專利名稱：含有脂和多肽的合成肺表面活性劑的制作方法
本申請為1988年7月1日歸檔的申請?zhí)枮镹O.214，228的后續(xù)申請。
本發(fā)明涉及一系列序列與哺乳動物肺表面活性蛋白序列無關(guān)的多肽的合成，這些多肽與脂混合物的制備，生產(chǎn)它們和用于治療哺乳動物呼吸系統(tǒng)窘迫綜合癥的藥用組合物的方法。
幼兒呼吸系統(tǒng)窘迫綜合癥(RDS)為生命的開始28天中死亡的首要原因。全世界每一百個幼兒中便有一個幼兒患此病，有百分之十死亡。這一綜合癥很少發(fā)生在足月生的幼兒身上，通常發(fā)生在早產(chǎn)或出生時重量太小(小于2公斤)的幼兒身上。成人RDS與幼兒的這一疾病有相似的臨床和病理學(xué)特性，它通過類似的強化護(hù)理的方法得到控制。成人的這一疾病有很多原因，是由各種肺損傷引起的，如擴散感染，胃容物或水的吸入，刺激物和毒素的吸入以及由過量麻醉劑等引起的肺水腫。RDS是與肺表面活性劑缺失或功能低下相關(guān)聯(lián)的，肺表面活性劑覆蓋在發(fā)生氣體交換的肺小泡上。
肺表面活性劑主要由脂(90%)組成，含有少量的各種氨基酸(10%)。主要的脂類型為磷脂，它占全脂的97%。磷脂的80%為磷脂酰膽堿(PC)，10%為磷脂酰甘油(PG)。70～80%的磷脂?；鶄?cè)鏈?zhǔn)秋柡偷?，其?5～90%的鏈長度為16個碳。主要的脂為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)。肺表面活性劑的旦白組分是各種各樣的，而且很難定性。主要的旦白質(zhì)為約32kd，其序列是從其CDNA來預(yù)測的(White等人，Nature，317卷，361～363頁，1985年)，它并已被克隆化(Floros等人，journalofBiologicalChemistry，260卷，495～500頁，1985年)。含量較少的一些低分子量的旦白質(zhì)也被分離得到了，有些序列也已有報導(dǎo)(Warr，等人，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA82，7915～7919，1987年;Glasser等人JournalofBiologicalChemistry，263卷9頁1988年;Tohansson等人，F(xiàn)EBSLetters，232卷，61～64頁，1988年;Glasser等人，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA84，4007，1987年;Revad等人，JouraalofclinicalInvest-(gatcon81，826-833，1988年)。
幼兒RDS一直相當(dāng)成功地用動物肺灌洗液(Smgth等人，Pediatrics，71卷，913～917)，1983;McCord等人，Arch.Dis.Child.63卷，10～16頁，1988年)和由人羊膜液中得到的人肺表面活性劑(Hallman等人，Pediatrics，71卷，473～482頁，1983年;J.pediatr，106卷，963～969頁，1985年;Merritt等人，N.Engl.J.Med.13卷，785～790頁，1986年)來治療。用有機溶劑提取過的母牛肺灌洗液合成脂混合后也是有效的(Fujiwara，等人，Lancet.1卷，55～59頁，1980年;Noach等人，Eur.J.RespirDis.69卷，321～335頁，1986年;KWong等人，Pediatrics，76卷，585～592，1985年Eahoning等人，Pediatrccs，76卷，145～153頁，1985年;Shapiro等人，Pediatrics，76卷，593～599頁，1985年;Gitlin等人，Pediatrccs，79卷，31～37頁，1987年;Raju等人，Lancet，1卷，651～656頁，1987年;Halliday等人，Lancet，1卷，476～478頁，1984年)。然而，純的合成得到的混合物還沒確認(rèn)為有活性的(Morley等人，Lancet，1卷，64～68頁，1981年;十中心研究小組，Br.Med.J.294卷，991～996頁，1987年;Milner等人，Arch.Dis.Child.58卷，458～460頁，1983年;Milner等人，同上，59卷，369～371頁，1983年;Wilkinson等人，Lancet，2卷，287～291頁，1985年)。我們知道用表面活性劑在成人RDS只做了一次臨床研究(Lochman等人，Adv.EXP.Med.Biol.222，511～517頁，1988年)，但文獻(xiàn)中已指出了其潛在的醫(yī)療價值(VanGolde等人，physiol，Rav.68卷，374～455頁)。
肺表面活性劑制劑宜含有全部定義的組份，據(jù)報道應(yīng)用單一的脂混合物成功的情況很有限，因此可看到肺表面活性劑中的旦白質(zhì)成份還是必需。一種方法就是采用基因工程得到的旦白質(zhì)，其序列基于由肺表面活性旦白質(zhì)的CDNA預(yù)示的氨基酸序列。另一種方法，也就是本發(fā)明的主題，是合成一些同定義的脂組份聯(lián)合使用時其物理特性適于表面活性劑功能的多肽，它們的序列與從肺表面活性劑中得到的旦白質(zhì)的序列無關(guān)。
廣義來講，本發(fā)明是有關(guān)合成的肺表面活性劑組份的，具體些講是有關(guān)可有效地用于治療RDS的含有合成多肽和脂類的表面活性組合物。這些合成多肽的序列不同于從哺乳動物肺灌洗液中分離得到的旦白質(zhì)的序列，這些多太可單一使用與脂組成混合物，也可聯(lián)合使用與脂形成混合物。多肽只占表面活性混合物的一小部分。
本發(fā)明中的化學(xué)組份，包括多肽組份以及與脂混合形成可治療呼吸系統(tǒng)窘迫綜合癥的組合物均為新的。本發(fā)明中的組合物可以高純度和采用標(biāo)準(zhǔn)方法而制得，因為它為一個合成組份的限定性的組合物。另外，這些組份不是從動物源得到的，從而降低了被病毒和細(xì)菌感染的可能性。其次，這些組份是生理型的，因而在哺乳動物存在最終消除混合物組分的代謝途徑。再者，沒有引入任何非生理性的分子。在圖中

圖1，為成年大鼠肺核型的對照Ⅰ和Ⅱ的壓力一體積曲線，圖2，為成年大鼠肺核型中顯示例1和2有效的壓力-體積曲線。
合成的肺表面活性劑，包括一個多肽和脂的復(fù)合物，其中多肽通式為式1
其中X為氫、一個C1～5烷基或C2～10?；?
Y和Y′各獨立地代表一個鍵或-(Ser)n-其中n為從1到3的整數(shù);
Q為一羥基，氨基，烷基氨基或烷氧基;
Z為一含8到25個氫基酸的多肽殘基，它由下列序列
-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”-A9”-A10”-A11”-A1”’-A2”’-的低聚物的碎片組成，它們可以從A1～A11代表的氨基酸中任何一個氨基酸殘基開始，其中A1，A1′，A1″，A1″′，A4，A4′，A4″，A8，A8′，和A8″各為獨自由親水性氨基酸中選出的基因，包括谷氨酸，天冬氨酸、丙氨酸、谷酰胺，天冬酰胺，甘氨酸，絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸和同型精氨酸;
A2，A2′，A2″，A2″′，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′和A10″各為獨立從親脂性氨基酸中選出的氨基酸殘基，包括殼氨酸，新亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，纈氨酸，苯丙氨酸，新纈氨酸，異亮氨酸和酪氨酸;
A5，A5′，A5″，A11，A11′和A11″多為獨自從Lys，Ora，Arg，hArg中選出的堿性氨基酸;
A9，A9′，A9″各為由親脂性的中性或堿性氨基酸中選出的殘基，包括Leu，NLe，Met，Ala，Val，Phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，Lys，hArg，Trp，Orn，Trp(For)，或其適于藥用的鹽，其中的脂包括一種或多種與天然肺表面活性劑有關(guān)類型的脂。
這些多肽-脂復(fù)合物及其藥用組合物可有效地用于治療哺乳動物呼吸系統(tǒng)窘迫綜合癥。
本專利說明書中使用的天然存在的氨基酸的縮寫如下Ala或A-丙氨酸
Val或V-纈氨酸Leu或L-亮氨酸Ile或I-異亮氨酸Phe或F-苯丙氨酸Trp或W-色氨酸Met或M-旦氨酸Ser或S-絲氨酸Tyr或Y-酪氨酸Asp或D-天冬氨酸Glu或E-谷氨酸Lys或K-賴氨酸Arg或R-精氨酸Nle-新亮氨酸Orn-鳥氨酸hArg-同型精氨酸Nva-新纈氨酸TrP(For)-N-甲酰基-色氨酸除甘氨酸以外天然存在的氨基酸均有一手性碳原子，除非特別指明，這里所指的光學(xué)活性的氨基酸為L-構(gòu)型的。作為慣側(cè)，這里書寫多肽結(jié)構(gòu)式時，氨基端寫在右邊，羧基端寫在右邊。
式Ⅰ中的某些多肽宜用于治療本發(fā)明中的呼吸系統(tǒng)窘迫綜合癥。式Ⅰ的這些多肽中，A1，A1′，A1″和A1″′至少有一個為Glu;A4，A4′，和A4″中至少有一個為Glu;A8，A8′和A8″中至少有一個為Glu，這樣的多肽較好。式Ⅰ中的另外一些多肽中，A2，A2′，A2″和A2″′中至少一個為Leu;A3，A3′，和A3″至少有一個為Leu;A6，A6′和A6″中至少有一個為Leu;A7，A7′和A7″中至少有一個為Leu;A10，A10′和A10″至少有一個為Leu的多肽較好。另外一些優(yōu)選的多肽其在式Ⅰ中，A5，A5′和A5″至少有一個為Lys;A9，A9′和A9″至少有一個為Phe;A11，A11′和A11″至少有一個為Lys。另外，申請者認(rèn)為式Ⅰ中較好的多肽為其中的Q為一氨基。
本發(fā)明中的多肽可用文獻(xiàn)上已知的很多種方法制得，這些方法包括固相序列法和片段合成，基因克隆以及這些方法的合并應(yīng)用。固相序列法可采用已有的自動方法，如應(yīng)用ABI多肽合成儀。在這一方法中，將α-氨基保護(hù))的氨基酸聯(lián)到樹脂上去，樹脂可采用文獻(xiàn)上通常用于固相合成的樹脂，優(yōu)選的是用0.5%～約3%的二乙稀基苯交聯(lián)的聚苯乙稀，其中的二乙稀基苯被氯甲基化或羥甲基化來提供與開始引入的α-氨基保護(hù)的氨基酸成酯的部位。
羥甲基樹脂的一個例子見BodansgRy等人，Chem.lud.(倫敦)，38卷，1597～98頁，1966年，中所述。氯甲基樹脂可從Bio Rad實驗室，Richmand，加利福尼亞洲，購到，對這一樹脂制法的描述見Stewart等人，《固相多肽合成》，(Freeman及CO出版公司，舊金山，1969年)，第1章，1～6頁，將保護(hù)的氨基酸聯(lián)到樹脂上的方法，見Gisin，
elv Chem.Acta，56卷，1476頁，1973年。很多帶有保護(hù)氨基酸的樹脂也可以買到。作為例子，為制備一個本發(fā)明中羥基端為Thr殘基的多肽，可采用聯(lián)有一個叔丁氧羥基(BOC)保護(hù)的Thr的芐基化和羥甲基化的苯基乙酰胺基甲基(PAM)樹脂，它可以以商品形式買到。
將α-氨基保護(hù)的氨基酸聯(lián)到樹脂上后，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ缬萌宜嵩诙燃淄橹校瑔为毷褂萌宜?，或在二氧六環(huán)中用Hcl除去保護(hù)基。脫保護(hù)在0℃和室溫之間進(jìn)行。也可采用用于除去特定α-氨基保護(hù)基的標(biāo)準(zhǔn)試劑和條件。除去α-氨基的保護(hù)基后，將其它氨基保護(hù)的氨基酸按所需順序進(jìn)行偶聯(lián)。另外，在與樹脂上的氨基酸序列相聯(lián)之前，也可先用液相法將幾個氨基酸偶聯(lián)成肽段。
保護(hù)氨基酸的α-氨基可采用文獻(xiàn)已知的任何保護(hù)基，這些保護(hù)基有(1)?；Ｗo(hù)基，如甲酰基，三氟乙酰基，苯二甲酰基，甲苯磺?；?tosyl)，苯磺?；趸交鶃喕酋；?，三苯甲基亞磺?；?，鄰硝基苯氧乙?；挺?氯代丁?；?(2)芳香氨酯基型保護(hù)基，如芐氧羰基和取代的芐氧羰基如對氯芐氧羰基，對硝基芐氧羰基，對溴芐氧羰基，對甲氧基芐氧羰基，1-(對-聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基和二苯甲基氧羰基;(3)脂肪族氨酯基型保護(hù)基，如叔丁氧羰基(BOC)，二異丙基甲氧羰基，異丙氧羰基，乙氧羰基和稀丙氧羰基;(4)環(huán)烷基氨酯型保護(hù)基，如環(huán)戊烷基氧羰基，金剛烷基氧羰基和環(huán)己基氧羰基;(5)，硫代氨酯型保護(hù)基，如苯基硫羰基;(6)，烷基型保護(hù)基，如三苯甲基(trityl)和芐基;(7)三烷基硅烷基，如三甲基硅烷，優(yōu)選的α-氨基保護(hù)基為叔丁氧羰基。
按照文獻(xiàn)上的方法，選擇一個合適的縮合試劑。當(dāng)所要上的氨基酸為Gln，Asp或Arg時，一個特別合適的縮合試劑為N，N′-二異丙碳二亞胺和1-羥基苯駢三唑、這些試劑的應(yīng)用阻止了腈和內(nèi)酰胺的形成。其它的縮合試劑為(1)碳二亞胺類(如，N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺和N-乙基-N′-(γ-二甲基氨基丙基碳二亞胺);(2)氰酰胺(如，N，N′-二苯基氰酰胺);(3)乙稀酮亞胺;(4)異噁唑鹽類(如，N-乙基-5-苯基異噁唑-3′-磺酸鹽;(5)芳香性的含1～4個氮原子的單環(huán)含氮雜環(huán)酰胺，如咪唑酰胺，吡唑酰胺和1，2，4-三唑酰胺，有用的一些雜環(huán)酰胺為N，N′-羰基二咪唑和N，N′-羰基-二-1，2，4-三唑;(6)烷氧基化的乙炔(如乙氧基乙炔);(7)，與氨基酸的羧基形成混合酸酐的試劑，(如乙基氯代甲酸酯和異丁基氯代甲酸酯)或形成待縮合的氨基酸的對稱酸酐(如(Boc-Arg)2-O)的試劑;(8)，環(huán)上氮原子連有一個羥基的含氮雜環(huán)衍生物(如N-羥基鄰苯二甲酰亞胺，N-羥基琥珀酰亞胺和1-羥基-苯駢三唑)。其他的活化試劑及其在肽合成中的應(yīng)用見Kapoor，J.Pharm Sci，59卷，1～27頁，1970年，申請者偏重于使用對稱酸酐為縮合劑。
各個保護(hù)的氨基酸或肽段與樹脂相連時，一般均過量4倍，縮合反應(yīng)可在二甲基甲酰胺二氯甲烷(1∶1)或單用二甲基甲酰胺，或單用二氯甲烷(較好)中進(jìn)行。當(dāng)縮合反應(yīng)進(jìn)行得不完全時，在去除保護(hù)基前必須重復(fù)縮合步驟，這樣才可將下一個氨基酸連到樹脂上。合成中的任何一個階段均用茚三酮反應(yīng)來檢測，見E.Kaiser等人，Analyt.Biochem，34，595(1970)。
當(dāng)?shù)玫剿璧陌被嵝蛄袝r，將多肽從樹脂上切下來，這可由甲醇解反應(yīng)來完成，如用二甲硫醚，對甲苯酚和硫代甲苯酚在稀氫氟酸水溶液中處理連有多肽的樹脂而完成。
象文獻(xiàn)中揭示的，固相太合成法中，很多氨基酸的側(cè)鏈功能基需要保護(hù)，文獻(xiàn)中也提到了保護(hù)基的選擇和使用，它取決于待保護(hù)的氨基酸和多肽上其它已保護(hù)的氨基酸殘基的存在。側(cè)鏈保護(hù)基選擇的關(guān)鍵之處就是在斷裂α-氨基保護(hù)基時這一保護(hù)基不被去除。例如，適于保護(hù)賴氨酸的側(cè)鏈保護(hù)基為芐氧羰基和取代的芐氧羰基，這里的取代基為鹵素(如氯、溴、氟)或硝基(如2-氯芐氧羰基，對硝基芐氧羰基，3，4-二氯芐氧羰基)，對甲苯磺?；逦煅豸驶?，3，4-二氯芐氧羰基和二異丙甲氧羰基，蘇氨酸、和絲氨酸的醇羥基可用乙酰基，苯甲?；宥』?，三苯甲基，芐基，2，6-二氯芐基或芐氧羰基保護(hù)。優(yōu)選的保護(hù)基為芐基。
這些保護(hù)基用文獻(xiàn)中已知的方法來去除。一般來講，保護(hù)基在肽鏈合成完成后去除，但是，它們可以在任何合適的時候被去除。
式1中的多肽與任何無毒的有機或無機酸形成適于藥用的鹽。典型的無機鹽包括鹽酸，氫溴酸，硫酸和磷酸以及酸式金屬鹽如磷酸氫二鈉和硫酸氫鉀。典型的有機酸有單、雙和三羥基羧酸，代表各為乙酸，甘油酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸、戊二酸，富馬酸，蘋果酸，酒石酸，檸檬酸，抗壞血酸，馬來酸，羥基馬來酸，苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水楊酸，2-苯氧基苯甲酸和磺酸如甲磺酸和2-羥基乙磺酸。
羥基端氨基酸的鹽包括任何無毒的與適當(dāng)?shù)臒o機或有機堿形成的羧酸鹽，這些鹽包括堿金屬鹽，如鈉鹽和鉀鹽;堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽;ⅢA族輕金屬鹽如鋁鹽;以及有機伯、仲、叔胺，如三烷基胺，有三乙胺，普魯卡因，二芐基胺，1-乙稀胺，N，N′-二芐基乙稀二胺，二氫樅胺，N-(低級)烷基派啶和任何其它適當(dāng)?shù)陌贰?br> 本發(fā)明中的旦白一磷脂復(fù)合物中的磷脂可為任何磷脂，這里包括磷酰甘油酯和神經(jīng)鞘脂類。磷酰甘油酯為甘油的二脂肪酸酯，其中保留一個端基羥基與磷酸形成酯。磷酰甘油酯的磷酸部分通常與一個醇如乙醇胺，絲氨酸，膽堿或甘油形成第二個酯。神經(jīng)鞘脂類為神經(jīng)鞘氨醇或二氫神經(jīng)鞘氨醇的單脂肪酸酯，其中1位的羥基與膽堿磷酸酯形成一個酯。本發(fā)明的旦白-磷脂復(fù)合物中優(yōu)選的脂為二棕櫚?；字Ｄ憠A(DPPC)，含有不同長度和飽和度的?；湹牧字Ｄ憠A(PC)，心磷脂(CL)，磷脂酰甘油(PG)，磷脂酰絲氨酸(PS)，脂肪酸(FA)，和三酰基甘油(TG)，DPPC為肺表面活性混合物的主要成分，而PC，CL，PG，F(xiàn)A和TG只占一小部分。本發(fā)明中用于磷脂的適當(dāng)?shù)闹舅釣殚L鏈脂肪酸(通常含碳原子為8或更多)，一般無支鏈。脂肪酸可為飽和或不飽和的。脂肪酸的典型代表為月桂酸，肉豆蔻酸、棕櫚酸和油酸。
本發(fā)明中旦白質(zhì)-磷脂復(fù)合物的藥用制劑可制成干的混合物或水性懸浮液，在一些情況下含有少量的有機溶劑，如乙醇或三氟乙醇，去污粉，如十二烷基磺酸鈉或去氧膽酸鈉鹽，鹽類，如氯化鈣或氯化鈉，碳水化合物，如葡萄糖，右旋糖或麥芽糖以及氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸。當(dāng)制成液體制劑時，可加入穩(wěn)定劑，防腐劑，滲透壓調(diào)節(jié)劑，緩沖劑和懸浮劑。根據(jù)需要，可加入適當(dāng)?shù)臍⒕鷦?。水性懸浮劑的PH可在2～10之間，可用酸和堿，如鹽酸，磷酸鈉或氫氧化鈉來調(diào)節(jié)。干燥的混合物可以再制成含有適于藥用的鹽、有機溶劑和去污劑的水性溶液。水性制劑在使用前可通過滲析，過濾或?qū)游鰧腋∪軇Q為適于藥用的溶劑。制劑可以以干燥粉末，水性懸浮劑或氣霧劑的形式直接施于呼吸窘迫患者的肺上。本發(fā)明中的藥用組和物可在氣密性的容器如小瓶和安瓿中無菌貯存。它們可于小瓶式安瓿中單獨貯存，使用前將其于單獨貯存的懸浮緩沖液混合。
脂類占肺表面活性劑制劑的50～99.9%，適當(dāng)?shù)闹瑸镈PPC，PC，CL，PG，PS，F(xiàn)A和TG.DPPC為主要成分，占全脂重的60～100%，其他脂的濃度很低，PC，CL，PG和PS占脂重量的比例可達(dá)30%;FA和TG占全脂重的比例可達(dá)10%，這些次要脂中的脂肪?；逆溈蔀槿我忾L度，飽和或不飽和。優(yōu)選的脂肪鏈?zhǔn)?2～16碳原子，2個不飽和鍵。優(yōu)選的脂組成為85～100%DPPC和0～15%PG。
合成肺表面活性劑中的脂組分通常見于哺乳動物肺表面活性物質(zhì)中，也可從工業(yè)來源中以高純度的形式得到。多太組分是用文獻(xiàn)中類似的方法采用固相合成而得到的。類似于本發(fā)明中的氨基酸序列曾用于血漿阿樸脂旦白脂結(jié)合區(qū)域的核型，從未用于合成肺表面活性劑的制劑。本發(fā)明中的脂與由哺乳動物灌洗液分離得到的旦白質(zhì)組成的混合物可有效地治療新生兒RDS。
但是，這類脂和合成肽混合物作為肺表面活性劑制劑還未見報道。
脂類混合于揮發(fā)性溶劑或混合溶劑中，如氯仿和甲醇混合物。有機溶劑在氮氣，氬氣或真空下蒸除?？梢院杏袡C和無機酸，堿，和鹽，和糖和葡萄糖的水溶液加入至此干的脂類混合物中，得到每毫升DPPC的濃度為0.1至100毫克。一般來說最好但并非必須把混合物加熱至25～50℃，劇烈混合，并且在25-50℃下孵育2小時。然后，肽或肽混合物以干粉或有些情況下懸浮于含象乙醇或三氟乙醇，或一象鹽酸胍或脲變性劑的水溶液加至脂混合物中，所加有機溶劑或變性劑用于增加肽在水溶液中的溶解度。特定的PH值能增強肽與脂的結(jié)合，因此水溶液的PH值可在2至10間變化。較好的混合方式是在水中于45-50℃下用超聲波混合器混合30-90分鐘，然后冷凍干燥并在-20℃保存。
在DPPC濃度為1至100毫克DPPC/毫升的水，一緩沖水溶液或一鹽水溶液中，脂與一合適洗滌劑，如辛基葡糖苷或去氧膽酸鈉以重量比為1比1至20混合。然后，肽以干粉或懸浮于含或不含有機溶劑，變性劑，或洗滌劑的水溶液的形式加入。混合物通過滲折、過濾，離心或?qū)诱鄣姆椒ㄈコ礈靹?br> 另外，肽和脂于含或不含少量水的揮發(fā)性有機溶劑中混合。揮發(fā)性溶劑在氮氣流或氬氣流，或真空爐，或用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，于加入水溶液前或后蒸除。然后混合物通過滲折，過濾或?qū)诱鄣姆椒ò阉越橘|(zhì)換成藥用合適的介質(zhì)，雖然此并非必需。在有些情況下，通過超離心，過濾，或?qū)诱鄯椒ò盐捶磻?yīng)的肽和脂從結(jié)合的肽與脂中分開會提高效率。然后混合物可以冷凍干燥或汽溶化。
本發(fā)明的多肽-磷脂復(fù)合物可用于治療新生兒的呼吸不適綜合癥，這是由于未發(fā)育全嬰兒的肺不能產(chǎn)生肺表面活性劑而產(chǎn)生的生理狀態(tài)。作為肺表面活性劑，本發(fā)明的復(fù)合物在用于RDS病人時，或者代替天然的，缺失的表面活性劑或增加缺少的天然表面活性劑。治療持續(xù)至嬰兒的肺能產(chǎn)生足夠的天然肺表面活性劑以至不必要進(jìn)一步治療時為止。
制劑最好是能用于氣管的，即懸浮液體，干粉，或氣霧劑。作為懸浮液，干的混合物或懸浮液的混合物與合適的試劑混合，如水，鹽水溶液，葡萄糖，和甘油，以得到一有效的藥用組成。較好的懸浮液含重量0.8-1.0%的氯化鈉和1-20mM的鈣離子。制劑過濾消毒。一般，制劑每毫升含DPPC1至100毫克，并以0.2至5毫升/公斤的劑量給藥。水懸浮液冷凍干燥得干的混合物。研細(xì)的干粉懸浮于象低級烷和如氟里昂的氟化烷烴里制得氣霧劑。氣霧劑存于加壓的容器中。
此表面活性劑以合適的劑量形式，通過氣管，通過氣霧劑，或通過懸浮液或干粉霧化至呼吸氣中給藥。此表面活性劑以單劑量或復(fù)劑量10至200毫克/公斤給藥。較好的給藥方法是把肽和脂以5-10毫克/每毫升生理鹽水的濃度通過氣管給藥，達(dá)到50-100毫克/公斤的劑量。
實施例1H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-OH肽1的DPPC復(fù)合物的制備固相法合成肽1。含DPPC(25毫克)的1毫升氯仿在氮氣流下蒸發(fā)干并冷凍干燥去除痕量的有機溶劑。往此干的脂混合物中加入3毫升水，然后于45℃下孵育1小時。然后往此液體制劑中加入0.5毫克肽Ⅰ。在45℃下此制劑于超聲混合器中混合2小時。所得脂-肽混合物冷凍干燥并于4℃下保存長至1個月。試驗前加入9毫升含0.9%Nacl，20mMHEPES緩沖液(PH為7.4)。此制劑在間歇混合，45℃下孵育1小時。此制劑呈半透明白色外觀，比只有DPPC略清。
實施例2Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-leu-Lys-Glu-Leu-LeuNH2(肽2)的DPPC復(fù)合物的制備固相法合成肽2。除最終懸浮緩沖液(PH為7.40)除含0.9%Nacl，20mM HEPES外，還含5mMCacl2外，肽2與DPPC的混合同實施例1。
實施例3Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2(肽3)的DPPC復(fù)合物的制備以類似地方式，制備肽3并與DPPC形成復(fù)合物。
類似地但混合重量25份DUPG與75份DPPC得肽2的DUPG/DPPC復(fù)合物。
實施例4Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2(肽4)的DPPC復(fù)合物的制備類似的方式，制備肽4并與DPPC形成復(fù)合物。
實施例5Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2類似的方式，制備肽5并與DPPC形成復(fù)合物。
實施例6Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2類似的方式，制備肽6并與DPPC形成復(fù)方物。
實施例7Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2類似的方式，制備肽7并與DPPC形成復(fù)合物。
實施例8Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2類似的方式，制備肽8并與DPPC形成復(fù)合物。
實施例9Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2類似的方式制備肽9并與DPPC形成復(fù)合物實施例10
類似的方式，制備肽10并與DPPC形成復(fù)合物。
實施例11肽1和2的肺表面活性劑評價。
合成表面活性劑制劑在成年鼠肺模型上試驗(Ikegamietal，(1979)Pediatr.Res.13，777-780)。參照Ⅰ和Ⅱ分別單用DPPC和狗肺表面活性劑作為參照標(biāo)準(zhǔn)。實施例1和2的制劑各3毫升在成年鼠肺模型上試驗。實施例1和2的制劑幾乎全部恢復(fù)了鼠肺的活動性。結(jié)果見圖1和2。參照1。參照Ⅰ的制備如下。DPPC購于AvantPolarLipids。溶有25毫克DPPC的氯仿先在氮氣流中蒸發(fā)干然后冷凍干燥去除痕量的有機溶劑，往干的脂混合物中加入3毫升水。制劑于45℃孵育1小時并同時用超聲混合器混合1小時。此脂冷凍干燥，在4℃下保存長至1周并與9毫升含0.9%Nacl，20mMHEPES緩沖液(PH為7.4)混合。在孵育1小時同時周期性混合后參照Ⅰ在成年鼠肺模型上試驗(圖1a)。參照1無增強鼠肺的活動性作用并且作為一肺表面活性劑是無效果的。
參照Ⅱ，參照Ⅱ的制備如下。狗肺表面活性劑按文獻(xiàn)制備。參照Ⅱ在壓力5厘米水柱的情況下恢復(fù)肺活量＞75%完全足夠的鼠肺。
權(quán)利要求
1.一個結(jié)構(gòu)式為的多肽；其中X為氫，一個氨基酸，二肽，或三肽，或含1至10個碳原子的脂肪，芳香，或環(huán)有機酸Y和Y′為互不相關(guān)的一個鍵或n為1至3的整數(shù)時的一(Ser)n-Q為一羥基氨基，烷基氨基或烷氧基Z為一含8-25個氨基酸的肽，由下列序列的低聚物的一個片段組成-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”A9”-A10”-A11”-A1”-A2’”-并且可以從A1-A11的任何一個氨基酸殘基開始，其中A1，A1′，A1″，A1′″，A4，A4′，A4″，A8，A8′和A8″選于由Glu，Asp，Ala，Gln，Asn，Gly，Ser，Thr，Lys，Arg，Orn和hArg組成的親水氨基酸組A2，A2′，A2″，A2′″，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′，和A10″選于由Leu，Nle，Met，Ala，Val，Phe，Nva和Tyr組成的親脂性氨基酸組；A5，A5′，A5″，A11和A11′A11″選于Lys，Orn，Arg，hArg組成的堿性氨基酸組；A9，A9′，A9″選于Leu，Nle，Met，Ala，Val，phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，Lys，Arg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)組成的親脂的中性或堿性氨基酸組或其適于藥用的鹽，但附有一先決條件，Z不能是-Glu-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Glu-Lys-Val-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Phe-；-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-lys-Glu-Ala-Phe；-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Na-Phe-；Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Ser-Lys-Val-Ala-Glu-Ala-Leu-Lys-Ala-Phe-。
2.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A1，A1，A1″或A1″′中至少有一個為Glu。
3.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A4，A4′，或A4″中至少有一個為Glu。
4.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A8，A8′，或A8″中至少有一個是Glu。
5.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A2，A2′，A2″，或A2″′中至少有一個是Leu。
6.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A8，A3′，或A3″中至少有一個是Leu。
7.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A6，A6′，或A6″中至少有一個是Leu。
8.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A7，A7′，或A7″中至少有一個是Leu。
9.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A10，A10′，或A10″中至少有一個是Leu。
10.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A5，A5′或A5″中至少有一個是Lys。
11.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A9，A9′，或A9″中至少有一個是Ala。
12.權(quán)利要求1中的一個肽，其中A11，A11′，或A11″中至少有一個是Lys。
13.權(quán)利要求1-12中的一個肽，其中Q為氨基。
14.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.
15.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
16.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
17.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
18.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.
19.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.
20.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.
21.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
22.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2.
23.權(quán)利要求1中的一個肽，序列為H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.
24.一個結(jié)構(gòu)式為的多肽;其中X為氫，一個氨基酸，二肽，或三肽，或含1至10個碳原子的脂肪，芳香，或環(huán)有機酸;Y和Y′為互不相關(guān)的一個鍵或n為1至3的整數(shù)時的-(Sern)n-Q為一羥基氨基，烷基氨基或烷氧基Z為一含8-25個氨基酸的肽，由下列序列的低聚物的一個片段組成-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”-A9”-A10”-A11”-A1”’-A2”’-并且可以從A1-A11的任何一個氨基酸殘基開始，其中A1，A1′，A1″，A1″″，A4，A4′，A4″，A8，A8′，和A8″選于由Glu，Asp，Ala，Gln，Asn，Gly，Ser，Thr，Lys，Arg，Orn和hArg組成的親水氨基酸組;A2，A2′，A2″，A2″′，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′和A10″選于由Leu，Nle，Met，Ala，Val，Phe，Nva和Thr組成的親脂性氨基酸組;A5，A5′，A5″，A11，A11′和A11″選于Lys，Orn，Arg，hArg組成的堿性氨基酸組;A9，A9′，A9″選于Leu，Nle，Met，Ala，Val，Phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，Lys，Arg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)組成的親脂的中性或堿性氨基酸組;或其適于藥用的鹽，與選于DPPC，PC，CL，PG，PS，F(xiàn)A，和TG的脂或脂混合物形成的復(fù)合物。
25.權(quán)利要求24中的一個復(fù)合物，其中DPPC為脂的主要成份。
26.權(quán)利要求24中的一個復(fù)合物，其中脂為DPPC和PG的混合物。
27.權(quán)利要求24中的一個復(fù)合物，其中脂含85-100%的DPPC和0-15的PG。
28.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中多肽序列為H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-NH2.
29.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
30.權(quán)利要求24-27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
31.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
32.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.
33.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.
34.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.
35.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
36.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2.
37.權(quán)利要求24至27中的一個復(fù)合物，其中肽序列為H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp(For)-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-OH.
38.一個治療呼吸不適綜合癥的方法，通過給患者一有效劑量的復(fù)合物，此復(fù)合物為由一個結(jié)構(gòu)式為的多肽;其中X為氫，一個氨基酸，二肽，或三肽，或含1至10個碳原子的脂肪，芳香，或環(huán)有機酸;Y和Y′為互不相關(guān)的一個鍵或n為1至3的整數(shù)時的-(Ser)n-Q為一羥基氨基，烷基氨基或烷氧基;Z為一含8-25個氨基酸的肽，由下列序列的低聚物的一個片段組成-A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-A9-A10-A11-A1’-A2’-A3’-A4’-A5’-A6’-A7’-A8’-A9’-A10’-A11’-A1”-A2”-A3”-A4”-A5”-A6”-A7”-A8”-A9”-A10”-A11”-A1”’-A2”’-并且可以從A1-A11的任何一個氨基酸殘基開始，其中A1，A1′，A1″，A1″′，A4，A4′，A4″，A8，A8′和A8″選于由Glu，Asp，Ala，Gln，Asn，Gly，Ser，Thr，Lys，Arg，Orn和hArg組成的親水氨基酸組;A2，A2′，A2″，A2″′，A3，A3′，A3″，A6，A6′，A6″，A7，A7′，A7″，A10，A10′和A10″選于由Leu，Nle，Mlt，Ala，Val，Phe，Nva和Tyr組成的親脂性氨基酸組;A5，A5′，A5″，A11，A11′和A11″選于Lys，Orn，Arg，hArg組成的堿性氨基酸組;A9，A9′，A9″選于Leu，Nle，Met，Ala，Val，Pys，F(xiàn)rg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)組成的親脂的中性或堿性氨基酸組Val，Phe，Nva，Ile，Tyr，Thr，Ser，Gln，Asn，Gly，lys，Arg，hArg，Trp，Orn，Trp(For)組成的親脂的中性或堿性氨基酸組;或其適于藥用的鹽和選自DPPC，PC，CL，PG，PS，F(xiàn)A和TG的脂質(zhì)或脂質(zhì)混合物。
39.權(quán)利要求38中的一個方法，其中DPPC是脂中的主要成份。
40.權(quán)利要求38中的一個方法，其中脂是DPPC和PG的混合物。
41.權(quán)利要求38中的一個方法，其中脂為85-100%的DPPC和0-15%的PG組成。
42.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為H-Ser-Ser-Ala-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-Ser-Ser-Ser-NH2.
43.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
44.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
45.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp-Leu-Lys-NH2.
46.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-NH2.
47.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Phe-Leu-Lys-NH2.
48.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Ala-Leu-Lys-NH2.
49.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Lys-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-NH2.
50.權(quán)利要求38至41中的一個方法，其中肽的序列為Suc-Lys-Leu-Lys-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Leu-Glu-Trp(For)-Leu-Lys-NH2.
全文摘要
本發(fā)明制備并在動物衰竭肺模型上評價了由具α螺旋結(jié)構(gòu)的一個多肽和一個或多個脂組成的合成肺表面活性劑及天然肺表面活性劑。
文檔編號C07K14/00GK1039029SQ8910447
公開日1990年1月24日 申請日期1989年7月1日 優(yōu)先權(quán)日1988年7月1日
發(fā)明者拉里·R·麥克列恩, 約翰·L·克拉坦安斯基 申請人:默里爾多藥物公司