專利名稱：培育重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的新方法，更確切地說，是涉及培育適合于能選擇性地獲得在末端沒有蛋氨酸殘基(下文稱為“Met”)的一種有價值多肽的這類重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的新方法。該蛋氨酸殘基是對應(yīng)于一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子。該方法是通過在培養(yǎng)基中，控制所用的溶解氧含量而實(shí)現(xiàn)的。
近年來，在生物化學(xué)領(lǐng)域中，尤其是在基因重組技術(shù)方面已取得了顯著的進(jìn)展，為制備大量具有生理活性的物質(zhì)，例如，在過去僅能少量得到的淋巴細(xì)胞活素，就已開拓出多種基因工程技術(shù)。
以上這些技術(shù)包括的一種方法是通過把多肽基因引入大腸桿菌(E.coli)載體并使該大腸桿菌細(xì)胞通過復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯表達(dá)該多肽，以大量生產(chǎn)所想要的有價值的多肽。已知這種方法在目前是最具代表性和最具優(yōu)越性的方法。
用這種基因工程技術(shù)制備有價值多肽時，無論宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞抑或是原核細(xì)胞，由于多肽的轉(zhuǎn)譯都是在對應(yīng)于蛋氨酸的起始密碼子(ATG)部位起始的，所制得的該多肽的氨基末端(N-末端)是蛋氨酸。已知由生物細(xì)胞天然產(chǎn)生這種多肽時，其氨基末端的蛋氨酸是被宿主細(xì)胞內(nèi)的氨基肽酶或類似酶切掉的(J.D.Watson，MolecularBiologyoftheGene(I)，3rdEdition，translatedbyKin-ichiroMiuraetal.，p.375(1977))。
然而，當(dāng)采用帶有一種引入的外源肽〔諸如干擾素-α(IFN-α)、生長激素(GH)或白細(xì)胞間素-2(IL-2)〕的載體所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞時，尤其是探索培育這種細(xì)胞來大量制備有價值多肽時，宿主細(xì)胞內(nèi)所存在的酶不能完全顯示其活性，結(jié)果產(chǎn)生出大量仍保留有N-末端為蛋氨酸的多肽(seeNature，293，408(1981)，etc)。已知帶有N-末端為蛋氨酸的多肽(例如，IL-1α和IL-1β)，其生物活性低于N-末端沒有蛋氨酸的天然多肽，而N-末端沒有蛋氨酸的多肽，也許因具有抗原性之故，是不能天然產(chǎn)生的。因此，該多肽用作藥物時，很可能要受到各種限制。
最近，有人提出使蛋氨酸氨基肽酶〔A.BEN-BASSATetal.，J.Bact.，169，751-757(1987);C.G.Milleretal.，P.N.A.S.，84，2718(1987)〕，氨基肽酶M〔S.Nakagawaetal.，Bio/Technol.，5，824(1987)〕或類似酶對帶有N-末端為蛋氨酸的多肽起反應(yīng)以切去蛋氨酸。盡管如此，這種方法僅對具有特定順序的多肽適用而不適用于其它各種各樣的類似肽，而且所用的酶價格昂貴，因此，這種方法實(shí)際應(yīng)用時，仍需繼續(xù)加以改進(jìn)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種切去N-末端蛋氨酸的方法，不管哪一種多肽，該方法適用于各種有價值的多肽。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種切去N-末端蛋氨酸的方法，該方法具有容易實(shí)施，適于工業(yè)生產(chǎn)以及滿意的經(jīng)濟(jì)效益等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明提供了一種培育重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培育用帶有其中引入所想要的多肽基因的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的一種宿主細(xì)胞，包括在培養(yǎng)基中限定使用不高于約20%飽和濃度的溶解氧的含量，以獲得從多肽中切去了對應(yīng)于該表達(dá)蛋白質(zhì)中起始密碼子的蛋氨酸的多肽。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，我們已進(jìn)行了深入的研究，我們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中培育重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞時，想要的N-末端沒有蛋氨酸的多肽的比例取決于培養(yǎng)基中溶解氧的含量，還發(fā)現(xiàn)通過適當(dāng)?shù)乜刂迫芙庋醯暮靠蓮谋举|(zhì)上有選擇性地獲得想要的沒有蛋氨酸的多肽，根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，我們完成了本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，關(guān)于這類多肽的制備，可通過簡單的方法，即將一種由帶有引入了多肽的基因的一種細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，在一含有特定的溶解氧含量的適宜培養(yǎng)基中進(jìn)行培育，不管采用何種多肽，均可從本質(zhì)上、有選擇性地制得想要的N-末端沒有蛋氨酸的多肽。因此，本發(fā)明的方法適宜于工業(yè)生產(chǎn)，且從經(jīng)濟(jì)效益而言，具有無需采用任何昂貴的酶即可實(shí)施的優(yōu)點(diǎn)。
用本發(fā)明方法制備的有價值多肽并不專門限于上文所說明的那一種，對具有已知氨基酸順序或經(jīng)已知DNA順序編碼的多種多肽也適用。這類多肽的例子有白細(xì)胞間素-1(IL-1)、白細(xì)胞間素-2(IL-2)、白細(xì)胞間素-3(IL-3)、白細(xì)胞間素-4(IL-4)、白細(xì)胞間素-5(IL-5)、白細(xì)胞間素-6(IL-6)、集落刺激因子(M-CSF、GM-CSF、G-CSF等)、腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴細(xì)胞素素(LT)和類似的淋巴細(xì)胞活素等。
有價值的宿主細(xì)胞為用于該細(xì)胞質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)，即其中所用的載體為鍵連有想要的多肽基因的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中已知的各種細(xì)胞和即將在下面列出的轉(zhuǎn)譯起始密碼子。這類宿主細(xì)胞的例子有大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、肺炎雙球菌(Diplococcuspneumoniae)、酵母、放線菌等。
以上這些宿主細(xì)胞可用已知方法轉(zhuǎn)化，用于制備轉(zhuǎn)化株的表達(dá)載體、編碼構(gòu)成該載體的想要的多肽基因、各種表達(dá)該基因的調(diào)節(jié)子如啟動子、編碼結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的核糖體的順序、摻入該基因的起點(diǎn)載體等也是已知的。此外，采用有關(guān)基因重組技術(shù)中的已知方法也可容易地制得上述各種物質(zhì)。
本發(fā)明方法用于表達(dá)由大腸桿菌轉(zhuǎn)化的IL-1α和IL-1β及其衍生物是特別方便和有效的。
本發(fā)明關(guān)于用于由大腸桿菌進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的IL-1系統(tǒng)，下面將會更詳細(xì)地加以說明，其它操作步驟可基本上相似。
本方法所用的IL-1α或IL-1β基因，可按照已知的天然IL-1α或IL-1β的氨基酸順序，采用例如亞磷酸三酯法(Nature，310105(1984))或類似的核酸化學(xué)合成法，完全地、一次性地合成，或可用含有該基因的細(xì)胞或類似細(xì)胞，用常規(guī)方法，進(jìn)行一次性萃取和分離。此外，IL-1基因已被確定，也是有效的。這類基因的例子就是下面對比文獻(xiàn)中所列出的那些基因。
＊Nishidaetal.，B.B.R.C.，143，345(1987)＊Frutanietal.，NucleicAcidRes.，13，5869(1985)＊EuropeanPatentApplication出版物編號237967＊EuropeanPatentApplication出版物編號237073表達(dá)該基因所用的啟動子可以是諸如λPL，λPR，trp，lacC，tufB，recA和lpp中任何一種已知的啟動子，其中以trp啟動子特別有效。
除了上述文獻(xiàn)中所列出的那些基因合用外，帶有IL-1基因的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體和這類啟動子并且對本發(fā)明是方便合用的還包括已經(jīng)公開的那些載體和啟動子，例如Kikumotoetal.，B.B.R.C.，147，315(1987)。
通過常規(guī)方法可將這些質(zhì)粒引入用作宿主細(xì)胞的大腸桿菌中，借以轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
用于培育所得到的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)基，可以是任何一種綜合培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基等，這些培養(yǎng)基通常用于培養(yǎng)大腸桿菌和產(chǎn)生想要的多肽。可利用的碳源通常包括例如葡萄糖、果糖、乳糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇等?？衫玫牡吹睦佑新然@、硫酸銨、酪蛋白氨基酸、酵母提取液、多胨、肉提取液、細(xì)菌胰蛋白胨、玉米漿等。其他有用的營養(yǎng)素的例子有K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、維生素B1、MgCl2等。具有下列組成的培養(yǎng)基特別適用于培育用帶有trp啟動子的表達(dá)載體的大腸桿菌。
Na2HPO4·12H2O 6g/lKH2PO43g/lNaCl0.5g/lNH4Cl 1g/l細(xì)菌酪蛋白氨基酸10g/l細(xì)菌酵母提取液0.5g/lL-半胱氨酸HCl75mg/lL-脯氨酸75mg/lL-亮氨酸75mg/l用4NNaOH將上述培養(yǎng)基調(diào)至pH7.4，隨后于121℃高壓滅菌30分鐘或于123℃蒸汽加熱滅菌20分鐘。接著，于接種前，立即把分別已滅過菌的下列混合物無菌地加到培養(yǎng)基中。
1M MgSO4·7H2O 2ml/l1M CaCl2·2H2O 0.1ml/l7.5mg/ml硫胺素HCl1ml/l40%葡萄糖18.75ml/l在適于轉(zhuǎn)化株生長的條件下，即通常最好在pH為5.5-8.5，18-40℃條件下，通氣并攪拌培育轉(zhuǎn)化株。
按照本發(fā)明，進(jìn)行上述培育時，要嚴(yán)格掌握培養(yǎng)基中的溶解氧含量，要限定其不高于約飽和濃度的20%，較好為約0-15%，最好為約0-5%。因此，在培育期間，當(dāng)轉(zhuǎn)化株開始表達(dá)該蛋白質(zhì)，即對數(shù)生長期時，尤其在對數(shù)生長期的最后階段，要限制溶解氧濃度。溶解氧濃度例如可通過適當(dāng)?shù)馗淖兺鈼l件，攪拌條件來加以控制。其詳情將在下面實(shí)施例中加以說明。
這樣，即可制得從其中切去了對應(yīng)于該被表達(dá)蛋白質(zhì)中起始密碼子的蛋氨酸的想要的有價值的多肽。
用常規(guī)方法，例如用酶免疫測定法(EIA)可證實(shí)該想要的多肽的產(chǎn)生。
用例如聲處理、SDS緩沖液的Laemmeli方法(Laemmeli，U.K.，Nature，227，680(1970))等常規(guī)方法分離和純化所得到的細(xì)胞可提取該想要的多肽。
本發(fā)明方法能從本質(zhì)上，有選擇性地提供從中切去了蛋氨酸的想要的有價值的多肽。不過，該產(chǎn)品很可能含有有蛋氨酸的多肽，要檢驗(yàn)該產(chǎn)品是否為含有蛋氨酸的多肽，例如可用TSK-SP-5PW(7.5×75mm層析柱，為ToyoSodaMfg。有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行凝膠色譜分析并在280nm處測定其組分的吸光度;或通過丹磺?；饔?、肽順序儀(AppliedBiosystems)等方法來測定N-末端的蛋氨酸含量。
按本發(fā)明方法制備的想要的多肽，可利用其理化性質(zhì)，通過各種常規(guī)方法純化(例如參見“BiologicalDataBookⅡ，”pp.1175-1259，第1版，第1次印刷，1980年6月23日，KabushikiKaishaTokyoKagakudojin出版)。有需要在溫和的條件下，如通過滲透打擊，從宿主中提取多肽，以便保留其高級結(jié)構(gòu)。處理純化的有效方法包括采用常用蛋白質(zhì)沉淀劑、超濾作用、分子篩色譜法(凝膠過濾)、液相色譜法、離心、電泳、親合色譜法，滲析以及上述各方法的結(jié)合使用。
具體地說，上述方法可按如下所述進(jìn)行首先，將從細(xì)胞提取液中所得到的上清液對想要的多肽部分純化，部分純化的處理例如可用諸如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或二甲基甲酰胺(DMF)之類的一種有機(jī)溶劑，或諸如乙酸、高氯酸(PCA)或三氯乙酸(TCA)之類的一種酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑;用諸如硫酸銨、硫酸鈉或磷酸鈉之類的鹽作為鹽析劑和/或用滲析膜、平板膜、空心纖維膜等進(jìn)行超濾。這些處理通常與在常規(guī)條件下所進(jìn)行的方法相同。
接著，將如此所獲得純化的粗產(chǎn)品進(jìn)行凝膠過濾，回收顯示出想要多肽的活性組分。合用的凝膠過濾劑并無特別限制，它包括由葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠、纖維素等組成的凝膠過濾劑。合用的凝膠過濾劑的實(shí)例還有諸如市場上可得到的交聯(lián)葡聚糖G型、交聯(lián)葡聚糖LH型、瓊脂糖凝膠型、瓊脂丙烯型(以上全是瑯瑪西亞產(chǎn)品)、細(xì)纖維(Cellofine)(Chisso公司)凝膠過濾劑P型、凝膠過濾劑A型(A、P型均為Bio-RadLab.產(chǎn)品)、Ultro凝膠-C(LKB產(chǎn)品)、TSK-G型(ToyoSodaMfg.有限公司產(chǎn)品)等。
從顯示出想要多肽活性的組分中，可分離出均一的想要的多肽，例如采用羥基磷灰石柱、DEAE離子交換柱色譜法、CM或SP法，聚焦色譜法、逆相高性能液相色譜法等?；蚱涓鞣椒ㄖY(jié)合，對組分進(jìn)行親合色譜法分析。
用各種已知方法對組分進(jìn)行聚焦色譜法分析時，適用的分析柱例如有PBE94(pharmaciaFineChemicals)等，適用的起始緩沖劑例如有咪鹽酸等，適用的洗脫劑例如有多緩沖液74(PharmaciaFineChemicals)和鹽酸(pH4.0)的混合物等。
例如可用C4Hi-Pore逆相HPLC柱(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室)等進(jìn)行逆相高性能液相色譜法?？捎靡译妗⑷宜?TFA)、水等、或上述各溶劑的混合物作為洗脫劑。這樣，所分離得到的多肽，其N-末端就沒有蛋氨酸。
如此得到的想要多肽與對應(yīng)于天然產(chǎn)生的多肽具有相同的生理活性，且同樣適用于制備與含有天然產(chǎn)生的這種多肽相同的藥物制劑。
所配制的這些藥物制劑，通常是以藥物組合物的形式，它包括有效量的多肽和適用的藥物載體。合用的藥物載體的例子包括諸如填料、補(bǔ)充劑、結(jié)合劑、濕潤劑、分散劑、表面活性劑之類的賦形劑和稀釋劑。這些藥物載體通常用于制備所想要的藥物劑型。至于藥物組合物的劑型并無特別限制，只要它們含有有效量的按本發(fā)明所制備的多肽，例如可以是片劑、粉劑、粒劑、丸劑等固體劑型，但是，通常適用的組合物劑型為注射用的溶液劑、懸浮劑、乳化劑等。另外，這類組合物也可以是干制品，在臨用前用與外加適合的載體配成液體。上述藥物組合物可用常規(guī)方法制備。
按照所制得藥物組合物的劑型，該組合物可經(jīng)一適合的途徑給藥，例如注射用的組合物可經(jīng)靜脈、肌肉、皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或其它途徑給藥。固體組合物可以口服或腸內(nèi)給藥。組合物中活性成分的含量和組合物的藥用劑量，可按照給藥方法和劑型、使用目的、患者的病情等加以適當(dāng)確定，但不能固定不變。通常需要將約1-80%(重量)的活性成分加到藥物制劑中，得到按活性成分計算，成人每日劑量約為0.1μg-10mg的制劑。制劑不一定一天只給藥一次。每天約藥劑量可分為3-4次。
下面各實(shí)施例將更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
在下面各實(shí)施例中，各物質(zhì)的生理活性可通過下列方法進(jìn)行測定。
(1)IL-1α活性的測定用C3H/HeJ小鼠的胸腺細(xì)胞，采用J.J.Oppenhein等人的方法(J.Immunol.，116，1466(1976))測定，以LAF表示其活性。
(2)GIF活性的測定將稀釋成各種濃度的每份0.1ml試驗(yàn)溶液加入96井微量培養(yǎng)板(Corning有限公司產(chǎn)品)的各個井中。接著，將含有10%FCS(小牛胎血清)和含有人黑素瘤細(xì)胞A375的2×104細(xì)胞/ml的0.1ml Eagle′s MEM懸浮液加入各井中。用一個CO2恒溫箱(Napco有限公司)溫育細(xì)胞4天。溫育后，將0.05ml的0.05%中性紅(Wako Junyaku有限公司)加到各井中，隨后于37℃溫育兩小時。移去上清液后，將0.3ml的磷酸緩沖鹽水慢慢地注入各井進(jìn)行洗滌。移去上洗滌液后，將等量的磷酸一鈉和乙醇的混合物0.1ml注入各井，用一微量混合器攪拌平板幾分鐘。再用一光度計，以在540mμ處的吸光度，測家96井徵量滴定平板(Titer check multiscane，product of Flow Lab.)中進(jìn)入細(xì)胞的染料量，以確定其生長抑制活性。隨后鑒別出對對照組細(xì)胞生長顯示出50%抑制的那個試驗(yàn)組(即該試驗(yàn)組抑制了對照組所測得的1/2吸光度)，把該試驗(yàn)組稀釋倍數(shù)的倒數(shù)視為GIF活性單位。因此，例如GIF活性為10單位時，即使該試驗(yàn)溶液再稀釋10倍，該溶液仍只有抑制50%細(xì)胞生長的活性。
以下各實(shí)施例將參照下面


。
圖1是用按照實(shí)施例2所得到的想要多肽進(jìn)行液相色譜分析的圖示。
實(shí)施例1將人IL-1β細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體ptrpGIF-α(按布達(dá)佩斯條約，已于1985年12月12日，按歐洲專利申請公布號237967公開的大腸桿菌×1776/ptrpGIF-α保藏號為FERMBP-949，保藏于日本工業(yè)科學(xué)和技術(shù)廳的發(fā)酵研究所(FRI)(地址日本1-3，Higashi1-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305，)引入大腸桿菌HB101。由此而得到的轉(zhuǎn)化株也已按布達(dá)佩斯條約，于1988年10月7日保藏于FRI，其保藏號為FERMBP-2089。用一菌環(huán)量的上述細(xì)胞接種到含下列組分的LB培養(yǎng)基(200ml)，于37℃震搖過夜溫育細(xì)胞，得到預(yù)保溫的培養(yǎng)物。
LB培養(yǎng)基的組分胰蛋白胨(Difco)10g/l細(xì)菌酵母提取液(Difco)5g/lNaCl(WakoJunyaku有限公司)10g/l(pH)(7.5)用一特定量的上述預(yù)保溫培養(yǎng)物接種具有下面給定組分的生產(chǎn)培養(yǎng)基，在下面表1所列出的條件下，隨后以一種不同的通氣速率將其接種到一個發(fā)酵罐內(nèi)。
生產(chǎn)培養(yǎng)基的組分Na2HPO4·12H2O 6g/lKH2PO43g/lNaCl0.5g/lNH4Cl 1g/l細(xì)菌酪蛋白氨基酸10g/l細(xì)菌酵母提取液0.5g/lL-半胱氨酸鹽酸75mg/lL-脯氨酸75mg/lL-亮氨酸75mg/l用4NNaOH將上述培養(yǎng)基調(diào)至pH7.4，隨后于120℃高壓滅菌30分鐘或于123℃蒸汽加熱滅菌20分鐘。接著，將分別滅菌過的下列各組分于接種時無菌地加入培養(yǎng)基中。
1M MgSO4·7H2O 2ml/l1M CaCl2·2H2O 0.1ml/l7.5mg/ml硫胺素鹽酸1ml/l40%葡萄糖18.75ml/l表1恒溫箱發(fā)酵罐(MarubishiMSJ-U3)培養(yǎng)基上述生產(chǎn)培養(yǎng)基培養(yǎng)基用量20l培育溫度37℃通氣0.25vvmor0.5vvm攪拌200r.p.m.
pH滅菌后以7.0開始接種量預(yù)保溫的培養(yǎng)物400ml/20升培養(yǎng)基溫育時間8小時培育時，要用一個溶解氧計(Marubishi生物工程有限公司)檢查培養(yǎng)基的溶解氧濃度。當(dāng)以0.25vvm速率進(jìn)行通氣時，對數(shù)生長期間培養(yǎng)基的溶解氧濃度至少為0%飽和度，即約5%-0%的飽和濃度。當(dāng)以0.5vvm速率進(jìn)行通氣時，對數(shù)生長期間培養(yǎng)基的溶解氧濃度至少為20%飽和濃度，即一般于約25%-20%飽和濃度之間變化。
生產(chǎn)培育完全后，將10ml培養(yǎng)物于10，000×g離心10分鐘，隨后收集細(xì)胞，接著將細(xì)胞懸浮于1ml的1M Na2HPO4(Wako Junyaku有限公司產(chǎn)品)，使其于4℃靜置數(shù)小時。之后，懸浮液進(jìn)行聲處理。所得細(xì)胞碎片于10，000×g離心10分鐘，收集上清液。
將500μl 100mM CH3COONa(pH5.5)加入500μl上清液中，于4℃使混合物靜置30分鐘，用0.22-μm過濾器(Millipore產(chǎn)品)濾除所生成的沉淀。濾液進(jìn)行液相色譜法分析(采用Utrochrom GTi(LKB產(chǎn)品);TSK凝膠SP-TPW7.5×75mm柱;吸附緩沖液50mM CH3COONa(pH5.5);用50mM CH3COONa與0.5M NaCl(pH5.5)進(jìn)行梯度洗脫，得Met(+)IL-1β和Met(-)IL-1β兩組分。Met(+)/Met(-)的比例可由所繪制出的圖中所示的面積比計算出，表2示出了該計算結(jié)果。
表2通氣速率Met(+)/Met(-)之比0.25vvm0.0790.5vvm0.385表2表明用較低的通氣速率，其結(jié)果所產(chǎn)生的Met(+)的比例極小，這就使得有可能選擇性地生產(chǎn)Met(-)。
實(shí)施例2由載體ptrpGIF-α-71S所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌HB101(HB101/ptrpGIF-α-71S);保藏號為FERMBP-1296，已按布達(dá)佩斯條約于1987年2月20日保藏在FRI，并以歐洲專利申請公布號237967公開)對IL-1β衍生物進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。該衍生物即為其中第71位半胱氨酸(Cys)被絲氨酸(Ser)取代的人IL-1β，該人IL-1β是采用Hitachi發(fā)酵罐(200升)，于0.5vvm通氣速率下，按與實(shí)施例1相同的方法培育的，隨后，按實(shí)施例1的方法進(jìn)行相同處理和相同的液相色譜法程序。對數(shù)生長期的培養(yǎng)基的溶解氧濃度約為5%-0%飽和濃度。
圖1表示所得到的色譜法分析圖。在該圖中，用(1)表示Met(+)，而用(2)表示Met(-)。
圖1顯示出本發(fā)明方法能選擇性地獲得Met(-)。
權(quán)利要求
1.一種培育重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中，培育一種由細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體中引入了一種多肽基因，培養(yǎng)基中溶解氧的含量限于不高于約20%飽和濃度，以得到從中已切掉對應(yīng)于該表達(dá)多肽中起始密碼子的蛋氨酸的多肽。
2.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中多肽是淋巴細(xì)胞活素。
3.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中多肽是白細(xì)胞間素-1、白細(xì)胞間素-2、白細(xì)胞間素-3、白細(xì)胞間素-4、白細(xì)胞間素-5、白細(xì)胞間素-6、集落刺激因子、腫瘤壞死因子或淋巴細(xì)胞毒素。
4.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)、酵母或放線菌。
5.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
6.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中多肽是白細(xì)胞間素-1，宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
7.權(quán)利要求6所定義的一種方法，其中白細(xì)胞間素-1是白細(xì)胞間素-1α或白細(xì)胞間素-1β。
8.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中多肽基因的啟動子是λPL、λPR、trp、lacC、tufB、recA或lpp。
9.權(quán)利要求8所定義的一種方法，其中多肽基因的啟動子是trp。
10.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中培養(yǎng)基中溶解氧的含量約為0%-5%飽和濃度。
11.權(quán)利要求1所定義的一種方法，其中培養(yǎng)基中溶解氧的含量是在對數(shù)生長期進(jìn)行控制的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育重組蛋白質(zhì)表達(dá)細(xì)胞的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中，培育一種由細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，該細(xì)胞質(zhì)表達(dá)載體中引入了一種多肽基團(tuán)，培養(yǎng)基中溶解氧的含量限于不高于約20％飽和濃度，以得到從中已切掉對應(yīng)于該表達(dá)多肽中起始密碼子的蛋氨酸的多肽。
文檔編號C07K14/52GK1033837SQ8810782
公開日1989年7月12日 申請日期1988年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1987年11月9日
發(fā)明者高野雅明, 鴨頭峻, 平井嘉勝 申請人:大塚制藥株式會社