專利名稱：制備單鏈尿激酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備單鏈尿激酶原(以下稱為前-uPA(pro-uPA)或sc-uPA)的方法，特別是指這樣一種生產(chǎn)前-uPA的方法，它包括從人體基因庫(kù)中獲得尿激酶(uPA)基因，把它插入到一個(gè)表達(dá)載體中，并將所得質(zhì)粒載體DNA引入至動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，以獲得一個(gè)能生產(chǎn)編碼蛋白的轉(zhuǎn)化子，從而從上述動(dòng)物細(xì)胞中獲得糖基化的前-uPA。
這項(xiàng)發(fā)明進(jìn)一步要獲得的產(chǎn)物是人類uPA啟動(dòng)子衍生物，它能控制象uPA一類基因的轉(zhuǎn)錄。該項(xiàng)發(fā)明還包括一些新的真核細(xì)胞表達(dá)載體以及與此有關(guān)的表達(dá)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。在表達(dá)載體中，將一個(gè)cDNA或一個(gè)基因放于人類uPA啟動(dòng)子或其衍生物的轉(zhuǎn)錄控制之下。
這項(xiàng)發(fā)明的另一個(gè)方面是一個(gè)“表達(dá)盒”，它含有人類uPA啟動(dòng)子或其衍生物、人類uPA轉(zhuǎn)錄起始子(即所謂的TATA盒)和一個(gè)多聚接頭。
尿激酶(uPA)是人尿中一種纖維蛋白溶酶原激活劑，可用來治療各種形式的血栓形成或栓塞疾病。
尿激酶的制備以純化從人類尿中提取的酶為基礎(chǔ)。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展和特異性抗尿激酶抗體(單克隆及多克隆抗體)的應(yīng)用，現(xiàn)已知道，uPA是一個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物前-uPA的激活產(chǎn)物(Wun等，1982，J.Biol.Chem.257，7262-7268;Nielsen等，1982，Biochemistry21，6410-6415)。前-uPA是一個(gè)單鏈蛋白質(zhì)(sc-uPA)，而uPA是一個(gè)雙鏈蛋白質(zhì)(tc-uPA)，sc-uPA中一個(gè)單個(gè)肽鍵的裂解，使scd-uPA一轉(zhuǎn)變?yōu)閠c-uPA這種單鏈前-uPA在蛋白水解酶，如胰蛋白酶或血纖維蛋白溶解酶的作用下，發(fā)生特異性裂解，使其專一性活力增加50倍以上。在體內(nèi)，這種轉(zhuǎn)化主要是由血纖維蛋白溶解酶起作用的。
1977年Nolan在人類胚腎細(xì)胞培養(yǎng)物中已找到纖維蛋白溶解酶原激活劑的非活性形式(BiochemBiophysActa1977;496，384-400)。這種作者認(rèn)為是尿激酶的原激活劑形式的物質(zhì)，可以被胰蛋白酶激活，而無分子量的變化。一旦被激活，就能被兔抗人尿激酶抗體抑制。用芐脒-瓊脂糖親和層析法可將“原激活劑”的非活性形式和活性形式分開。
單鏈纖維蛋白溶解酶原激活劑的分子量為56，000，在血纖維蛋白板上，其專一性活性為40，000-50，000CTA單位/mg，對(duì)血纖維蛋白的高親和力可見于歐洲專利40238上。
歐洲專利申請(qǐng)出版第92182號(hào)就是關(guān)于用重組DNA技術(shù)制備尿激酶衍生物，它特別闡明了在一個(gè)原核生物的宿主(大腸桿菌)中通過重組DNA技術(shù)得到的低分子量尿激酶(約30，000D)的純化和定性。
另一歐洲專利申請(qǐng)EP-A-37687描述了編碼具有人類尿激酶特性的纖維蛋白溶酶原激活物的脫氧核糖核酸(DNA)片段，以及在某種細(xì)菌中表達(dá)該DNA順序的方法。而在歐洲專利申請(qǐng)出版第154272號(hào)，描述了在動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)糖基化單鏈尿激酶的方法，它是從已建立的人類腎臟細(xì)胞素的mRNA得到DNA，通過重組DNA技術(shù)而生產(chǎn)糖基化單鏈尿激酶。Riccio等，在NucleicAcidResearch，13，2759(1985)描述了人類uPA啟動(dòng)子區(qū)域約800堿基對(duì)片段的順序，它含有一個(gè)5′側(cè)翼區(qū)域。
如下所預(yù)期的，這項(xiàng)發(fā)明闡明了一個(gè)在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)通過重組DNA技術(shù)生產(chǎn)前-uPA的方法。這一方法包括把一個(gè)DNA載體引入適當(dāng)?shù)膭?dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)，該載體上有一人類基因組起始點(diǎn)DNA片段，含有人類-uPA基因的編碼區(qū)域而不是調(diào)節(jié)區(qū)域。經(jīng)培養(yǎng)，可生產(chǎn)出與自然發(fā)生的前-uPA有相同氨基酸順序的人類型前-uPA。
含uPA編碼區(qū)的人類基因組起始點(diǎn)DNA片段，是在一個(gè)適當(dāng)?shù)妮d體內(nèi)，用一段基因本身或在已知編碼順序的基礎(chǔ)上合成一個(gè)適當(dāng)長(zhǎng)度的DNA片段作為DNA探針或用一個(gè)cDNA衍生的探針進(jìn)行基因庫(kù)的篩選，而從人類基因庫(kù)獲得的，如按照這一技術(shù)，在λ噬菌體或Cosmids裝配型質(zhì)粒內(nèi)的基因庫(kù)中獲得。
這個(gè)uPA編碼片段是通過SmaⅠ消化DNA克隆而得到的一個(gè)7.3千堿基對(duì)片段，這樣一個(gè)DNA片段在下文中還會(huì)提到，稱為開放性讀碼(ORF)，表示一個(gè)含有uPA·mRNA的轉(zhuǎn)錄一轉(zhuǎn)譯單位的基因組DNA順序，它可能被插入一些內(nèi)含子，更可能包含5′和3′不轉(zhuǎn)譯區(qū)域或與或其中一部份具有轉(zhuǎn)譯效率或mnRNA穩(wěn)定性有關(guān)的一個(gè)部分。較好ORF的一例就是一個(gè)上述所定義的順序，其中插入有10個(gè)內(nèi)含子。
在這項(xiàng)發(fā)明所述的方法中，所使用的表達(dá)載體可以是任何已知的用于轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。它們必須含有一個(gè)調(diào)節(jié)mRNA轉(zhuǎn)譯的順序，如啟動(dòng)子，以及一個(gè)多聚腺苷化位點(diǎn)，有些還含有一個(gè)真核細(xì)胞復(fù)制源。特別的是啟動(dòng)子區(qū)域，它可以是能用于動(dòng)物細(xì)胞的任何已知啟動(dòng)子。從哺乳動(dòng)物的病毒，如還原病毒(即RSV)、SV40(遲早)和腺病毒(遲早)中可以得到異種啟動(dòng)子，還可選用動(dòng)物或人類源的調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，有些這類調(diào)節(jié)啟動(dòng)子是來自于鼠或人的金屬巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽Ⅰ和Ⅱ、熱休克蛋白等，這些在參考文獻(xiàn)中可以查閱到，如Hamer等，EukaryoticViralVectors，Y.Gluzman編輯，1983，7-12，Mayo等，Cell，29，99-108(1982)和Korin等，Nature，308，513-519(1984)。
除了那些調(diào)節(jié)啟動(dòng)子外，發(fā)現(xiàn)人類uPA啟動(dòng)子區(qū)是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)一個(gè)它所控制的基因的高效啟動(dòng)子。人類uPA啟動(dòng)子區(qū)域是在人類基因組庫(kù)中(如上)，通過SmaⅠ消化而得到的，約含2.38千堿基對(duì)，在人類uPA基因上，約從-2383堿基對(duì)至+29堿基對(duì)。
這種啟動(dòng)子和其衍生物可通過不同試劑如佛皮醇酯被引入，并高水平地表達(dá)uPA基因。
不僅是這種“自然”人類uPA啟動(dòng)子可用來在一個(gè)適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞系中表達(dá)一個(gè)基因，而且，通過缺失、插入或突變所產(chǎn)生的衍生物，保持著原有的調(diào)節(jié)能力，甚至是具有更好的調(diào)節(jié)能力，也可用于這項(xiàng)發(fā)明所述的方法中，特別是uPA啟動(dòng)子區(qū)域缺失所得的衍生物尤為有利。用OxaNⅠ或EcoRⅤ處理uPA啟動(dòng)子，接著進(jìn)行連接，所得的片段即為有代表性的缺失衍生物。特別是用OxaNⅠ消化后，得到的缺失衍生物在-1827和-1202堿基對(duì)間喪失了一個(gè)0.6千堿基對(duì)的片段，而用OxaNⅠ和EcoRⅤ消化，得到的缺失衍生物在-1827和-537堿基對(duì)間缺失了一個(gè)1.29千堿基對(duì)的片段。
已發(fā)現(xiàn)這些缺失衍生物可以產(chǎn)生調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，其產(chǎn)率相當(dāng)于或高于通常的病毒啟動(dòng)子，如RSV，后者通常被認(rèn)為是效率很高的啟動(dòng)子系統(tǒng)。
盡管在uPA啟動(dòng)子或其衍生物控制下，表達(dá)較有利的基因是uPA基因，但這一啟動(dòng)子可用來表達(dá)任何已知基因或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的編碼順序。
至于多聚腺苷化位點(diǎn)，則可以是所知中的任何一個(gè)，例如與啟動(dòng)子區(qū)域相連的一個(gè)來自u(píng)PA基因本身或來自另一個(gè)哺乳動(dòng)物基因的多聚腺苷化位點(diǎn)。一旦制備成含一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域、一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始子及一個(gè)方便的多聚接頭的表達(dá)盒準(zhǔn)備完畢，就可以接入到經(jīng)選擇的基因中，以轉(zhuǎn)化入一個(gè)動(dòng)物細(xì)胞。通常，各個(gè)部分組成到一起的順序不是很關(guān)鍵的，所以側(cè)翼區(qū)可能會(huì)首先連到復(fù)制系統(tǒng)上，包括一個(gè)標(biāo)記物或其它區(qū)域，如增強(qiáng)劑、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域等，這些是基因中首先插入的。
各種片段組成在一起的方式是由一系列因素決定的，這些因素與形成的容易性、限制性位點(diǎn)的選擇、特殊片段的應(yīng)用等有關(guān)。這些因素最終又需要熟悉該項(xiàng)專業(yè)的操作人員的選擇。
復(fù)制系統(tǒng)的選擇在某種程度上取決于這是一個(gè)短暫的還是穩(wěn)定的表達(dá)。對(duì)于短暫表達(dá)，需要用含一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)的病毒順序(如SV40)為附加體。穩(wěn)定表達(dá)則可用其它附加物(如牛乳頭狀瘤病毒的載體)或結(jié)合入基因組的順序而得到。將一些這樣的病毒順序，如基因gpt，neo和dhfr聯(lián)上標(biāo)記物，這些標(biāo)記物可用于選擇含載體的細(xì)胞以及整個(gè)外來順序的擴(kuò)增。
為了最大限度地增加所設(shè)計(jì)的產(chǎn)物，即人類前-uPA的產(chǎn)生，較為方便的是采用第一個(gè)含uPA表達(dá)盒的構(gòu)建物和第二個(gè)含選擇性標(biāo)記的獨(dú)立構(gòu)建物共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
或者，可將uPA盒串聯(lián)到一個(gè)基因，如dhfr的表達(dá)盒上，基因通過這樣一個(gè)串聯(lián)構(gòu)建物而得到擴(kuò)增。
宿主細(xì)胞可以是任何動(dòng)物細(xì)胞，最好是哺乳動(dòng)物或鳥類的細(xì)胞。在這些細(xì)胞內(nèi)，生產(chǎn)出前-uPA的量與用uPA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞前相同。一些明顯含人類起始點(diǎn)的上述細(xì)胞，包括有已知的和已建立的細(xì)胞學(xué)，這些細(xì)胞在轉(zhuǎn)化前可能或不可能產(chǎn)生可回收量的前-uPA，比如LBb，一個(gè)來自親本L細(xì)胞的小鼠成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞學(xué)(CorsaroC.M.和PearsonL.M.“在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率的增強(qiáng)”，《Somaticcellgenetics》7，603-616，1981);CHO，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(KaoF.T，PuckF，Proc.Natl.Acad.Sci，60，1275-1281，1968)和A431人類表皮樣腫瘤細(xì)胞學(xué)(FabricantR.N，DelarcoJ.E，和TodaroGF，“在培養(yǎng)中對(duì)人體黑素瘤細(xì)胞的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體”，《Proc，Natl.Acad，Scr.》USA74，565-569，1977)。上述前二種細(xì)胞系(LB6和CHO)不能生產(chǎn)前-uPA，而后一種(A431)可以生產(chǎn)，通常，在該項(xiàng)發(fā)明的過程中，已建立的細(xì)胞學(xué)，如CHO、COS、LTK、Hela和CN-1是適用的。
生產(chǎn)uPA的單層CHO細(xì)胞經(jīng)重復(fù)克隆后，可得到保留有uPA生產(chǎn)能力的衍生的細(xì)胞系后者也能在培養(yǎng)基懸液中自身復(fù)制。這樣的細(xì)胞系在培養(yǎng)上的容易性和每個(gè)大發(fā)酵單元內(nèi)有高的產(chǎn)量方面的優(yōu)點(diǎn)對(duì)操作人員是顯而易見的。這些基因組uPADNA的轉(zhuǎn)化，CHO細(xì)胞系在培養(yǎng)基懸液中的生長(zhǎng)體現(xiàn)了這項(xiàng)發(fā)明較好的一方面。
可用任何方便的方法將表達(dá)載體引入宿主，如微量注射、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、經(jīng)磷酸鈣沉淀的DNA轉(zhuǎn)錄和電刺激(參見Banerji.J.等，Cell33，729-740(1983);GrahamF.L.和VanderEbA.J，Virology，52，456-467(1983)和PotterH等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，81，7161-7165(1984))。
轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞在一個(gè)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中生長(zhǎng)，如Dulbecco's改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)，它含10%-20%滅活胎小牛血清，在這一培養(yǎng)基中，細(xì)胞能穩(wěn)定地生長(zhǎng)，然后加入適當(dāng)?shù)倪x擇劑，如一種抗菌素。
重復(fù)克隆經(jīng)選擇的細(xì)胞，用常用的方法測(cè)定前-uPA/uPA的產(chǎn)量，如血纖維蛋白溶解試驗(yàn)或免疫胺溶解試驗(yàn)(IAA)。產(chǎn)生的克隆進(jìn)行群塊培養(yǎng)，以大量生產(chǎn)前-uPA。
在大量培養(yǎng)中，重要的一點(diǎn)是在起始培養(yǎng)基中要加無嘌呤核酸或在培養(yǎng)過程中加入這一物質(zhì)，可回收得到高的前-uPA的產(chǎn)量，典型的加入的濃度是10-50Iu/ml.多效用20-25Iu/ml。
根據(jù)前導(dǎo)順序是否保留、產(chǎn)物是否能分泌，可連續(xù)地或反復(fù)地更改培養(yǎng)基從培養(yǎng)基中分離前uPA。如果前導(dǎo)順序不保留，產(chǎn)物滯留于細(xì)胞內(nèi)，則可以收獲細(xì)胞，殺死并使之溶出后，分離產(chǎn)物。常用的分離和純化方法是親和層析，HPLC、反相HPLC、FPLC、電泳、抽提、沉淀等常用技術(shù)。
一個(gè)驚奇的發(fā)現(xiàn)是，利用這項(xiàng)發(fā)明所生產(chǎn)的sc-uPA在β-鏈上有一個(gè)不同的糖基化，卻保留了與人類尿中的sc-uPA相同的結(jié)構(gòu)和組成，以及有相同類型的生物活性。實(shí)際上，這些產(chǎn)物的α-鏈有與尿中sc-uPA相同的電泳遷移率，而β-鏈則有明顯的不同的電泳遷移率，其遷移率相當(dāng)于分子量增加1000-2000。這些差別可以用特異性糖苷酶，如糖肽酶F或唾液酸苷酶來測(cè)定，前者能移去糖蛋白上所有的N-鏈糖，后者能夠去除糖蛋白的末端唾液酸殘基。
可以看到，該項(xiàng)發(fā)明中sc-uPA/tc-uPA得到的sc-uPA或tc-uPA蛋白，經(jīng)糖肽酶F處理，以移去所有N末端的糖后，其電泳遷移率與人尿中的sc-uPA或tc-uPA的遷移率相同。用相同的方法處理，將該項(xiàng)發(fā)明中sc-uPA/tc-uPA的產(chǎn)物的末端唾液酸殘基除去，所得的糖蛋白與經(jīng)同樣處理的來自人尿sc-uPA/tc-uPA相比，電泳遷移率不同(遷移率降低)通過該項(xiàng)發(fā)明得到的sc-uPA的生物活性可用簡(jiǎn)便的體內(nèi)或體外法測(cè)試。體外試驗(yàn)可用所謂的血纖維蛋白板方法，在一個(gè)血纖維蛋白凝膠板上測(cè)定由該項(xiàng)發(fā)明所生產(chǎn)的sc-uPA的血纖維蛋白溶解活性，這種凝膠是血纖維蛋白原和疑血酶聚合而成的。
對(duì)照來自尿成細(xì)胞的sc-uPA，校正由該項(xiàng)發(fā)明所生產(chǎn)的sc-uPA的參數(shù)的體外試驗(yàn)法，是一種對(duì)sc-uPA到tc-uPA在血纖維蛋白溶酶作用下激活的動(dòng)力學(xué)分析。
另一個(gè)體外試驗(yàn)的例子是用合成底物的水解的動(dòng)力學(xué)分析或用血纖維蛋白溶酶激活的seu-PA活化人類宋鞍茲苊岡畝ρ 分析。
進(jìn)一步的體外試驗(yàn)研究了被血纖維蛋白溶酶激活的sc-uPA(即來自本發(fā)明的tc-uPA的復(fù)合物)對(duì)血纖維蛋白溶解活性的抑制作用。該項(xiàng)研究選用一個(gè)特殊的合成底物，用一個(gè)已知的人體纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑，如內(nèi)皮1(PAⅠ-1)。
所有這些實(shí)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)被測(cè)物的血栓溶解活性是極有意義的，且為治療應(yīng)用提供了依據(jù)。
得自該項(xiàng)發(fā)明的sc-uPA/tc-uPA復(fù)合物在這些試驗(yàn)中與人尿sc-uPA/tc-uPA有相同類型的胺溶和血纖維蛋白溶解活性。
D.Collen等在J.Clin.Inv.1983，73，368-376.一文中描述了一個(gè)兔體內(nèi)實(shí)驗(yàn)性血栓的體內(nèi)模型，用以測(cè)定得自發(fā)明的化合物的血栓溶解活性。
簡(jiǎn)單說來，用血管夾取出麻醉兔外周頸靜脈的一個(gè)切片，測(cè)定容量。在空的靜脈部分加入凝血酶溶液，再加入含人體血纖維蛋白碎片的新鮮血液，形成的血塊在移去夾子前放置預(yù)計(jì)的時(shí)間(方便的是30分鐘)，然后計(jì)算碎片的量。把要測(cè)試的血纖維蛋白原激活劑注入耳邊緣的靜脈，一定時(shí)間后，將含凝血酶的血管段末端縫合，測(cè)定所含的碎片。以殘留的碎片和剛開始所含的碎片間的百分率來計(jì)算血栓溶解的程度。
由這項(xiàng)發(fā)明得到的的sc-uPA化合物與尿中分離的sc-uPA具有相同的生物學(xué)特性，因此可被用作相同的治療指征，即主要用于血栓溶解或治療血栓疾病。按其本身的技術(shù)，這一復(fù)合物可被用作象這樣的、甚至是更好的系統(tǒng)。在一些參考書中，如Remington的Pharm-aceuticalSciences，17th版，1985，MackPublishingCo.中描述了這些技術(shù)。尤其是這些產(chǎn)物能摸擬一般uPA或scu-PA配方，而配方應(yīng)用。
一個(gè)較好的治療指征是在梗塞或栓塞早期，如心肌梗塞、肺栓塞或周圍動(dòng)脈栓塞，可產(chǎn)生血栓溶解。給藥途經(jīng)以e.v.為佳，藥的形式可以是大丸藥或灌注。較好的方法是，e.v.大丸藥給藥得自該項(xiàng)發(fā)明的復(fù)合物的血栓溶解有效量，必要的話，在一個(gè)很短的時(shí)間中進(jìn)一步e.v.灌注低劑量。根據(jù)病人年齡、血栓大小、情況的不同，每日劑量差異很大。對(duì)梗塞及相應(yīng)的治療，在10-40mg/飲食范圍有效，常用15-30mg/飲食對(duì)一個(gè)正常(70Kg)的病人，最好是20mg/飲食。在這個(gè)特殊的治療范圍，已經(jīng)知道的適當(dāng)?shù)膭┝亢头幏桨甘峭ㄟ^醫(yī)師一例例治療后得出的，接該項(xiàng)發(fā)明，病例應(yīng)是混血?jiǎng)游?，哺乳?dòng)物尤其是人為好。含通常的穩(wěn)定劑，如所述的商業(yè)用尿激酶的劑量單位是50，000-200，000IUuPA/單位。
以下是一種凍干藥物制劑，在2ml無菌鹽水中復(fù)溶，e.v.注射.
3Fllsc-uPA5mg甘露糖醇20mg乙二胺四乙酸鈉2mg磷酸緩沖液q.s.
關(guān)于該項(xiàng)發(fā)明中轉(zhuǎn)染載體的制備和方法方面，以下將作詳細(xì)闡述。(從A.1至A.7)A.1-人類uPA基因的克隆.
人類基因組DNA庫(kù)是通過將部分消化的肝DNA克隆在Charon28λ載體中獲得的，含uPA基因的噬菌體是通過用適當(dāng)探針篩選基因庫(kù)得到的，這種探針來自部分未拼接的人uPACDNA。分離陽(yáng)性噬菌體克隆，用限制性分析法測(cè)定，分離含uPA“讀碼”(ORF)的部分或含uPA啟動(dòng)子的5′區(qū)域部分。
A.2-uPA編碼DNA的制備人類uPAmRNA的5′末端附近，有4個(gè)SmaⅠ限制性切點(diǎn)最右邊的位于編碼區(qū)以外，在uPA多聚腺苷化位點(diǎn)之上，這些5′的SmaⅠ位點(diǎn)聚集在第一個(gè)外顯子和第一個(gè)內(nèi)含子內(nèi)的小片段DNA上，接著這一區(qū)域的是位于第二個(gè)外顯子開始處的轉(zhuǎn)譯起始編碼(

圖1)。
λ-uPA噬菌體克隆的限制性分折表明，至少在我們這樣的酶解情況下，僅僅第1和第5SmaⅠ位點(diǎn)被切開。所以，用SmaⅠ消化λ-uPA1，在瓊脂糖凝膠上分離DNA片段，有可能切除uPA編碼區(qū)域，然后插入一個(gè)不同的載體。這樣做，也可得到另一個(gè)SmaⅠ片段，更確切地說，是從5′到uPAORF的2.38千堿基對(duì)SmaⅠ片段，含uPAmRNA起始點(diǎn)、啟動(dòng)子和通過反一調(diào)節(jié)因子進(jìn)行調(diào)節(jié)的區(qū)域。這一片段能調(diào)節(jié)3′鄰近基團(tuán)的mRNA轉(zhuǎn)錄。
A.3-uPA基因在動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。
為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)人類uPA基因，編碼uPAmRNA的DNA區(qū)域必須置于真核細(xì)胞啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。一系列不同的信號(hào)(即增強(qiáng)子和多聚腺苷化位點(diǎn))會(huì)影響mRNA的轉(zhuǎn)錄率和mRNA的穩(wěn)定性(Y.Gluzman，ViralVectors，ColdSpringHarborPress，NewYork)。
A.4-RSV衍生載體的構(gòu)建該項(xiàng)發(fā)明中，有效的真核生物啟動(dòng)子是勞氏肉瘤病毒(RSV)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)(見D.E.Schwartz等，“勞氏肉瘤病毒的核苷酸分析”，《Cell》32，853(1983)。轉(zhuǎn)好的RSV衍生質(zhì)粒是“質(zhì)粒RSV-Neo”?？咕匦旅顾乜剐曰騺碜约?xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5，被插入至RSV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子下游的RSVLTR中，5′一直到SV40多聚腺苷化位點(diǎn)。因它還含有PBR322來源的氨芐青霉素抗性和復(fù)制功能起始點(diǎn)，RSV-Neo質(zhì)粒可在大腸桿菌中繁殖，轉(zhuǎn)染到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，RSV-Neo使這些細(xì)胞對(duì)新霉素和其類似物產(chǎn)生抗性(參見F.Colbere-Garapin等，“高等真核細(xì)胞的一種新的顯性選擇標(biāo)記”;《J.Mol.Biol》.150，1(1981)和P.J.Southeton和P.Berg，“在SV40早期區(qū)域啟動(dòng)子控制下哺乳動(dòng)物細(xì)胞向含抗菌素抗性基因的細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)化”;《J.Molec.和Appl.Genetics，》1，327(1982))。
表達(dá)人類uPA的載體可以從RSV-Neo獲得，用uPA編碼區(qū)域代替位于RSV啟動(dòng)子和SV40多聚腺苷化位點(diǎn)之間的新霉素抗性基因，這樣，用RSV-Neo作為一種起始材料，人類uPA基因以相同的轉(zhuǎn)錄定向插入到RSVLTR中，這樣的質(zhì)粒叫RSV-sc-uPA。含有這種質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，可使它們產(chǎn)生在培養(yǎng)基中分泌uPA的能力。
簡(jiǎn)單地說，uPA表達(dá)載體(RSV-uPA)可以如下構(gòu)建a)從λ-uPA噬菌體的插入中得到一個(gè)含uPA編碼區(qū)域的7.3千堿基對(duì)片段。
b)一段含RSV的LTR的DNA片段，SV40多聚腺苷化位點(diǎn)和PBR322衍生氨芐青霉素抗性以及來源于質(zhì)粒RSV-Neo中的原核生物復(fù)制起始點(diǎn)。
c)在RSV啟動(dòng)子的控制之下插入了uPA編碼區(qū)域，形成細(xì)菌質(zhì)粒RSV-uPA。
d)RSV-uPA與RSV-Neo一起共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)e)選擇帶有抗菌素抗性，并產(chǎn)生uPA的克隆，進(jìn)一步擴(kuò)增。
A.4.1-載體DNA的制備RSV-Neo是一個(gè)已知的、目前應(yīng)用的質(zhì)粒，它含有來自細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5在RSV啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄控制之下的新霉素抗性基因，轉(zhuǎn)染入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，質(zhì)粒使其對(duì)新霉素類似物G418產(chǎn)生抗性。
RSV-Neo用HindⅢ消化，5′凸出未端用DNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段補(bǔ)平。用HpaⅠ消化，用小牛小腸磷酸酶(CIP)處理，使之產(chǎn)生兩個(gè)平整末端的、去磷酸化片段。小的含有復(fù)制起始點(diǎn)和來自質(zhì)粒PBR322的氨芐青霉素抗性基因。在它的端點(diǎn)，有RSV啟動(dòng)子和SV40多聚腺苷化位點(diǎn)(PAS)，在瓊脂糖上分離后，這個(gè)3.5千堿基對(duì)片段被純化，作為一個(gè)真核生物的表達(dá)讀碼，其中可以插入uPA基因。
A.4.2-在RSV啟動(dòng)子下uPA基因的克隆插入片段和載體DNA被連在一起，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸細(xì)胞，在氨芐青霉素抗性克隆中篩選出RSV-uPA，它含有接適當(dāng)方向插入到RSVLTR內(nèi)的人類uPA編碼區(qū)域A.5BPV衍生游離載體的構(gòu)建增加用外源基因轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的蛋白質(zhì)生產(chǎn)的可能性是增加基因拷貝數(shù)。例如，使用脫氫葉酸還原酶(DHFR)來源的載體或牛乳頭狀瘤病毒(BPV)來源的載體。
BPV是一個(gè)通常出現(xiàn)在牛肉瘤中的7945bp(堿基對(duì))長(zhǎng)的雙鏈環(huán)狀DNA病毒[見C.Y.Chen等，“牛乳頭狀瘤病毒Ⅰ型基因組的基本結(jié)構(gòu)和遺傳組織”，《Nature》299，529(1982)]。感染細(xì)胞使染色體外的病毒DNA保持穩(wěn)定的游離基因形式高拷貝地存在。(見M.F.Law等，“用牛乳頭狀瘤病毒轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞只含有染色體外的病毒DNA順序”，《Proc，Narl.Acad.Sci.》USA78，2727(1981)，和W.D.Lancaster，“在病毒誘導(dǎo)的馬和牛腫瘤細(xì)胞和病毒轉(zhuǎn)化的鼠細(xì)胞中牛乳頭狀瘤病毒DNA整合的明顯缺失”，《Virology》108，251(1981))。BPV基因組能被粗略地再分成三個(gè)功能區(qū)非編碼的調(diào)節(jié)區(qū)，約1kb(千堿基對(duì))長(zhǎng)，在HindⅢ和HpaⅠ位點(diǎn)之間，轉(zhuǎn)化區(qū)域在BamHⅠ和HpaⅠ之間，跨越約60%的基因組，從BamHⅠ到HindⅢ間的病毒結(jié)構(gòu)蛋白的編碼區(qū)(見M.Lusky和M.Botchan，“牛乳頭狀瘤病毒質(zhì)粒完整順序的特性”，《Cell》，391(1984)，和B.A.Spalholz等，“用E2基因產(chǎn)物反向激活牛乳頭狀瘤病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子”，《Cell》42，183(1985))。BPVDNA能被用來轉(zhuǎn)化嚙齒類細(xì)胞，但在體外轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中卻不能形成BPV顆粒，因?yàn)锽amHⅠ-HindⅢ區(qū)域不能被表達(dá)(E.Antmann，“BPV轉(zhuǎn)錄，多聚腺嘌呤RNA和轉(zhuǎn)錄方向的評(píng)價(jià)”，《J.Virol.》43，59(1982)，和L.W.Engel，BPV型的轉(zhuǎn)錄方向，《J.Virol.》47，516(1983))。但這個(gè)區(qū)域似乎對(duì)轉(zhuǎn)化并不必須。用BPV和pMLd構(gòu)建了雜化質(zhì)粒，pMLd是一個(gè)缺失了抑制病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的某種“有害”順序的質(zhì)粒pBR322衍生物[M.Lusky和M.Botchan，“牛乳頭狀瘤病毒質(zhì)粒完整順序的特性”，《Cell》36，391(1984);B.A.Spalholz等，“用E基因產(chǎn)物反向激活牛乳頭狀瘤病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子”，《Cell》42，183(1985)]。這些重組病毒能在E.coli和動(dòng)物細(xì)胞中擴(kuò)增，并能容易地在重組DNA過程中使用[D.DiMaio等，“BPV載體能象質(zhì)粒一樣在小鼠和細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制”，《Proc.Natl.Acad.Sci.》USA79，4030(1982);P.J.Kushner等，“一個(gè)能在小鼠細(xì)胞和E.coli中復(fù)制的質(zhì)粒”，《J.Mol.Appl.Gen.》1，527(1982)，N.Sarver等，BPVDNA“一個(gè)新的真核細(xì)胞克隆載體”，《Molec.andCell.Biol.》1，486(1981)]。BPV基因組體外轉(zhuǎn)化嚙齒類細(xì)胞的能力保持在雜化質(zhì)粒中[C.A.Heilman“在BPV轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞中病毒的專一性轉(zhuǎn)錄”;《Virology》119，22(1982)]，這種重組質(zhì)粒能被用作哺乳動(dòng)物的表達(dá)載體(F.Colbere-Garapin等，“一個(gè)對(duì)高級(jí)真核細(xì)胞的新的明顯的選擇性標(biāo)記”，《J.Mol.Biol.》150，1(1981))。P.J.Southern和P.Berg，“用SV40早期啟動(dòng)子控制之下的細(xì)菌基因?qū)Σ溉閯?dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化為抗菌素抗性”，《J.Molec.andAppl.Genetics，》1，327(1982);N.Sarves等，“能在細(xì)菌中存活的BPV-pML2質(zhì)粒載體在小鼠細(xì)胞中的復(fù)制和轉(zhuǎn)化”，《Proc.Natl.Acad.Sci.》USA79，7147(1982);N.Sarver等，“BPV穿梭載體，基因表達(dá)”，《J.Setlow》和A.Hollandered，173，PlenumPress，NewYork.N.Sarver等，“在BPVI型載體中大鼠前胰島素原基因的增加子依賴性表達(dá)”，《Mol.Cell.Biol.》5，3507(1985);E.T.Scherborn等，“經(jīng)BPV載體導(dǎo)入小鼠細(xì)胞的人U1基因的表達(dá)”，《Mol.Cell.》5，1318(1985);M.Eiden等，“通過使用BPV來源的穿梭載體，在小鼠細(xì)胞中引入Ⅰ型人T細(xì)胞型白血病毒小外殼蛋白”，《Mol.Cell.Biol.》5，3320(1985);P.M.Howley等，“來源于BPVDNA的真核的克隆載體”;《Methodsinenzymology》101，387(1983)，D.DiMaio等，“經(jīng)BPV載體導(dǎo)入小鼠細(xì)胞的克隆的HLA重鏈基因的高水平表達(dá)”;《Mol.Cell.Biol.》4，340(1984);N.Husiung等，“用BPV-金屬巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽載體高效生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原”，《J.Molce.Appl.Genet.》;Y.Wang等，“用染色體外復(fù)制的BPV載體在NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞中增加生產(chǎn)乙型肝炎表面抗原”，《Mol.Cell.Biol.》3，1032(1983);M.Karin等，“攜帶在自主復(fù)制穿梭質(zhì)粒上的人金屬巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)”，《Proc.Natl.Acad.Sci.》USA80，4040(1983)，L.Maroteaux等，“BPV-干擾素β-1重組子轉(zhuǎn)化的小鼠細(xì)胞中，人類干擾素β-1-基因的放線菌酮誘導(dǎo)表達(dá)”，《J.Virol.》47，89(1983);S.Mitrani-Rosenbam等，“小鼠細(xì)胞中BPVDNA載體上的人干擾素β-1基因的誘導(dǎo)表明及染色體外表達(dá)的維持”，《Mol.Cell.Biol.》3，233(1983);G.N.Palakis和D.H.Hanmer，“在異源細(xì)胞中克隆的生長(zhǎng)素和金屬巰基組氨酸三甲基內(nèi)鹽基因的表達(dá)”，《RecentProgressinHormoneResearch》39，363(1983)，含有BPVDNA的BPV230.8質(zhì)粒在BamHⅠ位點(diǎn)克隆λpBR322來源的pML2d質(zhì)粒，(見B.Binetruy等，“含有與質(zhì)粒DNA相連的BPV型1DNA的重組DNA分子的質(zhì)粒狀態(tài)在嚙齒動(dòng)物成纖維細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞中”，《EMBOJ.》1，621(1982))。
游離基因表達(dá)載體有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)a)轉(zhuǎn)染的DNA與轉(zhuǎn)化不同，它是插入在細(xì)胞染色體DNA中，游離基因載體保持基因在一特定的環(huán)境中表達(dá)。
b)基因拷貝數(shù)通常較用插入基因得到的高且更穩(wěn)定。
含有RSVuPA啟動(dòng)子ORF轉(zhuǎn)錄單位的一系列BPV衍生載體構(gòu)建如下Ⅰ)在pBPV230.8的三個(gè)不同的位點(diǎn)插入單一的XhoⅠ位點(diǎn)可獲得三種不同的載體。
Ⅱ)在RSV-uPA的轉(zhuǎn)錄單位末端插入兩個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)。
Ⅲ)用XhoⅠ酶切RSV-uPA轉(zhuǎn)錄單位，雙向插入三種BPV衍生載體上Ⅳ)通過在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中用RSV-Neo與它們共轉(zhuǎn)染，并篩選具有抗菌素抗性，產(chǎn)生uPA克隆的方法來檢測(cè)六種質(zhì)粒產(chǎn)生uPA的能力。
A.5.1-BPV230.8的限制性位點(diǎn)的修飾。
為了避免不適當(dāng)?shù)牟迦胛稽c(diǎn)和基因定向(如啟動(dòng)子阻抑)，最好在BPV230.8質(zhì)粒的三個(gè)不同位點(diǎn)雙向插入RSV-uPA結(jié)栓。為了做到這點(diǎn)，通過插入一個(gè)磷酸化的XhoⅠ接頭分別將質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ進(jìn)行改造。質(zhì)粒DNA首先用合適的酶酶切，然后用DNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段將凸出端補(bǔ)平，加入大量的XhoⅠ接頭進(jìn)行連接，得到的DNA片段用XhoⅠ分解，自身聯(lián)結(jié)后再轉(zhuǎn)化E.coli的感受態(tài)細(xì)胞。
得到的三種質(zhì)粒-pBB新的單一位點(diǎn)XhoⅠ被插入在BamHⅠ位置，通過接頭與載體的融合，使兩側(cè)各有一個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)。
-pBS新的單一位點(diǎn)XhoⅠ被插入SalⅠ位置，通過接頭與載體的融合，使兩邊各產(chǎn)生一個(gè)SalⅠ位點(diǎn)。
-pBH新的單一位點(diǎn)Xho1被插入HindⅢ位置。
A.5.2.-RSVuPA的限制性內(nèi)切酶修飾在RSV-uPA質(zhì)粒中，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和ApaⅠ每個(gè)只能切割一次，前者在接近RSV啟動(dòng)子的pBR322的衍生區(qū)，而后者在靠近uPA多聚腺嘌呤位點(diǎn)的SV40的分區(qū)。這兩個(gè)位點(diǎn)用XhoⅠ接頭修飾如下質(zhì)粒DNA用NdeⅠ和ApaⅠ雙酶切，凸出端補(bǔ)平后用XhoⅠ接頭修飾。將含有復(fù)制起始點(diǎn)和氨芐青霉素(Amp)抗性的片段去磷酸化。然后連接到含有RSV/uPA表達(dá)功能的片段上，這樣得到質(zhì)粒p71。該質(zhì)粒上的RSV/uPA結(jié)構(gòu)兩側(cè)各有一個(gè)XhoⅠ位點(diǎn)。用XhoⅠ酶切之后，它將產(chǎn)生一個(gè)含有RSV啟動(dòng)子，uPA編碼區(qū)的DNA片段，適用于克隆到任何含有XhoⅠ或者SalⅠ位點(diǎn)的載體或者那些可被改造后含有這些插入位點(diǎn)的載體。
A.5.3-在BPV衍生載體中RSV/uPA的插入將pBB和pBH分別XhoⅠ酶切，而pBS用SalⅠ酶切，并將線性化的載體各自用CIP去磷酸化，含有RSV/uPA結(jié)構(gòu)的片段是通過用XhoⅠ酶切質(zhì)粒p71，并在瓊脂糖凝膠上分離得到的，將載體和插入的DNA連接，再用在BPV上僅有一個(gè)切點(diǎn)的XbaⅠ酶解，然后自身對(duì)合，用于轉(zhuǎn)化E.Coli感受態(tài)細(xì)胞，可以得到一定數(shù)量的在三個(gè)不同位點(diǎn)雙向插入RSV/uPA轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒。
A.6-人類uPA啟動(dòng)子的制備已知通過RNA多聚酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的真核基因是在非常復(fù)雜的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下，這些啟動(dòng)子的激活或阻遇導(dǎo)致了每一個(gè)基因在細(xì)胞周期、組織和分化階段的專一性表達(dá)。而且細(xì)胞外因素(如激素、離子、溫度)通過完全不同的機(jī)制激活，調(diào)節(jié)或阻遇活性的穩(wěn)定狀態(tài)水平。DNA結(jié)合因子、核基質(zhì)和DNA共價(jià)修飾，如甲基化，給啟動(dòng)子提供了轉(zhuǎn)錄附近基因的能力。
將一個(gè)位于編碼proUKORF上游并含有proUKmRNA起始位點(diǎn)和啟動(dòng)子的DNA片段克隆到無啟動(dòng)子質(zhì)粒pEMBL8-CATSmaⅠ位點(diǎn)上，該位點(diǎn)在細(xì)菌氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因上游得到的質(zhì)粒(定名為puPA2)，在向啟動(dòng)子方向的SmaⅠ位點(diǎn)的5′端插入XhoⅠ接頭以便于進(jìn)一步修飾。puPA2質(zhì)粒及其衍生物最終轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，通過估計(jì)CAT的活力來測(cè)定它們的轉(zhuǎn)錄能力。
該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，uPA啟動(dòng)子能推動(dòng)CAT基因的轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄水平可以與RSV啟動(dòng)子相比，因此，當(dāng)外源基因或cDNA插入在uPA啟動(dòng)子下游的多聚接頭區(qū)域時(shí)，puPA2質(zhì)粒及其衍生物是強(qiáng)表達(dá)載體。所以含有uPA啟動(dòng)子區(qū)域的質(zhì)粒片段可被用作插入在質(zhì)粒多聚接頭中的基因和cDNA前的“表達(dá)盒”(多聚接頭來自pEMBL8)。
A.6.1-uPA表達(dá)載體用SmaⅠ酶切λ-PA1DNA可產(chǎn)生一個(gè)含有人類uPA啟動(dòng)子的片段(參見前)，該片段可被克隆到一個(gè)基團(tuán)的上游以起始該基團(tuán)在合適的哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，這種結(jié)構(gòu)主要有三個(gè)優(yōu)點(diǎn)-表達(dá)載體不需要含有任何病毒源的一些順序-啟動(dòng)子含有具有可被離子、化學(xué)物質(zhì)、激素等信號(hào)誘導(dǎo)的特性的順序-保留在mRNA5′端的啟動(dòng)子來源順序給mRNA提供了較高的穩(wěn)定性簡(jiǎn)而言之，含有可起始3′區(qū)域基因轉(zhuǎn)錄的人類uPA啟動(dòng)子的載體制備如下a)通過SmaⅠ酶切從λ-uPA1中得到一個(gè)2.38千(堿基對(duì))片段b)該片段以一定方向，在SmaⅠ位置插入到一個(gè)質(zhì)粒中，如pEMBL8CAT，從而得到質(zhì)粒puPA2;
c)啟動(dòng)子的SmaⅠ5′位點(diǎn)通過接頭作用轉(zhuǎn)變?yōu)閄hoⅠ位點(diǎn)，因而產(chǎn)生了質(zhì)粒puPA2/41(該質(zhì)粒與puPA2相似)，當(dāng)進(jìn)入一個(gè)適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物細(xì)胞時(shí)能表達(dá)鄰近的CAT基因。
d)用XbaⅠ部分酶切puPA2/41將CAT基團(tuán)切掉，補(bǔ)平凸出末端，與SalⅠ接頭連接，再用SalⅠ酶切以得到質(zhì)粒pPP41;
e)從λ-uPA1噬菌體中得到含有uPAORF的一個(gè)7.3(千堿基對(duì))SmaⅠ片段(見A.2)，將其按正確的方向插入到pPP41單一的SmaⅠ位點(diǎn)中，以得到各為pPP41XS的uPA表達(dá)質(zhì)粒;
f)pPP41XS與RSV-Neo共轉(zhuǎn)染;
g)選擇帶有抗菌素抗性及產(chǎn)生uPA的克隆并擴(kuò)增。
A6.2-puPA2質(zhì)粒的構(gòu)建為了得到puPA2質(zhì)粒，用SmaⅠ酶切λ-uPA1噬菌體DNA，從凝膠中回收純化2.38kb的色帶，插入到用SmaⅠ酶切并用CIP去磷酸化的PEMBL8載體中，選擇具有正確方向啟動(dòng)子重組質(zhì)粒的細(xì)菌克隆，其中，puPA2含有一個(gè)從前uPA啟動(dòng)子5′端到CAT基因的2.38千堿基對(duì)片段。當(dāng)轉(zhuǎn)染入前uPA生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)，它能起始細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄。
A6.3puPA2/41質(zhì)粒的構(gòu)造為了在前uPA啟動(dòng)子5′端插入一個(gè)單一位點(diǎn)以用于進(jìn)一步改造puPA2質(zhì)粒，可以用SmaⅠ部分酶切，然后插入XhoⅠ接頭，以改造該限制性酶切點(diǎn)，得到的質(zhì)粒puPA2/41的uPA啟動(dòng)子的上游端SmaⅠ位點(diǎn)被單一的XhoⅠ位點(diǎn)所代替。
puPA2質(zhì)粒以及衍生物起始鄰近CAT基因轉(zhuǎn)錄的能力與RSV-CAT相比較，在RSV-CAT質(zhì)粒中，CAT基因是在RSVLTR的轉(zhuǎn)錄控制之下，通過磷酸鈣沉淀法將質(zhì)粒導(dǎo)入A1251細(xì)胞(細(xì)胞系源于腎癌)，用瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)法測(cè)量CAT活性。
puPA2/41DNA用XhoⅠ部分酶切，凸出端用DNA多聚酶ⅠKlenow片段補(bǔ)平，與過量的SmaⅠ接頭連接，再用SmaⅠ酶切，在瓊脂糖凝膠上純化4.8千堿基對(duì)的片段，自身連接笞惺芴珽.coli細(xì)胞，用小量制備分析法篩選質(zhì)粒pPP41。外源基因可以插入在PEMBL8的uPA啟動(dòng)子和mRNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游的多聚接頭，可使用XhoⅠ和SalⅠ將啟動(dòng)子基因結(jié)構(gòu)從pPP41上切下來，插入已知質(zhì)粒的XhoⅠ或SalⅠ位點(diǎn)上。
A6.4-在pPP41中uPA基因的插入將λ-uPA1DNA用SmaⅠ酶切得到的7.3千堿基對(duì)片段的uPAORF，與SmaⅠ酶切，CIP處理過的pPP41DNA連接起來，轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。在抗氨芐青霉素克隆中，篩選載有由其本身啟動(dòng)子控制的uPAORF毗鄰區(qū)域的質(zhì)粒pPP41XS，這個(gè)結(jié)構(gòu)重新建成了在mRNA起始位置下游的原來的SmaⅠ位點(diǎn)及原來的mRNA轉(zhuǎn)錄順序。
A.7-uPA啟動(dòng)子缺失衍生物的構(gòu)建質(zhì)粒細(xì)胞啟動(dòng)子的改造，如缺失、插入或突變都可以給啟動(dòng)子提供一個(gè)新的特性，如更廣的專一性和更高的轉(zhuǎn)錄水平。事實(shí)上，在這類啟動(dòng)子中，誘導(dǎo)區(qū)域仍然保留著，因此，當(dāng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)有負(fù)干擾時(shí)，可以通過外界因子來調(diào)節(jié)它們，以提供特殊的作用。
來源于人uPA啟動(dòng)子的2.38千堿基對(duì)DNA片段的內(nèi)部缺失可以通過基因工程改造細(xì)菌質(zhì)粒(如上述的)puPA2/41方便地得到，尤其是通過使用已經(jīng)存在于uPA啟動(dòng)子內(nèi)的限制性位點(diǎn)得到的缺失，用這種方法得到兩種質(zhì)粒質(zhì)粒puPA2/17，在兩個(gè)OxaNⅠ位點(diǎn)之間有625bp(堿基對(duì))的缺失。
質(zhì)粒puPA2/254，從在5080位置的OxaNⅠ位點(diǎn)到6369位置的EcoRⅤ位點(diǎn)內(nèi)有1.28千堿基對(duì)的缺失。(參見圖8，puPA2質(zhì)粒圖)這兩個(gè)質(zhì)粒在修飾過的uPA啟動(dòng)子的下游載有CAT基因，因此，當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后啟動(dòng)子活性可以通過在真核細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染之后測(cè)量CAT活性而方便地檢測(cè)。
由于使用了來自于PEMBL8讀碼的多聚接頭，不同的基因可以容易地置于這些缺失啟動(dòng)子的控制之下，這些缺失啟動(dòng)子能被稱為“表達(dá)盒”，從5′→3′方向，帶有啟動(dòng)子、mRNA起始位點(diǎn)、多聚接頭及不同載體所帶有的插入的上游基因。
使用這個(gè)結(jié)構(gòu)，還表達(dá)了uPA基因，簡(jiǎn)單地說，組建如下a)puPA2/41用OxaNⅠ完全消化，以得到puPA2/17;
b)puPA2/41用ECoRV、OxaNⅠ完全酶解，然后用DNA多聚酶Ⅰ的Klenow片段補(bǔ)平，以得到質(zhì)粒puPA2/254;
c)測(cè)定CAT的轉(zhuǎn)錄水平以檢測(cè)兩個(gè)由uPA衍生的缺失性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄能力;
d)如A6.3所述，將CAT基因從puPA2/17和puPA2/254中切除;
e)將uPAORF置于兩個(gè)有缺頭的啟動(dòng)子的控制之下;
f)將兩個(gè)uPA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
附圖用于進(jìn)一步列舉本發(fā)明，在說明書和權(quán)利要求書中參考附圖是用作說明的，但它并非將本發(fā)明局限于這個(gè)范圍。下面對(duì)于附圖的簡(jiǎn)短說明被用于幫助理解附圖和更全面更容易地理解本發(fā)明。
圖1是uPA基因、mRNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。
從上到下uPA基因插入至噬菌體λ-uPA2的限制圖;
uPA基因插入至噬菌體λ-uPA1的限制圖。
uPA“開放讀碼”(BaBamHⅠ;EⅠEcoRⅠ;SSmaⅠ;HⅢHindⅢ)的限制圖;
人體uPA基因的外顯子/內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)黑塊末轉(zhuǎn)譯的5′和3′區(qū)，陰影塊轉(zhuǎn)譯的外顯子;劃線處轉(zhuǎn)譯的內(nèi)含子;
部分未剪接的cDNA克隆體pHUKI的外顯子/內(nèi)含子的結(jié)構(gòu);
在外顯子和前uPAmRNA的氨基酸之間的對(duì)應(yīng)性;
在蛋白質(zhì)區(qū)和前uPA中的氨基酸之間的對(duì)應(yīng)性。
圖2是RSV-uPA的結(jié)構(gòu)。
一含有用于從λ-uPA1中得到的uPAmRNA的完整ORF的SmaIDNA片段(見圖的上部)被插入消化后的RSV-Neo質(zhì)粒至HindⅢ和HpaⅠ上的轉(zhuǎn)錄有用的部分中，RSV-Neo質(zhì)粒攜帶細(xì)菌質(zhì)粒的功能和RSV的LTR(見該圖的左面)。RSV-uPA具有在包含于RSVLTR中的啟動(dòng)子控制下的uPAORF，當(dāng)它插入到一個(gè)合適的真核細(xì)胞宿主時(shí)，它可以表示蛋白質(zhì)(見該圖的下部)。
圖3是RSV-uPA的限制性位置的修飾。
RSV-uPA中的NdeⅠ和ApaⅠ的部位可通過產(chǎn)生質(zhì)粒p71的連接物的插入而被兩個(gè)XhoⅠ位置所取代(見圖3中部)。在RSV啟動(dòng)子控制下，用XhoⅠ消化p71質(zhì)粒得到一含有uPAORF的片段，該RSV啟動(dòng)子可以被插入至含有載體的XhoⅠ或SalⅠ中(圖3下)。
圖4是pBPV-230.8的限制圖。
由pBR332衍生的pML2d被插入到BPV-1基因組(Saver等《mol.Cell.Biol.》5，3507;1985)的唯一的BamHⅠ位置，BamHⅠ系鄰近轉(zhuǎn)譯區(qū)的3′末端的位置被修飾成SalⅠ。
圖5是將RSV-uPA結(jié)構(gòu)插入至游離基因載體。
質(zhì)粒pBPV230.8通過取代分別從pBB、pBH和pBS中得到的三個(gè)病毒位置BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ的一個(gè)而被修飾，相應(yīng)地得到pBB、pBH及pBS。在每一衍生的載體中的新的XhoⅠ位置被涂塊。由XhoⅠ連接物插入而產(chǎn)生的新的BamHⅠ和SalⅠ的位置以及位于pBB和pBS中的XhoⅠ位置的側(cè)面的BamHⅠ和SalⅠ均被顯示。
在上述三種質(zhì)粒中，RSV/uPA結(jié)構(gòu)(見圖3)被插入到由下面的兩組質(zhì)粒定位的XhoⅠ位置pBBuPAa、pBHuPAa和pBSuPAa，這里uPA和BPVmRNAs轉(zhuǎn)錄成和BPV有同樣的方向。
pBBuPAb，pBHuPAb和pBSuPAb，這里uPAmRNA和BPVmRNAs在反方向轉(zhuǎn)錄。
圖6是puPA2的結(jié)構(gòu)。
質(zhì)粒pEMBL8-CAT是通過用攜帶細(xì)菌CAT基因(Dente等，《Nucl.AcidRes.》，1645-1655;1983)的片段取代ClaⅠ和HindⅢ之間的片段而從pEMBL8衍生的。一含有uPA啟動(dòng)子的SmalⅠ片段插入到產(chǎn)生質(zhì)粒puPA2的CAT基因的上游(本圖的右邊)，質(zhì)粒puPA2具有可轉(zhuǎn)錄CAT基因的正確的啟動(dòng)子順序位置。
圖7是人體uPA啟動(dòng)子的順序這里顯示的是從含有mRNA啟動(dòng)點(diǎn)的λ-uPAⅠ噬菌體DNA的2.38KbSmaⅠ片段的順序、TATA盒狀室和uPA啟動(dòng)子的上游調(diào)節(jié)基因區(qū)。在圖上的核苷酸+1對(duì)應(yīng)于由Riccio等引述的采用引物擴(kuò)張分析后的uPAmRNA中的第一個(gè)核苷酸。
圖8是uPA啟動(dòng)子和它的衍生物的限制圖。
這里顯示了表明uPA啟動(dòng)子已經(jīng)被修飾的puPA2修飾質(zhì)粒的限制圖;尤其是puPA2/41，這里，在啟動(dòng)子5′末端位置的SmaⅠ已被轉(zhuǎn)化為XhoⅠ;
puPA2/17，這里在兩個(gè)OxaNⅠ位置之間的區(qū)被刪除了;
puPA2/254，這里在5′OxaNⅠ位置和EcoRⅤ位置之間的區(qū)被刪除了。
圖9是uPA啟動(dòng)子衍生的載體圖9A描述了質(zhì)粒puPA2/41、puPA2/17和puPA2/254的限制圖。
圖9B描述了用SalⅠ/XbaⅠ消化和SalⅠ連接而切除CAT基因而依次從puPA2/41、puPA2/17和puPA/254得到的質(zhì)粒pPP41、pPP17和pPP254的限制圖。
這些載體含有uPA啟動(dòng)子(或它們的衍生物)、TATA盒狀室和mRNA啟動(dòng)點(diǎn)，苯遣迦牒?，例燃偓渔V哂蠱boⅠ、BglⅡ、BclⅠ和BamHⅠ末端的片段，將它們插入平整末端的SmaⅠ位置或插入BamHⅠ的位置，它們可用于表達(dá)基因。這些結(jié)構(gòu)可以用Xhol和SalⅠ雙重消化而切除。同樣的雙重消化可以用切除在所表達(dá)的基因或cDNA不同質(zhì)粒5′上插入的啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)，如“擠出喑盒”一樣。黑圓點(diǎn)表明質(zhì)粒復(fù)制的起始源。
圖9C描述了通過將含有uPAORF的7.3KbSmaⅠ片段插入質(zhì)粒的SmaⅠ位置而依次從pPP41、pPP17和pPP254衍生的質(zhì)粒pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS。
圖10是3Fllscu-PA與人腎scu-PA(KohnoT.、HopperP.、LillquistJ.S.、SuddithR.L.、GreenleeR.、MoirD.T.《Biotechnol.》1984，2，628-634)、人體A431scu-PA、人體尿scu-PA和鼠scu-PA的N-末端的氨基酸順序(18個(gè)殘基)的對(duì)比。
圖11是a)尿的scu-PAb)從A431細(xì)胞中得到的scu-PAc)RSV-A431-scu-PAd)RSV-LB6-scu-PAe)BPV-LB6-scu-PAf)RSV-CHO-scu-PA在非還原條件下的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳)結(jié)果最右邊的一行表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖12是在還原條件下(見1.6.2)，在用血漿酶將圖11中所述的scu-PA′s(以相同的順序)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的tcu-PA′s的活化作用后的SDS-PAGE結(jié)果。最右邊的一行表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖13是在還原條件下(見1.6.5)，用血漿酶活化如圖11中所述的scu-PA(以相同的順序)而得到的tcu-PA′s未經(jīng)處理的和用糖肽酶F處理后的SDS-PAGE的比較。未處理的tcu-PA和糖肽酶F處理后的tcu-PA為1∶1的混合物置于一個(gè)行列上。
最右邊的一行表示分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖14是在還原條件下(見1.6.5)，用血漿酶活化如圖11中所述的scu-PA′s(以相同的順序)而得到的tcu-PA′s未經(jīng)處理和用神經(jīng)氨酸酶處理后的SDS-PGAE的比較。未經(jīng)處理的tcu-PA和神經(jīng)氨酸酶處理后的tcu-PA的1∶1的混合物置于每一行列中。
最左邊的一行表明分子量標(biāo)準(zhǔn)。
下面的實(shí)例只是用于闡述明本發(fā)明和開發(fā)本發(fā)明的途經(jīng)，但并非將本發(fā)明局限于此。為了使它們更容易理解，我們?cè)谝恍┱鹿?jié)(從1.1-1.6.7)中描述了一些實(shí)例中所要應(yīng)用的技術(shù)和方法(如酶修飾、DNA沉淀、蛋白質(zhì)純化等)，在不同的實(shí)例中，所用的技術(shù)和方法基本相同。
1.1所使用的細(xì)胞是商業(yè)上可得到的或通過科學(xué)團(tuán)體可以得到的1.2細(xì)胞在一合適的培養(yǎng)基，諸如含有10%加熱滅活的胎兒溫血清的改進(jìn)的Dulbecco′s培養(yǎng)基(Eagle)(DMEM)中生長(zhǎng)。
1.3用于分子生物學(xué)的培養(yǎng)基、緩沖液和溶液。
在所有情況中試劑是在可得到的情況下用“DNA/RNA級(jí)”和“分析純級(jí)”的。如果不另加說明，則用于細(xì)菌和噬菌體生長(zhǎng)的液體和固體培養(yǎng)基、緩沖液和溶液均采用在ManiatisT.、FritschE.F.、SambrookJ.著《分子克隆》，(一本實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，ColdSpringHarbor實(shí)驗(yàn)室，(1982)，以后稱“Maniatis等”中所描述的方法制備、貯存和使用。如果不另加注明，則玻璃器皿、塑料器皿和實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備均采用同樣的參考文獻(xiàn)中所描述的方法置備、貯存和使用。使用去離子/蒸餾水，如用于酶緩沖液，則要使用熱壓處理后的水。
1.4用于分子生物學(xué)的酶限制性核酸內(nèi)切酶、DNA修飾酶和RNase(核糖核酸酶)均是商業(yè)上可得到的。我們所使用的是從Boehringer、BethesdaReserchLaboratories(BRL)、CollaborativeReserch、NewEnglandBiolabs和Pharmacia處購(gòu)買的。溶菌酶和牛血清白蛋白(BSA)也是商業(yè)上可得到的。我們從Boehringer的BSA和Sigma處購(gòu)買溶菌酶。通常所使用的緩沖液被用于每一個(gè)酶反應(yīng)。它們的組成和制備是公知的，通常是根據(jù)賣酶的公司提供的報(bào)告而制備的，制成物均進(jìn)行無菌過濾并于20℃等分貯存。一般所使用的很多緩沖液也都是在商業(yè)上以濃縮液購(gòu)得的。合成的DNA銜接物如t-RNA和鯡魚精液DNA均是商業(yè)上可得到的。我們從P-LPharmacia或NewEnglandBiolabs購(gòu)買合成DNA街接物，從Boechringer購(gòu)買tRNA和鯡魚精液DNA。
1.5rDNA技術(shù)如果在下列實(shí)例中不另外注明，rDNA技術(shù)是以Maniatis等和在本文最初的參考文獻(xiàn)中所描述的方法而進(jìn)行的。
1.5.1.限制性消化和DNA的酶修飾一次或多次限制性消化和DNA酶修飾均以已有技術(shù)的方式進(jìn)行，也可用通常可得到的制造手冊(cè)中或Maniatis等，Ch.4中描述的方式進(jìn)行?！盁釡缁睢笔侵冈?0℃保溫10-15分鐘使酶滅活，然后在室溫下保持10-15分鐘，并在Eppendorf離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)2分鐘，使混合物沉出。較佳地，限制性消化和DNA酶修飾后的結(jié)果可于含有1%瓊脂凝膠的0.5微克/ml的溴化3.8二氨基5-乙基-6-苯基菲啶翁上于100V層析1-2小時(shí)進(jìn)行證實(shí)(也可參見Maniatis等，Ch.5)。
1.5.2苯酚/三氯甲烷抽提較佳的是以Maniatis等，P.458-459中描述的方式從核酸水溶液中得到蛋白質(zhì)的苯酚/三氯甲烷的抽提物。當(dāng)反應(yīng)體積小于200微升時(shí)，DNA可被反抽提。
1.5.3DNA沉淀較佳地，通過加入0.1倍體積的3MpH5.2的醋酸鈉和2.5倍體積的乙醇(在-20℃)而進(jìn)行DNA沉淀。只有當(dāng)在下列實(shí)例中指明時(shí)，可加入20～40微克的tRNA?；旌衔镏糜诟杀?乙醇浴中15～30分鐘，或保持在-20℃過夜，然后在Eppendorf微型離心機(jī)中或在Sorvall離心機(jī)中于4℃離心15分鐘(10000×G)。DNA塊狀物用70%乙醇洗一次，再用100%的乙醇清洗一遍，最后在Savant真空離心機(jī)中干燥。
1.5.45′末端脫磷酸作用較佳地，DNA5′末端脫磷酸是用商業(yè)上可得到的腓腸磷酸酯酶(CIP，從Boehringer購(gòu)買的)，在37℃，pH＝8下保持1小時(shí)而進(jìn)行的。CIP可以通過苯酚三氯甲烷抽提除去，也可將EGTA(亞乙基雙(氧亞乙基次氨基)四乙酸)加入到其最后的濃度為約50mM并在68℃加熱45分鐘而除去CIP。
1.5.5DNA連接DNA連接以已有技術(shù)中的方法進(jìn)行。通常，要遵循T4 DNA連接酶的制造商的說明。通常，當(dāng)合成銜接物被使用時(shí)，連接酶反應(yīng)在8℃進(jìn)行，而在所有其它的情況下，則在14～16℃下進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)DNA的平整末端要進(jìn)行連接時(shí)，PEG1500或PEG4000被加入到10%的最終濃度。通常，下列組成的10×連接用緩沖液被使用0.66MTris-HCl(pH＝7.6)、50mM Mg Cl2、50mM二硫代蘇糖醇和50mMATP。
1.5.6DNA銜接物較佳地，銜接物DNA以Maniatis等，125-126頁(yè)中所描述的方法使用，磷酸化和驗(yàn)證，以392頁(yè)中描述的方法使用，單個(gè)銜接物以及銜接DNA片段的連續(xù)激酶反應(yīng)、連接和限制均可采用電泳來檢驗(yàn)將銜接物置于2%瓊脂糖凝膠上10～20分鐘(銜接DNA片段則為1～2小時(shí))，然后，以Maniatis等，172頁(yè)中描述的采用自體放身造影照片法目測(cè)DNA。
1.5.7制備型凝膠電泳較佳地，制備型凝膠電泳在含有0.5微克/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡的0.7%～0.8%的瓊脂凝膠上于1×TBE緩沖液
采用商業(yè)上可得到的或其它機(jī)構(gòu)可得到的感受態(tài)細(xì)胞，諸如本技術(shù)領(lǐng)域中已知的BRL(BethesdaResearchLaboratories)的菌株DH1、DH5或HB101而進(jìn)行，這些菌株在制造商的說明書中都進(jìn)行過摘錄。通常，當(dāng)DNA片段被插入至不同的質(zhì)粒中時(shí)，要使用100微升(BRL)的原液，當(dāng)用DNA銜接物轉(zhuǎn)化限制位置時(shí)，使用少量的20微升(BRL)的原液。在無抗生素培養(yǎng)后，細(xì)胞被展開于LB瓊脂平板上(Maniatis等，P440-444)并在合適的抗生素存在下，37℃培養(yǎng)過夜。
1.5.9轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞的篩選(小型處理分析器分析)較佳地，DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的抗性菌落通過在5mlLB和適量抗生素(Maniatis等，P440)和液體培養(yǎng)的分析樣品(1.5ml)，于37℃過夜使獨(dú)立的菌落生長(zhǎng)而進(jìn)行篩選，采用Maniatis等(P366-367)所描述的煮沸法。通常，要引入下面的更改。
反應(yīng)體積增加為1.5倍;
大腸桿菌菌株DH1被煮沸60秒;
不增加鹽，但增加1倍體積的異丙醇并將試管在-20℃保持20～25分鐘而進(jìn)行DNA沉淀;
沉淀的DNA用1ml70%的乙醇清洗一次，再用1ml100%的乙醇清洗一次;
無DNA酶的RNA酶以10微克/ml的濃度加入，DNA在70℃培養(yǎng)20分鐘。
1.5.10質(zhì)粒的大規(guī)模制備較佳地，質(zhì)粒的大規(guī)模制備以Maniatis等，Ch.3中描述的方法進(jìn)行。較佳為堿性溶菌法被用于回收質(zhì)粒DNA(參見，Mamiatis等，P.90-91)，質(zhì)粒DNA在含有CsCl梯度級(jí)分的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁中純化二次，然后，混合物用異戊醇抽提，含有DNA的水相被分離出來，進(jìn)行TEpH8透析(Maniatis等)并在4℃貯存。
1.6所得到的前-尿激酶(Pro-uvikinase)的純化和特性測(cè)定。
1.6.1化學(xué)藥品所有使用的化學(xué)藥品是商業(yè)上廣范圍可得到的或能從商業(yè)上可得到的產(chǎn)品制備的。例如，下面的一覽表包括了在下面的實(shí)例中所使用的化學(xué)藥品和它們的來源從BioRad，Richmond，USA得到的Affi-凝膠10(活化瓊脂糖)、丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉、Camassie亮藍(lán)、從pharmacia，Uppsala，Sweden得到的CNBr活化的瓊脂糖(凝膠)、用于低分子量蛋白質(zhì)電泳標(biāo)定的工具;安福林兩性電解質(zhì)系從LKBABBrommaSweden購(gòu)得;從Sigma.化學(xué)公司，StLouis，MO63178，USA得到的牛血清白蛋白(BSA)、Cohn級(jí)分V、豬胰蛋白酶、豬血漿酶、纖維蛋白原Ⅰ型級(jí)分Ⅳ、芐脒、從Bayer，Leverkusen，GFR得到的無嘌呤核酸，從BoehringerMannheimGmbH，F(xiàn)RG得到的糖肽酶F，從KabiAB，Stockolm，Sweden得到的S-2444。高分子量的尿激酶(HMW-uPA)由LepetitRsesarchLaboratoriesSpAMilano，Italy制備。Scu-PA(pro-uPA)可以根據(jù)Stump.D.C.，ThienpointM.、CollenD《J.Biol.Chem，》261，1267-1273，1986中所描述的方法而大量地制備。A431-scu-uPA是根據(jù)CortiA.NolliM.L.、SoffientiniA.、CassaniG.在《ThrombHaemostas》56，219-224，1986中所描述的方法而得到的。人體內(nèi)皮血纖維蛋白溶酶原活性劑的抑制劑(PAI-1)可以根據(jù)VanMourikJ.A.、LawrenceD.A.和LoskutoffD.J在“由內(nèi)皮細(xì)胞合成的血纖維蛋白溶酶原活性劑(抗活性劑)的抑制劑的純化”，《J.Biol.Chem.》259，14914-14921，1984中描述的方法而大量地制備。
所有其它的試劑均是從MerckDarmstad，GFR或CarloErba，Italy得到的商業(yè)上可得到的分析純級(jí)的產(chǎn)品。
1.6.2免疫和活性的分析血纖維蛋白分析是通過血纖維蛋白單體板方法(AsturpT.、MullertzS.“估計(jì)血纖維蛋白活性的血纖維蛋白單體板方法”《Arch.BiochemBiophys》40∶346-351，1952)而進(jìn)行。尿激酶參考標(biāo)準(zhǔn)被用于標(biāo)定每一個(gè)分析?；钚詼y(cè)定采用國(guó)際單位(I·U)，它是與國(guó)際參考制品相關(guān)的原始標(biāo)準(zhǔn)。sc-uPA(產(chǎn)生單鏈尿激酶的細(xì)胞)血纖維蛋白的潛在活性在活化后以下列方式測(cè)定血漿酶(10mg)用CNBr-活化瓊脂糖(交聯(lián)瓊脂)(2.5ml)進(jìn)行偶聯(lián)。采用0.5M碳酸鈉緩沖液作為偶聯(lián)緩沖液。一血漿瓊脂糖(0.9ml)與0.15M氯化鈉和0.05M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)之比為1∶10的懸浮液用sc-uPA樣品(0.1ml)混合，并于20℃下緩慢旋轉(zhuǎn)(離心)1小時(shí)。通過在10000×g離心2分鐘而將血漿瓊脂糖除去，上清液用血纖維蛋白單體板分析進(jìn)行測(cè)定。
蛋白質(zhì)的濃度根據(jù)Lowry(LowryO.、RosebroughH.、ParrA、RandallR.，“用葉素酚試劑進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定”《J.Biol.Chem.》1951，193，265-275)的方法進(jìn)行測(cè)定。
酰胺分解鑒定通過測(cè)定合成的基質(zhì)pyro-Glu-Gly-Ary-PNA，S-2444的水解速度而進(jìn)行(ClaesonG.、FribergerP.、KnosM.、ErikssowE.，“在血漿酶、腺激肽釋放酶和尿激酶中前激肽釋放酶的測(cè)定方法”《Haemostasis》7∶76-78，1978)。
免疫吸附劑-酰胺分解(IAA)鑒定是根據(jù)CortiA.、NolliML.、CassaniG.“采用一種新的免疫吸附劑酰胺分解鑒定(IAA)分別測(cè)定單鏈和雙鏈尿激酶型血纖維蛋白溶酶原的激活劑”《Throm.Hae-mostas》56∶407-10(1986)中描述的方法而進(jìn)行的。該鑒定法結(jié)合了免疫測(cè)定的選擇性和酶活力測(cè)定的專一性，開發(fā)出兩種蛋白質(zhì)的抗原測(cè)定和酶性能測(cè)定。tcu-PA和scu-PA被選擇地免疫吸附在涂覆有單克隆抗體5B4的微量滴定板的一側(cè)，并進(jìn)行血漿酶活化處理前、后的酶活性測(cè)定。
1.6.3逆相FPLC逆相色譜在FPLC(快速蛋白質(zhì)液體色譜)體系(pharmaciaFineChemicals)中進(jìn)行，采用pro-RPCHR5/10逆相色譜柱(大孔、微顆粒的二氧化硅與C1/C8基團(tuán)相結(jié)合)。洗脫緩沖液為緩沖液A在水中含0.1%三氟乙酸，和緩沖液B在乙腈中含0.1%三氟乙酸;洗提方式先100%A緩沖液20分鐘，再在65分鐘內(nèi)線性梯度增加緩沖液B，從0～60%。然后100%緩沖液B25分鐘，流速為0.3ml/小時(shí)。
1.6.4電泳過程SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)是根據(jù)LaemmliUK(“在噬菌體T4頭部裝配過程中結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的裂解”《Nature》227∶680-685，1970)描述的，在-1.5×120×150mm的凝膠平板或在一快速、高分辨的電泳體系(如Pharmacia的Phast體系，也可參見OlssonI.等《Electrophoresis》9∶16-22，1988)進(jìn)行。聚集的和分散的凝膠中分別含有3%和12.5%的丙烯酰胺。在每片凝膠板上使用商業(yè)上可以得到的用于分子量測(cè)定的電泳標(biāo)定工具(Pharmacia)的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)(Ampholinse)在凝膠上移動(dòng)。2-巰基乙醇被用作還原劑，Comassie亮藍(lán)R250被用作凝膠著色劑。免疫吸印法基本上根據(jù)(參見SalernoG.，VerdeP.、NolliML.、CortiA.、SzotsH.、MeoT.、JohnsonJ.、BullokS.、CassaaniG.和BlasiF.，“人體尿激酶的單克隆抗體測(cè)定單鏈前尿激酶前體”，《ProcNatlAcadSciUSA》81∶110-114，1984)描述的進(jìn)行，使用純化的抗-uPA單克隆抗體，如Mab5B4(NolliML.，CortiA.，SoffientiniA.，CassanoG.“識(shí)別人體尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑的受體連接區(qū)的單克隆抗體”《ThromHaemostas》，56∶214-8，1986)、Mab105IF10和Mab52C7(見上SalernoG.等)和兔的抗-uPA抗血清。
1.6.5用糖肽酶F和神經(jīng)氨酸酶處理Pro-uPA整份(2微升)重組scu-PA(pro-rPA)和在0.1MpH7.4的磷酸鈉緩沖液中濃度為1.5mg/ml的由Stump等描述的方法制備的(見1.6.1)尿scu-PA在同樣的緩沖液用2微升濃度為5微克/ml的血漿酶溶液混合，并在37℃靜置4小時(shí)。然后，將在100mM磷酸鈉、20mMEDTA(乙二胺四乙酸)、0.1%2-巰基乙醇、1%Triton×-100(聚對(duì)異辛基苯基醚乙二醇酯)和10mM芐脒中的3微升濃度為6.6IU/ml的糖肽酶F(BoerhingerMannheim)或在50mMpH＝5的己酸鈉緩沖液、50mM氯化鈉和10mM的芐脒中的4微升濃度為1mg/ml的神經(jīng)氨酸酶(產(chǎn)氣英膜梭狀芽孢桿菌，Boehringer)加入到每一樣品中。所有樣品均于37℃反應(yīng)過夜，然后，用SDS-PAGE法分析(見1.6.4)。
1.6.6等電(點(diǎn))聚集(IEF)IEF在1mm厚的凝膠平板上進(jìn)行，凝膠平板中含有5%丙烯酰胺(丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的比例較佳地為25∶1)、2%pH3.5-10的兩性電解質(zhì)、4M尿素和3.5%甘油。凝膠冷至12℃。預(yù)聚焦后，將50微升樣品(0.3mg/ml)加到陽(yáng)極過濾紙帶上。在20W，1500V在平衡狀態(tài)下總的移動(dòng)時(shí)間為150分鐘。切下5mm的凝膠薄片作pH測(cè)定，用1ml10mM的氯化鉀洗提并在12℃測(cè)定pH。對(duì)所存在的尿素未作等電點(diǎn)(PI)修正。凝膠染色采用BlakesleyRW.BoeziJA，“使用Comassie亮藍(lán)G-250進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)染色的一種新染色技術(shù)”《AnalBiochem》82，580-582，(1977)中描述的方法進(jìn)行。
1.6.7N末端順序分析N末端的氨基酸分析用一生物體系中應(yīng)用的470A型氣相蛋白質(zhì)順序分析器進(jìn)行。
1.6.8C末端順序分析C末端分析是通過在100微升含0.1MpH5.5的乙酸鈉和4M尿素的溶液中，用羧肽酶Y(Sigma，St.Louis，Mo，USA)在室溫下培養(yǎng)3Fllsc-uPA(RSV_LB6-scu-PA)(200微克)而進(jìn)行的。羧肽酶Y與3Fllsc-uPA的質(zhì)量比約為1∶50。在期間移出10微升整數(shù)份的物質(zhì)，在100℃加熱10分鐘并真空干燥。將每一個(gè)樣品都溶解于40微升0.2MpH9.5的硼酸鈉中，取5微升的部份用過量的鄰苯二甲醛處理1分鐘(室溫下)，然后放入Backman超球狀(ultrasphere)ODS(250×4.6mm)層析柱中，該層析柱置于(HP1090HPLC體系中。在0.1MpH6.8的磷酸鈉中平衡。在23分鐘內(nèi)，線性梯度增加甲醇水溶液的濃度從40%～80%。流速為0.7ml/min，可以成功地分離。氨基酸衍生物用HP1046熒光色譜儀側(cè)定，并用HP3390積分儀根據(jù)通常的統(tǒng)計(jì)分析法和計(jì)算方法進(jìn)行定量。
1.6.9用PAⅠ-1人體內(nèi)皮血纖維蛋白溶酶原激活劑的抑制劑來抑制tcu-PA的活性人體內(nèi)皮血纖維溶酶原激活劑的抑制劑(PAⅠ-1，20ug/ml)用SDS(最終濃度為0.5%)活化，在37℃活化30分鐘。往55微升的活化后的PAⅠ-1中，加入55微升在0.2MTris-HCL緩沖液(H7.6)中的1%(V/V)Triton×-100和0.1%(V/V)Tween20進(jìn)行稀釋。然后，加入30微升8ng/mltcu-PA(試驗(yàn)樣品)，混合并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。為了測(cè)定殘余的活性，往其中加入在0.1MTris-HCl(pH＝7.6)和0.1%Tween20中的110微升的人體血纖維溶酶原(6C·U·/ml)，樣品在37℃保溫45分鐘。然后加入0.5ml0.9mMS-2251，樣品在室溫下保溫20分鐘。在用0.1ml50%乙酸鈉使反應(yīng)停止后，測(cè)定405nm的光密度值。PAⅠ-1以不同的量存在時(shí)，殘余的活性以無PAⅠ-1作為對(duì)照的活性的百分?jǐn)?shù)來表示，一次劑量響應(yīng)曲線被標(biāo)繪。從該曲線可以計(jì)算控制血纖維蛋白溶酶原激活體活性為50%時(shí)，維持用的PAⅠ-1的量。
1.7動(dòng)力學(xué)分析1.7.1用血漿酶活化scu-PA′s用血漿酶活化尿和重組scu-PA的動(dòng)力學(xué)在含有38mM氯化鈉、0.01%Tween20，0.01%牛血清白蛋白和0.5mM)Pyro-Glu-Gly-Ary-對(duì)硝基苯胺(S-2444)的50mMpH7.6的Tris-HCl緩沖液中，在37℃時(shí)測(cè)定。反應(yīng)體系用0.5nM血漿酶和50-750nMscu-PA′s標(biāo)定。S-2444是tcu-PA的專一性的底物，它不被血漿酶水解，因而在這些條件下，由血漿酶的活化作用而從每一scu-PA產(chǎn)生的tcu-PA的量與在405nm進(jìn)行光學(xué)測(cè)定得的排放的對(duì)硝基苯胺量成正比。當(dāng)標(biāo)繪成Lineweaver-Burk型圖時(shí)，根據(jù)活化初速度可以計(jì)算Km和Vmax的值。
1.7.2在S-2444上的酰胺分解活性為了測(cè)定酰胺分解活力的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可將血漿酶活化的u-PA′s(4.5nm)置于不同濃度(0.03-0.3mM)的0.1MTirsCl(pH8.8)、50mMNaCl和0.1%牛血清白蛋白中的Pyro-Gly-Arg-對(duì)硝基苯胺(S2444)中于37℃下保溫。對(duì)硝基苯胺排出的初速度在405nm光學(xué)測(cè)定。從Lineweave-Bark圖中可看出，對(duì)于各種濃度的S-2444的吸收率隨時(shí)間而線性增長(zhǎng)，由此，Km和Vmax可以通過將線性回歸程序所得到的曲線外推而計(jì)算。
1.7.3人體血纖維蛋白溶酶原的活化用尿和重組tcu-uPA′s(20pm)將血纖維蛋白溶酶原活化為血漿酶的動(dòng)力學(xué)在37℃，于含有0.04MNaCl，0.01%Tween80、0.01%牛血清白蛋白、0.5mMD-Val-Leu-Lys-對(duì)硝基苯胺(S-2251)和血纖維蛋白溶酶原(5.2-23mM)的0.05MTris-HCl緩沖液(pH＝7.4)中進(jìn)行。因?yàn)镾-2251是血漿酶的專一性底物，它不被tcu-PA水解，在該條件下，所產(chǎn)生的血漿酶活性是與對(duì)硝基苯胺的排放量成正比的，在405nm下光學(xué)地測(cè)定。對(duì)于各種濃度的血纖維溶酶原的活化初速度被顯示于Lineweaver-Burk圖中，由此，Km和Vmax可以通過將線性回歸程序所得到的曲線外推而計(jì)算。
實(shí)例EO人體基因庫(kù)在噬菌體λ-Charon 28中的人體基團(tuán)DNA的庫(kù)采用已有技術(shù)[參見P.H.Hieter等，《Cell》Vol.22，197-207(1980)和Maniatis等]建立。重組λ-溶胞產(chǎn)物在大腸桿菌K12族LE392(Maniatis等，P504)上滴定。噬菌體滴定技術(shù)以及帶有切口的轉(zhuǎn)譯探針的噬菌體庫(kù)的篩選技術(shù)也是已有技術(shù)中的(如可參考Maniatis等)，而且被大量地應(yīng)用于下列具體實(shí)驗(yàn)中Ｎ松稈。 0微升稀釋1000倍的溶胞產(chǎn)物被吸收到在10mM MgSO中的0.3ml大腸桿菌K12 LE 392的2.5倍濃縮的培養(yǎng)物上，并于37℃培養(yǎng)20分鐘。加入7ml 0.7%瓊脂糖，整個(gè)混合物被鋪展于含有NZYMC瓊脂(A型酪蛋白水解物10g/l;NaCl5g/l;酵母提取物5g/l;酪氨酸1g/l;MgSO4.7H2O2g;pH調(diào)整到7.5;見Maniatis等)的150mm塑料平板上?？偭繛?.41ml的10-3倍稀釋的溶胞產(chǎn)物被用于41塊板。保溫一天后，觀察到平均每塊板上的噬菌斑為1.5×104個(gè)。在41塊板上所觀察到的總數(shù)為6×105個(gè)噬菌斑是完好的。每塊板上的所有噬菌斑均轉(zhuǎn)移到兩個(gè)硝化纖維素過濾質(zhì)中(Schleicher和Schuell公司)。過濾質(zhì)進(jìn)行常規(guī)的干燥、洗滌、真空烘干和預(yù)雜交(見Maniatis等)。雜交采用一由人體尿激酶cDNA中分離出來的DNA片段所組成的切口轉(zhuǎn)譯探針而進(jìn)行(VerdA.等，《Proc.Natl.Acad.Sci.》81，4727-4731，1984)。
E0.1-缺口轉(zhuǎn)譯質(zhì)粒pHUK-1(Verde et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.81，4727-4731，1984)含有一個(gè)與人體尿激酶的信使RNA互補(bǔ)的重組體插入子。通過瓊脂糖凝膠電泳切開相應(yīng)的凝膠區(qū)，并用電洗脫(參見1.5.7)回收DNA片段，由此分離得到的1.5千堿基對(duì)pstⅠ片段約含有人體尿激酶信使RNA的75%的密碼區(qū)(Verde et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，81，4727-4723，1984)。上述pstⅠ片段(5.0微克)的均勻標(biāo)記系在200微居的α-32P-dCTP和200微居α-32P-dGTP的存在下，用Bethesda研究實(shí)驗(yàn)室的一套切口轉(zhuǎn)譯設(shè)備進(jìn)行的(參見Maniatis et al.)。標(biāo)記DNA的產(chǎn)率為1.8-2.9×108居里/分·微克。
E0.2-uPA基因正噬菌體的分離41對(duì)過濾器(如在EO中得到)用切口轉(zhuǎn)譯Rst-Ⅰ片段進(jìn)行雜交。由8只過濾器形成的組被雜交在一只塑料袋中的40毫升雜交溶液內(nèi)，該溶液約含有108居里/分的標(biāo)記DNA。在2x SSC(將17.5克Na Cl和88克檸檬酸鈉溶解在800毫升水中，用NaOH水溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.4，并將總體積調(diào)節(jié)至1升)和0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)(Maniatix et al，pag.447)中雜交17小時(shí)，溫度為42℃。在室溫下，用2x SSC-0.1%SDS將過濾器洗滌4次，時(shí)間為15分鐘，然后在68℃溫度下，再用1x SSC-0.1%SDS洗滌1次，時(shí)間為2小時(shí)。干燥后，使過濾器在X-射線膠片(kodak)中暴露12-24小時(shí)，然后顯影。從這一篩選，用少量NZYMC液體培養(yǎng)基(Maniatis et al.)采集在兩只相同的過濾器(3只)中的同樣位置上具有正雜交斑點(diǎn)的噬菌斑，并將其以不同的稀釋度來感染大腸桿菌K12 L392，然后鋪展在10厘米的NZYMC-瓊脂培養(yǎng)平板上。接著挑選出具有500-5000噬菌斑的平板，并再次進(jìn)行篩選。此后將這些噬菌斑轉(zhuǎn)移到一對(duì)硝基纖維素過濾器(Schleicher和Schuell公司出品)上，并用上述缺口轉(zhuǎn)譯的人體uPA cDNA的1.5千堿基對(duì)Pst-Ⅰ片段處理和雜交該過濾器。實(shí)際上，所有噬菌斑均給出正雜交信號(hào)，富集因子約為105。三個(gè)正噬菌斑中的單個(gè)噬菌斑分離體被稱為λ-uPA-1，λ-uPA-2，λ-uPA-3。
E0.3-大規(guī)模噬菌體的制備用大量培養(yǎng)液的溶菌產(chǎn)物將噬菌斑在大腸桿菌K12LE392上進(jìn)行放大，噬菌體通過在氯化銫中反復(fù)分成色帶(banding)而進(jìn)行分離，然后相繼用酚，以及氯仿/異戊醇(24∶1)萃取水相，并按“Maniatis等，cH3”所述的方法，從水相中用乙醇沉淀出DNA，由此對(duì)噬菌體進(jìn)行提純。
實(shí)施例E1uPA-密碼基因在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)E1.1-uPAORF的分離基本上按E0.3中所述的方法得到的200微克λ-uPA1，使之在80微升溶液中用30單位的SmaⅠ消化1小時(shí)，溫度為25℃，然后用EDTA(最終濃度為50mM)終止反應(yīng)，并且一個(gè)10厘米的探針(comb)在100伏電壓下，使DNA在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，此后在紫外光下對(duì)凝膠進(jìn)行分析，從凝膠中截取第二個(gè)最慢帶(約7.3千堿基對(duì))，此即含有人體uPA基因敞開讀碼(ORF)的SmaⅠ段片。用電洗脫所含的DNA，并按1.5.7中所述的方法進(jìn)行提純。
E1.2-載體DNA的制備通過HindⅢ消化、插入、HpaⅠ消化、CIP處理，以及在瓊脂糖凝膠上的片段分離，由此制備含有RSV啟動(dòng)區(qū)和pBR322衍生氨芐青霉素抗性及復(fù)制源的RSV-neo衍生片段。
有關(guān)RSV-neo的更為詳細(xì)的修飾描述如下(參見圖2)E1.2.1-HindⅢ消化在37℃溫度下，用含80單位HindⅢ的200微升溶液將20微克RSV-neo質(zhì)粒DNA消化完畢。限制酶通過加熱滅活，然后用等體積的酚和氯組成的溶液對(duì)混合物進(jìn)行萃取，再加入50微克轉(zhuǎn)移DNA(參見1.5.3)，使DNA沉淀析出，接著再將其溶解在20微升TE(Tris10mM，pH8，EDTA1mM，Maniatisetal.)中。
E1.2.2-插入和HpaⅠ消化由上述制備得到的敞開載體，通過在37℃的溫度下，由1單位的DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段，在25微升溶液(Manintisetal，pag.113)中對(duì)DNA培養(yǎng)1小時(shí)，使該載體的凸出端齊平，然后按1.5.2和1.5.3中所述的方法進(jìn)行提純。此后在37℃下，用含有80單位HpaⅠ的40微升溶液處理1小時(shí)，將線性圓頭載體DNA切開，接著再用同樣方法提純。以上這些操作切開了對(duì)新霉素有抗性的基因，留下一個(gè)平端的3.5千堿基對(duì)長(zhǎng)的DNA片段，該片段具有在LTR啟動(dòng)區(qū)和SV40多腺苷酸化點(diǎn)之間敞開的RSV-neo，并含有復(fù)制源和由質(zhì)粒pBR322(參見圖2)衍生得到的對(duì)氨芐青霉素有抗性的基因。
E1.2.3-CIP處理用含有1.5單位的小牛腸磷酸酶(CIP)的50微升反應(yīng)培養(yǎng)基(最終體積)處理DNA，以從DNA端除去5′磷酸殘基;以后再加入雙(氧乙烯基次氮基)四乙酸亞乙酯，(EGTA)(最終濃度為10mM)，并在68℃溫度下進(jìn)行處理，以對(duì)酶進(jìn)行滅活(參見1.5.4)。
E1.2.4-片段的提純?nèi)?.5.7中所述的方法，用0.6%瓊脂糖制備型凝膠分離DNA片段。截取含有3.5千堿基對(duì)色帶的凝膠部分，并用電泳洗脫DNA片段(參見1.5.7)，然后將所得的混合物調(diào)節(jié)至合適的鹽濃度，接著再在Elutip-D柱(Schleicher和Echuell公司制造)中進(jìn)行提純。洗脫后，將乙醇、乙酸鈉和載體轉(zhuǎn)化RNA加到DNA溶液中，使DNA沉淀析出，而后按1.5.3所述的方法再使其溶解在20微升TE中。
E1.3-uPA基因在RSV-LTR啟動(dòng)區(qū)下的克隆。
將3單位的T4DNA連接酶和2.5微升的10X緩沖液(Mani-ayis等，246頁(yè))加到3微克脫磷酸化的DNA載體(按上述E1.2中所述的方法制備)和7.5微克的7.3千堿基對(duì)的uPA片段(按E1.1中所述的方法制備)中。將上述25微升的反應(yīng)混合液在14℃下培養(yǎng)16小時(shí)(參見1.5.5)后，用于轉(zhuǎn)化100微升的HB101大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(參見1.5.8)。于37℃溫度下，在含有50微克/升氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板(10克/升胰化胨，5克/升酵母浸液，10克/升氯化鈉，用氫氧化鈉水溶液將pH值調(diào)節(jié)至7.5)上放置過夜，挑選出細(xì)菌。取出分離的菌落，使之在含有氨芐青霉素的5毫升LB中生長(zhǎng)，并用標(biāo)準(zhǔn)微量制品分析(Standardminiprepanalysis)(參見1.5.9)處理。對(duì)提純后質(zhì)粒DNA的限制圖譜進(jìn)行研究，以確定質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中uPA基的正確定向。具有正確定向的這些質(zhì)粒中的一種被稱之為RSV-uPA，將其分離，并用于以后的實(shí)驗(yàn)中(參見圖2)。
E1.4.1-轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前一天，將含有細(xì)胞(鼠LB6，由Corsaro C.M和Pearson L.M在Somatic Cell Genetics，7，603，1981中作了描述)的Dulbecco改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM，F(xiàn)low Labo-ratories Inc.)以約104微升/平方厘米的濃度鋪展在培養(yǎng)平板上，在上述培養(yǎng)基中還添加了青霉素(50單位/毫升)、鏈霉素(50微克/毫升)、2mM谷氨酰胺和10%熱滅活的小牛胎血清(FCS)。在轉(zhuǎn)染的當(dāng)天，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)階段，在加入DNA之前3小時(shí)，再補(bǔ)充以養(yǎng)分。轉(zhuǎn)染基本上采用磷酸鈣-DNA共沉淀法(Graham and Van der Eb，Virology 52，456，1983)將含有DNA[此處是RSV-uPA(參見E1.3)和RSV-neo(參E1.2)的混合物，二者之比約為1∶1)的2M CaCl2(0.25毫升，最終體積)溶液加到2x HBS(137mM NaCl、0.7mM Na2HPO4、21mM HEPES、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙基磺酸，pH7.1)(0.25毫升)中，由此制備磷酸鈣DNA沉淀物。然后將此DNA共沉淀混合物加到細(xì)胞中。在37℃下保持3小時(shí)后，從細(xì)胞中移出沉淀物，用DMEM(不加牛胎血清)將細(xì)胞洗滌二次，然后加入1.5倍的15%丙三醇的HBS溶液，使細(xì)胞在37℃溫度下培養(yǎng)1-2小時(shí)，接著再用DMEM(不加牛胎血清)洗滌，以除去丙三醇。此后用上述全部的DMEM供給細(xì)胞(當(dāng)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí))，并使之在37℃左右的溫度下保持48小時(shí)左右，在這過程中，細(xì)胞慢慢地進(jìn)行胰蛋白酶化，在含有10%熱滅活FCS、50單位/毫升毒霉素、50微克/毫升鏈霉素、2mM谷氨酰胺和0.8微克/毫升G418(Geneticin，Gibco)的DMEM中的細(xì)胞以約105細(xì)胞/培養(yǎng)平板的濃度鋪展。然后將細(xì)胞培養(yǎng)2-3周左右，且每隔三天更換一次培養(yǎng)基。此后，對(duì)菌落計(jì)數(shù)，將其轉(zhuǎn)移到24-井型微量滴定板上，在測(cè)定上清液之前讓其生長(zhǎng)至飽和。在添加含有10%DMSO的熱滅活牛胎血清后，將顯示出有效的前-uPA(pro-uPA)生產(chǎn)水平(大于0.5微克/毫升)的克隆以凍結(jié)物形式貯藏在液氮中。將這些細(xì)胞再次克隆，以選出高產(chǎn)率者，亦按上述方法將其凍結(jié)貯藏。在這些實(shí)驗(yàn)中顯示出最高的前uPA生產(chǎn)能力的克隆(稱為3F11或RSV-LB6)，再進(jìn)行克隆，并大量培養(yǎng)。
E1.4.2-大量培養(yǎng)按上述實(shí)施例所述方法得到的具有最高生產(chǎn)能力的克隆的接種物，使之在一只能自動(dòng)控制溶解氧濃度、pH和溫度的4升細(xì)胞反應(yīng)器中生長(zhǎng)，為方便起見，將其稱為3F11。培養(yǎng)用的介質(zhì)是含有5%熱滅活的FCS、1mM谷氨酰胺、25單位/毫升青霉素、25微克/升鏈霉素、400微克/毫升G418和27國(guó)際單位/毫升的抑肽酶的DMEM，或者也可用無血清的配方，該配方以1∶1的DMEM和F10(FlowLabs.Inc.)為基本組分，并加有27國(guó)際單位/毫升的抑肽酶、白蛋白、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、乙醇胺、膽堿、維生素和微量金屬。使細(xì)胞接種物在一只150平方厘米的燒瓶中生長(zhǎng)，瓶?jī)?nèi)裝有DMEM，并加入10%熱滅活的FCS、2mM谷氨酰胺、50單位/毫升毒霉素、50微克/毫升鏈霉素和400微克/毫升G418，細(xì)胞系在Cytodex微型載體(Pharmacia)上進(jìn)行培養(yǎng)。
在整個(gè)培養(yǎng)過程中，細(xì)胞達(dá)到了最高總體密度(即2.5×106個(gè)/毫升)，并合成得到前-uPA，然后用已知的方法，例如纖維蛋白溶解法或IAA測(cè)定法(參見1.6.2.)進(jìn)行分析測(cè)定。由IAA方法測(cè)定表明，最高濃度達(dá)到20微克/毫升。
E1.4.3用CHO(KaoF.T.PuckF.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，1275-1281，1968)或A431(FabricantRN.etal，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，565-569;1977)細(xì)胞重復(fù)上述克隆實(shí)驗(yàn)(參見E1.4.1和E1.4.2.)。轉(zhuǎn)染/培養(yǎng)條件基本上不變，但用Ham的F10(FlowLabs)代替DMEM作為CHO細(xì)胞的培養(yǎng)基。
為方便起見，用上述RSV載體轉(zhuǎn)染CHD細(xì)胞后所產(chǎn)生的單鏈uPA被稱為RSV-CHD-scu-PA，而由A431所產(chǎn)生的稱為RSV-A431-scu-PA。
產(chǎn)生前uPA的單層CHD克隆的再次克隆，及未附著生產(chǎn)克隆的選擇，由此得到一種能產(chǎn)生產(chǎn)前uPA的克隆懸浮液(1.5毫克/升，用IAA法測(cè)定)。
E1.5-前uPA的定量測(cè)定按上述方法(E1.4)得到的細(xì)胞系所產(chǎn)生的前uPA的量可用纖維蛋白溶解法(參見1.6.2.)進(jìn)行測(cè)定。在勞氏(Rous)肉瘤病毒(RSV-LTR)的長(zhǎng)末端重復(fù)的控制下，使含有該基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，以產(chǎn)生對(duì)新霉素(RSV-neo)抗性，以及在同樣的RSV-LTR(質(zhì)粒RSV-uPA)控制下，使含有uPA基因的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，以上所進(jìn)行的這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果被歸納在下表中表1G418抗性前uPA被選出克前uPA的產(chǎn)量細(xì)胞系克隆的編號(hào)克隆的編號(hào)隆的編號(hào)(微克/毫升)(用IAA法)LB628110.2-2LB650310.8-2LB61581431-51.5-52-10
從EXP3所進(jìn)行的產(chǎn)生2-10微克/毫升前uPA的克隆，以后再進(jìn)行亞克隆，并在大量培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，以生產(chǎn)前uPA。
表1(續(xù))G418抗性前uPA被選出克前uPA的產(chǎn)量細(xì)胞系克隆的編號(hào)克隆的編號(hào)隆的編號(hào)(微克/毫升)(用IAA法)CHO22211850.5-10.5-1.51-51.5-52-10A431＊2215-10＊非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的前uPA生產(chǎn)能力為0.5毫克/毫升實(shí)施例E2用RSV-uPA-BPV載體生產(chǎn)uPA在RSVuPA質(zhì)粒DNA中，限制核酸內(nèi)切酶NdeⅠ和ApaⅠ各自僅僅切割一次(圖3)，第一個(gè)在靠近RSV啟動(dòng)區(qū)的pBR322衍生區(qū)，而第二個(gè)在靠近uPA多腺苷酸化位點(diǎn)的3′區(qū)。這二個(gè)位點(diǎn)可通過XhoⅠ連結(jié)而進(jìn)行修飾，經(jīng)XhoⅠ消化后，得到一個(gè)含有RSV啟動(dòng)區(qū)/uPA密碼區(qū)的片段，后者適合于將其克隆在含有XhoⅠ位點(diǎn)或SaⅡ位點(diǎn)的載體中。
E2.1.1在37℃下，用含有420單位NdeⅠ的300微升溶液將70微克的RSV-uPA DNA消化完全(測(cè)定條件150mM NaCl，10mMM Tris·HCl，pH7.8，7mM MgCl2，6mM 2-巰基乙醇，100微克/毫長(zhǎng)BSA)。經(jīng)熱滅活后，將Nacl濃度調(diào)節(jié)到ApaⅠ的條件(6mM NaCl，6mM Tris·HCl，pH7.4，6mMMgCl2，6mM2-巰基乙醇，100微克/毫升BSA)，并在30℃溫度下，用含有160單位ApaⅠ的400微升(最終體積)溶液在4小時(shí)內(nèi)完全切開DNA。然后按1.5.3中所述的方法對(duì)DNA進(jìn)行提純和沉淀，接著再使其溶于20微升TE中，并在37℃下，用5單位的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ將DNA(最終反應(yīng)體積為25微升)培養(yǎng)1小時(shí)，以插入NdeⅠ突出端，而后將酶加熱滅活(Maniatis等，113頁(yè))。
E2.1.2如1.5.5所述，將以上所得的經(jīng)NdeⅠ/ApaⅠ消化的圓端RSV-uPA質(zhì)粒與磷酸化的XhoⅠ連接酶DNA(摩爾比約1∶50)混合，并在8℃下培養(yǎng)18小時(shí)(最終體積為50微升)(如1.5.5所示)，然后對(duì)連結(jié)酶進(jìn)行熱滅活。接著在37℃下，用含有120單位XhoⅠ的200微升溶液消化4小時(shí)，并對(duì)XhoⅠ進(jìn)行熱滅活。
E2.1.3用電泳法，在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶翁的0.75%瓊脂糖凝膠上分離以上所帶的DNA片段，分離時(shí)間為20小時(shí)，電壓為35伏(詳細(xì)情況可參見1.5.7)所得到的色帶在紫外透穿照射器上進(jìn)行檢測(cè)，最大的色帶相應(yīng)于8.35千堿基對(duì)RSV啟動(dòng)區(qū)/uPA密碼的片段，而最小的色帶相應(yīng)于2.45千堿基對(duì)的抗氨芐青霉素的，并含有復(fù)制源的?。将诊喗哥Y .5.7中所述的方法進(jìn)行切割和提純。最小的色帶用3單位的CIP在37℃下處理30分鐘，再在56℃下處理30分鐘，提純和沉淀按1.5.2和1.5.3中所述的方法進(jìn)行。將大片段和小片段以不同的摩爾比(大致在1∶1至4∶1的范圍內(nèi))混合，在14℃下連接3小時(shí)，并按1.5.8所述的方法，將各種反應(yīng)混合物的一部分用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHI反應(yīng)感受態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞在含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)過夜，對(duì)分離出來的菌落的質(zhì)粒進(jìn)行分析，以測(cè)得合適的限制片段圖譜，從中選出一個(gè)(質(zhì)粒p71)，在該質(zhì)粒中，置于RSV啟動(dòng)區(qū)轉(zhuǎn)譯控制下的人體uPA基因可通過用XhoⅠ(圖3底部)切割，而與其余質(zhì)粒分離。
E2.1.4-限制位點(diǎn)修飾通過插入一個(gè)獨(dú)特的XhoⅠ位點(diǎn)，在三個(gè)不同的位點(diǎn)(分別為BamHⅠ，HindⅢ或SalⅠ)對(duì)pBPV230.8(圖4)進(jìn)行修飾，所說的單一的XhoⅠ位點(diǎn)可使RSV-啟動(dòng)區(qū)/uPA密碼區(qū)(RSVuPA)較容易地插入。在每一實(shí)驗(yàn)中，使用過量的合適限制酶(BamHⅠ，HindⅢ或SalⅠ)在37℃溫度下，將100微升(最終體積)溶液中的10微克BPV230.8DNA在3小時(shí)內(nèi)消化完全。上述的酶經(jīng)由加熱的方式滅活，而DNA系按1.5.3中所述的方式提純，然后再溶解在10微升緩沖液(50mMTris，pH7.2，10mMMgSO，0.1mM二硫蘇糖醇，50微克/毫升BSA，Maniatis等，113頁(yè))中，接著在37℃下，用5單位的大腸桿菌DNA聚合酶的Klenow片段處理2小時(shí)，使之成平端。聚合酶經(jīng)熱滅活后，在37℃溫度下用5單位CIP在50微升(最終體積)溶液中對(duì)DNA進(jìn)行30分鐘的脫磷酸化處理，接著再在56℃下處理30分鐘。最后，在EGTA存在下，通過加熱對(duì)酶進(jìn)行滅活處理，并按1.5.2和1.5.3所述的方法對(duì)DNA予以提純。向重新溶解的圓頭線形的BPV230.8DNA加入標(biāo)記的XhoⅠ聯(lián)結(jié)子DNA(摩爾比為200∶1)，并使其在2.5單位的T4DNA連接酶的存在下(1.5.4)，在50微升(最終體積)溶液進(jìn)行15小時(shí)的連接，溫度為8℃。對(duì)連接酶進(jìn)行熱滅活后，用8個(gè)單位的XhoⅠ消化約含有1%連接DNA的試樣，再在連結(jié)前后用等分量的DNA進(jìn)行電泳，并按1.5.6中所述的方法分析。然后，將鹽濃度調(diào)節(jié)至100mMNaCl，而將pH值調(diào)節(jié)至7.5左右(Maniatisetal，pag.104andBiochemicalsforMolecularBiology;BoehringerMannheim，Munich1985)，在200微升溶液中用XhoⅠ切割所有的DNA，處理時(shí)間為1小時(shí)，溫度為37℃，接著使之負(fù)載在0.6%的瓊脂糖凝膠中，并進(jìn)行電泳，截出相應(yīng)于線形質(zhì)粒的色帶，再經(jīng)電洗脫和提純(按1.5.7中所述的方法)。線形DNA通過連結(jié)進(jìn)行自對(duì)合，并用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞(BRL)(參見1.5.8)。在含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)平皿上培養(yǎng)過夜后，分離所得到的菌落中的質(zhì)粒，用微量制品分析(參見1.5.9)法鑒別是否有新XhoⅠ位點(diǎn)存在。結(jié)果表明，獲得了下述pBPV230.8衍生質(zhì)粒(圖5中間)(1)pBB，其中XhoⅠ位點(diǎn)產(chǎn)生在BamHⅠ位置上，兩側(cè)與二個(gè)BamHⅠ位點(diǎn)相接;
(2)pBS，其中XhoⅠ位點(diǎn)產(chǎn)生在SalⅠ位置上，兩側(cè)與二個(gè)SalⅠ位點(diǎn)相接;
(3)pBH，其中XhoⅠ位點(diǎn)產(chǎn)生在HindⅢ位置上。
E2.1.5在各個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用含有過量XhoⅠ(在pBS的情況下為SalⅠ)的50微升溶液在37℃的溫度下，將含量各為50微克的pBB、pBH和pBSDNA消化完全，時(shí)間為2小時(shí)，用加熱的方式對(duì)酶進(jìn)行熱滅活，按1.5.4中所述的方法，用1單位的CIP對(duì)直線化質(zhì)粒DNA進(jìn)行脫磷酸化處理。酶經(jīng)滅活后，將DNA載在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%瓊脂糖凝膠上，電泳16小時(shí)，電壓為30伏。按1.5.7中所述的方法，電洗脫一個(gè)相應(yīng)于單體形線形質(zhì)粒的主要DNA色帶，再經(jīng)提純和重新溶解。同樣，用80單位的XhoⅠ將50微克的p71質(zhì)粒DNA消化完全，對(duì)酶進(jìn)行熱滅活，將混合物載在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的0.6%瓊脂糖凝膠上，并在30伏電壓下電泳16小時(shí)，具有8.35千堿基對(duì)的色帶的凝膠部分含有RSV啟動(dòng)區(qū)/uPA密碼區(qū)結(jié)構(gòu)，此處按1.5.7中所述的方法對(duì)其進(jìn)行電洗脫、提純和使之重新溶解。BPV載體DNA(圖5中間)和插入DNA(圖3底部)以2∶1至1∶4的比例混合，并在DNA濃度約為0.2微克/微升的條件下，用2單位的T4DNA連結(jié)酶試樣進(jìn)行連接， 5℃下處理24小時(shí)。用緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)介質(zhì)，連接的DNA在37℃溫度下用含有20單位XbaⅠ的15微升(最終體積)溶液消化1小時(shí)(測(cè)定條件50mM NaCl，6mMTris-HCl，pH7.9，6mM MgCl2，100微克/毫升BSA)。所說的酶并不切割RSV/uPA結(jié)構(gòu)，而僅對(duì)BPV230.8衍生載體切割一次。在XbaⅠ經(jīng)熱滅活后，所得的DNA混合物用水稀釋1至5倍，再加入10X連接緩沖液，并在14℃下，用2.5單位的T4 DNA連接酶培養(yǎng)2小時(shí)。從各個(gè)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中取出5微升試樣，用來轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞(參見1.5.8)。這些細(xì)菌在含有氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)平皿上生長(zhǎng)過夜，溫度為37℃，然后用微量制品分析法(參見1.5.9)分析從所產(chǎn)生的菌落中取出的試樣。從具有合適限制圖譜的隔離菌落中選出質(zhì)粒(參見1.5.9，圖5底部)。
E2.1.6-轉(zhuǎn)染/大量培養(yǎng)按E1.4.1中所述的方法，對(duì)鼠的LB6細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，而生產(chǎn)率最高的細(xì)胞按E1.4.2所述的方法進(jìn)行大量培養(yǎng)。
E2.1.7-uPA的定量測(cè)定根據(jù)E2.1.6中所述的方法轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，它所產(chǎn)生的uPA的量，按E1.5所述的方法進(jìn)行測(cè)定。在勞氏肉瘤病毒(RSV-LTR)的長(zhǎng)末端重復(fù)控制下，轉(zhuǎn)染引起含有該基因的RSV-Neo質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，以產(chǎn)生對(duì)新霉素(neo)的抗性。而含有RSV-uPA盒(Cassette)(參見圖3底部，并參看E2.1.5)的BPV衍生載體給出抗新霉素的生產(chǎn)前uPA的克隆，而前uPA的量在1.3微克/毫克至26微克/毫升的范圍內(nèi)。由這些細(xì)胞所產(chǎn)生的單鏈uPA稱為BPV-LB6-scu-PA。有關(guān)這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)歸納如下G418抗性前uPA克被選出克前uPA克隆的編號(hào)隆的編號(hào)隆的編號(hào)產(chǎn)量(微克/毫升)(用IAA法測(cè)定)19651-31-52-102-1010-20例E3前-uPA的純化和特性測(cè)定將培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的上清液(見E1，4，2)分別進(jìn)行純化和然后進(jìn)行分析以確定它們的主要結(jié)構(gòu)特征，將RSV-LB6-scu-PA、RSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA的電泳情況與人類尿源的scu-PA和A431未轉(zhuǎn)化細(xì)胞的scu-PA(A431-scu-PA)作平行比較。
E3.1-前-uPA的純化通過基本按照前面所述的用于A431-uPA從A431腫瘤細(xì)胞上清液中的純化的方法[考鐵A(CortiA)、諾里M.L.(NolliM.L)、索弗安蒂那A.(SoffientiniA.);加沙尼G(CassaniG)單鏈尿激酶類纖維蛋白溶酶原激體從人類A431細(xì)胞中的純化和特性化，血栓形成和止血法(ThromHaemostas)1986;56∶219-224]，采用Mab5B4-瓊膠糖和離子交換FPLC上的免疫親和性色層層析，可從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分別純化3F11-scu-PA(RSV-LB6-scu-PA)、RSV-A431-SCuPA、RSV-CHO-SC-uPA和BPV-LB6-uPA(見E1.4.2)。
用0.15M氯化鈉和包含1%聚乙二醇(PEG)6000的pH值為7.4的0.05M磷酸鈉緩沖劑耒平衡帶有一種結(jié)合高分子量尿激酶而不結(jié)合低分子量形式的單克隆抗體的一種瓊脂糖變性基層[MAB5B4-瓊脂糖，2.6cm×8.6cm，根據(jù)常規(guī)方法制備，如由考鐵A.(CortiA)、諾里M.L(Nolli M.L)、索弗安蒂那A(SoffientiniA)和加沙尼G.(Cassani G)在(Throm Haemostas1986;56∶219-24中所描述的]。所述柱負(fù)載有24公升4℃的流速為220ml/h的含有scu-uPA的細(xì)胞上清液(見上面和E1，4，2)，然后用平衡緩沖劑對(duì)其洗滌，用1M氯化鈉和包含1%PEG6000的0.1M乙酸進(jìn)行解吸。用IAA試驗(yàn)全部蠓藎切┌瑂cu-PA的餾份收集、合并和進(jìn)一步純化，并通過采用由pH值為4的約0.05M乙酸鈉緩沖劑預(yù)平衡的單SHR5/5柱(以球狀親水樹脂為基礎(chǔ)的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑，它具有狹的顆粒尺寸分布，帶電荷的基團(tuán)為-CH2SO3)的在一種FPLC(塊速蛋白質(zhì)液相色層分析)系統(tǒng)(Pharmaciafinechemical，瑞典)中的離子交換色層分析對(duì)其進(jìn)行純化及濃縮。通常用兩倍蒸餾水稀釋試樣以減小離子強(qiáng)度，然后將其負(fù)載于柱之上。在用平衡緩沖劑洗滌后，在50分鐘內(nèi)用從30-70%(B在A中濃度)的緩沖劑A(0.05M乙酸鈉緩沖劑，pH4)和緩沖劑B(1M氯化鈉，0.05M乙酸鈉，pH5)的鹽/pH線性梯度混合物進(jìn)行洗脫所結(jié)合蛋白質(zhì)，然后用100%B將其洗脫20分鐘，流速為60ml/h。通過IAA(見1.6.2)測(cè)量包含0.034mg/l酶催化活性的uPA抗原和0.870mg/l酶催化非活性、可被血漿酶活化的uPA抗原的3F11(RSV-LB6)細(xì)胞上清液，各個(gè)回收步驟中所回收的酶催化活性和非活性u(píng)PA(前-uPA)的數(shù)量報(bào)道在表2中。如由IAA評(píng)價(jià)的那樣，從24.1升3F11上清液中回收到約0.95mg活性u(píng)PA和15.5mg可被血漿活化的uPA，相應(yīng)于全部收得率分別為116%和73.8%。在最終產(chǎn)物中的酶催化活性u(píng)PA占總量的5.8%，對(duì)3F11-scu-PA(RSV-LB6-scu-PA)的反相FPLC分析導(dǎo)致了在280nm處有一個(gè)單個(gè)的吸附峰，它具有與A431scu-PA和尿scu-PA(c.f1.6.1)相同的停留時(shí)間。
當(dāng)將從產(chǎn)生PSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA的細(xì)胞中得到的細(xì)胞上清液置于該純化過程中時(shí)，可獲得相似的結(jié)果。
E3.2-scu-PA的結(jié)構(gòu)特性測(cè)定E3，2，1-分子量和免疫反應(yīng)性通過SDS-PAGE和免疫吸印法對(duì)從3F11細(xì)胞上層液(3P11scu-PA)中純化得到的材料(見E1.6)進(jìn)行分析以確定其純度、分子形式和免疫學(xué)性能。針對(duì)尿uPA的不同表位[例如Mab5B4，Mab105IF10和Mab52C7(見1.6.4)]，在與兔抗-uPA抗血清和各種不同的單克隆抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)的硝化纖維素膜上的吸印后，在非還原條件下3F11-uPA的SDS-PAGE(見1.6.4)展示了一條52，000Mr的色帶。對(duì)于自然尿scu-PA(1.6.1)也可獲得相似的免疫反應(yīng)性式樣，它表明3F11scu-PA在免疫學(xué)上與人類尿scu-PA緊密相關(guān)。在還原條件下3F11-uPA的SDS-PAGE顯示出50，000Mr主色帶(它相應(yīng)于大于總蛋白質(zhì)的90%)以及33，000Mr和20，000Mr的兩個(gè)次色帶。所有色帶都通過韋斯頓(Western)吸印法與抗uPA抗血清進(jìn)行免疫反應(yīng)，它表明由3F11細(xì)胞上清液純化得到的材料基本上由含量小于10%雙鏈uPA(3F11tcu-PA)的單鏈uPA(3F11scu-PA)50，000Mr色帶、33，000Mr和20，000Mr色帶組成。
E3.2.2-鏈結(jié)構(gòu)和糖基化在用血漿酶(c.f.1.6.2)活化后，探索了3F11-scu-PA(RSV-LB6-uPA)、RSV-A431-scu-uPA、RSV-CHO-scu-uPA和BPV-LB6-scu-PA的分子形式，上面所有的物質(zhì)(scu-PA的)都由血漿酶轉(zhuǎn)化為由一個(gè)20，000MrA鏈和一個(gè)33，000MrB鏈組成的52000Mr雙鏈蛋白質(zhì)(tcu-PA的)，它由SDS-PAGF在還原條件下確定。在用血漿酶和苷肽酶F或用血漿酶和神經(jīng)氨酸苷酶(neuraminidasr)(見1.6.5)處理之前和之后，將重組體scu-PA的分子量和鏈結(jié)構(gòu)與那些自然尿scu-PA(1.6.1)進(jìn)行比較。
上述scu-PA的各個(gè)重組體在非還原條件下的電泳活動(dòng)度比尿SCu-PA略低，相應(yīng)于分子量(見圖11)上相差1000-2000，在還原條件下也獲得了相似的結(jié)果。根據(jù)tcu-PA的B鏈活動(dòng)度，可計(jì)算得其分子量為32，000-33，000Mr，同時(shí)得到尿tcu-PA的B-鏈的分子量為31，000Mr(見圖12)。A鏈(20，000Mr)上沒有觀察到任何區(qū)別，當(dāng)用甘肽酶F處理所有的scu-PA以使N-糖苷鍵水解時(shí)[斯代芬G.J(SteffensG.J)、根茲勒.W.A(GünzlerW.A)、奧丁.F.(OttingF)、弗蘭庫(kù)斯.E.(FrankusE.)、弗勞赫.L.(FloheL.)，低分子量的人類尿尿激酶的完整氨基酸順序，赫普-賽勒(Hoppe-Seyler)的Z.物理化學(xué)1982，363，1043-1058]，觀察到對(duì)于所有蛋白質(zhì)的B-鏈(見圖13)來說，都具有相同的30000Mr色帶，這些數(shù)據(jù)反映出scu-PA的重組體和尿scu-PA在電泳活動(dòng)度方面的不同與不奶嗆坑泄亍Ｍü蒙窬彼彳彰福ㄍ僖核彳彰福 .6.5)，一種選擇性地切除糖蛋白的終端唾液酸殘基的酶來處理上述scu-PA，可證實(shí)這種在糖含量方面的不同。在用血漿酶培養(yǎng)和隨后用唾液酸苷酶培養(yǎng)后，尿scu-PA只用血漿酶處理的尿scu-PA相比較，表明在A鏈和B鏈上都沒有明顯的不同，而在相同條件下，重組體scu-PA的B鏈的電泳活動(dòng)度則在未處理蛋白質(zhì)和完全去糖基化的蛋白質(zhì)(見圖14)的中間，因此這些蛋白質(zhì)具有不同的唾液酸含量。
E3.2.3-等電位聚焦(isoelectrofocusing)將3F11scu-PA和RSV-A431-scu-PA進(jìn)行等電位聚焦(IEF)(見1.6.6，)以與A431scu-PA和尿scu-PA比較，對(duì)于所有的蛋白質(zhì)，觀察到幾種等電位形態(tài);具體地說，對(duì)于3F11scu-PA和RSV-A431-scu-PA來說，至少觀察到六種等電位形態(tài)PI8.75，8.85，9.0，9.1，9.15和9.25，而對(duì)于A431-scu-PA，觀察到四種等電位形態(tài)PI9.1，9.15，9.25和9.3。尿scu-PA呈現(xiàn)出所有3F11scu-PA和A431scu-PA所觀察到的色帶，雖然其數(shù)量上是不同的。
E3.2.4-氨基酸順序分析A)由自動(dòng)埃德邁(Edman)降解(見1，6，7)分析3F11scu-PA的N-末端氨基酸順序(18基)，獲得的順序報(bào)道于圖10中，如圖示，3F11scu-PA的順序與自然人類尿scu-PA和A431scu-PA的相同[加塞S.(Kasais.)、阿里莫拉H.(ArimuraH.)、尼希達(dá)M.(NishidaM.)、蘇亞馬T.(SuyamaT)，單鏈前-尿激酶的初步結(jié)構(gòu)，J.生物化學(xué)(J.Biol.Chem)1985;260/12382-12389]，但它明顯地與鼠scu-PA的順序不同[伯林D.(BelinD.)、邁沙里J.D(VassaliJ.D.)、康貝派恩C.(Combep-ineC.)、高杜F.(GodeauF.)、那加邁恩Y.(NagamineY.)、里奇E.(ReichE.)、高泄H.P.(KocherH.P.)、杜伏奧埃新R.(DuvoisinR.)，互補(bǔ)DNA編碼鼠尿激酶類纖維蛋白溶酶原活化劑的克隆化、核苷酸排列和表示，EurJ.生物化學(xué)(Eur.J.Biochem)1985，148，225-232)。
B)用羧肽酶Y對(duì)3F11scu-PA的消化的動(dòng)力學(xué)分析(見1.6.8)表明C-末端順序Ala-Leu(COOH)與人類尿scu-PA的相一致(加塞S.、阿里莫拉H.、尼希達(dá)M.和蘇亞馬T.的單鏈前-尿激酶的初步結(jié)構(gòu)，J.生物化學(xué)(J.Biol.chem)1985，260，12382-12389]。
E3.2.5-uPA和PAⅠ-1的相互作用人類內(nèi)皮纖維蛋白溶酶原激活抑制劑(PAI-1)與tcu-PA反應(yīng)而形成1∶1克分子復(fù)合物，它在第二個(gè)步驟中成為共價(jià)的，因此阻止了tcu-PA的蛋白分解活性[貝許邁F.(BachmannF.)，纖維蛋白溶解，血柱形成和止血法(ThrombosisandHaemostasis)1987由M.維斯卻瑞特(M.Verstraete)、J.維米蘭(J.Vermylen)、H.R里能(H.R.Lijnen)和J.阿努特(J.Arnout)編輯，國(guó)際血柱形成和止血法協(xié)會(huì)(IntevnationalsocietyonThrombosisandHaemostasis)和羅文(Leuven)大學(xué)印刷，羅文1987，第227-265頁(yè)]。我們已探索了由PAI-1(見1.6.9)對(duì)上述uPA的(RSV-LB6-scu-PA，RSV-A431-scu-PA，RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA在血漿酶活化之后)抑制作用的程度，為了這個(gè)目的，用固定量的血漿酶活化的tcu-PA(見1.6.2)預(yù)培養(yǎng)增加量的PAⅠ-1，并使用血漿酶特定酶解物S-2251，用一種間接測(cè)定法測(cè)量殘留纖維蛋白溶酶原激活體活性，繪制出抑制作用的劑量-效果曲線(無PAⅠ-1的活性百分?jǐn)?shù)作為PAⅠ-1濃度的函數(shù))。在1.7ng/ml下，uPA達(dá)到50%活性抑制作用，在有6-8ng/mlPAⅠ-1的所有情況下，所有的tcu-PA呈現(xiàn)出相似的曲線。
E3.3-酶催化活性E3.3.1溶解血纖維蛋白的活性在通過用血漿酶瓊脂糖處理(見1.6.2)而使3F11scu-PA轉(zhuǎn)化成酶催化活性的3F11tcu-PA后，確定其酶催化活性，通過離心分離可容易地將固定化的血漿酶從經(jīng)活化的酶中分離，這樣就防止了在接下來的測(cè)定中的可能的干擾，由血纖維蛋白板方法確定的3F11tcu-PA特定的溶解血纖維蛋白活性為117225Iu/mg(見表2)，這個(gè)結(jié)果與對(duì)A431tcu-PA報(bào)道的值符合得很好[考梯A.(CortiA.)、諾里M.L(NolliM.L.)、加沙尼G.(CassaniG.)，由一種新的IAA方法對(duì)單鏈和雙鏈尿激酶類纖維蛋白溶酶原激活體的不同探測(cè)，血栓形成和止血(ThromHaemostas)1986，56，407-410]E3.3.2-動(dòng)力學(xué)分析將3F11-scu-PA(RSV-LB6-scu-PA)、RSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA和BPV-LB6-scu-PA與尿scu-PA和A431-scu-PA在它們?cè)诩兓到y(tǒng)(見1.7.1，1.7.2和1.7.3)中的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)方面進(jìn)行比較，用萊恩威弗-伯克(Lineweaver-Burk)類型的分析方法研究通過血漿酶使scu-PA向tcu-PA的活化(表3)和血漿酶活化的uPA水解顯色酶解物S-2444(表4)和活化纖維蛋白溶酶原(表5)能力。在所有情況下，各種不同的scu-PA呈現(xiàn)出相似的動(dòng)力學(xué)狀態(tài)，其米氏常數(shù)(Michaelis-Menten)(Km)和催化常數(shù)(Kcat)的值相差不大。
表3采用血漿酯的scu-PA的活化動(dòng)力學(xué)(pH7.6和37℃)scu-PA Km(微摩爾) Kcat(S-1)催化常數(shù)尿的0.170.09A4310.210.09RSV-A4310.280.11RSV-LB60.140.11BPV-LB6RSV-CHO表4在Glp-Gly-Ayg-PNA(S-2444)上的酰胺分解動(dòng)力學(xué)(pH8.8和37℃)scu-PA Km(微摩爾) Kcat(S-1)催化常數(shù)尿的8025A4317223RSV-A4317623RSV-LB66924
BPV-LB67826RSV-CHO7626表5人類纖維蛋白溶酶原的活化動(dòng)力學(xué)(pH7.4和37℃)scu-PA Km(微摩爾) Kcat(S-1)催化常數(shù)尿的231.1A431171.0RSV-A431211.1RSV-LB6241.3BPV-LB6241.3RSV-CHO241.3實(shí)施例E4人類uPA啟動(dòng)子區(qū)的修飾的衍生物的結(jié)構(gòu)E4.1-puPA2質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)50微克(microg)如E0.3所述所制備的λ-uPA1DNA，在30℃下，在合適的緩沖劑中，在100微升(microl)(最終體積)中具有30單位(U)的SmaⅠ中消化60分鐘。500毫微克(ng)所得到的DNA在一種含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1%的瓊脂糖凝膠(體)上分析，而剩余物在-20℃下貯藏。然后酶在68℃(10分鐘)下熱失活，且所產(chǎn)生的DNA制劑加在一種含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓上0.8%預(yù)制的瓊脂糖凝膠(體)上。在TBE緩沖劑(Maniatis)等，ch.5)中，50體積(V)下，進(jìn)行電泳分離20小時(shí)，DNA色帶在一種中級(jí)長(zhǎng)度UV透照(射)器上顯示。切出一條約2.38千堿基對(duì)(kb)含有前-uPA(pro-uPA)啟動(dòng)子的色帶，且如1.5.7所述的經(jīng)電洗脫和純化的DNA、50微克pEMBL8CATDNA(圖6)相似地在30℃下，在25微升(最終體積)中具有30單位的SmaⅠ中消化1小時(shí)。加入64微升水、10微升CIP10X緩沖劑和在1微升(最終體積)中的1單位的CIP，再在37℃下培養(yǎng)該反應(yīng)混合物60分鐘。CIP如1.5.4所述加入EGTA和加熱是失活的，且在如1.5.7所述的相樣條件下，DNA在一種含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓0.8%的瓊脂糖凝膠(體)上純化。1.5微克2.38千堿基對(duì)λ-uPA1衍生的片段和500毫微克如上面所制備的直線型的脫磷pEMBL8CATDNA混合在一起，并在14℃下在20微升含有10%的聚乙二醇(PEG)和2單位的T4DNA連接酶的合適的緩沖液中連接20小時(shí)。然后，5微升該反應(yīng)混合物如1.5.8所述用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101E.Coli細(xì)胞。分析對(duì)氨芐青霉素抗性菌落，且在其中含有在正確定向處的插入物的一個(gè)選出，并稱為puPA2(圖6右面)。
E4.2-puPA2/41質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)得到一種上面所制備的Sma部分消化直線型的puPA2DNA的最佳條件是通過分別用1.0，2.0，3.0和4.0單位在10微升(最終體積)合適的緩沖劑中的SmaⅠ消化250毫微克該質(zhì)粒來研究。50%(體積/體積)各反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至不同的管子中，并在30℃下反應(yīng)6分鐘后在干冰/乙醇浴中冷凍，而剩余部分在培養(yǎng)9分鐘之后冷凍。然后，各冷凍樣品用EDTA配為10毫摩爾/升，酶為熱失活的，且DNA在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基苯基菲啶鎓的1%瓊脂糖微小凝膠(體)上分析。通過用2單位培養(yǎng)15分鐘和用3單位培養(yǎng)6分鐘得到良好的效果。然后，一種預(yù)制的浸提確定如下5微克puPA2DNA用40單位在50微升合適的緩沖劑中的SmaⅠ消化，該反應(yīng)通過加入1微升500毫摩爾/升EDTA而停止，且冷凍。在所加的酶熱失活之后，該puPA2制品與2.25微克XhoⅠ接合子混合，如1.5.6所述磷酸化，并在86微升一種含有10%的聚乙二醇1500和2.5單位的T4DNA連接酶的反應(yīng)混合物中進(jìn)行連接，先在7℃下培養(yǎng)6小時(shí)，然后緩慢地升高溫度至17℃，并進(jìn)一步培養(yǎng)10小時(shí)。連接酶是熱失活的，10%連接的DNA在37℃PRT下，用在20微升(最終體積)中的55單位的XhoⅠ消化，然后，該酶熱失活，且DNA如1.5.3所示沉淀。沉淀的DNA再溶解在4微升TE(Maniatis等)中，加入1微升含有5X連接緩沖劑(Maniatis等)的1單位的T4DNA連接酶，在15℃下放置該混合物自連接2小時(shí)30分鐘，且然后用于轉(zhuǎn)化HB101感受態(tài)E.Coli細(xì)胞(1.5.8)。氨芐青霉素抗性菌落通過微型制品(minimprep)分析篩選。其中之一，含有SmaⅠ位(位于含有2.38千堿基對(duì)插入物的5′末端的側(cè)翼)轉(zhuǎn)化為一個(gè)XhoⅠ位(圖8)的，稱為puPA2/41。
E4.3-CAT分析puPA2、其衍生物puPA2/41和RSV-CAT分析它們進(jìn)行CAT基團(tuán)轉(zhuǎn)錄的能力。質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染給人類A1251細(xì)胞列(1.1)，它通過磷酸鈣沉淀步驟(方法)從一種腎臟癌中衍生出來(Stoppe-lliM.P.VerdeP.，GrimaldiG.，LocatelliE.K.，BlasiF.細(xì)胞生物學(xué)雜志(J.CellBiol.，1968，102，1231-1241)，且在64±4小時(shí)之后，測(cè)定可能在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中產(chǎn)生的CAT蛋白質(zhì)的含量。
E.4.3.1-質(zhì)粒DNA的純化質(zhì)粒DNA用如BrinboimH.C.和DolyJ.1979，核酸研究(NucleicacidRes.)，7，1513(也在Maniatis等第90頁(yè)中報(bào)道)的在(強(qiáng))堿溶解方法，從一種400毫升LB流體培養(yǎng)液中培養(yǎng)過夜的各細(xì)菌細(xì)胞系來純化。因此所得到的質(zhì)粒DNA在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓CsCl級(jí)份上純化兩次，含有其的色帶通過穿孔(punturing)收集，并用異戊醇(參見Maniatis等第93-94頁(yè))徹底萃取。含有DNACsCl水溶液然后用水以1∶4稀釋，且通過加入0.1體積3摩爾/升的乙酸鈉pH5.2和3體積乙醇而沉淀。在-20℃下放置該混合物30分鐘后，DNA部分在4℃下，15分鐘內(nèi)，以10000Xg離心下來，用70%的乙醇洗滌一次，并用100%的乙醇洗滌一次，干燥，溶解在2毫升TE中，再沉淀，并用同樣的方法洗滌，且最后再溶解在1毫升TE(Maniatis等)中。測(cè)定O.D.260，并調(diào)節(jié)濃度至約500毫微克/微升，在微小凝膠(體)上校對(duì)，且再通過分光光度計(jì)測(cè)定。最終，質(zhì)粒DNA用無水乙醇以1∶1稀釋，并在-20℃下貯藏。
E.4.3.2-通過磷酸鈣步驟沉淀對(duì)每一個(gè)使將受轉(zhuǎn)染的60毫米陪替氏(Petri)碟，40微升DNA乙醇/TE溶液，等當(dāng)量為10微克DNA，在一莎文特(Savant)真空離心機(jī)中干燥，且再溶解于220微升水中。加入30微升2/摩爾/升Ca Cl2(來自Mallinkrodt或Merck)，并迅速混合。混合250微升2XHBS(10克/升HEPES，4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸、16克/升NaCl，pH7.1±0.05，無菌的)和5微升100×PO4(70毫摩爾/升Na2HPO4和70毫摩爾/升NaH2PO4，無菌的)，并廣泛地鼓泡時(shí)用一根巴斯德(Pasteur)吸移管緩慢地滴加DNA/CaCl2溶液。然后，在室溫下，將該混合物放置30分鐘(Graham和Vander Eb，病毒學(xué)(Virology)，52，456;1984)。
E.4.3.3-A1251病毒學(xué)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染(transfection)在37℃下，5%的Ca增濕培養(yǎng)器中A1251細(xì)胞生在接近匯集在全部介質(zhì)中[用10%的胎兒小牛血清(Hyclone)和1%的抗菌溶液(Gibco)補(bǔ)充的DME介質(zhì)(Gibco)]中。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，該細(xì)胞在60毫米陪替氏碟中以105細(xì)胞/碟分裂，且在轉(zhuǎn)染前再用新的介質(zhì)增補(bǔ)4至6小時(shí)。在to時(shí)，加入沉淀的DNA，且將該混合物放置在培養(yǎng)器中16至18小時(shí)。在培養(yǎng)過夜之后，細(xì)胞用DME(7.2)洗滌一次，再用全部介質(zhì)補(bǔ)充，放置在培養(yǎng)器中以完成培養(yǎng)，且收獲。在實(shí)驗(yàn)中重復(fù)三次，干的DNA溶解后的各步驟分別為各樣品進(jìn)行。所獲得的細(xì)胞用于后續(xù)步驟。
E.4.3.4-細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的制備在添加沉淀的DNA后64±4小時(shí)之后，該細(xì)胞(如E.4.3.3制備)用一種無Ca++的磷酸鹽-緩沖鹽水(PBS)(80克NaCl，2克KCl，11.5克Na2HPO4·2H2O，2克KH2PO4每1升蒸餾水，調(diào)節(jié)pH7.2)洗滌3次，然后加入1毫升STE(100毫摩爾/升NaCl，10毫摩爾/升TRIS，1毫摩爾/升EDTA)，且在室溫下將該混合物放置5分鐘。然后，用一把橡膠淀帚刮出該細(xì)胞，并放在一根埃本道夫(Eppendorf)管中，在4℃下，3分鐘內(nèi)在微型離心機(jī)中旋轉(zhuǎn)下來，并再懸浮在100微升Tris250毫摩爾/升pH7.8中，將該細(xì)胞懸浮液放置在干冰/乙醇浴中15分鐘，且然后轉(zhuǎn)移至一個(gè)37℃浴中;重復(fù)這冷凍/解凍兩次，在4℃下，3分鐘內(nèi)，在微型離心機(jī)中將該細(xì)胞核旋轉(zhuǎn)下來，且將上層清液轉(zhuǎn)移至一根新的管子中。為了克服由于板(盤)至板的細(xì)胞數(shù)目中可能的很小的差別(所引起的)各樣品的蛋白質(zhì)含量的微小差異，蛋白質(zhì)濃度根據(jù)洛里(Lowry)的方法(參見E.1.6)通過從各樣品中測(cè)定10微升來決定。溶胞產(chǎn)物的剩余部分在-20℃下貯藏，直至用于CAT檢定。
E.4.3.5-CAT檢定將一個(gè)含有100⒖死醋愿魅馨锏牡鞍字實(shí)奶寤賈 33.5微升水和44微升含有22.5微升2摩爾/升TrispH7.8的預(yù)混合溶液中，向其中加入20微升一種3毫克/毫升乙酰(基)Co A(Sigma)和1.5微升放射性14C-氯霉素(50-60毫居里(mci)/毫摩爾，來自Amersham)的新制備溶液。在37℃下培養(yǎng)該混合物1小時(shí)，然后，該反應(yīng)通過加入1毫升乙酸乙酯并攪動(dòng)以終止反應(yīng)。所形成的兩個(gè)相在一個(gè)埃本道夫微型離心機(jī)(5分鐘)中分離，且有機(jī)相轉(zhuǎn)移至一根新的埃本道夫管中，在一個(gè)莎文特真空離心機(jī)中干燥essicated)，再溶解在20微升乙酸乙酯中，并通過在0.25-1毫升硅膠板(Kodak)薄層層析上檢定。用氯仿∶甲醇(HPLC級(jí))進(jìn)行層析2-3小時(shí)，95∶5為流動(dòng)相，且相應(yīng)于示蹤抗菌的放射性點(diǎn)通過射線顯跡法顯影。相應(yīng)于放射性點(diǎn)的色譜的區(qū)域切下，放在具有5毫升的一種合適的閃爍液如?？抵Z佛勞瓦(Econofluor)的小玻璃瓶中，用一個(gè)β計(jì)數(shù)器測(cè)定(新英格蘭核)和放射性。結(jié)果如下列表3所示。
E4.4.1-質(zhì)粒puPA2/17的結(jié)構(gòu)300毫微克puPA2/41 DNA(參見E3.2)在37℃下，在合適的緩沖液(100毫摩爾/升Na Cl2，10毫摩爾/升Tris.HCl pH7.5，10毫摩爾/升Mg Cl，10毫摩爾/升2-巰基乙醇，100微克/毫升BSA)中，用4.2單位的OxaNⅠ完全消化4小時(shí)。DNA抗(氨芐青霉素)性在一種含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的微小凝膠(體)(1.5.1)上校對(duì)，且酶通過在68℃下加熱10分鐘而失活。然后，加入2微升水、1.5微升10X緩沖液(參見1.5.5)和1.5微升T4 DNA連接酶，且該混合物在15℃下培養(yǎng)18小時(shí)。2.5微升該混合物用于轉(zhuǎn)化E.Coli HB101耐久細(xì)胞(1.5.8)。氨芐青霉素抗性菌落通過微型制品分析(1.5.9)分析。選出那些具有正確限制樣本的，且其中之一稱為puPA2/17。(圖8)。
E4.4.2質(zhì)粒puPA2/254的結(jié)構(gòu)4微克puPA2/41 DNA(參見圖8)在10微升合適的緩沖液(50毫摩爾/升Na Cl，10毫摩爾/升Tris HCl，10毫摩爾/升Mg Cl2和1毫摩爾/升二硫蘇糖醇)中，用5單元EcoRⅤ消化至完全;(Maniatis等)然后，在37℃下，2小時(shí)內(nèi)加入～種7微升水、2微升0.5摩爾/升Tris pH8和在1微升緩沖液(Maniatis等)中的1單位CIP的混合物。該混合物在37℃下培養(yǎng)1小時(shí)，加入EGTA至一個(gè)最終濃度10毫摩爾/升，且該混合物在68℃下培養(yǎng)45分鐘。DNA(如1.5.3所述)沉淀，洗滌和干燥，且最終再溶解在7.5微升TE(Maniatis等)中。DNA在37℃下，用在10微升(最終體積)中的4.2單位OxaNⅠ徹底消化4小時(shí)，且5′端在37℃下用1單元DNA PolⅠ(20微升，最終體積)的克雷諾(Klenow)片段補(bǔ)平1小時(shí)。然后DNA沉淀(1.5.3)，且再懸浮在7.5微升TE(Maniatis等)中。加入0.5微升100毫摩爾/升ATP、1微升10X緩沖液(參見1.5.5)(Maniatis等)和2.5單位T4 DNA連接酶(1微升，最終體積)，且該混合物在15℃下培養(yǎng)18小時(shí)。然后2.5微升該混合物用于轉(zhuǎn)化E.Coli HB101感受態(tài)細(xì)胞(1.5.8)，該細(xì)菌沉積在含有LB板(Maniatis等)的氨芐青霉素上。選擇含有正確限制樣本的菌落，且其中之一稱為puPA2/254(圖8)。
E4.4.3-CAT分析測(cè)試puPA2/41、其缺失衍生物puPA2/17和puPA2/254及RSV-CAT的CAT基因轉(zhuǎn)錄的能力。質(zhì)粒DNA在A1251細(xì)胞列(1.1)中通過磷酸鈣沉淀技術(shù)轉(zhuǎn)染，且在64±4小時(shí)之后測(cè)定細(xì)胞內(nèi)CAT含量?；旧先鏓4.3中所述進(jìn)行質(zhì)粒DNA的純化、通過磷酸鈣的沉淀、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、細(xì)胞溶胞產(chǎn)物的制備和CAT檢定。結(jié)果如下所示
表A1251RSV-CAT100puPA2/41128puPA2/17303.8puPA2/254378.5E4.5-uPA衍生的表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)細(xì)菌CAT基因可從質(zhì)粒puPA2/41，puPA2/17和puPA2/254中切去，為了用它們作為表達(dá)載體。優(yōu)先地，改進(jìn)(變換)將保存uPA啟動(dòng)子導(dǎo)出順序、uPATATA盒、mRNA起始點(diǎn)和pEMBL8-衍生出來的多元連接物。包括這┓段У腄NA片段可從載體中切去，且插入上游至不同的基因如“表達(dá)盒”。從上述質(zhì)粒，三種uPA-衍生物表達(dá)載體通過切開細(xì)菌CAT基團(tuán)得到來自puPA2/41的pPP41，來自puPA2/17的pPP17;來自puPA2/254的pPP254。
E4.5.1-pPP41的結(jié)構(gòu)2.5微克puPA2/41DNA在37℃下用4單位XbaⅠ部分消化45分鐘，且該反應(yīng)通過加入EDTA(至10毫摩爾/升)而停止，并加熱失活。沉淀(1.5.3)之后，DNA在37℃下，用2.5單位DNAPolⅠ(最終體積20微升)的克雷諾片段充滿1小時(shí)，在8℃下，用2單位連接酶連接至一種50摩爾過量的SalⅠ連接物(1.5.5和1.5.6)16小時(shí)，且在酶熱失活后，在37℃下用一種過量的SalⅠ完全消化2小時(shí)。DNA片段連接在一種0.75瓊脂糖凝膠上(層析)，且含有一個(gè)5.6千堿基對(duì)范圍的DNA片段凝膠(體)部分切出。然后，該DNA如1.5.7所述萃取和純化，再懸浮在10微升TE中，且2微升該溶液在16℃下用2單位連接酶(最終體積10微升)自行連接4小時(shí)。。然后，2.5微升該DNA制劑用于轉(zhuǎn)化DH5E.coli感受態(tài)細(xì)胞(1.5.8-1.5.9)。在該氨芐青霉素-抗性菌落質(zhì)粒pPP41中，即是通過微型制品分析選擇一種含有包括在SalⅠ位和XbaⅠ位之間下游至CAT基因被刪除的區(qū)域的質(zhì)粒(圖9B)。
E4.5.2-pPP/17和pPP/254的結(jié)構(gòu)基本上在依照上面概述的步驟，通過在37℃下分別用24單位XbaⅠ完全消化10微克puPA2/17DNA或10微克puPA2/254DNA2小時(shí)可得到兩種表達(dá)載體。直線的質(zhì)粒的5′凸出端在37℃下，用DNAPolⅠ(2.5單元)的克雷諾片段補(bǔ)平1小時(shí)，且在8℃，用2單位連接酶連接至一種50摩爾過量的SalⅠ連接物(1.5.5和1.5.6)16小時(shí)，且在該酶熱失活之后，DNA在37℃下用一種過量的SalⅠ完全消化2小時(shí)。然后，該酶熱失活，且DNA沉淀(1.5.3)，并再懸浮在10微升TE中。2微升該DNA溶液在15℃下用2單位DNA連接酶(最終體積10微升)連接16小時(shí)，且2.5微升用于轉(zhuǎn)化DH5E.Coli感受態(tài)細(xì)胞。在芐青霉素抗性菌落中，選擇質(zhì)粒pPP17和pPP254，它們運(yùn)載uPA-導(dǎo)出刪除啟動(dòng)子，且有如E4.5.1中pPP41所述的相同的一般特性(圖9B)。
實(shí)施例E5uPA衍生微型基因的制備E5.1.載體的制備來自pPP41、pPP17、pPP254質(zhì)粒DNA(各20微克，如上面所述制備的)通過在25℃下用50單位SmaⅠ分別消化它們3小時(shí)(最終體積50微升)而直線化。然后直線的質(zhì)粒在37℃下用1單位CIP脫磷酸化1小時(shí)，在0.8%的瓊脂糖凝膠(體)(參見1.5.3)上純化，再懸浮在20微升TE中，并在4℃下貯藏。
E5.2-微小基因的制備上面所得到的直線或脫磷酸化質(zhì)粒DNA(E5.1)(3微克)在15℃下，在具有2單位連接酶的10%PEG1500(最終體積10微升)中，與1微克uPA-ORF(例如，含有如E1.1所述得到的uPA編碼區(qū)域的SmaⅠ斷片(7.3.千堿基對(duì))混合。
2.5微升來自各反應(yīng)混合物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.ColiDH5細(xì)胞(參見1.5.8)。在氨芐青霉素-抗性菌落質(zhì)粒pPP41XS、pPP17XS和pPP254XS中，通過微型制品分析(參見1.5.9)具有下列性質(zhì)(圖9C)的選擇分別從pPP41、pPP17和pPP254衍生出的質(zhì)粒-uPA編碼區(qū)域插入在含有載體的uPA啟動(dòng)子的SmaⅠ位中-uPAmRNA起始位與人類uPA基因的一樣-它們含有一種pEMBL8衍生出的順序-uPA-導(dǎo)出微小基因可從那載體中切去，且最好通過用XhoⅠ和SalⅠ消化插在不同的載體中-切去的微小基因因插在具有一個(gè)SalⅠ或一個(gè)XhoⅠ位的載體中-切去的微小基因可插在載體中，使它們?cè)诓逶谝环N合適的宿主中時(shí)能維持一種游離(episomal)形式-在來自u(píng)PA啟動(dòng)子的一種2.35片段的控制下，pPP41XS具有uPA編碼區(qū)域;
-在pPP41XS中所得到的同樣的啟動(dòng)子片段的強(qiáng)制下，pPP17XS具有uPA編碼區(qū)域，但其中在兩個(gè)OxaNⅠ位之間產(chǎn)生缺失;
-在pPP41XS中所得到的同樣的啟動(dòng)子片段的控制下，pPP254XS具有uPA編碼區(qū)域，但其中在5′OxaNⅠ位和EcoRⅤ位之間產(chǎn)生缺失。
E5.4-轉(zhuǎn)染(trasfection)大量培養(yǎng)在鼠LB6細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)如E.1.4.1所述進(jìn)行。最多所產(chǎn)生的細(xì)胞為如E.1.4.2所示的大量培養(yǎng)。
E.5.5-uPA的定量估計(jì)根據(jù)E.5.4通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生的uPA的量如E.1.5.所示測(cè)定，使共同傳染的含有該基因的質(zhì)粒在勞氏(Rous)肉瘤病毒(RSV-LTR)的長(zhǎng)端重復(fù)控制下用于抗新霉素(neo)，含有uPA基因的質(zhì)粒在一種uPA-衍生出的啟動(dòng)子(pPP41XS、pPP17XS或pPP254XS)控制下的轉(zhuǎn)染的結(jié)果如下報(bào)道(隱蔽(暗)的前-uPA通過IAA測(cè)定，參見1.6.2.來自RSV-uPA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的含量認(rèn)為是100%)%前-uPA產(chǎn)物RSVuPA100173pPP41XS克隆2623631212pPP17XS克隆220231831209pPP254XS克隆2178231所回收的scu-PA的物理-化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)與上面所報(bào)道的RSV-LB6-scu-PA(3F11scuPA)的性質(zhì)相同。
通過在CHO或A431細(xì)胞中重復(fù)轉(zhuǎn)染和大量培養(yǎng)，得到一種scu-PA，分別具有同樣的RSV-CHO-scu-PA或RSV-A431-scuPA化學(xué)-物理和生物學(xué)性質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種制備人類型單鏈糖基化尿激酶(前uPA)的方法，它包括用含有uPA密碼基因組順序的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所說的uPA基因組順序是約7.3千堿基對(duì)的DNA片斷，該片段是通過克隆在合適的克隆載體中的基因組DNA經(jīng)SmaⅠ部分消化而得到的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所說的克隆載體是λ-噬菌體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所說的動(dòng)物細(xì)胞是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所說的動(dòng)物細(xì)胞選自給定的人、鼠、倉(cāng)鼠和猴類的細(xì)胞系。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所說的細(xì)胞系選自鼠LB6、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)和人體表皮樣癌的細(xì)胞系。
7.根據(jù)權(quán)利要1、2、3、4、5或6所述的方法，其特征在于所說的uPA密碼順序是處于人體uPA啟動(dòng)區(qū)或其來自人體的衍生物的控制下。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所說的人體uPA啟動(dòng)區(qū)具有圖7中所示的順序，或其等位基因型。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所說的人體uPA啟動(dòng)區(qū)是2.38千堿基對(duì)片段，該片段是通過用SmaⅠ消化被克隆在合適克隆載體中的基因組DNA而得到的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所說的克隆載體是λ-噬菌體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一條所述的方法，其特征在于所說的啟動(dòng)區(qū)是人體uPA啟動(dòng)區(qū)的缺失衍生物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所說的人體uPA啟動(dòng)區(qū)衍生物是一種缺失衍生物，它失去被約在1827千堿基對(duì)和1202千堿基對(duì)之間的OxaNⅠ所切割的0.6千堿基對(duì)片段，或者是這樣一種缺失衍生物，它失去在約為1827千堿基對(duì)的OxaNⅠ位點(diǎn)和約為537千堿基對(duì)的EcoRⅤ位點(diǎn)之間的1.29千堿基對(duì)片段。
13.一種用于表達(dá)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中密碼順序的啟動(dòng)區(qū)順序，其特征在于它是一種人體uPA啟動(dòng)區(qū)的插入、缺失或突變衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的啟動(dòng)區(qū)順序，其特征在于所說的啟動(dòng)區(qū)順序是一種人體uPA啟動(dòng)區(qū)的缺失衍生物。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述啟動(dòng)區(qū)順序，其特征在于所說的人體uPA啟動(dòng)區(qū)衍生物是一種缺失衍生物，它失去被OxaNⅠ所切割的0.6千堿基對(duì)片段，或者是這樣一種缺失衍生物，它失去在約1827千堿基對(duì)的OxaNⅠ位點(diǎn)和約597千堿基對(duì)的EcoRⅤ位點(diǎn)之間的1.29千堿基對(duì)片段。
16.一種表達(dá)盒(exepression cassette)，它包括權(quán)利要求13、14或15的啟動(dòng)區(qū)。
17.一種能轉(zhuǎn)錄真核細(xì)胞中側(cè)翼基因或cDNA的表達(dá)載體，它包括人體uPA啟動(dòng)區(qū)順序或權(quán)利要求13、14或15中的啟動(dòng)區(qū)。
18.一種具有DNA順序的表達(dá)載體，它包括uPA密碼人體基因組順序和啟動(dòng)區(qū)順序，后者是人體uPA啟動(dòng)區(qū)順序或根據(jù)權(quán)利要求13、14或15中所述的啟動(dòng)區(qū)。
19.一種質(zhì)粒，其特征在于該質(zhì)粒選自pPP41、pPP17或pPP254。
20.一種能表達(dá)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中人體uPA密碼順序的質(zhì)粒，其特征在于所說的質(zhì)粒選自pPP41XS、pPP17XS或pPP254XS。
21.一種轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞，其特征在于它包含權(quán)利要求13、14或15中的啟動(dòng)區(qū)，或者是權(quán)利要求19或20的質(zhì)粒。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞能表達(dá)uPA或scu-PA。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞選自已建立的人、鼠、倉(cāng)鼠或猴類的細(xì)胞系。
24.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞選自鼠LB6、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢或人類表皮樣癌的細(xì)胞系。
25.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是一種中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系，它能夠在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或在懸浮液中表達(dá)蛋白質(zhì)。
26.根據(jù)權(quán)利要求21、22、23、24或25所述的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其特征在于所說的轉(zhuǎn)化細(xì)胞含有一種針對(duì)選擇劑的抗性基因。
27.一種糖基化單鏈人類型尿纖維蛋白溶酶原激活劑，用凝膠電泳分析測(cè)得的表觀分子量較之從人尿中所得的scu-PA高500-3000單位，上述差異是由于分子量的差異取決于B鏈的不同糖基化而造成的。
28.糖基化單鏈人體尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑具有(a)人體前uPA的氨基和羧基末端順序;(b)在SDS-PAGE的表現(xiàn)分子量約為52，000，相應(yīng)于較之從人體尿中所得的前uPA的分子量高1000-2000左右(在同樣的測(cè)定條件下測(cè)得)，上述分子量的差異主要是由于B鏈分子鏈的相應(yīng)差異造成的;(c)A鏈的表觀分子量與人類A鏈分子量相等;(d)用糖肽酶F除去N-糖取代基后，B鏈的表觀分子量與人的B鏈表觀分子量相等。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的糖基化單鏈人體尿激酶型纖維蛋白溶酶原激活劑，其進(jìn)一步特征在于所說的激活劑系由轉(zhuǎn)化的鼠LB6、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢或人體表皮樣癌的細(xì)胞所產(chǎn)生的。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的糖基化單鏈人體尿激酶型蛋白溶酶原激活劑，其特征在于所產(chǎn)生的細(xì)胞系按權(quán)利要求7所述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
31.一種糖基化單鏈人體尿激酶型蛋白溶酶原激活劑，其特征在于3F11-sc-μPA、RSV-A431-scu-PA、RSV-CHO-scu-PA或BPV-LB6-scu-PA。
32.一種人類型雙鏈尿激酶，它由權(quán)利要求27、28、29、30或31中的糖基化單鏈人類型前uPA的蛋白質(zhì)分解而得到，或者可按權(quán)利要求1至11中任何一條所述的方法進(jìn)行制備。
33.一種藥劑，它含有權(quán)利要求27、28、29、30或31的中化合物，這種化合物用作藥劑的活性組分。
34.一種治療血栓形成或栓塞疾病的方法，它包括給所需治療的病人施用抗血栓形成或抗栓塞的有效量的權(quán)利要求27、28、29、30或31中所述的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用以制備單鏈前尿激酶(以下也稱作前uPA或(scu-PA)的方法。更具體地說，它涉及一種制備前uPA的方法，該法包括從人體基因組庫(kù)中回收uPA基因，將其插入一個(gè)表達(dá)載體中，將所得的質(zhì)粒載體DNA引入動(dòng)物細(xì)胞中，以得到一種能產(chǎn)生編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化突變體，以及從所說的動(dòng)物細(xì)胞中回收糖基化的前uPA。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1033289SQ8810396
公開日1989年6月7日 申請(qǐng)日期1988年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1987年8月10日
發(fā)明者喬瓦尼·卡薩尼, 瑪里亞路易薩·諾利, 費(fèi)德里科·瑪里亞·羅比亞蒂, 安杰洛·科爾蒂, 弗朗切斯科·布拉西 申請(qǐng)人:格魯普萊皮蒂特股份有限公司