淀進(jìn)行了分離。在4支微型管中分別添加0、5、 10、30 μ L的0. 5M硫酸水溶液及30、25、20、0 μ L的MiIliQ水并使之均勻，然后，分別注入所 得離心上清100 μ L，制備成容量均為130 μ L。
[0363] 對(duì)其進(jìn)行攪拌后，靜置10分鐘，得到了 ρΗ7. 4、ρΗ6. 6、ρΗ3. 8、ρΗ1. 7的"完成pH調(diào) 節(jié)完的培養(yǎng)液"（"相當(dāng)于步驟（2)中得到的溶液"）。ρΗ6· 6、ρΗ3· 8以及pHL 7的"完成pH 調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"出現(xiàn)白濁，確認(rèn)了沉淀的生成。將這些"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"，用離心機(jī) 以12000G離心5分鐘，分離出因 pH變化而生成的沉淀（相當(dāng)于"步驟（3)中分離出的固 體")。將得到的離心上清分別轉(zhuǎn)移至其他微型管中，作為"完成PH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上清"（相 當(dāng)于"步驟（3)的固體分離后的溶液"）。向殘留的沉淀添加與除去的離心上清相同容量的 緩沖液（IOOmM Tris-HCl，pH8. 5)，進(jìn)行攪拌，沉淀迅速溶解，得到了"沉淀溶解溶液"（相當(dāng) 于"步驟（4)中得到的溶液"）。沉淀溶解溶液的pH均在中性附近，分別為pH8. 3、pH8. 3、 pH8. 1、pH7. 8?？紤]到上述沉淀發(fā)生的pH范圍、以及生成的沉淀在中性附近可逆地迅速再 溶解，可知步驟（2)中觀察到的沉淀現(xiàn)象是與一般不可逆的蛋白質(zhì)的酸變性現(xiàn)象全然不同 的現(xiàn)象。
[0364] 對(duì)通過上述操作得到的ρΗ7· 4、ρΗ6· 6、ρΗ3· 8、pHL 7的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上 清"以及"沉淀溶解溶液"進(jìn)行還原SDS-PAGE，通過確認(rèn)50-Teri的條帶，對(duì)伴隨pH變化 的50-Teri的沉淀以及可溶化進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。需要說明的是，還原SDS-PAGE使用了 Any kD?Mini-PROTEAN(注冊(cè)商標(biāo)）TGXtm預(yù)鑄凝膠（Bio-Rad Laboratories株式會(huì)社）進(jìn)行，通 過用SYPRO(注冊(cè)商標(biāo)）Ruby(Life Technologies Japan株式會(huì)社）進(jìn)行了染色，檢測(cè)出了 融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶。然后，將各pH下的條帶濃度用軟件Multi Gauge(FUJIFILM 公司制造）進(jìn)行了數(shù)值化，按照以下的計(jì)算公式計(jì)算出了各pH下的50-Teri的回收率。
[0365] 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的條帶濃度/ {:步驟⑷中 得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的條帶濃度+步驟（3)的固體分離后的溶液中的融合蛋白質(zhì)的條 帶濃度}] X 100
[0366] 而且，在后述的實(shí)施例以及比較例中通過還原SDS-PAGE進(jìn)行回收率計(jì)算的情況 下，也與實(shí)施例1同樣地實(shí)施。
[0367] 計(jì)算出的pH7. 4、pH6. 6、pH3. 8、pHL 7的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的50-Teri回收 率分別為1 % %。圖I-A示出了計(jì)算出的回收率與"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液" 的pH之間的關(guān)系。由該圖可知，步驟（2)中觀察到的沉淀現(xiàn)象是與蛋白質(zhì)的溶解度在其等 電點(diǎn)變得最小的等電點(diǎn)沉淀現(xiàn)象完全不同的現(xiàn)象。
[0368] 圖I-B中示出了"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"的pH與"pH完成調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上清"以 及對(duì)應(yīng)的"沉淀溶解溶液"的各電泳圖中融合蛋白質(zhì)50-Teri的條帶部分，以及回收率。
[0369] ρΗ7· 4的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上清"中存在的50-Teri在ρΗ6· 6、ρΗ3· 8以及 pHl. 7下未檢測(cè)出，而在"沉淀溶解溶液"中被檢測(cè)出。
[0370] 〔實(shí)施例 1-2〕
[0371] 具有生理活性肽特立帕肽的融合蛋白質(zhì)50-Teri的制造和目標(biāo)蛋白質(zhì)特立帕肽 的制造
[0372] 就實(shí)施例1-2而言，與實(shí)施例1同樣地進(jìn)行實(shí)施，使用了生理活性肽特立帕肽（34 個(gè)氨基酸殘基）（Teri)作為目標(biāo)蛋白質(zhì)；使用了由從CspB成熟蛋白的N末端起的50個(gè)氨 基酸殘基構(gòu)成的序列（CspB50)作為具有自組裝能力的蛋白；使用了 proTEV蛋白酶識(shí)別序 列作為用于酶切的氨基酸序列；使用了棒狀桿菌型細(xì)菌的谷氨酸棒桿菌作為宿主。
[0373] (1)特立帕肽分泌表達(dá)質(zhì)粒pPKK50TEV_Teri的構(gòu)建
[0374] 按照實(shí)施例1的（1)中所述的操作流程進(jìn)行了構(gòu)建。
[0375] (2)使用pPKK50TEV_Teri融合蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)
[0376] 按照實(shí)施例1的（2)中所述的操作流程，對(duì)用pPKK50TEV_Teri進(jìn)行了轉(zhuǎn)化的谷氨 酸棒桿菌YDK010株進(jìn)行了培養(yǎng)。
[0377] (3)從培養(yǎng)液除去菌體、以及除去了菌體的培養(yǎng)液的保存
[0378] 按照實(shí)施例1的（3)中所述的操作流程實(shí)施。
[0379] ⑷伴隨pH變化的融合蛋白質(zhì)50-Teri的沉淀及可溶化
[0380] 將冷凍保存的除去了菌體的培養(yǎng)液在25°C下解凍，用離心機(jī)以12000G離心1分 鐘，對(duì)冷凍保存中生成的主要由無機(jī)鹽構(gòu)成的沉淀進(jìn)行分離。在8根微型管中分別添加 0μ L、5y L、10y L、15y L、20y L、30y L、40y L、50y L 的 0· 5M 硫酸水溶液、以及 50μ L、 45μ L、40y L、25y L、30y L、20y L、10y L、0y L的MilliQ水并使之均勻，然后，分別注入得 到的離心上清600 μ L，制備成容量均為650 μ L。
[0381] 對(duì)其進(jìn)行攪拌后，靜置 10 分鐘，得到了 ρΗ7. 9、ρΗ7. 6、ρΗ7. 3、ρΗ7. 1、ρΗ6. 6、ρΗ4. 9、 ρΗ4· 1、ρΗ3·7的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"（"相當(dāng)于步驟（2)中得到的溶液"）。ρΗ7· 1、 ρΗ6.6、ρΗ4.9、ρΗ4. 1、ρΗ3. 7的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"出現(xiàn)白濁，確認(rèn)了沉淀的生成。對(duì) 這些"完成PH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液"，用離心機(jī)以12000G離心5分鐘，分離出因 pH變化而生成的 沉淀（相當(dāng)于"步驟（3)中分離出的固體")。將所得離心上清分別轉(zhuǎn)移至其他微型管中，作 為"完成PH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上清"（相當(dāng)于"步驟（3)中固體分離后的溶液"）。向殘留的沉 淀添加與除去了的離心上清相同容量的緩沖液（IOOmM Tris-HCl，pH8. 5)，進(jìn)行攪拌，沉淀 迅速溶解，得到了"沉淀溶解溶液"（相當(dāng)于"步驟⑷中得到的溶液"）。"沉淀溶解溶液" 的 pH 均在中性附近，分別為 ρΗ8· 0、ρΗ8· 0、ρΗ8· 0、ρΗ8· 0、ρΗ8· 0、ρΗ7· 9、ρΗ7· 7、ρΗ7· 6。
[0382] 對(duì)通過上述操作得到的 ρΗ7· 9、ρΗ7· 6、ρΗ7· 3、ρΗ7· 1、ρΗ6· 6、ρΗ4· 9、ρΗ4· 1、ρΗ3· 7 的"完成pH調(diào)節(jié)的培養(yǎng)液上清"及"沉淀溶解溶液"進(jìn)行還原SDS-PAGE以及反相HPLC，對(duì) 伴隨pH變化的50-Teri的沉淀和可溶化進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。需要說明的是，50-Teri回收率 的計(jì)算使用反相HPLC按以下的計(jì)算公式進(jìn)行。
[0383] 回收率（％ )=[步驟⑷中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的量/{:步驟⑷中得到的 溶液中融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量}] X 100
[0384] 對(duì)各融合蛋白質(zhì)的量根據(jù)反相HPLC中的相應(yīng)峰面積進(jìn)行了定量。具體而言，通過 使用已知物質(zhì)（IGF-I)制作了標(biāo)準(zhǔn)曲線，將各測(cè)定樣品的相應(yīng)峰面積套用該標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì) 算出融合蛋白質(zhì)的量。反相HPLC條件如下所示。
[0385] 系統(tǒng)：Waters Alliance PDA 系統(tǒng)一套
[0386] 柱：YMC-Triart C18 Φ 4. 6 X 100_，粒徑 5 μ m，微孔徑 12nm
[0387] 柱溫：30°C
[0388] 流動(dòng)相A : IOmM乙酸銨水溶液，10%乙腈水溶液，pH7. 0
[0389] 流動(dòng)相B : IOmM乙酸銨水溶液，80 %乙腈水溶液，pH7. 0
[0390] 流速：1. OmT ,/mi η
[0391] 檢測(cè)：220nm
[0392] 注射體積：30 MI
[0393]

【權(quán)利要求】
1. 一種融合蛋白質(zhì)的制造方法，其是具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融 合蛋白質(zhì)的制造方法，所述制造方法包括下述（1)?（4)的步驟： (1) 制備包含融合蛋白質(zhì)的溶液的步驟； (2) 將步驟⑴中得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至使回收率達(dá)到10%以上的pH的步驟，其中， 回收率通過下述計(jì)算公式來計(jì)算： 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中的融合蛋白質(zhì)的量/{步驟⑷中得到的溶 液中融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量}]X 100 ; (3) 從步驟⑵中得到的溶液分離固體的步驟；以及 (4) 將步驟（3)中分離出的固體溶解在溶液中的步驟，所述溶液具有12以下且比步驟 (2)中得到的溶液的pH高0. 1以上的pH。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白質(zhì)是細(xì)胞表層蛋白質(zhì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，細(xì)胞表層蛋白質(zhì)為CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部分。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部分為下述（a)或（b): (a) 由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 與SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性蛋白質(zhì)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成熟蛋白 質(zhì)的N末端起的6?250個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成熟蛋白 質(zhì)的N末端起的6、17、50或250個(gè)氨基酸殘基中的任意殘基構(gòu)成的序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)為 10 ?1000 個(gè)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1?7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋 白質(zhì)之間還包含用于酶切或化學(xué)切割的氨基酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間存 在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶識(shí)別序列、胰蛋白酶的識(shí)別序列或Factor Xa 蛋白酶的識(shí)別序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1?9中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟⑵的pH為9以下。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1?10中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（2)的pH調(diào)節(jié)使用選自硫 酸、鹽酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸進(jìn)行。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（3)的分離利用離心分離和 /或膜過濾進(jìn)行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（1)中得到的溶液是具有表 達(dá)融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物的棒狀桿菌型細(xì)菌的培養(yǎng)液的上清。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1?13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（2)中指定的回收率為30% 以上。
15. -種目標(biāo)蛋白質(zhì)的制造方法，其包括下述（1)?（5)的步驟： (1)制備包含具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的溶液的步 驟，且該融合蛋白質(zhì)在具有自組裝能力的蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間包含用于酶切或化學(xué)切 割的氨基酸序列； (2) 將步驟⑴中得到的溶液的pH調(diào)節(jié)至使回收率達(dá)到10%以上的pH的步驟，其中， 回收率通過下述計(jì)算公式計(jì)算： 回收率（％) =[步驟⑷中得到的溶液中融合蛋白質(zhì)的量/{步驟⑷中得到的溶液 中融合蛋白質(zhì)的量+步驟（3)的固體分離后的溶液中融合蛋白質(zhì)的量}]X 100 ; (3) 由步驟（2)中得到的溶液分離固體的步驟；以及 (4) 將步驟（3)中分離出的固體溶解在溶液中的步驟，所述溶液具有12以下且比步驟 (2)中得到的溶液的pH高0. 1以上的pH ; (5) 與步驟（4)同時(shí)、或在步驟（4)中途、或在步驟（4)之后，位于具有自組裝能力的蛋 白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的氨基酸序列部位對(duì)融合蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切或化學(xué)切割的處理的步 驟。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，對(duì)所述融合蛋白質(zhì)進(jìn)行切割處理的步驟是進(jìn) 行酶切處理的步驟。
17. 權(quán)利要求15所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白是細(xì)胞表層蛋白質(zhì)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，細(xì)胞表層蛋白質(zhì)是CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部 分。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)或其一部分是下述（a)或 (b)： (a) 由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)； (b) 與SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列具有95%以上的同源性蛋白質(zhì)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成熟蛋 白質(zhì)的N末端起的6?250個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的序列。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，CspB成熟蛋白質(zhì)的一部分是由從CspB成熟蛋 白質(zhì)的N末端起的6、17、50或250個(gè)氣基酸殘基中的任意殘基構(gòu)成的序列。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15?21中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)為 10 ?1000 個(gè)。
23. 權(quán)利要求15?22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是特立帕肽。
24. 根據(jù)權(quán)利要求15?22中任一項(xiàng)所述的方法，其中，目標(biāo)蛋白質(zhì)是SEQ ID N0:93所 示的比伐盧定中間體。
25. 根據(jù)權(quán)利要求15?24中任一項(xiàng)所述的方法，其中，具有自組裝能力的蛋白與目標(biāo) 蛋白質(zhì)之間存在的用于酶切的氨基酸序列是ProTEV蛋白酶識(shí)別序列、胰蛋白酶的識(shí)別序 列或Factor Xa蛋白酶的識(shí)別序列。
26. 根據(jù)權(quán)利要求15?25中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（2)的pH為9以下。
27. 根據(jù)權(quán)利要求15?26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（2)的pH調(diào)節(jié)使用選自硫 酸、鹽酸、乙酸、磷酸以及三氟乙酸中的酸來進(jìn)行。
28. 根據(jù)權(quán)利要求15?27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（3)的分離通過離心分離 和/或膜過濾來進(jìn)行。
29. 根據(jù)權(quán)利要求15?28中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（1)中得到的溶液是具有 表達(dá)融合蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建物的棒狀桿菌型細(xì)菌培養(yǎng)液的上清。
30. 根據(jù)權(quán)利要求15?29中任一項(xiàng)所述的方法，其包括在步驟（4)和/或步驟（5)之 后進(jìn)行的（6)對(duì)融合蛋白質(zhì)或目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化的步驟。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，步驟（6)利用柱色譜來進(jìn)行。
32. 根據(jù)權(quán)利要求15?31中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟（2)中指定的回收率為 30%以上。
33. -種產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)的固體并對(duì)其進(jìn)行分離的方法，其包括將包含具有自組裝能 力的蛋白與目標(biāo)蛋白質(zhì)形成的融合蛋白質(zhì)的溶液的pH調(diào)節(jié)至9以下，從而產(chǎn)生固體，然后， 對(duì)該固體進(jìn)行分離。
【文檔編號(hào)】C07K14/34GK104487586SQ201480001911
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月18日
【發(fā)明者】野中孝裕, 萬年輝久, 鶴井典子 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社