專利名稱：細胞毒性藥物結(jié)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機化學(xué)、免疫學(xué)及藥物化學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明提供了細胞毒性藥物結(jié)合物，它們可用于將細胞毒性藥物定靶施用于需要這種治療的病人。藥物結(jié)合物的定靶是利用抗體達到的，這些抗體能識別與需用細胞毒性藥物治療的細胞相結(jié)合的抗原，并因此將細胞毒性藥物傳遞給細胞。本發(fā)明還提供了用于合成結(jié)合物的中間產(chǎn)物。
用藥物治療癌癥現(xiàn)在已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)中的一個組成部分。但所用藥物是具有活性的細胞毒性藥劑，這種藥物對病人有危險。為了限制毒性，必須嚴格控制施用劑量和頻率。本發(fā)明通過抗體緩解了這一毒性問題，即利用抗體將長春花堿(Vinca)藥物導(dǎo)向癌細胞，從而減少與病人正常組織接觸的細胞毒性藥物的數(shù)量。進一步，本發(fā)明中用于使藥物和抗體結(jié)合的連接子是不穩(wěn)定的，它可將藥物定靶釋放于癌細胞。
本發(fā)明提供了一系列通過連接子系統(tǒng)與抗體連接的長春花堿藥物結(jié)合物，所述連接子系統(tǒng)具有相當良好的藥物釋放特性，這些結(jié)合物都是生理活性形式的藥物結(jié)合物。
本發(fā)明提供了一種具有下式的細胞毒性藥物結(jié)合物
其中，Ab是一種生理上可接受的抗體或其識別抗原的片段，它能識別與不良細胞結(jié)合的抗原，m是從1至大約10的整數(shù)，Z是氫或C1-C3直鏈烷基;
X是一個鍵、C1-C4亞烷基、C2-C4亞烯基或氨基-C1-C4亞烷基;
Y是一個鍵、羰基、-O-、-S-、或磺酰基，前提是如果X是氨基亞烷基，則Y是羰基或磺?；绻鸛是一個鍵，則Y是一個鍵或羰基;
Ar是吡咯基、間苯基或?qū)Ρ交?，苯基上可由溴、氯、氟、甲氧基、硝基或C1-C2烷基單取代或雙取代;
V是具有下式的長春花堿藥物
其中，R是H、CH2或CHO;在單獨論及R2和R3時，R3是H，R1和R2之一是乙基，另一個是H或OH;當R2和R3與它們與之結(jié)合的碳原子一起論及時，它們形成環(huán)氧乙烷，此時R1是乙基;R4是H、(C1-C3烷基)-CO、或氯取代的(C1-C3烷基)-CO。
本發(fā)明還提供了制備上述結(jié)合物的新的中間產(chǎn)物，樣些中間產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式為
其中R5是羥基、一個酸性活化基團、一個構(gòu)成鹽的半分子、或一個酸性保護基團，其他可變基團定義如上。
本發(fā)明還提供了通過給病人非腸道施用本發(fā)明的結(jié)合物而控制不良細胞生長的方法。本發(fā)明進一步的方面是一種藥物治療組合物，它含有分散于非腸道施用基質(zhì)中的本發(fā)明的結(jié)合物。
本發(fā)明更進一步的方面是制備上述結(jié)合物的方法，包括使上述的中間產(chǎn)物與上式中所述的抗體或其片段反應(yīng)。另一種方法則包括使式子為H2N-HN-V的長春花堿酰肼與式子為
的中間產(chǎn)物反應(yīng)。
本發(fā)明的長春花堿藥物結(jié)合物由抗體、連接子和酰肼型的長春花堿藥物組成。此結(jié)合物的顯著療效性質(zhì)主要由連接子的性質(zhì)產(chǎn)生，它被設(shè)計成能以對靶細胞產(chǎn)生最大藥物毒性的方式由抗體釋放長春花堿藥物。下面將分別討論結(jié)合物中的三個主要組分，說明結(jié)合物的合成，最后，將給出結(jié)合物合成和生物效應(yīng)的實例。
抗體結(jié)合物中抗體部分的基本性質(zhì)是它能夠識別與不良細胞結(jié)合的抗原。應(yīng)當理解，長春花堿藥物對許多種細胞都具有很強的細胞毒性。因此，在用藥物殺傷細胞或控制其生長時，選擇能夠識別這種細胞并與之結(jié)合的抗體。
抗體的來源對于本發(fā)明并不是關(guān)鍵的，可以選自任一類免疫球蛋白或其亞類，包括IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。同樣，來源的生物種也不是關(guān)鍵的，只要其抗體能定靶于長春花堿藥物能發(fā)揮有用效應(yīng)的細胞就行。
在現(xiàn)有技術(shù)中，藥物結(jié)合物中使用最多的是單克隆抗體，本發(fā)明也優(yōu)選使用它們。但并不排除多克隆抗體。一種更新類型的抗體是嵌合抗體，它是在實驗室中通過重組技術(shù)制備的，該技術(shù)能夠表達修飾的DNA，此DNA既編碼任一所需抗體的抗原結(jié)合區(qū)，又同時編碼任一所需的其他氨基酸順序。因此，本發(fā)明可以得到并使用這樣的嵌合抗體，它的一部分來自一個種，另一部分來自另一個種。使用嵌合抗體也是本發(fā)明所優(yōu)選的。
抗體的來源和特性并不是關(guān)鍵的，只要它能定靶于待治療的細胞，并且不使結(jié)合物產(chǎn)生不能接受的毒性就行。根據(jù)本發(fā)明的公開，普通專業(yè)人員能夠很容易地用候選抗體制備結(jié)合物并評價它們。為方便起見，下面將討論一下評價抗體和結(jié)合物的方法。首先，抗體應(yīng)當由具有足夠穩(wěn)定性的雜交瘤產(chǎn)生，從而能允許制備出一定數(shù)量的抗體?？贵w本身應(yīng)當能夠經(jīng)受結(jié)合反應(yīng)和純化過程，尤其是應(yīng)當具有足夠的水溶性，使得能夠以一定的濃度進行化學(xué)操作。
首先評價用候選抗體制備的結(jié)合物的抗原結(jié)合能力。可以期望，游離抗體的結(jié)合能力會被適度降低，這種降低是可以接受的。然后測試結(jié)合物，以確定其針對抗原陽性細胞的離體細胞毒性。在同樣的檢測中，有效結(jié)合物的細胞毒性要比游離藥物的略低一些。然后根據(jù)Johnson和Laguzza的方法(CancerRes.473118-22，1987)，利用裸鼠人腫瘤異種移植模型評價通過了前兩項測試的結(jié)合物。候選結(jié)合物應(yīng)當與游離藥物、游離藥物和游離抗體的混合物、以及帶有非定靶免疫球蛋白的結(jié)合物一同在裸鼠中測試，它應(yīng)當比所有這些更有效或更安全。劑量范圍和施用頻率的研究應(yīng)當用異種移植模型進行。
使在異種移植模型中有效的結(jié)合物進行動物試驗，所用動物已知能表達與人相似類型的感興趣的抗原。如果結(jié)合物在此測試中與抗原產(chǎn)生顯著的結(jié)合，并且在由異種移植模型預(yù)測有療效的劑量下基本上沒有毒性，則可以認為候選結(jié)合物具有治療潛力。
許多目前已知的抗體能都用于本發(fā)明中。一個感興趣的具體抗體是L/1C2，它是由寄存于美國典型培養(yǎng)物收集中心(Rockville，MD)的雜交瘤HB9682產(chǎn)生的。
抗體5E9C11是由ATCC雜交瘤HB21產(chǎn)生，它識別由許多腫瘤表達的鐵傳遞蛋白受體。一種稱為B72.3的抗體可由國立癌癥研究所得到，它能識別由乳腺癌和結(jié)腸癌二者表達的抗原。
OKT3和OKT4是兩種具有非腫瘤抗原反應(yīng)活性的感興趣抗體，它們分別與外周T細胞和人T輔助細胞結(jié)合。它們分別由寄存于ATCC的CRL8001和CRL8002雜交瘤產(chǎn)生。
下列是可用于各種治療目的的其他的抗體來源。由ATCC培養(yǎng)物HB2、HB22、HB44、HB78和HB136產(chǎn)生的抗人淋巴細胞和單核細胞抗體，它們可用于免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療。一種由ATCC培養(yǎng)物HB84產(chǎn)生的抗鐵傳遞蛋白受體的抗體，它可用于腫瘤治療。ATCC培養(yǎng)物HB8059產(chǎn)生針對結(jié)腸直腸癌單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體，培養(yǎng)物HB8136產(chǎn)生針對成熟人T細胞表面抗原的抗體，它們可用于免疫調(diào)制和T細胞白血病治療。
本領(lǐng)域的專業(yè)人員很容易確定另一些候選抗體。關(guān)于易得到抗體的一個特別有用的信息來源是《Linscott'sDirectoryofImmunologicalandBiologicalReagents》(Linscott'sDirectory出版，40GlenDrive，MillValley，California94941)。該書的1984版列出了60多種腫瘤相關(guān)的單克隆抗體，并且每種至少有一個商業(yè)來源。
應(yīng)當理解，用本發(fā)明的結(jié)合物可以治療多種不良細胞。眾所周知，長春花堿藥物對各種類型的癌癥都有效，癌細胞被認為是優(yōu)選的由本發(fā)明結(jié)合物定靶的細胞。
尤其是，還包括支持惡性腫瘤持續(xù)發(fā)育的細胞，以及控制抗腫瘤免疫作用發(fā)生的免疫系統(tǒng)細胞。作為靶子的具體類型的癌相關(guān)細胞包括上皮鱗狀癌細胞、腺癌細胞、小細胞癌細胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞、黑素瘤細胞、腎細胞癌細胞、移行細胞癌細胞、肉瘤細胞、支持腫瘤脈管系統(tǒng)的細胞和類淋巴腫瘤(如白血病和淋巴瘤)的細胞。
然而，長春花堿藥物還對其他許多類型的細胞具有細胞毒性。因此，可以通過選擇合適的抗體，利用結(jié)合物來殺傷或顯著改變這種不良細胞，例如由病毒粒子感染的細胞，由各種有害因子感染的T細胞，以及免疫系統(tǒng)中促進或控制自身免疫疾病發(fā)生的細胞。
應(yīng)當理解，正確選擇的抗體片段具有與完整抗體相同的效應(yīng)。因此，在實施本發(fā)明時，能夠識別與待治療細胞相結(jié)合的抗原的抗體片段(優(yōu)選F(ab′)2片段)和完整抗體一樣有用。
式Ⅰ中未顯示連接子基團與抗體反應(yīng)和結(jié)合的確切機理，這一點尚不完全清楚。如下面所證實，該反應(yīng)是?；磻?yīng)，抗體分子上有若干位點可接受酰化反應(yīng)。最通常的是認為抗體的?；磻?yīng)是在賴氨酸殘基的游離氨基上進行的。然而，酰化反應(yīng)也能進攻羥基、酚羥基、咪唑環(huán)等，也許還有其他半分子。
式Ⅰ表明，每個抗體分子結(jié)合有1至大約10個連接子-藥物半分子。當然，每抗體分子上的這種半分子數(shù)目是平均數(shù)，因為一批給定的結(jié)合物所含的分子必然有不同的藥物-連接子與抗體的比例。當然，為了最有效地利用昂貴的抗體，每個抗體分子上應(yīng)結(jié)合若干藥物分子。然而，結(jié)合過多的藥物-連接子半分子，通常會對抗體對抗原的識別和結(jié)合能力以及抗體的水溶性產(chǎn)生不利影響，因此必須為m找到一個折衷值。一般說來，m的優(yōu)選值為大約4至大約10。另一優(yōu)選值是從大約3至大約8。
長春花堿藥物近些年來，長春花堿藥物一直是藥學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的目標。已研究的數(shù)量非常之大，它們散見于文獻和專利之中，有幾種已獲準用于治療人的癌癥。用于本發(fā)明結(jié)合物中的長春花堿藥物本身是藥物學(xué)領(lǐng)域已知的，并且專業(yè)人員很容易得到和使用它們。為方便讀者起見，下面將對此藥物作一些討論。
在上面的式Ⅱ中，如果R是甲基，R1是羥基，R2是乙基，R3是H，R4是乙?；?，則代表VLB(長春花堿);如果R是甲?；?，R1是羥基，R2是乙基，R3是H，R4是乙?；瑒t代表長春新堿(VCR);如果R是甲基，R1是乙基，R2是羥基，R3是H，R4是乙?；瑒t代表長春西定(leurosidine);如果R是甲基或甲?；琑1是乙基，R2和R3與它們結(jié)合的碳原子一起形成α-環(huán)氧化物，R4是乙?；?，則分別代表長春素(leurosine)和leuroformine;如果R是甲基，R1是乙基，R2和R3是H，R4是乙酰基，則代表脫氧VLB“B”(4′-脫氧長春西定或4′-表脫氧VLB);如果R是甲基，R2是乙基，R1和R3是H，R4是乙?；瑒t代表脫氧VLB“A”或4′-脫氧VLB;如果R是CHO，R1是乙基，R2和R3是H，R4是乙酰基，則代表4′-表脫氧長春新堿(1-甲?；?1-脫甲基-4′-脫氧長春西定)。
根據(jù)美國專利4，203，898第12欄65行以下和第18欄實例3所述的方法，將長春花堿藥物轉(zhuǎn)化成用于本發(fā)明結(jié)合物中的酰肼。在此方法中，在大約60℃下和密封的試管中，使無水酰肼在乙醇中與合適的長春花堿生物堿反應(yīng)。此反應(yīng)的產(chǎn)物是4-脫乙酰基3-羧基酰肼，因為C-4上的乙酸基在堿性反應(yīng)條件下被水解。如果希望制備在C-4(Ⅱ中的R4是(C1-C3烷基)-CO或氯(C1-C3-烷基)-CO)位的酯，則首先通過與丙酮的反應(yīng)形成N2-亞丙基衍生物而將上述的脫乙?；鵆-3羧基酰肼保護起來。將酰肼上可?；腘H2基團針對?；饔糜行У乇Ｗo起來后，便可以常規(guī)方式用酰基鹵(例如氯乙?；?或酰基酸酐(例如丙酸酐)使此保護過的衍生物?；?。然后，可用酸處理去除保護基團。如果C-3羥基也被?；?有時會發(fā)生)，則此C-3?；蓛?yōu)選采用濕硅膠處理而去除(參見Hargrove，美國專利3，392，173)。
下面列出了一些可以優(yōu)選用于結(jié)合物中的式Ⅱ的長春花堿藥物，及它們在本領(lǐng)域中所用的俗名4-脫乙?；?VLB-3-酸基酰肼(R4＝R3＝氫;R＝甲基;R1＝羥基;R2＝乙基)4-脫乙酰基-VCR-3-羧基酰肼(R4＝R3＝氫;R＝CHO;R1＝羥基;R2＝乙基)4-脫乙?；?4′-表脫氧-VLB-3-羧基酰肼(R4＝R2＝R3＝氫;R＝甲基;R1＝乙基)4-脫乙?；?VLB-4-丙?；?3-羧基酰肼(R4＝COCH2CH3;R＝甲基;R1＝羥基;R2＝乙基;R3＝氫)。
連接子連接子基團X-Y-Ar-C(Z)是一個有機基團，它的一端與羰基鍵合，另一端與酰肼鍵合。與長春花堿酰肼連接的鍵是亞烷基酰肼鍵。但應(yīng)當理解，此鍵在溶液中可能以另外的形式存在，尤其是在生理溶液中。雙鍵可被打開，使得功能團或質(zhì)子與氮原子和碳原子形成鍵。其結(jié)果是，羥基或其他氧關(guān)聯(lián)的基團可能附著于原雙鍵的一側(cè)，而氨基關(guān)聯(lián)的半分子也可能是這樣。水能夠與這些原子之一形成弱鍵?？贵w的半分子也能夠與其中的一個原子形成弱鍵，可能發(fā)生不止一個這種反應(yīng)，從而形成混合物。但這種產(chǎn)物是暫時的，在所有本說明書中，結(jié)合物都將以亞烷基酰肼的形式描述，因為這是其中普遍而穩(wěn)定的形式。
X基團可以僅僅是一個鍵，或可以是C1-C4亞烷基，例如亞甲基、亞乙基、亞丁基、2，2-亞丙基、異亞丁基或1，2-二甲基亞乙基;或可以是C2-C4亞烯基，例如乙烯基、烯丙基或2-甲基烯丙基;或可以是氨基-C1-C4亞烷基，例如氨基亞甲基、氨基亞乙基、氨基-3-甲基亞丙基、氨基-1，1-二甲基亞乙基等。如果X是氨基亞烷基，則氨基鄰接于Y基團。優(yōu)選的X基團包括一個鍵、C1-C2亞烷基和氨基-C1-C3亞烷基，例如亞甲基、亞乙基、氨基亞甲基和氨基亞丙基。
Y基團是一個橋接基團，它可以僅僅是一個鍵，或可以是羰基、磺?；?、氧或硫。優(yōu)選的Y基團是一個鍵、氧和羰基。
X和Y基團相互連接，并不是所有的Y基團都能與某些X基團結(jié)合。當X是氨基亞烷基時，Y只能是羰基或磺?；?當X是一個鍵時，Y只能是一個鍵或羰基。
Ar基團是吡咯基或苯基。苯基連接于間位或?qū)ξ?，苯基可以是未取代的，或是用所述基團單取代或雙取代的。典型的取代的Ar基團包括2-溴-間-苯基、3-氯-對-苯基、2，5-二氟-對-苯基、3-甲氧基-5-氯-對苯基、2，6-二硝基-間苯基、3-丙基-對苯基、2-甲基-5-氟-間苯基等。優(yōu)選的Ar基團包括未取代的苯基(尤其是對苯基)和單取代的苯基(尤其是單取代的對苯基)，以及吡咯基。
側(cè)鏈基團Z可以是氫，或C1-C3直鏈烷基，包括甲基、乙基和丙基。優(yōu)選的Z基團是氫和甲基。
為了進一步說明本發(fā)明的結(jié)合物，例舉出下面的連接子基團X-Y-Ar-C(Z)。在每個例子中，連接子基團的命名始于連接子的C(Z)端，向羰基端進行，這是為了使基團的命名具有一致性，因此沒有遵循命名法則。
2-亞甲基吡咯-5-基1-(3-亞甲基吡咯-4-基)乙?；?-(2-亞甲基吡咯-4-基氧基)亞乙基1-〔2-(1，1-亞乙基)吡咯-5-基硫〕-2-甲基亞乙基1-(3-亞甲基苯基)-2-甲基亞丙基1-(2，6-二氯-4-亞甲基苯基硫)亞乙烯基1-〔2，4-二甲基-3-(1，1-亞丙基)苯氧基〕-2-亞丙烯基1-〔3-溴-4-(1，1-亞丁基)苯基〕-3-戊烯酰基4-亞甲基-2-硝基-4-苯甲酰氨基亞甲基1-(4-亞甲基苯基亞磺酰氨基)亞乙基1-(3-甲氧基-4-亞甲基苯基亞磺酰氨基)-3-甲基亞丙基用于本發(fā)明結(jié)合物的優(yōu)選連接子基團是4-亞芐基、1-(4-亞甲基苯甲酰氨基)亞乙基、1-(4-亞甲基苯基)乙烯基、4-亞甲基苯氧基亞甲基、1-(2-亞甲基吡咯-5-基)亞乙基和1-〔4-(1，1-亞乙基)苯氧基〕乙?；?。
中間產(chǎn)物本發(fā)明的中間產(chǎn)物是與抗體反應(yīng)以制備結(jié)合物的反應(yīng)劑。它們由長春花堿酰肼和連接子部分構(gòu)成，末端是羧酸或修飾的羧酸。上面已經(jīng)討論了構(gòu)成中間產(chǎn)物的可變基團，只有末端R5基團例外。如下面合成部分所討論，R5可以是形成酸的羥基，或可以是羧酸活化基團。它也可以是一個形成鹽的半分子，例如堿金屬離子、堿土金屬離子或氨基如二乙基氨基、二乙醇氨基等。它還可以是酸保護基團，這一點可以參見文獻(例如Greene，《Protective Groupsin Organic Synthesis》Wiley，New York，1981，pp.152-92)。這種保護基團包括酯、酰胺和酰肼，尤其是R6基團例如苯甲酰甲基氧基、三氯乙氧基、正丁氧基、三苯基甲氧基、三甲基甲硅烷基氧基、甲錫烷基酯、二甲基氨基等。
優(yōu)選的中間產(chǎn)物是那些含有上述優(yōu)選的X、Y和Ar基團的中間產(chǎn)物。用于反應(yīng)的優(yōu)選的中間產(chǎn)物是那些R5是酸活化基團的中間產(chǎn)物;R5是其他形式的中間產(chǎn)物可用作制備活化形式的中間產(chǎn)物。
中間產(chǎn)物也可以其本身的效力用作抗癌藥物，并可與其中所含有的長春花堿藥物相同的方式和相似的劑量用于此目的。
合成本發(fā)明結(jié)合物是通過這樣的方法制備的這些方法是根據(jù)本領(lǐng)域目前已知的原則分別進行的。在這些方法中，涉及抗體的主要問題當然是盡可能地保留抗體的結(jié)構(gòu)和功能，并且允許中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的純化。根據(jù)這些原則，就能夠或以主要順序進行反應(yīng)步驟(即可以使連接子和抗體結(jié)合，然后使長春花堿酰肼與連接子反應(yīng))，或使連接子和長春花堿酰肼反應(yīng)，然后使產(chǎn)生的中間產(chǎn)物與抗體結(jié)合作為第二步驟。
產(chǎn)生連接子基團的起始化合物的制備，是根據(jù)常規(guī)的有機化學(xué)方法完成的。這些化合物中有許多都是市售可得的，其他的則能夠由有機化學(xué)的普通專業(yè)人員制備。
本發(fā)明中間產(chǎn)物和結(jié)合物的合成示意如下。
流程A
其中，R6是酸保護基團、羥基或構(gòu)成鹽的半分子;酮或醛可能是以二甲基或二乙基縮醛的形式存在。
其中，R7是如下所述的酸保護基團;
其中，酮或醛可能是以二甲基或二乙基縮醛的形式存在;
長春花堿酰肼V-NH-NH2，可作為堿使用，或作為堿的酸加成鹽使用。硫酸鹽特別方便。然而，可以制成通常的酸加成鹽，為進一步的合成提供方便形式的長春花堿酰肼。例如，可以使用這樣的鹽類如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、苯甲酸鹽、馬來酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等，在特殊的反應(yīng)條件下使用它們非常方便。
R7基團是羧酸活化基團，它是從公知的常用于活化羧酸的基團中選出的，用作?；噭?。用于肽化學(xué)中的活化基團在此非常有用。例如，經(jīng)常用作這種活化基團的有如琥珀酰亞胺氧基、苯二甲酰亞氨氧基、甲磺酰氧基、甲苯磺酰氧基、苯磺酰氧基、苯并三唑氧基、氯、溴、疊氮基等。優(yōu)選的羧酸活化基團是琥珀酰亞胺氧基、苯二甲酰亞氨氧基和苯并三唑氧基。
通過使用(例如)二環(huán)己基碳二亞胺或其他典型的酯化試劑，很容易將羧酸活化基團置于起始化合物(R6-CO-X-Y-Ar-(Z)C＝O)或中間產(chǎn)物的羧酸上。這種反應(yīng)在惰性有機溶劑例如二噁烷、四氫呋喃、氯化烴等中進行，反應(yīng)可在大約0-50℃范圍的中等溫度下進行。在下面的制備部分進一步說明了活化的連接子中間體的制備。
本發(fā)明結(jié)合物的各種合成步驟可以兩種方式進行使施行該方法的設(shè)備的產(chǎn)量最大，或使產(chǎn)率最高。在大多數(shù)情況下(即使不是所有情況的話)，反應(yīng)中抗體本身的費用最大，因此反應(yīng)的最佳化要求基于抗體達到最大產(chǎn)率。因此，最佳的操作條件將取決于所用具體抗體的最大穩(wěn)定性所需的條件。進一步，基于抗體的最大產(chǎn)率通常要求反應(yīng)的最后一步應(yīng)當是抗體與中間產(chǎn)物的反應(yīng)。為了達到最大限度地利用抗體，并為了在某種程度上提高昂貴的長春花堿藥物的利用率，最佳操作條件可能是使用大為過量的連接子中間產(chǎn)物。
在選擇使中間產(chǎn)物或活化的連接子中間產(chǎn)物與抗體反應(yīng)的條件時，主要應(yīng)考慮的是維持抗體的穩(wěn)定性。因此，反應(yīng)在其組成對抗體無害的水溶液介質(zhì)中進行。一種特別合適的水溶液介質(zhì)是硼酸緩沖液，其中的硼酸根離子濃度在大約0.1-0.5摩爾濃度的范圍內(nèi)。反應(yīng)基質(zhì)的pH應(yīng)為中性至微堿性，例如在大約7-9的范圍內(nèi)。雖然反應(yīng)介質(zhì)是水溶液，但存在少量的有機溶劑不會有害，而且可能相當有利。例如，可將中間產(chǎn)物或連接子中間產(chǎn)物溶于少量有機溶劑中，然后將有機溶液加至抗體的水溶液中。用于此目的的合適的有機溶劑包括(例如)二甲基甲酰胺、四氫呋喃、二噁烷或乙二醇醚。
一般說來，有必要在較低的濃度下進行反應(yīng)，因為抗體的溶解度一般不會很大。例如，抗體濃度通常在每毫升水溶液介質(zhì)大約5-25mg的范圍內(nèi)。
如上所述，每摩爾抗體分子結(jié)合有1至大約10摩爾的連接子和藥物。為了達到這樣的結(jié)合比例，通常必須使用過量的連接子中間產(chǎn)物或中間產(chǎn)物?？贵w在酰化條件下的反應(yīng)活性有某些不同，但一般說來，在該方法中，每摩爾抗體大約使用5至30摩爾的連接子中間產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。
在大約0°至40℃的溫度范圍下，使抗體的酰化作用進行幾分鐘至幾小時。反應(yīng)本身的速率是很快的，因此，在能使抗體維持可接受的穩(wěn)定性的相對低溫下，通常能夠使該方法達到可接受的產(chǎn)量。本發(fā)明的結(jié)合物及含有抗體的各種中間產(chǎn)物，可方便地根據(jù)常規(guī)方法通過層析法純化。下面的“制備”和“實例”說明了典型的純化過程。涉及抗體的反應(yīng)進程可通過雙波長紫外分析法跟蹤，就象通常分析抗體-藥物結(jié)合物所做的那樣。
進行層析純化時，可用稀的緩沖液水溶液洗脫，它可以與用作后續(xù)步驟水溶液反應(yīng)介質(zhì)的緩沖液水溶液完全一樣。
長春花堿酰肼V-NH-NH2與連接子中間產(chǎn)物的反應(yīng)迅速而且溫和，如果此反應(yīng)是以流程B作為第二步進行的話，則它在大約室溫下和在例如上述的水溶液介質(zhì)中就能正常地進行。一種特別有用的介質(zhì)是稀釋的乙酸緩沖液，尤其是略呈酸性pH(例如大約5-7)的0.1M乙酸鈉。也可使用其他的微酸性緩沖液，例如硼酸、微酸性的磷酸緩沖液、生理緩沖鹽水等。如果此反應(yīng)是以流程A作為第一步驟，則它能在有機溶劑中更有效地進行，例如四氫呋喃、二噁烷、二甲基甲酰胺等。長春花堿藥物的反應(yīng)應(yīng)在暗中進行。
下面的“制備”和“實例”進一步說明了本發(fā)明結(jié)合物的合成。
制備14-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，4-羧基亞芐基酰肼1.3g的4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼溶于50ml四氫呋喃中，并向其中加入5g無水硫酸鈉和2g4-羧基苯甲醛?；旌衔镌诘獨庵泻褪覝叵聰噭觾商欤缓筮^濾，在真空下蒸發(fā)至干燥。將殘渣溶于50ml二氯甲烷中，用水洗滌2次。然后使有機層在硫酸鈉上干燥，并利用硅膠桂通過高壓液相層析進行純化，用8升95∶5的乙酸乙酯∶甲醇至1∶1的乙酸乙酯∶甲醇的線性梯度洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分，在真空下蒸發(fā)至干燥，得到490mg的標題化合物，通過質(zhì)譜儀對其進行鑒別，表明有一個重量為900的分子離子。
制備24-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，4-(N-琥珀酰亞胺氧基)羰基亞芐基酰肼將247mg制備1的中間產(chǎn)物加至63mgN-羥基琥珀酰亞胺中，并加入8ml二氯甲烷。將混合物攪動5分鐘，然后加入113mg二環(huán)己基碳二亞胺，再加入52mg對甲苯磺酸。將混合物攪動1小時，然后在冰浴中冷卻，用pH7的0.05M磷酸二氫鉀萃取2次，每次3ml。有機層用硫酸鈉干燥，然后在硅膠上層析，用95∶5的氯仿∶甲醇洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分，真空下濃縮后得到227mg所需的中間產(chǎn)物。
實例1抗體007B與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿、羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物抗體007B是由一種雜交瘤產(chǎn)生的，該雜交瘤是由Varki等人(CancerResearch44∶681-86，1984)所述的產(chǎn)生抗體KS1/4的雜交瘤產(chǎn)生的亞克隆。將一部分007B在pH8.6，0.34M硼酸緩沖液中透析，濃度為10.3mg/ml。在19.4ml的抗體溶液中，滴加13mg形式為1.6ml二甲基甲酰胺溶液的制備2的中間產(chǎn)物?；旌衔镉谑覝叵略诎抵袛噭?小時，然后離心。上清液通過SephadexG25(Pharmacia，Piscataway，NJ)作凝膠過濾，用pH7.4的生理緩沖鹽水洗脫。洗脫液通過0.2μm孔經(jīng)的濾膜過濾，并進行紫外分析。得到35ml的產(chǎn)物溶液，其中含有3.36mg/ml結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾抗體4.1摩爾長春花堿藥物。
利用在雌性Charles River裸鼠中的UCLA/P3肺腺癌異種移植模型，對結(jié)合物進行活體測定。試驗開結(jié)時，每只小鼠皮下移植107UCLA/P3腫瘤細胞。移植后的第2、5和8天，對每只小鼠注射在生理緩沖鹽水中的結(jié)合物或制備2的中間產(chǎn)物。對照小鼠只注射鹽水。結(jié)合物或長春花堿中間產(chǎn)物的劑量(以長春花堿酰肼的含量為基礎(chǔ))出示如下。在移植后第14、21和28天，測量通過移植誘導(dǎo)的腫瘤大小。每個處理組由5只小鼠組成，但未處理的對照組由10只小鼠組成。下面給出了第28天的結(jié)果。
表1處理劑量mg/kg%抑制實例11.51000.751000.381000.19710.1055制備21.5280.75110.3800.19190.1031實例2抗體007B與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物除了藥物-連接子與抗體的輸入比例不同外，在同樣的條件下進行三種連接反應(yīng)。每種中的抗體都是007B，形式為0.8ml在pH8.6的硼酸緩沖液中的溶液，濃度為12.3mg抗體/ml。
制備2的中間產(chǎn)物以含有30mg/ml中間產(chǎn)物的二甲基甲酰胺溶液的形式提供。將此有機溶液加至每一反應(yīng)的抗體溶液中，使反應(yīng)混合物在暗中攪動2小時。然后如實例1純化，結(jié)果如下。
A.長春花堿藥物中間產(chǎn)物的數(shù)量為0.65mg，以0.02ml溶液的形式提供;再加入0.045ml二甲基甲酰胺。產(chǎn)物為結(jié)合比例為5.7的5.7mg結(jié)合物，形式是6.5ml溶液。
B.使用了1.3mg長春花堿-連接子中間產(chǎn)物，形式為0.04ml溶液再外加0.025ml二甲基甲酰胺。產(chǎn)物為在5.4ml溶液中的0.7mg結(jié)合物，結(jié)合比例為7.2。
C.使用了在0.065ml溶液中的1.95mg中間產(chǎn)物。沒有得到產(chǎn)物。
測定實例2A的產(chǎn)物針對組織培養(yǎng)中的UCLA/P3腺癌細胞系的效應(yīng)，測定方法是通過測量3H-亮氨酸摻入細胞中的抑制率，來確定它針對癌細胞的細胞毒性。結(jié)合物的50%抑制濃度是0.08μg/ml，制備1的中間產(chǎn)物的IC50是0.07μg/ml，4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼的IC50是0.001μg/ml。
實例3抗體007B與4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物以大得多的規(guī)模進行類似實例1的結(jié)合，起始物為40ml含有10mg007B抗體/ml的抗體溶液。在抗體溶液中加入3.3ml含有63.8mg制備2的中間產(chǎn)物的二甲基甲酰胺溶液。再另外加入4.8ml二甲基甲酰胺。反應(yīng)混合物在暗中攪動1.5小時，然后如實例1所述純化，得到在120ml生理緩沖鹽水中的278mg結(jié)合物溶液，結(jié)合比例為4.8。通過真空透析至pH7.4的生理緩沖鹽水中使產(chǎn)物濃縮，得到含有7.2mg/ml結(jié)合物的18ml溶液，結(jié)合比例為4.4。
基本上如實例1所述，在雌性裸鼠中活體測定結(jié)合物針對UCLA/P3誘導(dǎo)的腫瘤的效應(yīng)。在移植后的第15、17、20和23天施用藥物，根據(jù)Geran等人(CancerChemother.Reports31，1972)的方案，在第27、34、41和48天測量腫瘤并估測其重量。
當結(jié)合物的施用始于第15天時，腫瘤的平均重量為1克。未處理對照動物中的腫瘤持續(xù)穩(wěn)定地生長，在第48天時的平均重量大約為6克。施用0.5、1和2mg/kg劑量的上述結(jié)合物形式的長春花堿藥物使腫瘤退化。在第27天觀察時，所有處理組中的腫瘤平均重量是大約250mg。在第48天時，1和2mg/kg處理組的腫瘤仍是200mg或更少。在第48天，0.5mg/kg組的腫瘤重量長至1克，這正是開始處理時的重量。
在另一個實驗中，在移植后的第16、19、22和25天，對移植了UCLA/P3的異種移植小鼠施用類似的但不同批號的同樣的結(jié)合物。此時的腫瘤平均重量大約1300mg。0.25mg/kg的劑量(以長春花堿酰肼含量為基礎(chǔ))延緩腫瘤的生長，但并不使其退化。0.5、1或2mg/kg的劑量使腫瘤退化，因此在37天時，所有三種處理中的腫瘤平均重量只有大約300mg。2mg/kg的處理使腫瘤平均重量在51天內(nèi)在此水平保持恒定;但接受0.5和1mg/kg的小鼠，其腫瘤的平均重量在51天時為大約700mg。
實例4抗體L4KS與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物如Starling等人所述(J.Cell.Biochem.Supp.11B1982，1987)，將抗體L4KB透析至pH8.6的0.34M硼酸緩沖液中，使其濃度為11.3mg/ml。使用10mg在此溶液中的抗體，在其中加入0.78mg在0.072ml二甲基甲酰胺溶液中的制備2的中間產(chǎn)物?；旌衔镉谑覝叵略诎抵袛噭?小時，然后離心。上清液在Biogel P6(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA94804)柱上層析，用生理緩沖鹽水洗脫。收集含有產(chǎn)物的組分，在真空下濃縮，對產(chǎn)物進行紫外分析，在279和293nm處觀察曲線，確定得到了結(jié)合比例為3.2的8.7mg結(jié)合物，其形式為含有1.5mg/ml的溶液。通過測定結(jié)合物針對組織培養(yǎng)中的UCLA/P3細胞的細胞毒性來評價結(jié)合物。結(jié)合物的IC50是0.024μg/ml，而4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼的IC50是0.001μg/ml。
實例5抗體14、95、55與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物如Corvalan等人所述(ProtidesofBiol.Fluids31921-24，1984)，將一部分抗體14、95、55透析至pH8.6的硼酸緩沖液中，得到1ml含有8.32mg抗體的溶液。在此溶液中加入在0.08ml二甲基甲酰胺溶液中的0.66mg制備2的中間產(chǎn)物。反應(yīng)混合物于室溫下在暗中攪動45分鐘，然后如實例1所述純化混合物，得到3.0mg結(jié)合比例為4.8的結(jié)合物，其形式為3.7ml生理緩沖鹽水溶液。
用放射免疫檢測法測定結(jié)合物的結(jié)合能力，并與未結(jié)合的抗體比較。結(jié)合物與抗體的滴定曲線基本相似，表明結(jié)合后并未顯著改變抗體的結(jié)合能力。
實例6抗體B72.3與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物抗體B72.3已由Colcher等人描述過(Proc.Natl.Acad.Sci.USA78199-203，1981)，并可由國立癌癥研究所得到。將一部分此抗體透析至pH8.6的硼酸緩沖液中，使其濃度為10mg/ml。在3種結(jié)合中各使用5mg抗體。每種結(jié)合中的長春花堿中間產(chǎn)物都是制備2的，以含有30mg/ml的溶液提供。反應(yīng)于室溫下在暗中進行2小時，混合物如實例1所述純化。
A.使用了在0.01ml溶液中的0.32mg長春花堿-連接子中間產(chǎn)物，再加入0.02ml二甲基甲酰胺。產(chǎn)物為在2ml溶液中的2.8mg結(jié)合物，結(jié)合比例為3.0。
B.使用了在0.02ml溶液中的0.65mg中間產(chǎn)物，再加入0.01ml二甲基甲酰胺。產(chǎn)物為在2ml溶液中的1.2mg結(jié)合物，結(jié)合比例為4.9。
C.使用了0.97mg在0.03ml溶液中的中間產(chǎn)物，產(chǎn)物為在2.7ml溶液中的0.5mg結(jié)合物，結(jié)合比例為6.6。
測定實例6C的產(chǎn)物針對組織培養(yǎng)中的LS174T腺癌細胞的效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)此結(jié)合物的細胞毒性IC50是0.047μg/ml，而4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿酰肼和制備1的中間產(chǎn)物各為0.0001。
實例7抗體KS1/4S2與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物抗體KS1/4S2是如Varki等人所述(CancerResearch44681-66，1984)的抗體KS1/4的抗原識別部分，將一部分抗體KS1/4S2以18mg/ml的濃度溶于pH8的0.34M硼酸緩沖液中。進行三種結(jié)合反應(yīng)，每一種都使用0.56ml的抗體溶液。每一反應(yīng)中，使抗體與制備2的中間產(chǎn)物結(jié)合，后者是以含有43.5mg/ml長春花堿藥物的二甲基甲酰胺溶液提供的。在每種反應(yīng)中，反應(yīng)都于室溫下在暗中進行1.5小時。反應(yīng)以后，反應(yīng)混合物如實例1純化。
A.使用了0.015ml長春花堿溶液，再加入0.03ml二甲基甲酰胺。產(chǎn)物數(shù)量為8.2mg，結(jié)合比例為2.1，形式為4.8ml在生理緩沖鹽水中的溶液。
B.使用了0.03ml長春花堿溶液，再加入0.015ml二甲基甲酰胺。產(chǎn)物是在5.2ml溶液中的7.8mg結(jié)合物，結(jié)合比例為3.6。
C.使用了0.045ml長春花堿溶液，得到在5.4ml溶液中的7.6mg結(jié)合物，結(jié)合比例為5.4。
通過放射免疫檢測法測定結(jié)合物的結(jié)合能力，結(jié)果表明，產(chǎn)物A的相對結(jié)合能力是天然抗體結(jié)合能力的54%，產(chǎn)物B為48%，產(chǎn)物C為37%。
制備3L/1C2抗體的生產(chǎn)冷凍的L/1C2雜交瘤瓶得自美國典型培養(yǎng)物收集中心，寄存號為HB9682。使小瓶在37℃水浴中旋轉(zhuǎn)，使其內(nèi)容物融化而回收可存活細胞。細胞懸浮液然后用平衡鹽溶液(GrandIslandBiologicalCompany(GIBCO)，3175StaleyRoad，GrandIsland，NewYork14072)以1∶2稀釋，使懸浮液通過血清底墊層離心，從而將細胞從冷凍基質(zhì)中分離出來。吸出上清液，將沉淀中的細胞懸浮至在T150組織培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基中(VentrexHL-1，VentrexLaboratories，Portland，ME)，其中補充有10%小牛血清，2mML-谷氨酰胺(GIBCO)和50μg/ml慶大霉素硫酸鹽(GIBCO)，培養(yǎng)瓶置于5%二氧化碳和37℃下。收集來自幾乎融合的培養(yǎng)物的上清液，通過離心去除細胞殘渣。使無細胞的上清液通過蛋白ASepharose柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，以從中純化抗體?？贵w結(jié)合在柱上，而培養(yǎng)基在pH8.0的0.01M磷酸鈉中被洗下。然后用pH3.5的0.1M磷酸鈉緩沖液由柱中洗脫抗體。洗脫的抗體立即用pH7.4的1MTrizma緩沖液(Sigma，St.Louis，MO)中和，在含有pH7.4的0.01M磷酸鈉和0.15M氯化鈉的真空透析儀(Bio-MolecularDynamics，Beaverton，OR)中透析和濃縮。使抗體制劑通過0.2μm孔徑的膜過濾而滅菌，貯存于4℃?zhèn)溆谩?br> 實例8抗體L/1C2與4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物在小瓶中加入10mg抗體L/1C2，形式為5.6ml在pH8的0.34M硼酸緩沖液中的溶液。在其中加入在0.45ml二甲基甲酰胺中的0.65mg制備2的中間產(chǎn)物?；旌衔镉谑覝叵聰噭?.5小時，然后離心。上清液在SephadexG25上通過層析純化，用生理緩沖鹽水洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分，得到在5.4ml溶液中的1.3mg結(jié)合物，通過紫外分析測定，其結(jié)合比例為每摩爾6.2摩爾。
測定產(chǎn)物針對組織培養(yǎng)中的T222細胞的效應(yīng)。它在0.032mcg/ml時抑制40%的細胞生長，在0.32mcg/ml時抑制70%。與此相比較，4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼在0.01mcg/ml時抑制45%的細胞生長，在0.1mcg/ml時抑制82%。
制備43-(4-甲?；交驶被?丙酸，N-琥珀酰亞胺酯在250ml瓶中加入在100ml二噁烷中的3g4-羧基苯甲醛和2.3gN-羥基琥珀酰亞胺。混合物攪動5-10分鐘，然后加入4.1g二環(huán)己基碳化二亞胺?；旌衔镉谑覝叵聰噭?小時，然后過濾。濾液在真空下蒸發(fā)后得到9.4g白色固體，使其在25ml熱的異丙醇中再結(jié)晶。用丙醇研制此中間產(chǎn)物，得到2.1g所需的4-羧基苯甲醛的N-琥珀酰亞胺酯。
再制備另外幾批此中間產(chǎn)物，將總量為10g的上述N-琥珀酰亞胺酯，加至在40ml1N氫氧化鈉和大約100ml水中的3.6gβ-丙氨酸溶液中。混合物攪動1.5小時，其間使pH保持在8以上。然后使混合物過濾，濾液用2N鹽酸酸化至pH1.9。用總量為150ml的乙酸乙酯萃取3次，合并有機層并用鹽水洗滌。然后使有機層在硫酸鈉上干燥，在真空下蒸發(fā)后得到4.6g白色固體，即3-(4-甲酰基苯基羰基氨基)-丙酸。
在一個小瓶中，加入100mg上述的中間產(chǎn)物、103mg二環(huán)己基碳化二亞胺、57.5gN-羥基琥珀酰亞胺和10ml二噁烷，混合物于室溫下在氮中攪動。通過薄層層析觀察反應(yīng)進程，再加入75mg二環(huán)己基碳化二亞胺和45mgN-羥基琥珀酰亞胺。4小時后使反應(yīng)混合物過濾，濾液在真空下蒸發(fā)成固體。得到大約200mg不純的產(chǎn)物，使其在30g硅膠上層析，用在二氯甲烷中的5%異丙醇洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分，蒸發(fā)后得到81mg不太純形式的所需中間產(chǎn)物。
制備5 抗體L/1C2 F(ab′)2片段抗體L/1C2的F(ab′)2片段如下制備將含有12.6mg胃蛋白酶/ml的2.4ml胃蛋白酶溶液，加至在270ml生理緩沖鹽水中的1.5gL/1C2抗體中。混合物于37℃放置2小時20分鐘，然后加入三乙醇胺終止反應(yīng)。然后通過在快速Sepharose(Pharmacia)柱上的層析濃縮產(chǎn)物，用0.15M乙酸鈉洗脫。合并含有F(ab′)2的組分，通過透析濃縮后得到100ml產(chǎn)物溶液，其中含有992mg抗體L/1C2的F(ab′)2片段。
制備6抗體L/1C2F(ab′)2片段，3-(4-甲?；交驶被?丙酰基衍生物將制備5中制備的L/1C2 F(ab′)2片段透析至pH8.6的0.34M硼酸緩沖液中，得到23mg在3.8ml溶液中的F(ab′)2片段。使此溶液與在102μl乙腈中的0.44mg3-(4-甲?；交驶被?丙酸，N-琥珀酰亞胺酯合并?；旌衔镉谑覝叵聰噭?小時，然后使溶液在11g Sephadex G25柱上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分，得到在9.6ml溶液中的19mg衍生的抗體片段，結(jié)合比例為每摩爾2.8摩爾。
實例9 L/1C2 F(ab′)2片段與4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，丙酰基-3-氨基羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物8mg制備6的中間產(chǎn)物加至6.9mg固體的4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼中。加入稀鹽酸將pH調(diào)至5.6，混合物于室溫下攪動21小時。然后使混合物離心，上清液在11gSephadexG25柱上層析，用生理緩沖鹽水洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分，過濾后得到4.8ml產(chǎn)物溶液，在280和325nm處觀察曲線進行紫外分析，發(fā)現(xiàn)此溶液含有3.5mg結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾抗體片段3.5摩爾長春花堿藥物。
如前述測定結(jié)合物針對細胞培養(yǎng)中的T222細胞的細胞毒性。以長春花堿酰肼的含量為基礎(chǔ)，在0.1μg/ml時沒有效應(yīng)，在1μg/ml時抑制85%的生長。
制備7抗體14.95.55，3-(4-甲?；交驶被?丙?；苌飳⒁徊糠挚贵w14.95.55透析至pH8.6的0.34M硼酸緩沖液中，得到含有11.6mg/ml抗體的溶液。將含有45.2mg抗體的3.9ml溶液加至10ml瓶中，在其中加入溶于132μl乙腈中的含有0.57mg制備4的中間產(chǎn)物的溶液?；旌衔镉谑覝叵聰噭?小時，然后在10gSephadexG25柱上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。使含有產(chǎn)物的組分過濾并作紫外分析，在258和280nm處觀察峰。得到40mg衍生物的產(chǎn)率，形式為含有2.6mg/ml的溶液。結(jié)合比例為每摩爾抗體4.1摩爾連接子。
實例10抗體14.95.55與4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，丙酰基-3-氨基羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物在瓶中加入14.75ml含有38.3mg修飾抗體的制備7的中間產(chǎn)物溶液，加入2.6ml1M磷酸緩沖液，然后加入22.2mg4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼硫酸鹽?；旌衔镉谑覝叵聰噭舆^夜，然后離心15分鐘，在45gSephadexG25柱上層析，用生理緩沖鹽水洗脫。對含有產(chǎn)物的組分作紫外分析，在280和325nm處觀察曲線，結(jié)果表明得到21.8mg結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾抗體3.8摩爾藥物。
測定結(jié)合物針對組織培養(yǎng)中的UCLA/P3細胞的效應(yīng)。以長春花堿酰肼的含量為基礎(chǔ)，其50%抑制濃度是0.035μg/ml。
利用異種移植了LS174T結(jié)腸癌細胞的雌性CharlesRiver小鼠，測定類似的但不同批號的同樣的結(jié)合物針對小鼠中誘導(dǎo)出的腫瘤的效應(yīng)。結(jié)合物在移植后的第9、11、14和17天靜脈施用，此時的平均腫瘤重量大約為1000mg。0.25mg/kg的劑量(以長春花堿酰肼的含量為基礎(chǔ))只是稍微減緩快速生長腫瘤的生長，在第28天，對照小鼠的腫瘤重10g。施用0.5mg/kg的小鼠的腫瘤平均重量為大約4.5g，施用1mg/kg的小鼠的腫瘤平均重量為大約1g，與開始處理時相比基本上沒有改變。
制備84-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，4-羧基甲氧基-α-甲基亞芐基酰肼1g4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼溶于75ml四氫呋喃中，再加入1.52g4-乙?；窖跻宜?。加入10ml二甲基甲酰胺和5g硫酸鈉，反應(yīng)在無水條件下于室溫攪動過夜。使反應(yīng)混合物過濾，濾液在真空下蒸發(fā)后得到固體殘渣，使其在硅膠上通過高壓液相層析純化，用在乙酸乙酯中的5%至50%甲醇的線性梯度洗脫。
濃縮含有產(chǎn)物的組分產(chǎn)生490mg所需的中間產(chǎn)物，通過質(zhì)譜分析鑒定，顯示出重量為900、944、957和973的分子離子。
制備94-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，4-琥珀酰亞胺氧羰基甲氧基-α-甲基亞芐基酰肼300mg制備8的中間產(chǎn)物溶于25ml二甲基甲酰胺中，溶液在冰浴中在氮下冷卻。在其中加入86μlN-甲基嗎啉，混合物攪動20分鐘。然后加入81μl異丁基氯甲酸酯，混合物再攪動20分鐘。然后加入108mgN-羥基琥珀酰亞胺，使混合物攪動過夜，同時使之緩慢回升至室溫。然后在真空下除去揮發(fā)物質(zhì)，殘渣置于二氯甲烷中并用鹽水洗滌。有機層用硫酸鈉干燥，在真空下蒸發(fā)后得到110mg所需的活性酯。
實例11抗體007B與4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，羰基甲氧基-α-甲基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物使抗體007B以4.05mg抗體/ml的濃度透析至pH8.6的0.34M硼酸緩沖液中。用不同量的制備9的中間產(chǎn)物進行兩種結(jié)合反應(yīng)。每種反應(yīng)中的抗體用量為12.15mg，形式為3ml的抗體溶液。與抗體的反應(yīng)于室溫下進行1小時，然后使反應(yīng)混合物離心，上清液在SephadexG25柱上通過層析純化，用生理緩沖鹽水洗脫。對含有產(chǎn)物的組分作紫外分析，在279和285nm處觀察曲線。
A.使用4.2mg溶于240μl二甲基甲酰胺中的制備9的中間產(chǎn)物。產(chǎn)物為在7.5ml溶液中的6mg結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾5.2摩爾。
B.中間產(chǎn)物的用量為溶于240μl二甲基甲酰胺中的6.3mg，得到在6ml溶液中的1.56mg結(jié)合物，結(jié)合比例為11.4。
根據(jù)前述的細胞毒性測試法，測定結(jié)合A的產(chǎn)物針對組織培養(yǎng)中的UCLA/P3腺癌細胞的效應(yīng)。發(fā)現(xiàn)濃度為50ng/ml的結(jié)合物抑制29%的細胞生長，濃度為100ng/ml時抑制93%。制備8的未結(jié)合中間產(chǎn)物的活性在細胞毒性測試中基本與此相同。
制備104-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，4-羧基甲氧基亞芐基酰肼用940mg4-甲?；窖跻宜徇M行與制備8基本相同的方法。產(chǎn)物為170mg所需的中間產(chǎn)物，質(zhì)譜分析顯示出重量為886、944和958的分子離子。
制備114-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，4-琥珀酰亞胺氧基羰基甲氧基亞芐基酰肼進行與制備9相同的方法，起始物質(zhì)為500mg制備10的中間產(chǎn)物、145μlN-甲基嗎啉、137μl異丁基氯甲酸酯和182mgN-羥基琥珀酰亞胺。產(chǎn)物為160g所需的活性酯。
實例12抗體007B與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，羰基甲氧基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物利用制備11的中間產(chǎn)物，在與實例11相同的條件下進行兩種結(jié)合反應(yīng)。結(jié)合A的產(chǎn)物為在5.8ml溶液中的6.6mg結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾3.5摩爾。結(jié)合B的產(chǎn)物為在7.2ml溶液中的6.0mg結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾5.2摩爾。
測定結(jié)合A的產(chǎn)物針對組織培養(yǎng)中的UCLA/P3細胞的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在100ng/ml時的生長抑制率為33%，在250ng/ml時為100%。制備10的中間產(chǎn)物的細胞毒性與此基本相同。
制備123-(5-甲?；量?2-基羰基氨基)丙酸，N-琥珀酰亞胺酯在瓶中加入139mg5-甲酰基吡咯-2-基羧酸、247mg二環(huán)己基碳化二亞胺、138mgN-羥基琥珀酰亞胺和10ml二甲基甲酰胺?；旌衔镉谑覝卦诘聰噭?小時，在真空下除去溶劑，得到394mg粗制活性酯。
上述殘渣置于1ml乙腈中。并非所有的殘渣都被溶解。將此異質(zhì)混合物緩慢加至在2ml0.5N氫氧化鈉中的89mgβ-丙氨酸溶液中。同時加入1N氫氧化鈉使pH保持在7.5-8.0之間。然后使混合物在室溫下攪動1小時，然后過濾。濾液用稀鹽酸酸化，用氯化鈉飽和，用乙酸乙酯萃取。然后干燥并濃縮成橙色油狀，使其在硅膠柱上層析，用在二氯甲烷中的10%甲醇洗脫。在真空下濃縮含有產(chǎn)物的組分，得到49mg3-(5-甲?；量?2-基羰基氨基)丙酸。
31mg上述的中間產(chǎn)物置于3ml二噁烷中，在其中加入35mg二環(huán)己基碳化二亞胺和19mgN-羥基琥珀酰亞胺?；旌衔镉谑覝卦诘聰噭?小時，然后過濾并在真空下濃縮。殘渣在硅膠上層析，用在二氯甲烷中的5%甲醇洗脫，得到大約6mg所需的中間產(chǎn)物活性酯。
制備13抗體007B，3-(5-甲?；量?2-基羰基氨基)丙?；苌?05mg在0.34M硼酸緩沖液中含有15mg/ml的抗體007B溶液，與300μl含有1.29mg制備12的中間產(chǎn)物活性酯的乙腈溶液合并?；旌衔镉谑覝叵聰噭?小時，然后在10gSephadexG25柱上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉洗脫。合并含有產(chǎn)物的組分并作紫外分光光度法分析，在280和300nm處觀察曲線。產(chǎn)物含有14.6ml溶液，濃度為5.7mg/ml，總計有83.2mg上述的中間產(chǎn)物。結(jié)合比例為3.6。
實例13抗體007B與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，丙酰基-3-氨基羰基-2-吡咯-5-亞甲基酰肼的結(jié)合物將36mg4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼硫酸鹽加至在12.4mlpH5.6的緩沖液中的60mg制備13的中間產(chǎn)物中，該緩沖液中含有0.1M乙酸鈉和0.15M磷酸鹽離子?；旌衔镌诎抵袛噭?4小時，然后離心。上清液在17gSephadexG25上層析，合并含有產(chǎn)物的組分，并進行紫外分光光度法分析，測量340和280nm處的光吸收。發(fā)現(xiàn)得到了在15.8ml溶液中的43.8mg結(jié)合物，結(jié)合比例為每摩爾抗體5.4摩爾長春花堿藥物。
使結(jié)合物進行放射免疫檢測，將它與抗原結(jié)合的能力與游離抗體的比較。發(fā)現(xiàn)結(jié)合作用只是稍微降低了抗體的結(jié)合能力。離體測定它針對UCLA/P3細胞的效應(yīng)，其50%的抑制濃度是0.0001μg/ml(以長春花堿酰肼含量為基礎(chǔ))。
制備14抗體007B，3-(4-甲酰基苯基羰基氨基)丙?；苌飳?.0ml在pH8.6的0.34M硼酸緩沖液中含有15mg/ml抗體的抗體007B溶液，與1.33mg在0.31ml乙腈溶液中的制備4的中間產(chǎn)物合并。反應(yīng)混合物于室溫下攪動1小時，然后在10gSephadexG25上層析，用pH5.6的0.1M乙酸鈉緩沖液洗脫。收集含有產(chǎn)物的組分并作紫外分析，測量258和280nm處的光吸收。發(fā)現(xiàn)結(jié)合物的濃度為5.1mg/ml，結(jié)合比例為4.3。結(jié)合物總產(chǎn)率率為91mg。
實例14抗體007B與4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿，丙?；?3-氨基羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物將36mg4-脫乙?；?23-脫甲氧基長春花堿酰肼硫酸鹽加至13.8ml在0.1M乙酸鈉緩沖液中的含有60mg制備14中間產(chǎn)物的溶液中。混合物于室溫下攪動24小時，然后離心并在17gSephadexG25上層析。收集含有產(chǎn)物的組分，通過0.22μm孔徑的膜過濾，得到21.9ml產(chǎn)物溶液，通過在280和293nm處測量光吸收的紫外分析表明，其中含有2.0mg結(jié)合物/ml。結(jié)合比例為每摩爾抗體4.1摩爾長春花堿藥物。
測定結(jié)合物針對雌性裸鼠中由UCLA/P3腺癌的異種移植誘導(dǎo)的腫瘤的效應(yīng)。在移植后的第16、19、22和25天以0.5mg/kg劑量(以長春花堿藥物的含量為基礎(chǔ))注射結(jié)合物。在第16天，處理動物的平均腫瘤重量為大約500mg。處理使腫瘤退化，在第51天，平均腫瘤重量只有大約50mg。未處理對照動物中的腫瘤穩(wěn)定生長至很大，就象此腫瘤通常表現(xiàn)的那樣。
組合物及使用方法本發(fā)明的結(jié)合物可用于抑制不良細胞生長的方法中，這是本發(fā)明的一個重要部分。因此，本發(fā)明還包括一種藥物組合物，最優(yōu)選的是適于注射至病人體內(nèi)的非腸道組合物。這種組合物是通過藥物化學(xué)領(lǐng)域常用的方法配制的。本發(fā)明組合物在生理上可接受的液體中具有可接受的溶解度，例如生理鹽水溶液和其他可安全地非腸道施用的水溶液。
非腸道施用的產(chǎn)品通常配制并分散于固體中，優(yōu)選冷凍干燥的固體，用前臨時再配制。這種制劑是本發(fā)明中有用的組合物。藥物化學(xué)家很清楚如何配制它們;一般說來，它們含有賦予等滲性的無機鹽的混合物，以及分散劑如乳糖，使干燥制劑在再配制時迅速溶解。將此制劑與與高度純化的水再配制成已知濃度的溶液。
結(jié)合物和上述藥物組合物被用來抑制不良細胞的生長，這是因為利用了結(jié)合物中長春花堿藥物所具有的細胞毒性。因此，結(jié)合物的使用范圍由長春花堿藥物的細胞毒性決定。在本說明書的抗體部分討論了一些類型的不良細胞，利用定靶于這些細胞的抗體，可以利用本發(fā)明的結(jié)合物治療這些細胞。優(yōu)選使用本發(fā)明的結(jié)合物和組合物抑制癌細胞的生長。
本發(fā)明結(jié)合物的最佳劑量和施用方案必須由治療醫(yī)生根據(jù)病人的狀況確定。當然，一般習(xí)慣是以分開劑量的形式施用細胞毒性藥物，在每一系列劑量之間間隔數(shù)天或數(shù)周。本發(fā)明的結(jié)合物在很寬的劑量范圍內(nèi)都有效，每周劑量一般落在大約0.1至大約10mg/kg結(jié)合物的范圍內(nèi)，更優(yōu)選的范圍是從大約0.25至大約4mg/kg。
為方便讀者起見，下面給出了幾種典型的非腸道結(jié)合物。
組合物1實例1的結(jié)合物100mg生理鹽水10ml
貯存于低溫下，靜脈注射用。
組合物2實例1的結(jié)合物100mg分散劑5mg生理鹽水10ml在低溫下冷凍干燥，在室溫或低于室溫下貯存干燥產(chǎn)品。施用時用純化水再配制后作靜脈注射。
組合物3實例4的結(jié)合物1g乳糖10mg生理鹽水100ml在低溫下冷凍干燥，在室溫或低于室溫下貯存干燥產(chǎn)品。施用時用純化水再配制后作靜脈注射。
組合物4實例9的結(jié)合物100mg生理鹽水20ml貯存于低溫下，靜脈注射用。
組合物5實例13的結(jié)合物1g分散劑12.5mg生理鹽水100ml在低溫下冷凍干燥，在室溫或低于室溫下貯存干燥產(chǎn)品。施用時用純化水再配制后作靜脈注射。
權(quán)利要求
1.一種制備具有下式的細胞毒性藥物結(jié)合物的方法
其中，Ab是生理上可接受的抗體或其識別抗原的片段，它能夠識別與不良細胞結(jié)合的抗原；m是從1至大約10的整數(shù)；Z是氫或C1-C3直鏈烷基；X是一個鍵、C1-C4亞烷基、C2-C4亞烯基或氨基-C1-C4亞烷基；Y是一個鍵、羰基、-O-、-S-、或磺?；?，前提是當X是氨基亞烷基時，Y是羰基或磺?；擷是一個鍵時，Y是一個鍵或羰基；Ar是吡咯基、間苯基、或?qū)Ρ交交峡捎射?、氯、氟、甲氧基、硝基或C1-C3烷基的單取代或雙取代；V是具有下式的長春花堿藥物
其中，R是H、CH3或CHO；當單獨論及R2和R3時，R3是H，R1和R2之一是乙基，另一個是H或OH；當R2和R3與它們與之結(jié)合的碳一起論及時，它們則形成一個環(huán)氧乙烷，此時R1是乙基；R4是H、(C1-C3烷基)-CO或氯取代的(C1-C3烷基)-CO；該方法包括(A)使定義于上式中的抗體Ab或其片段與具有下式的中間產(chǎn)物反應(yīng)
其中，R5是羥基、酸活化基團、構(gòu)成鹽的半分子或酸保護基團；其他的可變基團如上述定義；或(B)使具有下式的修飾抗體
與等當量的具有下式的酰肼反應(yīng)其中，Ab、X、Y、Ar、Z、V和m都如上述定義。
2.權(quán)利要求1的方法，其特征在于該方法在PH為大約7至大約9的緩沖液水溶液中進行。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中的抗體為單克隆抗體或嵌合抗體或其識別抗原的片段。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的X是一個鍵或氨基-C1-C3亞烷基。
5.權(quán)利要求4的方法，其中的Y是一個鍵、羰基或氧。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的方法，其中的Ar是苯基、單取代的苯基或吡咯基。
7.權(quán)利要求1或2的方法，用該方法制備L/1C2與4-脫乙酰基-23-脫甲氧基長春花堿，羰基-4-亞芐基酰肼的結(jié)合物。
8.一種制備藥物組合物的方法，它包括使權(quán)利要求1定義的藥物結(jié)合物與一種或多種藥物上可接受的賦形劑混合。
全文摘要
一系列含有抗體的抗體-長春花堿藥物結(jié)合物能定靶于與不良細胞結(jié)合的抗原，從而通過細胞毒性的長春花堿藥物控制或殺傷這些細胞。藥物通過一個有機基團與抗體連接，該有機基團在抗體端含有一個羰基，在長春花堿端含有一個亞烷基酰肼。
文檔編號C07K16/00GK1040205SQ8910554
公開日1990年3月7日 申請日期1989年8月7日 優(yōu)先權(quán)日1988年8月8日
發(fā)明者喬治·約瑟夫·卡利南, 本納特·科爾曼·拉古扎, 威廉·倫納德·斯科特 申請人:伊萊利利公司