專利名稱：人的上皮細胞成長因子的制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用遺傳工程的方法有效地制造人的上皮細胞成長因子(hEGF)的方法。
現(xiàn)在，人們已經(jīng)判明hEGF與β-尿抑胃激素是同一物質(zhì)，而本發(fā)明擬大量且方便地提供作為抗?jié)儎┑人幤窞橛行У膆EGF。
已經(jīng)公知的遺傳工程之方法是以下的一系列操作(1)把對所需物質(zhì)進行編碼的遺傳因子組建到載體中，(2)使用該載體對宿主大腸桿菌進行轉(zhuǎn)化，(3)對如此獲得的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，(4)通過從培養(yǎng)液中的回收來獲取所需物質(zhì)，此外還進行了種種研究以通過上述方法來得到對人體有利的微量蛋白質(zhì)。
Tacon，W.，Carey，N.，Emetage，S.Molec.gen.Genet.，177，427(1980)。
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根據(jù)最新技術(shù)已經(jīng)公開的有這樣的方法，例如通過同時具備對來自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子之啟動子進行編碼的遺傳因子和在其控制下對信號肽進行編碼的遺傳因子，并把對hEGF進行編碼的遺傳因子也組建進去而形成重組DNA。最后獲得hEGF(特開昭63-003799號公報、特開昭63-003800號公報)。這里，為了達到在培養(yǎng)時能提高得率的目的，例如蛋白質(zhì)合成能的誘導發(fā)生之前是在低溫區(qū)域進行培養(yǎng)，而在蛋白質(zhì)合成能誘導后則在高溫區(qū)域進行培養(yǎng)，或者，蛋白質(zhì)合成能的誘導發(fā)生之前在弱酸性或中性條件下進行培養(yǎng)，而在蛋白質(zhì)合成能誘導之后則在弱堿性條件下進行培養(yǎng)等，已對其培養(yǎng)方法作了種種研究，且分別取得了成果。
根據(jù)以上所述的已有技術(shù)，則目的產(chǎn)物hEGF確實能夠獲得一定程度之得率。然而，在欲進行伴有往培養(yǎng)基的分泌的高密度培養(yǎng)時卻存在著不少缺點。例如(1)按照目前的方法，還不能任意控制轉(zhuǎn)化的大腸桿菌開始產(chǎn)生hEGF的時期，(2)因此，還不能在開始產(chǎn)生hEGF之前，先使轉(zhuǎn)化的大腸桿菌充分繁殖，(3)因而，在進行所謂的高密度培養(yǎng)(在本發(fā)明說明書中，它是指對借助400D550以上的大腸桿菌所進行的培養(yǎng))之時，轉(zhuǎn)化的大腸桿菌不能夠控制產(chǎn)生hEGF之過程。
再者，在原理上也不可能適用高密度培養(yǎng)中所必須的Fed-Batch法(在培養(yǎng)過程中一邊加入培養(yǎng)基一邊繼續(xù)進行培養(yǎng)的方法)。
根據(jù)本發(fā)明者們的實驗，轉(zhuǎn)化大腸桿菌一旦開始產(chǎn)生hEGF，就會有轉(zhuǎn)化大腸桿菌本身的繁殖受到抑制的現(xiàn)象。其原因未必十分清楚，但是從所產(chǎn)生的hEGF不停留在轉(zhuǎn)化大腸桿菌的細胞內(nèi)或胞外質(zhì)(內(nèi)膜與外膜之間)中而分泌在細胞外這一hEGF特異的現(xiàn)象來看，可以推測在轉(zhuǎn)化大腸桿菌上受有很大的應激，因此也可推測出這是由于在產(chǎn)生hEGF的同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌本身的繁殖受到抑制的緣故。
根據(jù)以上分析，為了實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，有必要在使轉(zhuǎn)化大腸桿菌充分繁殖的時候開始hEGF的產(chǎn)生，為此，就必須做到能對hEGF產(chǎn)生的時間進行任意的控制。
本發(fā)明的要點為以下各點(1)作為啟動子應使用能對trp合成酶系遺傳因子的啟動子進行編碼的遺傳因子。
(2)應通過添加3-吲哚丙烯酸(IAA)來對轉(zhuǎn)化大腸桿菌產(chǎn)生hEGF的時期進行控制。
(3)在培養(yǎng)時應使用能對需添加的培養(yǎng)基的添加速度進行變化的Fed-Batch法。
(4)添加培養(yǎng)基的碳源應為葡萄糖、甘油或葡萄糖與甘油的組合物。
(5)進而，在上述(4)中，在使用Fed-Batch法之基礎(chǔ)上，作為添加培養(yǎng)基的碳源，應在使用了葡萄糖之后再使用甘油。
以下，就上述各點進行詳細描述。
在作為啟動子而適用來自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的物質(zhì)時，由于培養(yǎng)基中磷酸鹽的存在，hEGF的產(chǎn)生能已停。通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌繁殖并在該過程中磷酸鹽被消耗而下降到一定濃度，來自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的啟動子就開始工作，于是開始產(chǎn)生出hEGF?，F(xiàn)有技術(shù)是通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH及溫度來提高其hEGF的產(chǎn)生能的。
在本發(fā)明中，不是使用來自大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的啟動子，而是使用上述trp合成酶系遺傳因子的啟動子。
根據(jù)本發(fā)明，是在培養(yǎng)基中事先加入50mg/l左右的色氨酸。隨著轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖，色氨酸被消耗，降到一定濃度以下之后，trp合成酶系遺傳因子的啟動子開始工作，于是hEGF開始產(chǎn)生，但如有足夠的色氨酸存在于培養(yǎng)基中，則本發(fā)明的啟動子就不會開始產(chǎn)生hEGF。另外，如以后的實施例所示的那樣，尤其是轉(zhuǎn)化大腸桿菌具有一旦分泌hEGF、就會減弱繁殖速度或停止繁殖這樣的性質(zhì)。
由此而了解到，由于具有本發(fā)明所用的trp啟動子的發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒載體，能容易地進行嚴密的發(fā)現(xiàn)控制，從而極其適合于利用在后述的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的高密度培養(yǎng)中。即，為了把hEGF的產(chǎn)生量提高到150mg/l以上，在色氨酸的存在下進行培養(yǎng)，并在轉(zhuǎn)化大腸桿菌已繁殖到充分的高密度時，快速地加入IAA，然后經(jīng)過短時間(10-18小時)之后，能從培養(yǎng)基中回收產(chǎn)物。
此外，在Fed-Batch法的添加培養(yǎng)基中不事先加入葡萄糖而加入甘油，或者在添加過程中通過把葡萄糖變更為甘油，就可能象以后將說到的那樣巧妙地控制trp啟動子工作的開始時期。
然而，IAA是色氨酸結(jié)構(gòu)的類似體，而且對于阻遏物蛋白的親和性要比色氨酸還強，所以通過優(yōu)先與阻遏物結(jié)合來防止阻遏物與啟動子(操作者)的結(jié)合。因此，即使在培養(yǎng)基中存在著色氨酸之情況下，也能由于在培養(yǎng)基中添加IAA而使該啟動子開始工作。
由于以上原因，故能夠理解到，在本發(fā)明中，在培養(yǎng)過程中的任何一個階段，通過添加IAA都可使得在高密度培養(yǎng)條件下的往培養(yǎng)基中的分泌所導致的hEGF的產(chǎn)生得以開始。本發(fā)明的重要內(nèi)容實際上就在這里。
如果提高轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖，那么可斷定其后的hEGF之產(chǎn)生是隨之成比例提高的。通過對培養(yǎng)基本身的研究，或通過Fed-Batch法的適用，能提高培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)化大腸桿菌的密度，所以如果在通過高密度培養(yǎng)提高了轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖之后，使hEGF開始產(chǎn)生，就能以相應的有效率來獲得hEGF。
在本發(fā)明中，可適當使用通常的遺傳工程學上常用的方法。例如，作為宿主大腸桿菌的可使用來自廣泛使用著的K12的大腸桿菌株，又，作為載體可以對市售的質(zhì)粒按遺傳工程的方法進行重組。更具體地講，在本發(fā)明中可以使用以下的大腸桿菌。
JM101、TB1、HB101、RR1、DH1、MM294、C600galk-、Y1090(pMC9消失株)
此外，還可使用它們的誘發(fā)株。
另外，在本發(fā)明中，例如可以使用以下的質(zhì)粒以及噬菌體DNA。
pDR540[フアルマシヤ公司制造]、M13mp18以及mp19(寶酒公司制造)再者，在本發(fā)明中，還可把以下的培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及添加培養(yǎng)基。
LB培養(yǎng)基(10g/l巴克土(バクトトリプトン)5g/l酵母抽捉物、5g/l食鹽)。
M9培養(yǎng)基(6g/l磷酸氫二鈉、3g/l磷酸二氫鉀、0.5g/l食鹽、1g/l氯化銨、2mM硫酸錳、0.1mM氯化鈣)4YTM9培養(yǎng)基(在M9培養(yǎng)基中添加以下成份。32g/l巴克土(バクトトリプトン)、20g/l酵母抽提物)。
另外，在平板培養(yǎng)基上可加入瓊脂以使之達到1.5%，而在M13噬菌體上層培養(yǎng)基中可加入瓊脂以使之達到0.6%，然后進行調(diào)制。在所有含質(zhì)粒的大腸桿菌的培養(yǎng)過程中，可在培養(yǎng)基中加入氨必西林且使其達到100mg/l之濃度，以防止質(zhì)粒的脫離。
作為本發(fā)明中所使用的限制酶和DNA修飾酶，可適合于使用通常的遺傳工程學上常用的方法。例如，可適宜于使用寶酒制造公司、東洋紡織公司、フアルマシヤ公司以及バ-リンガ-マンハイム公司制造的產(chǎn)品。在本發(fā)明中，這些產(chǎn)品的使用可通過以下說明書以及文獻來進行(MolecularCloning;aLaboratoryManual.ColdSpring，HarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork)。
另外，在本發(fā)明中，大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的精制以及噬菌體DNA的精制，可適宜于使用通常的遺傳工程上常用的手法。另外，也可按照文獻(MolecularCloning)的記載及說明書進行精制。
本發(fā)明中的低(聚)核苷酸可以通過通常的DNA合成中常用的方法(例如トリエステル法)進行合成。另一方面，也可以利用市售的DNA合成機(AppliedBiosystem公司制造，型號380B)進行合成。
此外，本發(fā)明中的低(聚)核苷酸的連接，可適合于采用通常的遺傳工程學上常用的方法。具體地說，把各合成的低(聚)核苷酸1μg放在20μl的磷酸二氫鉀激酶緩沖液(根據(jù)MolecularCloning)中進行磷酸化處理，然后進行混合，在70℃下加熱10分鐘之后，又化1小時逐漸冷卻至室溫，接著，加入與混合液同量的1倍濃度的磷酸二氫鉀激酶緩沖液，又加入T4DNA連接酶，在16℃下放置一個晚上。以后，在70℃下加熱10分鐘以使T4連接酶失活，再根據(jù)乙醇沉淀法交換該緩沖液，然后，為生成目的產(chǎn)物的斷片而用兩端的限制酶加以切斷后，再用8%的聚丙烯酰胺塊的凝膠電泳進行區(qū)分。用借助緩沖液進行的提取法(根據(jù)MolecularCloning)從含有目的產(chǎn)物的DNA斷片的凝膠提取出DNA并加以精制。這種方法是本發(fā)明的低(聚)核苷酸的連接的典型例子。
作為本發(fā)明的目的物的hEGF量的測定可適宜使用通常的遺傳工程學上常用的方法。具體地說，例如可以市售的hEGF[湧永制藥公司制、アマシヤム公司制]為標準，利用放射免疫測定(使用アマシヤム公司的儀器)進行測定。
以下，通過揭示參考例以及實施例來對本發(fā)明作更詳細的描述。
參考例1發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒的制備(1)trp啟動子、SD排列、大腸桿菌堿性磷酸酶信號肽遺傳因子的合成。
把要利用的trp啟動子及其SD序列(Shine-Dargarno核蛋白體結(jié)合部位)，規(guī)定為以復制開始點的A為+1時的-60位的T至+26位的A。在-60位的T的5′一側(cè)考慮與載體的連結(jié)，而設置HindⅢ切斷點。大腸桿菌堿性磷酸酶信號肽遺傳因子是根據(jù)天然排列的，但是考慮到與載體的連結(jié)以及往hEGF遺傳因子的連結(jié)，則把開始密碼子的GTG變更到ATG，把C末端的GCT變更到GCG，并在其3′一側(cè)設置EcoRⅠ切斷點。把以上的排列分成8個低(聚)核苷酸加以合成，根據(jù)常用的方法進行連結(jié)，接著作為HindⅢ-EcoRIDNA斷片加以精制。此外，把該斷片插入在MBmp18噬菌體復制型DNA的HindⅢ-EcoRⅠ切斷點之間，并通過dideoxy法確認其堿的排列(

圖1)。
(2)hEGF遺傳因子的合成。
hEGF遺傳因子的排列，是以天然的hEGF的氨基酸排列為基礎(chǔ)而加以設計的。在設計排列時考慮了使用大腸桿菌中使用頻率較高的密碼子，除去能獲得二次結(jié)構(gòu)那樣的反復排列，在遺傳因子中途為設置連結(jié)遺傳因子而必要的SphⅠ切斷點。
具體地說，是作為由21個低(聚)核苷酸構(gòu)成的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片而制作了hEGF遺傳因子。
首先按照普通方法，對構(gòu)成前半部分的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片的11個低(聚)核苷酸進行合成、連結(jié)，并將其插入在MBmp18噬菌體復制型DNA的EcoRⅠ-SacⅠ切斷點之間。再采用dide-oxy法確認堿的排列。
接著，也采用常用的方法，對構(gòu)成后半部分的SphⅠ-SacⅠDNA斷片的10個低(聚)核苷酸進行合成和連結(jié)，并將其插入MBmp18噬菌體復制型DNASphⅠ-SacⅠ切斷點之間，再采用dideoxy法確認堿的排列。
從各自的重組M13噬菌體的復制型DNA，切出前半部分的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片和后半部分的SphⅠ-SacⅠDNA斷片，并進行連結(jié)，從而制備了hEGF遺傳因子。
已完成的hEGF遺傳因子上，5′末端變?yōu)镋coRⅠ切斷點，這部分相當于hEGF的N末端氨基酸的天門東酰胺。3′末端變?yōu)镾ac切斷點，并形成在它的前面，連續(xù)著終止密碼子TGA、TAG。此后，把連結(jié)了的hEGF遺傳因子的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片插入M13mp18噬菌體復制型DNA的EcoRⅠ-SacⅠ切斷點，再通過dideoxy法再次確認了堿的排列(圖2)。
(3)發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒的制備首先，通過使用DNA聚合酶Klenow斷片和T4連接酶(ligase)的常用方法，使pDR540(ファルマシヤ公司制造)的EcoRⅠ切斷點消失，從而制備了pDR540 E-質(zhì)粒。
此后，在該pDR540 E-DNA的BamHⅠ切斷點插入按照通常的方法合成并連結(jié)的聯(lián)結(jié)子，并重新導入EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、PvuⅡ切斷點。
再者，在該PvuⅡ切斷點插入TrpA終止區(qū)序列(フアルマシヤ公司制造)，從而制備pATGt質(zhì)粒。在該pATGt質(zhì)粒DNA的EcoRⅠ切斷點與SacⅠ切斷點之間插入含有合成hEGF遺傳因子的EcoRⅠ-SacⅠDNA斷片，從而制備了pBT19質(zhì)粒。
接著，把含有trp啟動子、SD序列、大腸桿菌堿性磷酸酶信號肽遺傳子的HindⅢ-EcoRⅠDNA斷片插入在pBT19的HindⅢ切斷點與EcoRⅠ切斷點之間，從而制備了有hEGF分泌發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pBT23(圖3及圖4)。
參考例2hEGF的發(fā)現(xiàn)及其分布使用pBT23DNA，對大腸桿菌C600galk-進行轉(zhuǎn)化，從而獲得保持了BT23的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
在0.1l的LB培養(yǎng)基中對保持有該pBT23的C600galk-株進行一夜的振蕩培養(yǎng)，并把它作為前培養(yǎng)液。然后在0.5l的振蕩燒杯中于0.2l的M9培養(yǎng)基內(nèi)(含有5g/l的酷蛋白氨基酸、2g/l的葡萄糖、10mg/l的維他命、100mg/l的氨必西林)，對上述的前培養(yǎng)液進行4ml植菌(2%植菌)，接著在37℃下進行125次/分的振蕩，加以培養(yǎng)。在對數(shù)繁殖初期(這時的OD約為0.1)，添加3-吲哚丙烯酸(IAA)，使其達到20mg/l的濃度，進而進行trp啟動子的誘發(fā)。在培養(yǎng)開始的1、2、4、6、8、24小時后取得試樣，進行離心分離而分離出培養(yǎng)基和菌體成分，再通過浸透壓振動法(ショツク)從菌體中進一步分離出胞外質(zhì)組分。培養(yǎng)基和胞外質(zhì)組分中的hEGF量，通過放射免疫測定法(マシヤム公司的儀器)被作了測定。其結(jié)果顯示在表1。
表1hEGF的分布hEGF量(mg/l)培養(yǎng)時間胞外質(zhì)培養(yǎng)基10.0110.01720.0160.03040.0220.19060.0170.43080.0140.490240.0040.730培養(yǎng)開始的24小時后，培養(yǎng)基中hEGF的量為0.73mg/l，成為最大。積蓄在胞外質(zhì)中的hEGF的量在培養(yǎng)了4小時后達到最大，其量至多不過0.02mg/l之程度，而培養(yǎng)了24小時后，該量就減少，幾乎不再存在。
由此可以確認，被分泌的hEGF的幾乎全部是存在于培養(yǎng)基中的，因此在以后的實驗中對于產(chǎn)生的hEGF，只沉淀了培養(yǎng)基中的量。
參考例3對宿主大腸菌桿株的探討使用pBT23DNA，對大腸桿菌HB101，RR1、DH1、MM294、Y1090(pMC9消失株)、JM101、TB1株進行轉(zhuǎn)化，獲得了分別保持了其pB23的轉(zhuǎn)化大腸桿菌。
在與參考例2相同的條件下，與先前的C600yalk轉(zhuǎn)化株一起，進行了培養(yǎng)。借助IAA進行的trp啟動子的誘發(fā)是在培養(yǎng)開始后的9.5小時時進行，并測定了此時與24小時后培養(yǎng)基中的hEGF的量(表2)。
表2各種轉(zhuǎn)化大腸桿菌的hEGF量hEGF量(mg/l)大腸桿菌株9.5小時24小時C600galk-0.54 1.25HB1010.541.25RR11.230.93DH10.640.45MM2940.280.50Y1090(pMC9消失株)0.030.02JM1010.810.67TB12.304.00在8種轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，以TB1的產(chǎn)生量為最多，達到了4mg/l。其次是C600galk-和HB101，它們均為1.25mg/l，可以認為這些菌株適合于hEGF的產(chǎn)生。
參考例4對rep啟動子衍生時期的探討采用保持有pBT23的HB101轉(zhuǎn)化株，在與參考例2相同的條件下進行培養(yǎng)，在對數(shù)繁殖中期、后期和定期中分別添加IAA并使它達到20mg/l并測定了培養(yǎng)基中的hEGF的量。其結(jié)果顯示在表3。
可以看出，在對數(shù)繁殖中期或定期中添加IAA可獲得較多的hEGF的產(chǎn)生量。
參考例5培養(yǎng)基組成與hEGF的產(chǎn)生量采用保持有pBT23的TB1轉(zhuǎn)化株，在與參考例2相同的條件下進行了培養(yǎng)(作為培養(yǎng)基的是使用表4的物質(zhì))。在把4YM9、M9-1、M9-2用作培養(yǎng)基的場合，經(jīng)過5小時后添加IAA以使其達到20mg/l，而把M9-3、M9-4用作培養(yǎng)基的場合則經(jīng)過9小時后添加IAA以使其達到20mg/l，并測定了24小時以后的培養(yǎng)基中的hEGF的量。
表4培養(yǎng)基組成4YM9 M9-1 M9-2 M9-3 M9-4M-培養(yǎng)基←←←←バヶトトリプトン32g/l酪蛋白氨基酸10g/l5g/l←2g/l酵母抽提物20g/l葡萄糖5g/l←2g/l←維他命Bi10mg/l←←←氨比西林100mg/l ← ← ← ←表5培養(yǎng)基組成和hEGF產(chǎn)生量hEGF量(mg/l)培養(yǎng)基9小時后24小時后4YTM90.040.09M9-10.680.70M9-21.981.69M9-33.037.25M9-40.912.38在使用M9-3培養(yǎng)基(含有5g/l酷蛋白氨基酸2g/l葡萄糖)之場合，hEGF的產(chǎn)生量達到最大，為7.25mg/l。此外還了解到，以含有大量色氨酸的天然成分為主體的培養(yǎng)基中，hEGF的產(chǎn)生量較少。
參考例6對基于培養(yǎng)基中的色氨酸的trp啟動子的控制以上各參考例中的培養(yǎng)是這樣一種自然誘發(fā)系統(tǒng)，即，在培養(yǎng)基中不含有色氨酸，從來自前培養(yǎng)液的色氨酸隨著大腸桿菌的繁殖而下降到一定濃度以下的時期開始就發(fā)生了trp啟動子的誘發(fā)。在該系統(tǒng)中，作為誘發(fā)物質(zhì)的IAA盡管能使hEGF的產(chǎn)生量增加，但并未直接使誘發(fā)啟動子的開關(guān)打開。
因此，我們決定事先在培養(yǎng)基中加入色氨酸，以查明能否抑制來自trp啟動子的誘發(fā)，又，即使能抑制，則能否通過添加IAA來解除抑制。
所加的色氨酸的量為1、3、10、20、30、40mg/l，此外，按照表6所示的濃度加入IAA。
使用保持有pBT23的HB101轉(zhuǎn)化株，在使培養(yǎng)基及其條件與參考例2相同的情況下進行了培養(yǎng)。另外，在培養(yǎng)開始的5小時以后添加IAA，并測定了培養(yǎng)基中的hEGF的量。其結(jié)果顯示在表6。
表6-1培養(yǎng)基中色氨酸的濃度與hEGF產(chǎn)生量
加入培養(yǎng)基中的色氨酸的濃度在10mg/l以下時，hEGF產(chǎn)生量為6-10mg/l，然而，色氨酸的濃度為20-40mg/l時，EGF的產(chǎn)生量為1-1.5mg/l，已大幅度減少了，從而了解到一定濃度以上的色氨酸會抑制hEGF的產(chǎn)生。
另外，在色氨酸濃度為20mg/l的場合，如添加20或40mg/lIAA，則hEGF的產(chǎn)生量增加了約8倍，但添加80mg/l時，hEGF產(chǎn)生量的增加停留在約4倍。在色氨酸的濃度為30-40mg/l時，添加80mg/lIAA而導致的hEGF產(chǎn)生量的增加為1.5倍，相當小。
從以上結(jié)果查明了添加適當量的色氨酸(這里為20mg/l)可抑制自trp啟動子的誘發(fā)，另外，添加IAA(20-40mg/l)可解除這種抑制，并使trp啟動子的開關(guān)打開。另外，已知，添加微量的色氨酸可促進轉(zhuǎn)化大腸桿菌的繁殖(通過添加10-40mg/l的色氨酸，菌體量會變?yōu)?.5-2倍)。另外也已明白，40mg/l以上的過剩量IAA的添加會抑制大腸桿菌的繁殖，因而招致hEGF產(chǎn)生量的低下。
綜上所述，得到以下結(jié)論。
(1)作為目的物的hEGF，通過充分的培養(yǎng)幾乎全部進入到培養(yǎng)液中。
(2)作為宿主大腸桿菌適當?shù)挠蠬B101、TB1或C600galk。
(3)通過IAA進行的trp啟動子的誘發(fā)，在繁殖后期進行為最適合。
(4)作為培養(yǎng)基為適當?shù)奈镔|(zhì)有，在M9培養(yǎng)基中加入了5g/l酷蛋白氨基酸、2g/l葡萄糖、10mg/l維他命B1的物質(zhì)。
(5)培養(yǎng)基中即使存在著色氨酸，但通過添加IAA能進行trp啟動子的誘發(fā)。
以這些事實為標識，可推測出，我們能夠從事通過發(fā)酵罐進行的大量的高密度培養(yǎng)，并進行了以下實驗。并且，探討了耐大量實驗的大腸桿菌培養(yǎng)上清液中的hEGF的精制法，并設計了以下方法。
實施例1hEGF的精制法(1)被陽離子交換樹脂(BIO-REX70;バイオテッド公司制造)的吸附(pH3.0)→溶出(醋酸銨pH8.0)→透析(醋酸氨pH5.5)。
(2)陰離子交換柱色譜分析(Q-ScpharoseFastFlow;フアルマシヤ公司制造，醋酸銨pH5.5)。
(3)逆相(C18)柱色譜分析(PepRPC;フアルマシヤ公司制造，0.1%三氟醋酸/乙腈)→凍結(jié)干燥。
該方法不但全部工序只需2-4天，而且不包括通常所使用的硅膠過濾色譜法，因此較容易擴大其規(guī)模。
例如，使用該方法，能夠從101的培養(yǎng)上清液得到10mg的精制hEGF。
精制hEGF具有與天然型相同的氨基酸組成以及與天然型相同的N末端的氨基酸排列。再者，精制hEGF在以下所述實驗中顯示了其生物活性。
實施例2與EGF受體的結(jié)合能按照以下所述的方法，確認了精制hEGF的與人細胞表面EGF受體的結(jié)合能。
在含有10%的牛胎血清(ギブコ公司制造)的グルベッコ變法イ-ゲル培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基ニッスイ公司制造)中懸濁人A431細胞，且使其濃度達10細胞ml。然后，在24個洞的培養(yǎng)板上以每一個洞1ml地加入該細胞懸濁液，并在37℃、5%CO2的條件下進行了24小時的培養(yǎng)。接著用含有50mM的N，N-二(2-羥乙基)-2-氨乙基磺酸(BES，pH6.5)、0.1%牛血清白蛋白(BSAシグマ公司制)的DMEM培養(yǎng)基(結(jié)合用緩沖液)對細胞洗凈2次，此后加入含有0.2ng/ml的125I標識的hEGF(アマシヤム公司制)與0.1-10，000ng/ml的hFGF的結(jié)合用緩沖液(0.3ml)。
在室溫下放置1小時之后，用結(jié)合用緩沖液對細胞洗凈2次，在每一個洞中加入0.3ml的0.2M的氫氧化鈉溶液，細胞溶解之后，最后測定了與EGF受體結(jié)合的I-hEGF的放射活性。其結(jié)果顯示在表7。
表7精制hEGF的與人EGF受體的結(jié)合能hEGF，ng/洞/104細胞結(jié)合阻害率(%)[精制hEGF]0.10181038100821，0009510，00098根據(jù)以上結(jié)果可確認，精制hEGF具有人培養(yǎng)細胞與EGF受體的結(jié)合能。
實驗例3細胞繁殖促進作用根據(jù)以下所述方法，確認了精制hEGF的細胞繁殖促進作用。
在含有10%牛胎血清的DMEM培養(yǎng)基中按10細胞/ml的比例懸濁了鼠Swiss3 T3細胞。然后在24個洞的培養(yǎng)板上按照每1個洞1ml的量加入該細胞懸濁液，接著在37℃且5%CO2的條件下進行培養(yǎng)直到細胞達到對數(shù)繁殖中期為止。此后，把培養(yǎng)基與含有0.2%牛胎血清的DMEM培養(yǎng)基進行交換，又在37℃且5%CO2的條件下繼續(xù)進行培養(yǎng)。在幾乎所有的細胞都進入定期之處，加入hEGF，再培養(yǎng)8小時。在每一個洞里添加0.5μCi的[甲基-3H]胸腺密啶核苷(247.9G Bq/mmol;アマシヤム公司制造)，培養(yǎng)了24小時以后，測定了進入細胞內(nèi)的[H]-胸腺嘧啶核苷的放射活性。其結(jié)果顯示在表8。
表8精制hEGF的細胞增殖促進作用濃度 ［3H]胸腺嘧啶核比率(ng/ml) 苷的進入(cpm)0.028641.000.336711.281.037531.313.0 4742 1.66從以上的結(jié)果證實了精制hEGF的細胞繁殖促進作用。
實驗例4豚鼠胃壁細胞中酸生成的抑制根據(jù)以下所述方法，就精制hEGF在分離壁細胞中胃酸生成的抑制作用，以14C-胞嘧啶(AP)積蓄為指標進行了確認。
在100%的氧氣通氣條件下于37℃中對分離壁細胞懸濁液[含有1.80×105細胞/ml、0.2%BSA的Hanks液(ニッスイ公司制造)]進行了20分鐘的保溫，然后加入0.1 μCi的14C-AP(4.37GBq/mmolアマシヤム公司制造)、精制hEGF以及作為刺激劑入加組胺(半井化學公司制造)(3μM)，或加入(dibutylyl cyclic-AMP)(dbc-AMP。
公司制造)，使其分別達到3μM和1mM，再次進行保溫。60分鐘以后，加入冰冷的Hanks液(4ml)，接著通過低速冷卻離心使反應停止。然后，加入2M的氫氧化鈉溶液(0.3ml)使細胞溶解，又在2M的鹽酸中進行中和，最后通過液體閃爍計數(shù)器測定了放射活性。
14C-AP積蓄，是從刺激時的進入值中扣除控制值，并以此為100%，用%刺激表示精制hEGF的作用，從而被顯示在表9
表9精制hEGF的酸生成抑制作用%刺激組銨3μM100組銨3μM+EGF 1nM 105組銨3μM+EGF 10nM 38.1組銨3μM+EGF100nM 23.1dbc-AMP1mM100dbc-AMP1mM+EGF1nM 106dbc-AMP1mM+EGF10nM 82.1dbc-AMP1mM+EGF100nM 50.8從以上結(jié)果可證實，精制hEGF具有抑制因組胺、dbc-AMP的任何一種之刺激所引起的豚鼠胃壁細胞的酸生成。
實施例1[間歇法]在通過前述燒杯培養(yǎng)所得到的種種見識之基礎(chǔ)上，試驗了用10升的發(fā)酵罐進行的大量培養(yǎng)。作為發(fā)酵罐的是使用容積為10升的東方酵母公司制的臺式罐，另外還安裝了能調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中pH和溶解的氧氣濃度的控制裝置。在宿主中使用了HB101。
前培養(yǎng)是在LB基中進行，并對此進行2%的植菌。作為培養(yǎng)基的是使用M9培養(yǎng)基(含有5g/l酷蛋白氨基酸、2g/l的葡萄糖、10mg/l的維他命B1、100mg/l的氨必西林)6升，在37℃且1vvm通氣量(體積/體積/分鐘;在1分鐘內(nèi)用壓縮機壓入與培養(yǎng)容量相同量的空氣。這里是6升/分)、溶解酸濃度為4ppm(在100-100rpm的范圍內(nèi)改變攪拌槳的旋轉(zhuǎn)數(shù)且進行控制)、pH7.0(通過4M氫氧化鈉溶液的滴入進行控制)、自動消泡(通過發(fā)酵罐上部的傳感器測出發(fā)泡狀態(tài)，自動地滴入硅系消泡劑進行消泡)等的條件下進行了培養(yǎng)。經(jīng)過4.5小時之后添加IAA，添加濃度為20mg/l。
作為對照，用同樣的前培養(yǎng)液、同樣的培養(yǎng)基組成，并在與參考例2相同的條件下進行了燒杯培養(yǎng)。其結(jié)果顯示在圖5。
發(fā)酵罐培養(yǎng)也好燒杯培養(yǎng)也好，經(jīng)過了4小時之后，hEGF開始產(chǎn)生，到9小時為止，保持著大體相同的產(chǎn)生量，但經(jīng)24小時之后，可看到在燒杯中的培養(yǎng)，其產(chǎn)生量為9mg/l，而發(fā)酵罐中的培養(yǎng)，其產(chǎn)生量與經(jīng)過9小時幾乎相同，僅為2mg/l。
因此可知，采用通常的間歇法不可能提高hEGF的產(chǎn)生量。我們認為其原因是，在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中溶解的氧氣量和pH被保持一定，始終提供了最適合于大腸菌增殖的條件，因此，培養(yǎng)基中的色氨酸被消耗，下降到某一濃度以下，在trp啟動子開始工作時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)源(碳源、氮源)就枯渴了。
所以，如下所述的那樣，我們考慮了在培養(yǎng)基中連續(xù)地添加新培養(yǎng)基的Fed-Batch法。
實施例2Fed-Batch法之一采用與實施例1相同的培養(yǎng)條件，4小時之后在添加IAA的同時加入培養(yǎng)基(含有20g/l酷蛋白氨基酸、200g/l葡萄糖、10mg/l維他命B1、100mg/l氨比西林、20mg/lIAA的M9培養(yǎng)基)，使用管式泵按每小時30ml的速率添加了24小時。作為對照，也進行了燒杯中的培養(yǎng)。其結(jié)果顯示在圖6。
在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，過了6小時之后，hEGF的產(chǎn)生量增加了，經(jīng)過9小時后，其產(chǎn)生量為25mg/l，24小時之后為55mg/l，與實施例1的間歇法相比較約增加了25倍。
但是，其最大的產(chǎn)生量也只停留在55mg/l之程度，另外，菌體繁殖也為OD550的6之程度，離開高密度培養(yǎng)的初期目的還相當遠，因此，進行了進一步探討。
由于已知在培養(yǎng)基中如事先加入色氨酸，則其菌體量就會增加，因此我們決定在基本培養(yǎng)基中添加色氨酸來抑制trp啟動子的工作，以圖增加菌體量。又由于已知，此時在培養(yǎng)基中如殘存有色氨酸，則在添加IAA時就會阻礙trp啟動子的工作，因此可望，在添加IAA時，色氨酸已被分解。
另一方面，甘油與葡萄糖不一樣，它不能形成對分解代謝產(chǎn)物的抑制。另外還知道在分解代謝產(chǎn)物的抑制被解除時，產(chǎn)生了色氨酸酶(色氨酸分解素)，因而分解了大腸桿菌內(nèi)的色氨酸。
所以在添加的培養(yǎng)基中，不是采用葡萄糖，而決定采用甘油。由此可期待如下機理，即存在于基本培養(yǎng)基中的葡萄糖被耗盡時，對分解代謝產(chǎn)物的抑制被解除，而產(chǎn)生色氨酸酶，色氨酸消失，trp啟動子的工作開始進行。
此外，還使所添加的培養(yǎng)基的添加速度也隨大腸桿菌的繁殖進行變化，進行了細致的研究。
實施例3Fed-Batch法之二除在基本培養(yǎng)基中加入色氨酸，以使其濃度達到30mg/l之外，使培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件均與實施例1相同，從3小時后開始添加培養(yǎng)基(含有5g/l酷蛋白氨基酸、200g/l甘油、10mg/l維他命B1、100mg/氨必西林、5mg/lIAA的M9培養(yǎng)基)，4小時之后添加了IAA。又，由于過剩量的IAA會阻礙大腸菌的繁殖與hEGF的產(chǎn)生，因此只加入到5mg/l。
在培養(yǎng)基的添加中，使用了P1管式泵(フアルマシヤ公司制造)、個人用計算機(9801VX41，日本電器公司制造)。對添加速度，是以添加過程中總計可變化49次那樣編制了程序。大腸桿菌的繁殖與hEGF的產(chǎn)生量顯示在圖7。
從大腸桿菌的繁殖速度將降低的5小時之后起，hEGF開始產(chǎn)生，24小時以后，hEGF的產(chǎn)生量達到70mg/l。另外，菌體的繁殖也增加到OD550的9。
從以上結(jié)果得知，hEGF的產(chǎn)生量是隨著菌體量的增加而增加的。
因此，為了進行更高密度的培養(yǎng)，對培養(yǎng)基組成、添加時期進行詳細的研究。具體說來，在培養(yǎng)基中加入宿主大腸桿菌的繁殖所必須的氨基酸，在中途把添加培養(yǎng)基中的碳源由葡萄糖變更為甘油。
如上所述，在葡萄糖的存在下，色氨酸會伴隨著大腸桿菌的繁殖而被消耗，但并不會因為色氨酸酶而被分解。于是，在最初的添加培養(yǎng)基中事先加入葡萄糖與色氨酸，一邊抑制trp啟動子的工作，一邊使大腸桿菌充分繁殖，然后添加IAA，同時把添加培養(yǎng)基變更為含有甘油的物質(zhì)，分解殘存的色氨酸，以加強IAA的作用，增加hEGF的產(chǎn)生量。
實施例4Fed-Batch法之三采用與上述同樣的Fed-Batch法，進行了以下的培養(yǎng)。
(1)培養(yǎng)基組成①基本培養(yǎng)基在M9培養(yǎng)基中加入以下物質(zhì)2.5g/l酷蛋白氨基酸、10g/l葡萄糖、50mg/l色氨酸、0.5g/l脯氨酸、1.0g/l亮氨酸、10mg/l維他命B1、10mg/l氨必西林、微量金屬鹽。
②添加培養(yǎng)基1在M9培養(yǎng)基中加入以下物質(zhì)
40g/l酷蛋白氨基酸、300g/l葡萄糖、50mg/l色氨酸、5g/l脯氨酸、5g/l亮氨酸、10mg/l維他命B1、100mg/l氨必西林、微量金屬鹽。
③添加培養(yǎng)基2在M9培養(yǎng)基中加入以下物質(zhì)40g/l酷蛋白氨基酸、300g/l甘油、5g/l脯氨酸、5g/l亮氨酸、10mg/l維他命B1、100mg/l氨必西林、微量金屬鹽。
(2)培養(yǎng)條件質(zhì)粒(宿主)為pBT23(HB101)培養(yǎng)容量(基本培養(yǎng)基1添加培養(yǎng)基1添加培養(yǎng)基2)為51+0.51+1.01。
培養(yǎng)溫度為37℃，pH為7.0。
通氣量為1.5vvm(7.51/分鐘)攪拌速度為900rpm。
消泡過程為自動進行(通過滴入硅系消泡劑來進行)。
培養(yǎng)基添加時期添加培養(yǎng)基1是在培養(yǎng)開始后的0.5-6小時之內(nèi)(添加速度可變);添加培養(yǎng)基2是在培養(yǎng)開始后的6-24小時之內(nèi)(添加速度一定。50ml/小時)。
IAA的添加時期規(guī)定為培養(yǎng)開始的6小時之后，IAA的濃度為5mg/l。
前培養(yǎng)的培養(yǎng)基規(guī)定與基本培養(yǎng)基相同。
植菌量規(guī)定為10%。
添加培養(yǎng)基1的供給速度是以添加過程中合計變化20次那樣編制了程序。大腸桿菌的繁殖與hEGF的產(chǎn)生量顯示在圖8。
24小時后的OD550為42，達到了培養(yǎng)的高密度化，于是獲得160mg/l的hEGF產(chǎn)生量。
4.附圖的簡要說明圖1顯示了本發(fā)明所涉及的trp啟動子、SD的序列、大腸桿菌堿性磷酸酶信號肽遺傳因子的序列。
圖2顯示了本發(fā)明所涉及的hEGF遺傳因子的序列。
圖3顯示了本發(fā)明所涉及的發(fā)現(xiàn)分泌質(zhì)粒的制備過程。
圖4顯示了本發(fā)明所涉及的發(fā)現(xiàn)分泌的質(zhì)粒pBT23的HindⅢ-BamHⅠ斷片的序列。
圖5顯示了實施例1的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時間(小時)，縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)?！癖硎景l(fā)酵罐中的培養(yǎng);■表示燒杯中的培養(yǎng)。
圖6表示實施例2的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時間(小時)，縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)。●表示發(fā)酵罐中的培養(yǎng);■表示燒杯中的培養(yǎng)。
圖7表示了實施例3的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時間(小時)，縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)以及菌體量(用OD550表示)。○表示菌體量，●表示hEGF量。
圖8表示了實施例4的結(jié)果。橫軸表示培養(yǎng)時間(小時)、縱軸表示培養(yǎng)基中hEGF的量(mg/l)、以及菌體量(用OD550表示)?！鸨硎揪w量、●表示hEGF量。
權(quán)利要求
1.一種hEGF的制法是由以下一系列操作構(gòu)成的遺傳工程方法，即(1)把對所需物質(zhì)進行編碼的遺傳因子組建到載體，(2)使用該載體對宿主大腸桿菌進行轉(zhuǎn)化，(3)對如此獲得的轉(zhuǎn)化體進行培養(yǎng)，(4)通過從培養(yǎng)液中的回收來獲得所需物質(zhì)，其特征在于(a)所需物質(zhì)為hEGF；(b)在上述(1)的操作中，于hEGF遺傳因子之上流領(lǐng)域組建對色氨酸(trp)合成酶系遺傳因子的啟動子進行編碼的遺傳因子以及對大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子的信號肽進行編碼的遺傳因子，而在下流領(lǐng)域中組建連續(xù)了的2個終止密碼子以及復制終止區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的hEGF制法，其特征是通過在培養(yǎng)時添加3-吲哚丙烯酸(IAA)，對宿主大腸桿菌產(chǎn)生hEGF的時期及量進行控制。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的hEGF的制法，其特征是培養(yǎng)方法是使用在添加速度上下了功夫的Fed-Batch法的高密度培養(yǎng)方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hEGF的制法，其特征是在Fed-Batch法中，作為要添加的培養(yǎng)基的碳源是采用葡萄糖、甘油或葡萄糖與甘油的組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的hEGF的制法，其特征是在Fed-Batch法中，作為要添加的培養(yǎng)基的碳源是使用葡萄糖之后再使用甘油。
全文摘要
一種作為遺傳工程方法的hEGF制法，其特征是在載體中組建能對hEGF進行編碼的遺傳因子，于hEGF遺傳因子之上流領(lǐng)域組建能對色氨酸合成酶系遺傳因子的啟動子進行編碼的遺傳因子以及能對大腸桿菌堿性磷酸酶遺傳因子信號肽進行編碼的遺傳因子，而在下流領(lǐng)域中組建連續(xù)了的2個終止密碼子以及復制終止區(qū)。
文檔編號C07K14/485GK1039843SQ8910457
公開日1990年2月21日 申請日期1989年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1988年7月15日
發(fā)明者矢野純一, 村井正俊 申請人:日本新藥株式會社