專利名稱：用于分段合成生物聚合物的多孔片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物聚合物的化學(xué)合成，特別涉及一種用于同時合成大量多苷核酸、多肽和多糖之類生物聚合物的裝置。
近年來，一些所需順序的生物聚合物的化學(xué)合成方案的開發(fā)已引起了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)許多領(lǐng)域內(nèi)的重大進(jìn)展。例如，合成DNA片段的結(jié)構(gòu)和相互作用的物理和生物化學(xué)研究已導(dǎo)致有關(guān)遺傳過程中分子作用機(jī)理(包括DNA代謝和基因表達(dá)的調(diào)節(jié))方面新的重大發(fā)現(xiàn)。合成多核苷酸通過用作DNA定序的引物，以及在基因克隆過程中作為雜交探測劑、連接子和轉(zhuǎn)接子，從而在遺傳機(jī)制的研究中起了關(guān)鍵性的作用。合成多核苷酸的另一用途是將DNA探查技術(shù)應(yīng)用于對疾病的診斷。此外，合成多核苷酸可用于基因置換療法中，以治療遺傳紊亂，以及用于其他基因組工藝過程，提供對疾病和饑餓的抵抗力。合成多核苷酸通常用于位點定向的體外誘變;研究遺傳調(diào)節(jié)元件內(nèi)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系;以及確定特定的氨基酸取代位置對蛋白質(zhì)功能的影響。后一用途稱為蛋白質(zhì)工程，它不僅有助于理解酶和其他蛋白質(zhì)的作用機(jī)理，而且也有可能設(shè)計功能優(yōu)良的蛋白質(zhì)和藥物，導(dǎo)致醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和工業(yè)的重大進(jìn)展。而且，合成特定順序多肽的獲得，使蛋白質(zhì)化學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)和生物工藝學(xué)產(chǎn)生了同樣驚人的進(jìn)展。
許多遺傳工程項目需要使用大量不同確定順序的多核苷酸，有時在一次實驗中需要幾百種不同的順序。同樣，某些蛋白質(zhì)化學(xué)實驗需要幾百種不同的肽順序。為了確定人類基因組的核苷酸順序(這一項目將立即著手進(jìn)行，并涉及許多實驗室)，將需要大約5千萬不同的多核苷酸引物。近來的努力，連同許多能由私人實驗室從事的其他很好的研究項目，就其目前的費用而言，在經(jīng)濟(jì)上對合成多核苷酸的研究者是不現(xiàn)實的(每個核苷酸殘基為5-20美元)。
限定順序的多核苷酸化學(xué)合成的實現(xiàn)應(yīng)歸應(yīng)于五十年代Michelson和Todd的開創(chuàng)性工作(Michelson，A.M.&Todd，SirA.R.，“NucleotidesPartⅩⅩⅩⅠⅠ.SynthesisofaDithymidineDinucleotideContaininga3′∶5′InternuclestideLinkage，”J.Chem.Soc.1955，pp.2632-2638)，他們研制出一種核苷酸內(nèi)部的5′-3′磷酸二酯鍵合的特種化學(xué)合成法。在以后的20年中，該法得到進(jìn)一步的發(fā)展，并以Khorana及其同事最終完全合成轉(zhuǎn)化RNA的基因而達(dá)到頂峰。(Khorana，H.G.，“TotalSynthesisofaGene，”Science，Vol.203，pp.614-625，(1979)。最近，磷酸二酯法已被磷酸三酯法(Letsinger，R.L.andOgilvie，K.K.，“AConvenientMethodforStepwiseSynthesisofOligothymidylateDerivativesinLarge-ScaleQuantities，”J.Am.Chem.Soc.，Vol.89，pp.4801-4803，(1967);Narong，S.A.，Brousseau，R.，Hsiung，H.M.andMichniewicz，J.J.，“ChemicalSynthesisofDeoxyoligonucleotidesbytheModifiedTriesterMethod，Method，Meth.Enzymol，Vol.65，pp.610-620，(1980))和亞磷酸三酯法(Letsinger，R.L.，F(xiàn)innan，J.L.，Heavener，G.A.andLunsford，W.B.，”PhosphiteCouplingProcedureforGeneratingInternucleotideLinks，“J.Am.Chem.Soc.，Vol.97，pp.3278-3279，(1975);Beaucage，S.L.andCaruthers，M.H.，”DeoxynucleotidePhosphoramidites-ANewClassofKeyIntermediatesForDeoxypolynucleotideSynthesis，”Tet.Lett.，Vol.22，pp.1859-1862，(1981)所取代，后二種方法的優(yōu)點是合成速度較快，副反應(yīng)較少。這二種方法均可按最初設(shè)計的方式，在溶液中進(jìn)行，但近來已修改成多核苷酸的固相合成[Matteucci，M.D.andCaruthers，M.H.，“SynthesisofDeoxyoligonucleotidesonaPolymerSupport，”J.Am.Chem.Soc.，Vol.103，pp.3185-3191，(1981);Sproat，B.S.andBannwarth，W.，“ImprovedSynthesisofOligodeoxynucleotidesOnControlledPoreGlassUsingPhosphotriesterChemistryandaFlowSystem，”Tet.Lett.，Vol.24，pp.5771-5774，(1983)]。在固相合成中，由于生長中的鏈以共價鍵的形式結(jié)合到不溶性載體上，因而具有合成速度較快的優(yōu)點，而且在兩個化學(xué)步驟之間可洗去試劑，避免了在每次添加單體后對多核苷酸產(chǎn)物進(jìn)行提純的需要。而且，固相合成可使過程實現(xiàn)自動化，以致每次加入堿基(通過多級反應(yīng)循環(huán))可在室溫下進(jìn)行，時間約10分鐘。在這些條件下的高縮合效率(通常大于99%)可使之自動合成鏈長大于100的多聚脫氧核苷酸。
用于固相合成多肽的化學(xué)方法通常是基于Merrifield的原始實驗記錄，后者曾被成功地用于合成具有酶活性的124-殘基核糖核酸酶A[Gutte，B.andMerrifield，R.B.，“TheSynthesisofRibonucleaseA，”J.Biol.Chem.，Vol.246，pp.1922-1941，(1971)]。這種方法系采用標(biāo)準(zhǔn)聚苯乙烯-二乙烯基苯載體，叔丁氧基羰基(BoC)的氨基保護(hù)，以及二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)與對稱的酐中間體的活化縮合。該法業(yè)已成功地用于自動肽合成裝置，以及下述的Houghton多級同步合成法中。
業(yè)已設(shè)計了幾種其他的肽合成法。其中最佳的一種方法(Auffret，A.D.andMeade，L.G.，“AlternativeStrategiesinPeptideSynthesis，”SyntheticPeptidesinBiologyandMedicine，Alitalo，K.，Partanen，P.andVaheri，A.(Eds..)，ElsevierSciencePublishers，Amsterdam，1985)系使用聚酰胺-硅藻土復(fù)合載體(此種載體對于連續(xù)流動合成顯現(xiàn)出優(yōu)良的性能)，基甲氧基羰基(Fmoc)的氨基保護(hù)，用活化1-羥基苯三氮唑(1-hydroxybenzatriazole)與五氟苯基酯(PFPE)中間體縮合?；钚怎ブ虚g體的高度穩(wěn)定性使它們比之較不穩(wěn)定的酐中間體能更為方便地用于肽的合成。
JohnSmith[“AutomatedSolidPhaseOligodeoxyribonucleotideSynthesis”，AmericanBiotechnologyLaboratory，pp.15-24(December1983)]和MarrinCaruthers[“GeneSynthesisMachinesDNAChemistryandItsUses”，Science，Vol.230pp.281-85(1985)]的綜述性文章中概括了多核苷酸合成方法(包括對化學(xué)反應(yīng)的描述)的新進(jìn)展。一個最有希望的新進(jìn)展是有關(guān)從花費不多的被保護(hù)的核苷就地產(chǎn)生氨基亞磷酸酯(phosphoramidite)中間體的成本-效果分析法的研究[Barone，A.D.，Tang，J.-Y.andCaruthers，M.H.，“InSituActivationofBis-Dialkylaminophosphines-ANewMethodforSynthesizingDeoxyoligonucleotidesonPolymerSupports，”Nucl.AcidsRes.，Vol.12，pp.4051-4061，(1984);Nielsen，J.，Taagaard，M.，Marigg，J.E.，vanBoom，J.H.andDahl，O.，“Applicationof2-cyanoethylN，N，N′，N′-tetraisopropylphosphorodiamiditeforInSituPreparationofDeoxyribonucleosidePhosphoramiditesandTheirUseinPolymer-SupportedSynthesisofOligodeoxyribonucleotides，”Nucl.AcidsRes.，Vol.14，pp.7391-7403，(1986)]。
另一有利的新進(jìn)展體現(xiàn)在使用脒基來保護(hù)環(huán)外氨基(e.g.，Caruthers，M.H.，McBride，L.J.，Bracco，L.P.andDubendorff，J.W.，“StudiesonNucleotideChemistry15.SynthesisofOligodeoxynucleotidesUsingAmidineProtectedNucleosides，”NucleosidesandNucleotides，Vol.4，pp.95-105，(1985))。用脒保護(hù)的基團(tuán)能穩(wěn)定脫氧腺(嘌呤核)苷殘基，防止其發(fā)生酸催化的脫嘌呤反應(yīng)(這種脫嘌呤反應(yīng)發(fā)生在合成循環(huán)中的脫三苯甲基步驟)，由此可合成更長的多核苷酸。
此外，最近有人報道了在二氧化硅載體上合成RNA聚合物的方法，該法涉及一種改進(jìn)的氨基亞磷酸酯方法[Kierzek，R.，Caruthers，M.H.，Longfellow，C.E.，Swinton，D.，Turner，D.H.andFreier，S.M.，“Polymer-SupportedRNASynthesisanditsApplicationtoTesttheNearest-NeighborModelforDuplexStability，”Biochemistry，Vol.25，pp.7840-7846，(1986)]。
雖然上述這些方法能以中等費用同時合成一種或幾種核苷酸順序，但仍然極需在此領(lǐng)域進(jìn)行技術(shù)開發(fā)，以降低合成費用，并能同時合成大量多核苷酸順序。業(yè)已沿著這一目標(biāo)在方法和裝置方面取得了一些進(jìn)展，從而能多級同時合成多核苷酸或多肽。
Frank等人[“ANewGeneralApproachfortheSimultaneousChemicalSynthesisofLargeNumbersofOligonucleotidesSegmentedSolidSupports”，NucleicAcidResearch，Vol.11，No.13，pp.4365-77(1983)]最近用纖維素濾紙作為固相載體，進(jìn)行多核苷酸的合成。被保護(hù)的核苷通過3′-0-琥珀酸鍵合，以共價鍵的形式連接到濾紙的羥基上，然后借助于前面所用的磷酸三酯法，用疏松的粒狀固相載體材料使之延伸。在上述論文中，作者報道了兩種八聚物的合成，并提出下述方案將濾紙疊成四種不同的反應(yīng)柱，并指定將A、G、C和T殘基加到生長的鏈中，在反應(yīng)循環(huán)之間選分圓盤，由此可同時合成大量不同的多核苷酸順序。作者證明，由該法合成得到的二種八聚物(在大多數(shù)循環(huán)期間存在于同一的反應(yīng)柱內(nèi))具有相當(dāng)?shù)氖章剩鳧NA順序分析表明，所得產(chǎn)物，包括預(yù)期的核苷順序，彼此并未發(fā)生相互沾染。
所推薦的用濾紙法來同時合成許多順序的方案后來由Matthes等人付之實現(xiàn)[“SimultaneousRapidChemicalSynthesisofOverOneHundredPolynucleotidesonaMicroscale”，TheEMBOJournal，Vol.3，No.4，pp.801-05(1984)]。這些作者采用磷酸三酯法(類似于Frank等人所報道的方法)，在二周內(nèi)同時合成一百多種多核苷酸順序。但Matthes等人的方法存在一些局限性。由于濾紙圓盤的低負(fù)載容量，以及它們較差的質(zhì)量傳遞性能(導(dǎo)致試劑不是最佳地進(jìn)入生長鏈中)，因而與標(biāo)準(zhǔn)固相合成法相比，該法各步的耦合效率偏低，僅僅產(chǎn)生非常少量具有有限鏈長度(直至20個鏈節(jié)左右)的所需的多核苷酸。所得的產(chǎn)物嚴(yán)重地被較短的失效順序污染，在使用前必須用耗費時間的方法提純。然而，這一方法顯現(xiàn)了以較低費用產(chǎn)生大量順序的可能性。顯然，許多實驗室已對該法進(jìn)行了嘗試，但看來只有很少的實驗室已能用這一技術(shù)獲得有用的產(chǎn)物。
一份最新的報告[Bannwarth，W.andLaiza，P.，“ASystemfortheSimultaneousChemicalSynthesisofDifferentDNAFragmentsonSolidSupport，”DNA，Vol.5，pp.413-419，(1986)]中描述了一種能同時合成幾種不同多核苷酸的裝置。該裝置包括一系列可重疊和旋轉(zhuǎn)的金屬盤，每只盤在其徑向?qū)ΨQ位置上具有單獨的一個反應(yīng)室，以及一些旁通狹孔。重疊的金屬盤可進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，以使所有的反應(yīng)室在垂直方向?qū)R，并由旁通孔使它們彼此相連，在這些反應(yīng)室中，需按指定要求將特定的核苷酸殘基加到置于其內(nèi)的，并與載體相結(jié)合的DNA鏈上。因此，通過在每一反應(yīng)循環(huán)后使金屬盤適當(dāng)旋轉(zhuǎn)(由試劑和溶劑通過系統(tǒng)順序流動而產(chǎn)生)，在各重疊的金屬盤中合成了各不相同的DNA順序。與分段的濾紙方法相比，此種裝置的主要優(yōu)點是耦合率較高，這是通過在反應(yīng)室中放置可控微孔玻璃載體而實現(xiàn)的。利用氨基亞磷酸酯的化學(xué)性質(zhì)，產(chǎn)生了最長達(dá)到36殘基的DNA鏈。裝置的另一優(yōu)點是可以實現(xiàn)自動化。但其主要缺點在于同時合成的量較低(至多同時產(chǎn)生12個DNA片段)。
在另一個用于同時合成不同多肽的方法中[Houghten，“GeneralMethodfortheRapidSolid-PhaseSynthesisofLargeNumbersofPeptidesSpecificityofAntigen-AntibodyInteractionoftheLevelofIndividualAminoAcids”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.82，pp.5131-35(August1985)]，Houghten使用了裝有用于肽的標(biāo)準(zhǔn)固相合成的固相載體樹脂的聚丙烯網(wǎng)袋。將一些含有這些樹脂的袋放入一只單獨的帶攪拌的反應(yīng)室內(nèi)，欲加入給定氨基酸的所有肽順序即能同時進(jìn)行耦合反應(yīng)。作者使用這一方法同時合成了不同的13鏈節(jié)的鏈共248種，其收率與標(biāo)準(zhǔn)單肽固相法不相上下。在這一研究工作中，各13鏈節(jié)的肽，除了單個氨基酸替換外，實際上都包含一個與“對照順序”相同的順序。因此，在加入每一種氨基酸時，把絕大多數(shù)含有樹脂的袋放入同一只帶攪拌的反應(yīng)容器中，而僅有那些含有肽(一個獨特的氨基酸將在順序中的這一位置加到此肽中)的樹脂是與大部分物料分開反應(yīng)的。雖然在Houghten的原來工作中合成得到的“不同”肽順序分別由相同的順序組成，僅有單個氨基酸與“對照順序”不同，他提出使用許多只帶有攪拌的反應(yīng)容器，而每一只容器裝有許多盛有樹脂的袋，此種方法能用于同時合成大量完全獨特的肽順序。Houghten的“茶葉袋”方法，包括其用于同時合成120種完全不同的15鏈節(jié)肽的說明，在最近的一篇文章中作了進(jìn)一步描述[Houghtenetal，“SimultaneousMultiplePeptideSynthesisTheRapidPreparationofLargeNumbersofDiscretePeptidesforBiologicalImmunological，andMethodologicalStudies，”Biotechnigues，Vol.4，No.6，pp.525-28(1986)]。
Houghten的“茶葉袋”方法尚有二個困難，以致可能使其難以實現(xiàn)大量核苷酸順序的同時合成?？擅芊獾木郾┚W(wǎng)袋對于目前用于多核苷酸合成的磷酸三酯法和亞磷酸三酯法的應(yīng)用尚不具備足夠的化學(xué)惰性性質(zhì)。由惰性材料(如聚四氟乙烯)構(gòu)成的含有載體的多孔袋，如果不能加以密封，則難于防止合成過程中袋中固相載體的漏失。更為嚴(yán)重的問題是，在多核苷酸合成的固相方法中，必須在柱的載體層上面留有足夠的空間，這樣從下面泵入溶劑和試劑時，載體就被向上的流動“托起”，產(chǎn)生幾乎是定量的化學(xué)反應(yīng)所需的顆粒內(nèi)必需的質(zhì)量傳遞。但非剛性“茶葉袋”的物理性質(zhì)決定了在溶劑和試劑通過柱的過程中，載體材料不能實現(xiàn)這種必需的“托起”。
因此，鑒于目前這些裝置和方法的不足之處，人們需要一種能快速地同時合成具有不同順序的大量任意種類的生物聚合物，而且收率高，費用低。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于生物聚合化學(xué)合成的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用來同時合成大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的第三個目的在于以很低的成本同時生產(chǎn)大量限定順序的生物聚合物。
本發(fā)明的第4個目的是提供一種適用于同時固相合成任何種類生物聚合物的裝置。
本發(fā)明的第5個目的系在高收率下同時生產(chǎn)大量限定順序的生物聚合物。
本發(fā)明的第6個目的是提供一種用于能同時生產(chǎn)生物聚合物的改進(jìn)型分段裝置。
本發(fā)明的第7個目的是提供一種在較低的試劑和溶劑的需求量下，同時生產(chǎn)大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的第8個目的是提供一種在較短的合成時間內(nèi)同時生產(chǎn)大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置。
本發(fā)明的第9個目的是提供一種同時生產(chǎn)大量生物聚合物的改進(jìn)型裝置，其中許多節(jié)段[以下稱為“片段”(Wafer)]在每次反應(yīng)循環(huán)后彼此易于分離。
本發(fā)明的最后一個目的是提供一種用于生物聚合物化學(xué)合成的改進(jìn)型固相載體節(jié)段(或稱片段)。
因此，為達(dá)到上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明人提供了一種分段的片段合成裝置，用于合成多種限定順序的生物聚合物，該裝置包括(1)溶劑輸送系統(tǒng);
(2)至少一個柱，它與溶劑輸送系統(tǒng)相連，以供溶劑和試劑流動通過該柱;以及
(3)在柱內(nèi)至少有一個片段，在其上發(fā)生聚合反應(yīng)。
在一個較佳的實施例中，合成裝置至少包括4個用以接受4種試劑的柱;以及位于各柱內(nèi)的許多片段，其中每一個片段用以合成一種限定順序的聚合物。根據(jù)用戶的需要，裝置可設(shè)計成自動、半自動或手動形式。
在另一實施例中，該裝置包括許多重疊的片段，這些疊片連結(jié)在一起構(gòu)成一個柱，同時溶劑輸送系統(tǒng)與該柱相連接，以提供流體通過柱的流動。
按照本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明人提供了一種用于合成多核苷酸、多肽和多糖之類生物多聚物的片段，它包括(1)固相載體材料;
(2)持留環(huán)，用以將載體材料保持在由該環(huán)內(nèi)壁所形成的腔室內(nèi);
(3)薄膜或燒結(jié)(frlt)之類的部件，其作用是使流體能流經(jīng)持留環(huán)并進(jìn)入載體材料，并防止載體材料從持留環(huán)中沖出。持留環(huán)最好包括一個密封反應(yīng)內(nèi)室，以容納和持留環(huán)載體材料，持留環(huán)的二端開口。上述多孔流動件是基本上呈惰性的多孔材料，最好設(shè)置在持留環(huán)的每一端，并橫越內(nèi)室，將其密封。另外，片段最好還包括一個惰性固定件，用以使載體材料固定在持留部件上。
固相載體材料宜選自由下列物質(zhì)所組成的這一組中的任一種，這些物質(zhì)是二氧化硅、可控微孔玻璃(CPG)、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚酰胺樹脂、聚酰胺-硅藻土復(fù)合樹脂、大網(wǎng)絡(luò)樹脂、二苯甲基胺樹脂，以及諸如MONOBEADS樹脂(Pharmacia出品)之類的大孔塑料樹脂。多孔載體材料包括一個含有以共價鍵形式連結(jié)的殘基(例如，在多核苷酸合成的情況下是核苷)的衍生物質(zhì)。
多孔膜或燒結(jié)塊最好包括由聚四氟乙烯或其他惰性的碳氟化合物所制成的撓性膜，或由玻璃、不銹鋼或鈦制成的剛性燒結(jié)塊。薄膜或燒結(jié)塊孔隙大小應(yīng)合適，既能容許流體通過片段，又能使多孔載體材料持留在片段上。
在一個較佳的實施例中，所說的片段包括(1)一種固相載體材料;
(2)一個內(nèi)持留環(huán)(內(nèi)環(huán))，它包括一個由環(huán)的內(nèi)壁所形成的內(nèi)反應(yīng)室，用以容納和持留載體材料，持留環(huán)的兩端開開;
(3)一種惰性的多孔薄膜或燒結(jié)塊，它位于并橫越持留環(huán)的各開口端，膜的直徑較之內(nèi)環(huán)大;以及(4)二個外環(huán)，其內(nèi)徑稍大于內(nèi)環(huán)，并圍繞著內(nèi)環(huán)，將膜的邊固定在內(nèi)、外環(huán)之間。最佳的外固定件系包括被設(shè)置在環(huán)繞持留環(huán)的每一端外表面的固定環(huán)。
在另一個較佳實施例中，所說的片段包括(1)一種固相載體材料，(2)一個惰性的圓筒形持留環(huán)，兩端開口;以及(3)一個惰性的環(huán)形燒結(jié)塊，它嵌入靠近持留環(huán)開口處的凹槽內(nèi)。
本發(fā)明的片段結(jié)構(gòu)可供同時生產(chǎn)多種生物多聚物。載體材料的幾何形狀可導(dǎo)致高的偶合效率，則性片段在每次反應(yīng)循環(huán)后易于分選。這種結(jié)構(gòu)方式可同時合成許多不同的順序。通過使用不同容量(衍生密度)的載體材料，并改變各片段的高度，可使合成規(guī)模從每個節(jié)段小于0.1微摩爾至大于10微摩爾。而且，可將不同高度的節(jié)段重疊在各個柱內(nèi)，使之能同時合成規(guī)模相差懸殊的產(chǎn)物。這種方法的靈活性和效率應(yīng)能達(dá)到在費用大為降低的情況下可合成大量的生物聚合物。例如在理想條件下(如有(機(jī)構(gòu))內(nèi)部合成設(shè)施時)，目前的多核苷酸合成費用以每個殘基計，一般為10至15美元。而分段的片段(以下簡稱分片段)裝置的相應(yīng)價格大為減低，可能低至0.50至2.00美元(以每個殘基計)。由于目前價格仍然是應(yīng)用合成生物多聚物的限制因素，分片段裝置的開發(fā)是生物聚合物在科學(xué)研究中應(yīng)用的另一定量飛躍，應(yīng)當(dāng)加快今后生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展。
以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明較佳實施例進(jìn)行描述，借此可清楚地顯現(xiàn)出本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點，以下是附圖簡要說明。
參照附圖

圖1是本發(fā)明之片段的一個實施例的分解透視圖;
圖2是本發(fā)明之片段的一個實施例的其組裝狀態(tài)時的剖面圖;
圖3是本發(fā)明之片段的一個實施例在其組裝狀態(tài)時的透視圖;
圖4是按照本發(fā)明設(shè)計的分片斷合成裝置的柱組裝件的示意圖;
圖5是按照本發(fā)明設(shè)計的分片斷合成裝置的示意圖;
圖6至圖8是本發(fā)明所產(chǎn)生的DNA的紫外光陰影顯像照片;
圖9為本發(fā)明的一個流程圖。
圖中全部數(shù)字標(biāo)記均前后一致，因此不同圖內(nèi)的相同部分具有同一的編號。。
首先參照附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述。在以下所揭示的各個部分，均就多核苷酸的合成而言，對本發(fā)明進(jìn)行討論。正如已指出的那樣，本發(fā)明同樣適用于生產(chǎn)可在固相載體上合成的任何生物聚合物。而且，以下的討論和附圖主要系描述和說明一個具體的片段結(jié)構(gòu)。應(yīng)該明白，這一描述僅用于說明而已，其他的片段結(jié)構(gòu)也可符合要求的。并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
圖1表示裝配前的本發(fā)明之片段10的結(jié)構(gòu)，亦即是其分解示意圖。該片段包含一個外固定件，后者又包括上、下固定環(huán)12和14。內(nèi)持留環(huán)16位于二個相對的固定環(huán)12和14之間，它與薄膜18和20一起構(gòu)成反應(yīng)室。該片段還包括多孔材料或膜18和20，它們各設(shè)置在持留環(huán)16的一端，橫過端口，并被固定在持留環(huán)16與固定環(huán)12和14之間。
持留環(huán)16的外徑略小于固定環(huán)12和14的內(nèi)徑。而多孔薄膜18和20的外徑大于持留環(huán)的外徑。
應(yīng)當(dāng)指出，此外所用的有關(guān)內(nèi)持留環(huán)和固定環(huán)的環(huán)、其結(jié)構(gòu)可包括圓形、長方形、正方形、以及其他幾何變體。重要的設(shè)計準(zhǔn)則在于，這些環(huán)應(yīng)具有一個空心的內(nèi)部空間，以便持留反應(yīng)物組分(參見下文)。
片段10的組裝狀態(tài)示下圖2和圖3。在其組裝時，先將多孔膜20置于下固定環(huán)14上，并使膜的邊沿著環(huán)的整個外周邊伸出環(huán)外。然后將持留環(huán)16置于下膜20上，并推入至下固定環(huán)14內(nèi)。環(huán)12、14和16的直徑系根據(jù)膜的大小而選定，以在環(huán)之間形成流體緊密封。將固相載體材料放入持留環(huán)后，將薄膜18放于環(huán)16上，并將環(huán)12推入就位，再使上膜18、固定環(huán)12和持留環(huán)16按上述同樣方式進(jìn)行密封。除了形成流體緊密封外，這種結(jié)構(gòu)有助于在化學(xué)反應(yīng)期間將膜牢固地保持在合適的位置上。通過使膜的邊緣搭接在持留環(huán)6上，并使薄膜緊固在固定環(huán)12和14與持留環(huán)之間，即可達(dá)到上述目的。
如圖2和圖3所示，組裝后的片段10中，薄膜18和20跨越并伸出內(nèi)持留環(huán)16的邊緣，而膜的邊固定在外固定環(huán)12和14與內(nèi)持留環(huán)16之間。
組裝的片段裝有反應(yīng)物組分22。該反應(yīng)物組分是固相載體，系由殘基(例如核苷)經(jīng)由有機(jī)間隔臂，以共價鍵的形式結(jié)合到固相載體中而制得。聚合物的生長系從殘基或初級堿基開始，這樣就與載體材料表面分開。在用薄膜18和固環(huán)12將片段密封前，將反應(yīng)物組分22放入內(nèi)持留環(huán)16中。由此，持留環(huán)16與薄膜18和20一起形成反應(yīng)物組分22的反應(yīng)室。
如前面所指出的，上述揭示是針對一種具體的片段結(jié)構(gòu)。應(yīng)當(dāng)著重指出，許多片段結(jié)構(gòu)的設(shè)計是可行的，并在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。例如，此種片段可以包括嵌接(snape)或螺紋連結(jié)的結(jié)構(gòu)。具體地說，片段10的另一種實施例可包括剛性的多孔燒結(jié)塊，后者嵌入套環(huán)上、下邊緣附近內(nèi)表面的凹槽內(nèi)。
片段是一種剛性的化學(xué)惰性室，因而不會干擾生物聚合物的合成，亦不會與合成所用的化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)。外固定環(huán)和內(nèi)持留環(huán)可由諸如聚四-氟乙烯和其他氟碳化物(例如KEVLAR和KALREZ)之類的各種惰性材料制成。
片段的尺寸可在很大的范圍內(nèi)變動。對于毫克量級多核苷酸的合成，內(nèi)持留環(huán)的內(nèi)徑宜在約2-10毫米的范圍內(nèi)，高度宜為2-10毫米左右。而對于合成克量級的產(chǎn)物，則內(nèi)徑和高度最好分別為20-100毫米左右。而且，可以增高由重疊的片段所組成的柱，以便同時合成大量不同的多核苷酸鏈。顯然該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將會認(rèn)識到，根據(jù)具體合成反應(yīng)的特性，可使片段較之上述的尺寸大或小些。而且，該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將會認(rèn)識到，柱尺寸的改變?nèi)Q于欲被合成的生物聚合物及所用的固相載體。在肽類的生產(chǎn)中，片段的尺寸一般趨向于上述范圍的上限。
可使試劑流過片段的多孔材料也由化學(xué)惰性的材料制成。例如，推薦的惰性材料包括聚四氟乙烯和其他氟碳化物材料，如KEVLAR、熔接或燒結(jié)玻璃、鈦和不銹鋼燒結(jié)物?？讖娇梢宰儎?，其選定原則是應(yīng)能使足夠流量的試劑和洗滌液通過片段，同時又能將載體材料和正在生長著的生物聚合物鏈保持在片段內(nèi)。若與CPG載體(直徑一般為120-180微米)一起使用時，建議孔徑為50-100微米。多孔材料可設(shè)計成不同的結(jié)構(gòu)，只要能達(dá)到必需的流量和保留作用。正如本文所列舉和描述的，多孔材料可以制成撓性膜、剛性燒結(jié)結(jié)構(gòu)等形狀。
固相載體是生物聚合物鏈形成之處，它們可選自各種已知的載體。推薦用于多核苷酸合成的載體包括聚苯乙烯-二乙烯基苯(DVB)、聚酰胺-硅藻土、二氧化硅、可控微孔玻璃(CPG)、以及MONOBEADS(一種由Pharmacia生產(chǎn)的樹脂)之類的塑料樹脂。由于CPG、二氧化硅和MONOBEADS呈剛性，亦即它們不會膨脹或收縮，因而是最佳的固相載體。推薦用于多肽類合成的載體包括聚苯乙烯和乙烯基苯樹脂、聚酰胺-硅藻土樹脂、二苯甲基胺樹脂、以及大網(wǎng)絡(luò)樹脂。
大孔徑(例如200-2000埃)的載體材料可使試劑易于達(dá)到生長的鏈，并能有效地洗去反應(yīng)物。而且，這類載體有助于聯(lián)成較長的鏈(例如50-200個殘基)，在聚合物之間不存在位阻現(xiàn)象。
裝入片段的載體材料22的量可以變動。在確定所加載體材料的量時，欲考慮的因素包括所需的DNA、RNA、多肽、多糖或其他的生物聚合物，以及流量和固相載體的衍生程度(例如每克載體中單體殘基的微摩爾數(shù))。在片段達(dá)到滿載的2/3至3/4時，可獲得良好的效果，因這一負(fù)載量已將混合和任何可能的膨脹因素估計在內(nèi)。使用孔徑非常大的剛性固相載體，例如孔徑為3000-4000埃的二氧化硅可使載體內(nèi)發(fā)生良好的質(zhì)量傳遞，因而片段能完全充滿衍生載體。
參見圖4，片段組裝后，立即將其放入柱24內(nèi)，試劑和洗滌溶劑通過柱流動，形成一個反應(yīng)循環(huán)。柱24被設(shè)計成可容納許多的片段10。如圖4和圖5所示，輸送系統(tǒng)20可利用諸如氬氣壓力之類的動力，使試劑和洗滌液通過柱24和片段10。流體最好自下而上通過柱，使確定片段中的多孔載體材料混合和分布，借此有利于反應(yīng)的進(jìn)行。一般來說，輸送系統(tǒng)至少與4個平行的柱相連接，這四個柱對應(yīng)于下述4種堿基，即胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和腺嘌呤(A)。若在合成中還使用改性的堿基堿基混合物，則可設(shè)置更多的柱。在每一柱內(nèi)可放入任意數(shù)量的片段，這取決于所需產(chǎn)生的生物聚合物的順序數(shù)量。例如亦可在柱內(nèi)只放一個片段。然而，通常這樣做是昂貴的，且效率低，正如前面已指出的，目前已有的一些設(shè)計則存在此種問題。通常，每一柱內(nèi)的片段數(shù)可在15-25左右。但是也可使用較之更多或更少數(shù)量的片段。當(dāng)然，所述的片段數(shù)必須能使足夠的流量的片。當(dāng)然，所選的片段數(shù)必須能使足夠的流量通過柱子。就這點而言，所選的片段外徑應(yīng)能使之與柱的內(nèi)表面緊貼地吻合，迫使流體流過片段本體，而不是沿著柱的則壁流動。若需更大的流量，則可使用不同的溶劑輸送系統(tǒng)。此外，片段數(shù)顯然是隨著不同的柱高度而改變。
柱24可由任何惰性材料制成，例如玻璃和不銹鋼是兩種較佳的材料。通常，柱包括一個柱活塞28，以便柱內(nèi)可裝入不同數(shù)量和高度的片段。
在另一個實施例中，片段可嵌合在一起，進(jìn)而由其自身形成一個分段的片段柱，不需要一個單獨的支承柱。在該實施例中，輸送系統(tǒng)26直接與分段的片段柱相連接。
如前指出，對于這類合成，需設(shè)置一系列含有片段的柱。每一個柱配備一種試劑，以便添加殘基。例如，在合成DNA時，四個柱將分別加入胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)和腺嘌呤(A)。同樣在RNA合成時，可用添加尿嘧啶(U)所必需的試劑來代替胸腺嘧啶。然而正如前面指出的，所用柱的數(shù)目對本發(fā)明來說并不重要。單個柱將足以滿足要求，但這將增加完成生物聚合物合成所需的時間。對于每一種合成都必須改變試劑，在一個柱內(nèi)所能合成的樣品數(shù)較之4個柱為少。因些，使用多級柱有助于進(jìn)行多種反應(yīng)，并可提高工藝的效率。另一種方法涉及添加二聚物、三聚物等。在這一合成中，增添了另外的柱。例如，對于二聚物，將需使用20個柱，亦即，每一種可被添加的二聚物對應(yīng)于一個柱;而每一種單獨的欲被添加的核苷堿基則又對應(yīng)于一個柱。
再回到DNA方法中，根據(jù)所需加入的第一個堿基，將片段選擇性地設(shè)置在T、G、C或A柱中和某一柱內(nèi)。在通過適當(dāng)量的試劑和化學(xué)物，而將上述的堿基加到多核苷酸鏈中后(構(gòu)成一個反應(yīng)循環(huán))，從柱中取出片段，并進(jìn)行分選，以供下一步的合成，然后將其插入相應(yīng)的柱內(nèi)，重復(fù)合成步驟。重復(fù)這一操作，直至合成所需的多核苷酸順序。因此，在使用不同的柱添加堿基時，每個片段經(jīng)歷了其單獨的合成模式。采用這種方法可同時合成許多不同的多核苷酸。
通過固相合成，本發(fā)明可用來生產(chǎn)任何生物聚合物。倘若這些方法采用本發(fā)明中所用的徑流設(shè)計，則最佳的合成包括用固相方法合成多核苷酸、多肽類和多糖類。對于采用本發(fā)明合成肽的最佳固相方法是前述的Fmoc五氟苯基酯法，使用聚酰胺-硅藻土作為載體。
該法適合用人工操作、半自動或全自動方法來同時合成多種限定順序的生物聚合物。例如可使用由微機(jī)控制的半自動設(shè)備。程序編制容許運行人員控制所有試劑向固相載體的輸送。計算機(jī)也可在每一步向操作人員提供分選片段，并將它們放入正確柱內(nèi)的指令。而在半自動系統(tǒng)中，后面這些任務(wù)則由運行人員完成。當(dāng)然，該技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的熟練人員明白，全自動系統(tǒng)是較佳的系統(tǒng)。在這種系統(tǒng)中，分選片斷，以及其后將它們放入下一個柱內(nèi)的操作均由機(jī)器完成。
分段的片段裝置是專用于能由固相、徑流方法完成的生物聚合物的合成。固相化學(xué)在合成生物聚合物中的優(yōu)點如下由于在每一步縮聚后，產(chǎn)物不必再進(jìn)行提純，因而使逐步添加而形成聚合物的操作大為方便。反應(yīng)物和試劑可方便地洗去。這種固相合成法業(yè)已開發(fā)，使之能適用于生物聚合物合成中所用的一些不同的化學(xué)過程。分段的片段能用于所有這些方法中。
在合成多核苷酸時，固相合成的每一步反應(yīng)效率經(jīng)測定約為95%至大于99%的范圍內(nèi)，每添加一次核苷的循環(huán)時間約為5-30分鐘。當(dāng)所需產(chǎn)物的量在毫克范圍內(nèi)時(對大多數(shù)應(yīng)用來說均已足夠)，這一方法是較佳的。另外，對于合成混合探測用多核苷酸，而其中殘基混合物存在于順序中某些位置時，則固相合成的方法極佳。
固相合成的氨基亞磷酸酯法(參見圖9)最好與本發(fā)明一起使用。
該法的活化中間體是5′-DMT-2′-脫氧核苷-3′-氨基亞磷酸酯。隨著第1個核苷的3′-羥基經(jīng)由烷基長鏈間隔臂，以共價鍵的形式結(jié)合到固相載體上，即開始這一方法。
經(jīng)由稀二氯乙酸處理，從結(jié)合在載體上的核苷的5′-OH中切去酸一穩(wěn)定的二甲氧基三苯甲基(DMTr)。在無水條件下，用四唑使核苷氨基亞磷酸酯(NucleosidePhosphoramidites)(較之結(jié)合在載體上的核苷5′-OH過量10-20倍摩爾)的氮原子質(zhì)子化，從而使其活化，并如第二步所示，發(fā)生縮合反應(yīng)。在完成相繼的各步耦合后，用碘在四氫呋喃和水中的溶液將活性亞磷酸酯轉(zhuǎn)化成較穩(wěn)定的磷酸酯(第4步)。根據(jù)需要，下一步可進(jìn)行封端反應(yīng)(使用乙酸酐二甲基氨基吡啶/二甲基吡啶，第5步)，使前述耦合反應(yīng)中未與活化氨基亞磷酸酯反應(yīng)的5′-羥基基團(tuán)乙酰化，以防止“截頭”和“無義”和(混亂)順序擴(kuò)散。
在每一合成循環(huán)結(jié)束時，A、C和G和環(huán)外胺基仍然處于酰胺保護(hù)狀態(tài)，間核苷酸磷酸酯基團(tuán)處于甲基酯化狀態(tài)，而生長鏈中的3′-OH端仍然是丁二酸與載體鍵合的狀態(tài)。在加入下一個殘基前，重復(fù)脫三苯甲基步驟。亮橙色的DMTr陽離子可通過分光光度法進(jìn)行測定，以計算耦合效率。利用分段的片段法，耦合效率約可達(dá)95%-99%。
在合成結(jié)束時，磷酸鹽化甲基(phosphatemethyl)保護(hù)基被苯硫氧化物離子切開，后者系在三乙胺(第6步)存在下，由苯硫酚生成。若在合成中使用2-氰基乙基氨基亞磷酸酯，則不需要這一步。然后用氨水處理(第7步和第8步)，將對堿不穩(wěn)定性的酰基(保護(hù)A、G和C中的環(huán)外氨基)和與固相載體相結(jié)合的共價鍵切開。若DMTr基仍然存在，則用濃乙酸將該基團(tuán)切開(第9步)。
如前如述，另一種方法(磷酸三酯法)常用于多核苷酸的合成。雖然磷酸三酯法可適用于本發(fā)明，但由于它需要較長的循環(huán)時間，并嚴(yán)格要求無水條件(這在分選片段時是難以達(dá)到的)，因而甚為遜色。
前面提到的在固相多核苷酸合成中的新進(jìn)展，包括在原處氨基亞磷酸酯的產(chǎn)生，脒保護(hù)基和核聚合物的合成，均可用于本發(fā)明。而且，將本發(fā)明應(yīng)用于今后生物聚合物合成化學(xué)的發(fā)展，包括對縮合、保護(hù)反應(yīng)和去保護(hù)反應(yīng)或固相載體的改進(jìn)，這對該技術(shù)領(lǐng)域的熟練人員將是顯而易見的。
使用市場上可買到的系統(tǒng)，可使上述合成方法在分段的片段合成生物聚合物中的應(yīng)用自動化。例如一種具有4個柱和Cruachen型PS200合成器的自動機(jī)可由IBMPC兼容微機(jī)控制。程序編制可使操作人員控制所有試劑向固相載體的輸送。這對于改進(jìn)欲用于分段片段法的反應(yīng)循環(huán)是需要的。而且，通過計算機(jī)記錄片段插入柱的順序，將有助于分選過程。在合成期間，計算機(jī)程序被用于指導(dǎo)各片段放入合適柱內(nèi)的操作。因此，計算機(jī)的打印輸出表明，在每次反應(yīng)循環(huán)后，哪些片段(由數(shù)字標(biāo)記)需放入所指定的柱內(nèi)，所以片段易于分選，而分離的片段被放入用以產(chǎn)生合適的合成反應(yīng)順序的柱內(nèi)。計算機(jī)程序的應(yīng)用減少了差錯，并使合成的可靠性得以提高。另外，亦由計算機(jī)控制的，并與現(xiàn)有合成裝置相連接的自動分選機(jī)的開發(fā)，使之可能用分段片段裝置完全自動合成生物聚合物。
以下將通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實施例1本實施例描述了一般用于在化學(xué)惰性的多孔片段內(nèi)分段合成多核酸的標(biāo)準(zhǔn)方法。該法的具體運用細(xì)節(jié)在給出的以下的實施例中。
A.交互式合成準(zhǔn)備程序的操作在IBM兼容計算機(jī)上，用數(shù)字處理程序輸入欲被合成的DNA順序(5′→3′方向)。順序文件被存儲在非資料性文件中，并以此格式命名。一俟順序輸入后，片段-DNA準(zhǔn)備程序(用Basic編寫)按磁盤機(jī)中的順序文件運行。片段-DNA程序檢查順序文件，并產(chǎn)生一個包括下述信息的硬拷貝(1)包括所有輸入順序，并連同賦于各順序的識別號碼和名稱一覽表;
(2)欲裝載各類衍生CPG載體的編號片段一覽表(定義每一順序中的3′-末端堿基);和(3)用于指導(dǎo)每次反應(yīng)循環(huán)后分選片段的示意圖。
B.試劑制備、片段組件和Cruachem型PS200DNA合成裝置的布置。
使用配有CruachemDNA合成裝置的軟件，已產(chǎn)生一個稱為“片段-CE20”的方法。該法描述如下方法片段-Ce20貯存器1乙腈貯存器2DMAP/四氫呋喃貯存器3乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶貯存器4碘/四氫呋喃/二甲基吡啶/水貯存器5乙腈貯存器6DCA/DCE
方法片段-CE20第一次循環(huán)第1步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝2.15分第2步解封DCA/DCE堿(可變)A持續(xù)時間＝1.30分G持續(xù)時間＝1.30分C持續(xù)時間＝2.30分T持續(xù)時間＝2.30分嘌呤(A/G)持續(xù)時間＝2.30分嘧啶(T/C)持續(xù)時間＝2.30分N(A/C/G/T)持續(xù)時間＝2.30分第3步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝1.30分正常循環(huán)第1步反應(yīng)(固定)持續(xù)時間＝4.30分第2步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝1.30分第3步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時間-0.12分第4步DMAP/THF洗滌(固定)持續(xù)時間＝0.12分第5步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時間＝0.12分第6步DMAP/THF洗滌(固定)
持續(xù)時間＝0.12分第7步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時間＝0.12分第8步DMAP/THF洗滌(固定)第9步乙酸酐/THF/二甲基吡啶洗滌(固定)持續(xù)時間＝0.12分第10步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝0.12分第11步封端/功能化(functionalie)(固定)持續(xù)時間＝1.30分第12步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝1.30分第13步碘/THF/二甲基吡啶/水洗滌(固定)持續(xù)時間＝2.00分第14步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝1.30分第15步封端/功能化(固定)持續(xù)時間＝60.00分第16步解決DCA/DCE基變量A持續(xù)時間＝1.30分G持續(xù)時間＝1.30分C持續(xù)時間＝2.30分T持續(xù)時間＝2.30分嘌呤(A/G)持續(xù)時間＝1.30分嘧啶(T/C)持續(xù)時間＝2.30分N(A/C/G/T)持續(xù)時間＝2.30分第17步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝1.30分最終循環(huán)第1步反應(yīng)(固定)持續(xù)時間＝4.00分第2步乙腈洗滌(固定)持續(xù)時間＝1.30分第3步碘/THF/二甲基吡啶/水洗滌(固定)持續(xù)時間＝2.00分第4步乙腈固定，洗滌持續(xù)時間＝4.00分開始合成前，必須先裝配片段。對于每個片段，應(yīng)先裝配片段底部，這樣就可通過頂部加入衍生的可控微孔玻璃(CPG)載體材料。如片段-DNA準(zhǔn)備程序的打印輸出所示，約加入了18毫克合適的CPG。最后，在反應(yīng)室上放置另一塊多孔聚四氟乙烯布，并用另一個聚四氟乙烯固定環(huán)將其緊固。然后如片段-DNA準(zhǔn)備程序的打印輸出中第2步所示，將片段裝入合適的柱內(nèi)。
運行所需的合成裝置準(zhǔn)備如下使用配有Gruachem合成裝置的運行程序，使貯存器充滿各自的試劑，并對溶劑管路進(jìn)行沖洗。最后配制的試劑是氨基亞磷酸酯和升華的四唑。下表描述了用分段法合成多核苷酸時所用的試劑。
正常循環(huán)片段-CE20方法對于每一個具有10個片段的柱的溶劑/試劑1.乙腈-12.5毫升(設(shè)有溶劑發(fā)送臺，使用11臺貯存槽);
2.65%(單位容積中重量百分比，以下用W/V表示)的二甲基氨基吡啶的四氫呋喃溶液-1.2毫升;
3.乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶-1.6毫升4.碘(0.1M，用水/二甲基吡啶/四氫呋喃(1∶10∶4)配制)-4毫升5.3%(w/v)的二氯乙酸/二氯乙烷，4毫升溶劑流量2毫升/分平均循環(huán)時間18分鐘合成規(guī)模0.5-1微摩爾/片段載體核苷-CPG，一般為15-20毫克/片段單體溶液0.1MCE氨基亞磷酸酯6.67毫升乙腈/0.5克T-氨基亞磷酸酯6.00毫升乙腈/0.5克G-氨基亞磷酸酯5.80毫升乙腈/0.5克A-氨基亞磷酸酯6.00毫升乙腈/0.5克C-氨基亞磷酸酯催化劑-0.5M四唑(20毫升乙腈/0.7克四唑)將0.5毫升單體和0.5毫升催化劑混合后注入柱內(nèi)。
C.多核苷酸的合成使用PS200CruachemDNA合成裝置及常駐操作軟件，片段-CE20法，以及圖5中所描述的分段片段合成裝置，并應(yīng)用前述的2-氰基乙基氨基亞磷酸酯化學(xué)過程，進(jìn)行多核苷酸的分段合成。使裝有片段的柱與合成裝置連接后，僅包括脫三苯甲基和洗滌的第一次循環(huán)按該法所指明的步驟(“第一次循環(huán)”，步驟1至3)進(jìn)行。緊接在第1步前(“正常循環(huán)”)，一俟注入氨基亞磷酸酯，各相繼的循環(huán)開始進(jìn)行。第15步(“正常循環(huán)”)并不是重復(fù)第11步的封端操作，而是一個不同的“暫?！睍r期，在此期間，如片段-DNA準(zhǔn)備程序的打印輸出所示，對片段進(jìn)行分選。在每一正常循環(huán)中，一旦片段的分送完畢，隨即將柱重新連接到合成裝置中，恢復(fù)合成循環(huán)，進(jìn)行脫三苯甲基和洗滌的操作。最終循環(huán)與正常循環(huán)相同，但免去封端和脫三苯甲基反應(yīng)。根據(jù)需要，在所有片段的合成完畢后，將片段重新裝入柱內(nèi)，使之進(jìn)行脫三苯甲基化反應(yīng)，以除去剩留的5′-DMT保護(hù)基團(tuán)。
合成完畢后，將片段內(nèi)的物質(zhì)倒入帶有螺旋塞的管形瓶中，然后按照CruachemPS200操作手冊所提供的指令，用已有技術(shù)的方法，使DNA與載體分開，接著再進(jìn)行解封和提純。
上述方法已進(jìn)行了許多次，結(jié)果在一天內(nèi)同時合成了3至79個不同的DNA順序(合成規(guī)模為0.5-1.0微摩爾)，其長度在15至25個殘基范圍內(nèi)。每一步的耦合效率一般為95%左右，而DNA順序業(yè)已由Maxam-Gilbert定序法得以證實。
實施例2三種多核苷酸試樣的同時合成為了評價分段片段合成裝置對于生物聚合物合成的效能，用圖1-5所示的設(shè)備，以及實施例1中所述的通用方法，同時合成三種15鏈節(jié)(詳見下文)。DNA分子試樣的核苷酸順序是1.5′-GAGCCATCAAGCCAG-3′2.5′-GCTGCAGAGAGGCCA-3′3.5′-GAGGTGTTGGAGCTG-3′合成過程的詳細(xì)情況陳述如下試劑來源Cruachem合成規(guī)模和片段尺寸每一片段(外徑10毫米，高度4毫米)包括10毫克的核苷-CPG(約0.6微摩爾)，系由下述尺寸的部件組裝而成(參見圖1至圖3)多孔聚四氟乙烯布，直徑為12毫米;內(nèi)持留環(huán)，內(nèi)徑和高度分別為4毫米;外固定環(huán)，外徑10毫米，高度2毫米;內(nèi)容積為0.050毫升。
反應(yīng)循環(huán)和試劑/溶劑的使用將CruachemPS200合成裝置說明書中譯述的有關(guān)已有技術(shù)操作的標(biāo)準(zhǔn)“CE-氨基亞磷酸酯”實驗方法(protocal)和反應(yīng)循環(huán)用于本實驗中。
使反應(yīng)循環(huán)中已確定的步驟(第1步的縮聚和第11步的封端)進(jìn)行一段時間，持續(xù)時間的長短與實施例1的“片段-CE20”法中所給出的時間相同(分別為4.0分和1.5分)。將0.1毫升的0.1MCE-氨基亞磷酸酯和0.1毫升的0.5M四唑(均在無水乙腈中)在注射器中混合后，注入各柱中，由此開始反應(yīng)循環(huán)的第一步。反應(yīng)循環(huán)中其余的“流水線”步驟進(jìn)行(2毫升/分)的持續(xù)時間為實施例1的“片段-CE20”法中“正常循環(huán)”所規(guī)定的時間的一半。就在分選步驟15之前，用氬氣將柱簡單地沖洗一下。平均循環(huán)時間為11分鐘。每個“片段”在每次循環(huán)中消耗的試劑量，連同每次加堿基的大致費用(根據(jù)核苷-CPG、試劑和溶劑的產(chǎn)品目錄價格估算)如下3.7毫升乙腈;
0.4毫升6.5%的二甲基氨基吡啶的四氫呋喃溶液;
0.5毫升乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶;
1.2毫升碘(0.1M濃度，以水/二甲基吡啶/四氫呋喃的配比為1∶10∶4配制而成);
1.2毫升的6.3%二氯乙酸/二氯乙烷;
0.06毫升的0.5M四唑的乙腈溶液;
0.06毫升的M2-氰基乙基氨基亞磷酸酯在乙腈中的溶液。
每次加堿基的費用為1.98美元，若用CruachemPS200合成裝置，按標(biāo)準(zhǔn)(已有技術(shù))方式運行而進(jìn)行合成，則相應(yīng)的費用達(dá)5.42美元。
合成后的解除保護(hù)、DNA提純和分析最后脫三苯甲基的步驟系在柱上進(jìn)行(如同“正常循環(huán)”的第16步)。將片段內(nèi)物質(zhì)注入1.5毫升eppendorf管形瓶中后，加入1毫升新配制的濃氫氧化銨溶液，然后將瓶子封蓋，并進(jìn)行混合。在室溫下保持20分鐘(在此期間，多核苷酸與CPG發(fā)生分離)后，將瓶內(nèi)液體連同所加的1毫升濃氫氧化銨一起轉(zhuǎn)移到一只帶有螺旋塞的玻璃管形瓶(外徑15毫米，高度45毫米)中，用聚四氟乙烯襯里的塞子緊緊密封后，在55℃溫度下培養(yǎng)6-15小時(解除C、A和G中的環(huán)外氨基保護(hù))。使用Savant Speed Vac濃縮器，通過抽真空將氨除去(用水噴射泵抽1小時，然后在高真空下放置過夜)。將干燥后的DNA溶于少量水中，然后用電泳法(20%聚丙烯酰胺，7M脲)提純，由20A260單位粗反應(yīng)產(chǎn)物所產(chǎn)生的“紫外先陰影”凝膠顯影示于圖6。
在每一凝膠中最高的色帶代表所需的全長產(chǎn)物，較低處的暗淡色帶代表“失效”順序，而底部深色的色帶代表溴酚蘭標(biāo)記染料。這些凝膠與在自動應(yīng)用生物系統(tǒng)380型合成裝置(AppliedBiosystemModel380ASynthesizer)(采用已有技術(shù)的氨基亞磷酸酯法)上所產(chǎn)生的同樣DNA產(chǎn)物而得到的凝膠類同，在此過程中所測得的耦合效率(采用標(biāo)準(zhǔn)三苯甲基釋放分析法)為98-99%。因此，用分段的片段合成裝置來合成這三種十五鏈節(jié)的平均耦合效率經(jīng)估算約為98-99%。
評注這些DNA產(chǎn)物成功地達(dá)到了5′-磷酸化(用T4多核苷酸激酶)，并可采用已有技術(shù)的方法，使之用作雜交探子。產(chǎn)物的高產(chǎn)率、高質(zhì)量，以及成本的降低均證明了本發(fā)明在同時合成多核苷酸方面的效能。而且，一個重要的發(fā)現(xiàn)是，在每次反應(yīng)循環(huán)后所進(jìn)行的人工分選過程不會給合成帶來不利影響。
實施例362種生物聚合物的同時合成為了確定本發(fā)明對于同時合成大量生物聚合物方面的效用，本發(fā)明人用圖1至5中所示的設(shè)備，及實施例1所述的通用方法合成了62種不同的DNA十九鏈節(jié)聚合物(以下將作詳細(xì)描述)。DNA分子試樣的核苷酸順序為1.5'-GAAAGGTTAGATTCCTCAC-3'2.5'-AAGAAAGGTCAAATTCCTC-3'3.5'-TGGTGGAAGCAAGGTTAAA-3'4.5'-GCTTGGTGGCAGAAAGGTT-3'5.5'-GAATGGTTTCTAACTGCTT-3'6.5'-TTTTCAAAGCGAATGGTTT-3'7.5'-GGTTTAATGTCCTGTTTTT-3'8.5'-GGCGTTTTCATCAGCGGTT-3'9.5'-CCACCCGGCCTTTTCTTCA-3'10.5'-GACGGCGCGTCACCCGGCC-3'11.5'-GTTGACGGCTCGCCACCCG-3'12.5'-TCTTCCAGTTCCTCTTCCG-3'13.5'-AGTTCTTCCCGTACCTCTT-3'14.5'-CCAGACCACCATACTCCAG-3'15.5'-GATTTCAGCATCGCCAGAC-3'16.5'-AGCGGCAGCATGTCGGTGT-3'17.5'-TGCACACGCTCGGTTTTCG-3'18.5'-TATGCACACCCCCGGTTTT-3'19.5'-AAGAGGTATCCACACGCCC-3'20.5'-GGTGATAAGCGGTATGCAC-3'
21.5'-CAACGTCCCCTTGCAGTTA-3'22.5'-ATAAACGTCTCGTTGCAGT-3'23.5'-ACGATAAACCTCCCGTTGC-3'24.5'-TTTGCAGGTCAGGATCGGT-3'25.5'-ATCTTTTGCCGGTTAGGAT-3'26.5'-CGCACCGGACTGTTTTGCA-3'27.5'-TCGTTACGCTCCGGAATGT-3'28.5'-CTTCGTTACCCACCGGAAT-3'29.5'-TACGACGACGTTCTTCGTT-3'30.5'-ACGCCTGGCCGATACGACG-3'31.5'-GCAATAAACTCCTGGCGGA-3'32.5'-GGCGCAATAGACGCCTGGC-3'33.5'-TCCTCTGGCTCAATAAACG-3'34. 5'-CAATCTGCGCGTAG
CCGC-3'35.5'-ATAATGCGCCGTTCAATCT-3'36.5'-CCATAATGCCCAGTTCAAT-3'37.5'-GAAAGATGCTCCATAATGC-3'38.5'-GAAAGATGCTCCATAATGC-3'39.5'-GCGAAAGATCCGCCATAAT-3'40.5'-CGCTACGGCCTTGCTCGCT-3'41.5'-ATCGCTTTCTCGCTACGGC-3'42.5'-TGATCGCTTCCGCGCTACG-3'43.5'-AAATCAGACGAAAGTTGAT-3'44.5'-TCATGCCATCAATCAGACC-3'45.5'-CACTCATGCGATAAATCAG-3'46.5'-GAGCACGGGCGCGTTCCAT-3'47.5'-TTCGCCTGATCACGGGTGC-3'48.5'-TGCTCTTTCTCCTGAGCAC-3'49.5'-CGTCCGTCCCGCGTTTCAA-3'50.5'-GACGGCGTCTGTCCAGCGT-3'51.5'-ACAGACGGCCTCCGTCCAG-3'52.5'-GATACAGACCGCGTCCGTC-3'53.5'-TTAATGGCTTCACGTTCAG-3'54.5'-GCGTTAATGTCTGCACGTT-3'55.5'-TTGGCGCGTCAATGGCTGC-3'
56.5'-CGGTTCCCTCCATTGGCGC-3'57.5'-ATGTCGGCGTCGGTTCCCT-3'58.5'-CGTTTGATACTGTCGGCGG-3'59.5'-TCGCCCGTTCGATAATGTC-3'60.5'-TCAACGGCACTCATCGCCC-3'61.5'-TCATCGTGTTCCTGCATGA-3'62.5'-GTTCATCGTCTACCTGCAT-3'詳細(xì)的合成細(xì)節(jié)如下試劑來源Cruachem;
合成規(guī)模和片段尺寸如實施例2所述，將18毫克衍生CPG(約0.6微摩爾)放入各片段中，片段的尺寸為外徑10毫米，高度4毫米。
反應(yīng)循環(huán)用“片段-CE20”法進(jìn)行合成(反應(yīng)循環(huán)如實施例1所示)。將由0.5毫升的0.5M四唑和0.5毫升的0.1M2-氰基乙基氨基亞磷酸酯所組成的混合物自下向上注入片段柱內(nèi)，以啟動第一步。平均反應(yīng)循環(huán)的持續(xù)時間為18分鐘。分選(第15步)所需的平均時間為12分鐘。
每次反應(yīng)循環(huán)的試劑和溶劑的用量0.8毫升乙腈;
0.08毫升的6.5%二甲基氨基吡啶的四氫呋喃溶液;
0.10毫升乙酸酐/四氫呋喃/二甲基吡啶;
0.26毫升碘(0.1M，用水/二甲基吡啶/四氫呋喃以1∶10∶4的比例配置);
0.26毫升的6.3%二氯乙酸/二氯乙烷;
0.03毫升的0.5M四唑的乙腈溶液;
0.03毫升的0.1M2-氰基乙基氨基亞磷酸酯的乙腈溶液。
每次加堿基費用0.65美元。這一數(shù)值僅是用CruachemPS200合成裝置，或用全自動應(yīng)用生物系統(tǒng)380A型設(shè)備，并按標(biāo)準(zhǔn)(已有技術(shù))方法來合成這些同樣的多核苷酸的合成費用的八分之一。
合成62種多核苷酸所需的全部時間合成在一天內(nèi)完成，共持續(xù)12小時。而用3-柱全自動運用生物系統(tǒng)380A型合成裝置，每天每個柱進(jìn)行二次合成，則產(chǎn)生同樣數(shù)量的多核苷酸需要10天。
合成后解除保護(hù)，DNA提純和分析所用的方法與實施例2所述的相同。圖7和圖8中所示的“紫外光陰影”凝膠代表用本實驗中生成的20A260單位的粗反應(yīng)產(chǎn)物所得的相應(yīng)凝膠圖。
根據(jù)紫外光陰影凝膠分析和提純后DNA產(chǎn)物的定量測定結(jié)果，在這一多級同時合成期間的平均耦合效率估計為92-98%。
評注提純后的多核苷酸在已有技術(shù)的方法中用于寡核苷酸-定向誘變。在本實驗中，DNA產(chǎn)物成功地進(jìn)行了5′-磷酸化(用T4多核苷酸激酶)，對合(annealed)成DNA模板，并用DNA聚合酶延伸。由此產(chǎn)生了高質(zhì)量的DNA產(chǎn)物，與已有技術(shù)的方法相比，該法收率高，費用大幅度降低，而且所需的時間也大大減少。
因此，本發(fā)明的片段可供多種限定順序的生物聚合物的合成。載體材料的幾何形狀導(dǎo)致高耦合效率，而剛性片段有助于每次反應(yīng)循環(huán)后的分選。本發(fā)明最大的優(yōu)點體現(xiàn)在由之所須用的合成費用降低，以及合成大量生物聚合物所需的時間減少。由分段片段法所產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)和省時的優(yōu)點應(yīng)當(dāng)提高對生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中商品和燃料今后發(fā)展的需求。
因此，本發(fā)明很適宜實現(xiàn)這些目的，達(dá)到這些目標(biāo)和上述提到的，及內(nèi)中固有的優(yōu)點。雖然，為了揭示起見，業(yè)已給出本發(fā)明目前最佳的實施例，但是仍可對零部件的結(jié)構(gòu)和配置作出許多變換，而這些變換將容易地顯現(xiàn)在該技術(shù)領(lǐng)域熟練人員的面前，并在本發(fā)明的精神和所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于合成生物聚合物的組合式化學(xué)惰性片段，它適合于多級對接重疊，在重疊狀態(tài)下，所說的各片段具有單獨的上多孔件和下多孔件，其特征在于它包括(1)一種能與生物聚合物殘基相結(jié)合的固相截體材料；(2)一個具有內(nèi)、外壁的持留環(huán)，用來使所說載體材料保持在由內(nèi)壁形成的室內(nèi)，該室與所說持留環(huán)的軸心在同一直線上；(3)上多孔件和下多孔件，分別設(shè)置在所說持留環(huán)的每一端，其中所說的多孔件可使流體流經(jīng)所說的持留環(huán)到達(dá)所說的載體材料，并防止所說的載體材料沖出所說的持留環(huán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說的持留環(huán)包括一個內(nèi)封閉反應(yīng)室，用以容納和持留所說的載體材料，而所說的持留環(huán)在兩端開口。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的片段，其特征在于所說的多孔流通件包括設(shè)置在所說持留環(huán)每一端的獨立部件，并穿越過所說的開口端，以密封所說的室。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于它還包括固定件，用以使所說的多孔流通件固定在所說的持留環(huán)上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的片段，其特征在于所說的固定件是化學(xué)惰性的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說的持留環(huán)是化學(xué)惰性的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說的固相載體材料系選自由下述物質(zhì)所組成的這一組中的任一種，這些物質(zhì)是二氧化硅、可控微孔玻璃、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚酰胺-硅藻土、苯甲基連接的聚苯乙烯樹脂、間隔基團(tuán)連接的苯乙烯樹脂、聚酰胺樹脂和大網(wǎng)絡(luò)樹脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的片段，其特征在于所說固相載體材料包括可控微孔玻璃。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說的固相載體材料包括一種與之以共價鍵形式結(jié)合的殘基的衍生材料。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說的多孔流通件包括氟碳化物材料、熔接或燒結(jié)玻璃、鈦或不銹鋼燒結(jié)物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說流通件的孔隙大小應(yīng)合適，既能使流體流動通過片段，又能將固相載體材料保留在片段中。
12.一種用于合成生物聚合物的組合式化學(xué)惰性片段，它適合于多級對接重疊，在重疊狀態(tài)下，所說各片段具有單獨的上多孔件和下多孔件，其特征在于它包括(1)一種能與生物聚合物殘基相結(jié)合的固相載體材料;(2)一個具有內(nèi)、外壁的持留環(huán)，它包括由所說環(huán)的內(nèi)壁形成的內(nèi)反應(yīng)室，并沿著相同的軸向延伸，以容納和持留所說的載體材料，所說的持留環(huán)的兩端開口;(3)惰性多孔膜，設(shè)置在所說的內(nèi)持留環(huán)每一開口處，并穿越過該開口端，所說膜的外徑大于所說內(nèi)持留環(huán)的最外直徑，以致所說的膜能延伸出所說的外壁;和(4)二個套筒狀外環(huán)，其內(nèi)徑略大于所說內(nèi)環(huán)與所說膜的厚度之和，以使所說膜的邊固定在所說的內(nèi)持留環(huán)和所說的套筒狀外環(huán)之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求3所述的片段，其特征在于所說的多孔流通件與所說的持留環(huán)緊壓密接。
14.一種用于合成多種限定順序生物聚合物的分段片段合成裝置，它包括(1)一個溶劑輸送系統(tǒng);(2)至少一個與所說溶劑輸送系統(tǒng)相連接的柱，以供溶劑和試劑流動通過所說的柱;和(3)至少一個如權(quán)利要求1所述的片段，該片段設(shè)置在所說的產(chǎn)生聚合物合成反應(yīng)的柱內(nèi)。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的合成裝置，其特征在于它至少包括四個柱，以接受四種試劑，在每一柱內(nèi)設(shè)置多個片段，其中所說的各片段系供合成限定順序的生物聚合物之用。
16.一種用于合成多種限定順序生物聚合物的分段片段合成裝置，其特征在于它包括(1)一個溶劑輸送系統(tǒng);(2)如權(quán)利要求1所述的多個重疊片段，所說的每一個片段包括一種生物聚合物合成材料，并與相鄰的片段相連接，由此形成一個柱，其中所說的每個片段與相鄰的片段直接對接，而且所說的溶劑輸送系統(tǒng)與所說的柱相接，以使流體流過所說的柱。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的片段，其特征在于所說的多孔件包括所說的固相載體材料。
全文摘要
一種用于合成生物聚合物的片段，它包括(1)固相載體材料，(2)一個反應(yīng)室，它用于容納和持留載體材料，以及(3)至少一種惰性多孔材料，以使流體流動通過片段。本發(fā)明也涉及一種分段片段合成裝置，該裝置至少設(shè)有一個(最好是許多個)片段，以供同時合成多種限定順序的生物聚合物。
文檔編號C07KGK1039250SQ88104418
公開日1990年1月31日 申請日期1988年7月14日 優(yōu)先權(quán)日1987年1月6日
發(fā)明者克內(nèi)夫·洛倫·貝蒂, 詹姆斯·達(dá)勒·弗羅斯特Ⅲ 申請人:貝勒醫(yī)學(xué)院