專利名稱：生物學(xué)活性乳清蛋白質(zhì)組合物，其生產(chǎn)方法及該組合物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有相當(dāng)量乳清蛋白質(zhì)濃縮物的生物學(xué)活性乳清蛋白質(zhì)組合物，所說的濃縮物含帶有谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)之蛋白質(zhì)和/或肽成分的乳清蛋白質(zhì)離析混合物，其中所說的成分基本上以未變性狀態(tài)存在，且乳清蛋白質(zhì)濃縮物的生物學(xué)活性限于其未變性的構(gòu)象。本發(fā)明還涉及經(jīng)超濾和使乳清、乳清濃縮物或再生的乳清蛋白質(zhì)濃縮物粉末受離子交換樹脂作用以生產(chǎn)所說乳清蛋白質(zhì)組合物的方法，以及生物學(xué)活性乳清蛋白質(zhì)組合物的下列應(yīng)用形式1)以適當(dāng)濃度作為牛乳或牛乳蛋白質(zhì)的代用品;
2)作為欲用于有乳糖吸收障礙者的食品的代用品;
3)作為乳制品，人或動(dòng)物食品的代用品或補(bǔ)充品;
4)作為藥物;
5)在增加人和動(dòng)物器官內(nèi)谷胱甘肽的合成速率，補(bǔ)充速率，和/或濃度水平的方法中使用;
6)給人或動(dòng)物口服治療或預(yù)防有效量的乳清蛋白質(zhì)組合物以改善人和動(dòng)物宿主抵抗力;
7)作為抗腫瘤療效組合物。
本發(fā)明還涉及含有所說的生物學(xué)活性乳清組合物及必要時(shí)加有適于經(jīng)口供給之中性載體的食品或食品添加劑、療效食品、強(qiáng)化保健食品、醫(yī)藥組合物及抗腫瘤療效組合物。
本發(fā)明還涉及經(jīng)口服給予相當(dāng)量含谷氨酰半胱氨酸(Glu-Gys)基團(tuán)的牛乳清蛋白質(zhì)混合物之未變性成分，即β-乳球蛋白和血清白蛋白及可能的免疫球蛋白，以增加細(xì)胞谷胱甘肽(GSH)水平的方法。
乳清是一種已知的乳品工業(yè)付產(chǎn)品。其組成近于沒有其酪蛋白的脫脂乳的組成。酸乳清是經(jīng)加入無機(jī)酸或經(jīng)產(chǎn)生乳酸(在牛乳內(nèi)接入乳酸發(fā)酵劑)，于PH接近酪蛋白等電點(diǎn)時(shí)酸化而成的。在分離凝乳后回收乳清。向牛乳內(nèi)加入凝乳酶也可使酪蛋白絮凝或凝結(jié)。脫水收縮后得到的乳清即所謂酶凝乳清。如果在牛乳的PH值或稍低但高于5.8到6.0的PH下絮凝，則所得乳清稱為甜乳清。
因此乳清是根據(jù)牛乳凝結(jié)的性質(zhì)而限定的。酸乳清主要是由制造新鮮凝固乳酪和酪蛋白工廠得到的。根據(jù)所用原料乳及干酪加工工藝的不同，乳清的組成成分可有很大差異。所有乳清均含有礦無機(jī)鹽、某些脂肪、一定量的乳酸及凝固酶，而最有用的部分顯然是含氮組分。事實(shí)上，含氮部分主要包含具有高生物學(xué)價(jià)值的可溶性乳蛋白質(zhì)。
從乳清中提取蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)技術(shù)包括在PH接近其等電點(diǎn)的條件下，經(jīng)變性加熱處理，使之變?yōu)椴蝗苄缘?。這種技術(shù)的一個(gè)明顯缺點(diǎn)是使蛋白質(zhì)變性。
如上所述，乳清蛋白是于PH4.6和20℃下沉淀酪蛋白后仍溶在乳清中的一組乳蛋白質(zhì)。牛乳中的大部分乳清蛋白質(zhì)是β-乳球蛋白(β-L)、α-乳球蛋白(α-L)、免疫球蛋白和血清白蛋白(SA)(其含量依次減少)。
從遠(yuǎn)古以來就已將乳清和乳清蛋白質(zhì)用于營(yíng)養(yǎng)目的。另外，在民間和古代醫(yī)藥中推薦使用乳清治療各種疾病，而且有一個(gè)例子是終生給倉鼠喂飼乳清蛋白質(zhì)食物，證明可以延長(zhǎng)倉鼠的壽命，但未作出解釋。
所有這些情況似乎都以某種方式與谷胱甘肽的改變有關(guān)，谷胱甘肽是一種對(duì)過氧化物游離基及其他毒性劑發(fā)揮抵御作用的普遍存在的要素。
谷胱甘肽是一種具有多種重要功能的、普遍存在的三肽硫醇(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰甘氨酸)，這些功能包括異源生物質(zhì)的解毒及使細(xì)胞免受氧中間體和游離基等需氧代謝付產(chǎn)物的損傷。調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽將影響可被氧化損傷抑制的淋巴細(xì)胞增殖性免疫反應(yīng)。谷胱甘肽可使細(xì)胞免受幅射及烷基化劑的影響。年齡相關(guān)的或?qū)嶒?yàn)誘發(fā)的晶狀體谷胱甘肽水平降低與白內(nèi)障形成有關(guān)。氧化性DNA損傷可得以迅速而有效地修復(fù)。人體能夠不斷地修復(fù)被氧化的DNA。小部分未被修復(fù)的損傷可引起DNA的持久性改變，并可能是引起老年病和腫瘤的一個(gè)主要因素。有幾種與年齡相關(guān)的疾病很可能是由游離基誘發(fā)的。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人體的研究顯示，有關(guān)組織中年齡相關(guān)的維生素E和其他抗氧化劑改變的數(shù)據(jù)是很不一致的，反之則一致認(rèn)為組織谷胱甘肽水平隨著年齡老化而降低。
鑒于這些原因，已對(duì)影響細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽合成的因素和增加細(xì)胞谷胱甘肽水平的途徑產(chǎn)生了很大興趣。
谷胱甘肽由三種氨基酸組成谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸。半胱氨酸的可用性是谷胱甘肽合成中的一個(gè)限制因素。半胱氨酸可得自食物蛋白質(zhì)并在肝臟中由蛋氨酸經(jīng)轉(zhuǎn)硫作用而產(chǎn)生。已嘗試了多種方法來增加細(xì)胞的谷胱甘肽水平。給予游離半胱氨酸并不是理想的方法，因?yàn)檫@種氨基酸會(huì)很快被氧化，有毒性并可能真正引起谷胱甘肽減少。給大鼠腹腔內(nèi)注射N-乙?；腚装彼嵋旬a(chǎn)生了相似的問題，不過口服這種化合物顯示可防止4-乙酰氨基酚誘發(fā)的谷胱甘肽降低。給予被運(yùn)輸并在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化成半胱氨酸的化合物，如L-2-氧噻唑烷-4-羧酸酯用作細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的輸送系統(tǒng)可有利于增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽。注射后4小時(shí)肝谷胱甘肽增加一倍，但8小時(shí)后轉(zhuǎn)為正常，16小時(shí)后則低于正常水平。為增加組織谷胱甘肽水平所作另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠皮下注射γ-谷氨酰半胱氨酸(胱氨酸)，40～60分鐘后腎中谷胱甘肽約增加55%，2小時(shí)后又轉(zhuǎn)而接近對(duì)照值。所給予的化合物被完整地輸送并用作谷胱甘肽合成酶的底物。另據(jù)報(bào)導(dǎo)，在給小鼠腹腔注射γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酰-甲基(或乙基)酯后約2小時(shí)，小鼠肝和腎谷胱甘肽水平增加一倍，但8小時(shí)后又轉(zhuǎn)為正常值。Meister給小鼠注射谷胱甘肽的一烷基酯，組織谷胱甘肽水平也具有相似的增加(US-A-4，784，685)。這種酯被輸送到組織細(xì)胞內(nèi)，并在細(xì)胞中去酯化，從而導(dǎo)致細(xì)胞谷胱甘肽水平增加。用這種方法獲得的組織谷胱甘肽漸增的動(dòng)力學(xué)是與已述及的腹腔注射谷胱甘肽甲基或乙基酯后的動(dòng)力學(xué)改變是相似的。在急性實(shí)驗(yàn)中已清楚地證明這些方法的效果(US-A-4，784，685);在用L-2-氧噻唑烷-4-羧酸酯處理的小鼠中，注射乙酰氨基苯之后并沒有出現(xiàn)預(yù)料的組織谷胱甘肽水平降低而是代之以組織谷胱甘肽水平和存活率的實(shí)際增加。增加組織谷胱甘肽水平的其他方法是基于在濃度降低后給予馬來酸二乙酯或BSO，以使谷胱甘肽濃度“過調(diào)節(jié)”(“overshoot”)而建立的。這些研究都是于體外使用小鼠細(xì)胞系進(jìn)行的。還發(fā)現(xiàn)使大鼠預(yù)先接觸缺氧環(huán)境可增加肺內(nèi)谷胱甘肽水平。
服用谷胱甘肽本身對(duì)組織谷胱甘肽水平影響不大，因?yàn)樗@然地不能被完整地輸送穿越細(xì)胞膜。
以前討論的某些增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度的方法，由于存在與初期谷胱甘肽減少有關(guān)的危險(xiǎn)，因此是有毒性或?qū)】挡焕摹＿@些包括使用γ-谷氨酰半胱氨酸(胱氨酸)、噻唑烷或谷胱甘肽酯(US-A-4，784，685)的方法為短期調(diào)整提供一種有益的可能性。但尚沒有顯示出它們?cè)趯?dǎo)致持久性細(xì)胞谷胱甘肽增高上的長(zhǎng)期效力，也沒有證明不存在可能的長(zhǎng)期毒性。在最常使用的短期致癌性和誘變性試驗(yàn)中，確實(shí)發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物是有積極效果的。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種有生物學(xué)活性的新的乳清蛋白組合物，其可用于人和動(dòng)物的食物中，并可作為藥物使用，該組合物含有特異的乳清蛋白質(zhì)組分或增加宿主細(xì)胞谷胱甘肽的組分，與使用未變性的乳清蛋白濃縮物相比，減少了為達(dá)到相似目的所需要的總量，該新的產(chǎn)品可作為膠囊，或易溶于水及其他液體的粉末給藥。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種通過口服給予含在牛源未變性乳清蛋白濃縮物中的半胱氨酸前體，來增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽水平的方法。給予相似量的游離半胱氨酸則沒有效果。另一方面，發(fā)現(xiàn)給予同樣量的其他蛋白質(zhì)，如有同樣高半胱氨酸含量的卵清，也不能有效地增加組織半胱氨酸水平。因此，以其未變性形式(即半胱氨酸的位置與蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián))存在的特定的乳清蛋白濃縮物物理-化學(xué)組合物，似乎對(duì)半胱氨酸作為細(xì)胞內(nèi)合成谷胱甘肽之前體的生物可利用性是一個(gè)關(guān)鍵性因素。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在不接觸與使用其他已知方法有關(guān)之毒性作用的條件下增加細(xì)胞谷胱甘肽水平的方法;已有證據(jù)表明，小鼠、倉鼠和人長(zhǎng)期攝入牛乳清蛋白質(zhì)濃縮物是無毒性的。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供為了任何目的的組織谷胱甘肽的持久性升高，這些目的是現(xiàn)有技術(shù)中期望得到的預(yù)防性細(xì)胞谷胱甘肽水平的長(zhǎng)期升高，如使細(xì)胞免受游離基、外來有害化合物、藥物解毒作用、幅射、免疫缺陷狀態(tài)等的傷害。
基于工業(yè)上由牛乳制備乳清和乳清蛋白質(zhì)濃縮物(W.P.C.)之方法的技術(shù)進(jìn)步，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，為了保留生物學(xué)活性，W.P.C.必須是未變性的。
因此，本發(fā)明中提出了一個(gè)與制備乳清蛋白質(zhì)濃縮物有關(guān)的新概念，即制備方法中具有保持未變性之構(gòu)象的特定目的，而其新發(fā)現(xiàn)的生物學(xué)活性正是依賴于這種構(gòu)象。這一概念自然地涉及工業(yè)化生產(chǎn)乳清蛋白質(zhì)中的兩個(gè)基本階段。
1.由牛乳中分離乳清的過程，其應(yīng)使乳清蛋白質(zhì)構(gòu)象盡可能小地偏離天然可接受的范圍。因此該過程應(yīng)避免過度加熱處理，及避免在可能使乳清蛋白質(zhì)變性的空氣存在下振蕩。
2.設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)娜榍宓鞍踪|(zhì)濃縮物生產(chǎn)工藝，以使乳清中的蛋白質(zhì)恢復(fù)其天然構(gòu)象。因此超濾和工藝的其他步驟應(yīng)盡可能地避免或限制加熱、泵送、通氣及其他促進(jìn)蛋白質(zhì)變性的加工步驟。
本發(fā)明所提供的優(yōu)點(diǎn)主要有1.口服給予相當(dāng)量的牛乳清蛋白質(zhì)濃縮物可提高小鼠肝、心和脾臟中的谷胱甘肽含量(

圖1、2、3)。
2.這種改變是溫和但持久的，而且是有著重要生物學(xué)意義的。
3.這一特性限于未變性乳清蛋白質(zhì)濃縮物的構(gòu)象。
4.谷胱甘肽是一種三肽(L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)。
給予半胱氨酸(極限底物)或谷胱甘肽本身或其他蛋白質(zhì)源(如卵清)并不能有效地提高細(xì)胞GSH水平。但發(fā)現(xiàn)給小鼠腹腔注射γ-谷氨酰-半胱氨酸可在短時(shí)間(幾個(gè)小時(shí))內(nèi)提高組織GSH水平。
5.乳清蛋白質(zhì)濃縮物含有相當(dāng)量的谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)，與酪蛋白不同，當(dāng)以其喂飼小鼠時(shí)并不能增加組織GSH水平。
6.谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)位于β-乳球蛋白和血清白蛋白部分中(見表1)。對(duì)牛乳免疫球蛋白的氨基酸序列尚未完全明了。
7.胰酶消化并不能裂解乳清蛋白質(zhì)的二硫鍵;已知代之以熱變性可裂解該鍵，從而使分子的球形結(jié)構(gòu)伸展以形成一種無規(guī)則的螺旋構(gòu)象。
下面參考附圖和附表進(jìn)一步描述本發(fā)明。
圖1喂飼不同食物之小鼠的脾谷胱甘肽含量。
＊未免疫的小鼠用4種食物喂飼3周，脾谷胱甘肽或身體生長(zhǎng)無組間差異＊＊飲食治療3周后免疫身體生長(zhǎng)和血清蛋白無組間差異＊＊＊U-Lacp未變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物D-Lacp變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物“DanmarkProtein”生產(chǎn)的Lacprodan-80免疫后第2、3、4和6天，喂飼U-Lacp的小鼠脾谷胱甘肽水平分別為13%(P＜0.01)、8%(P＜0.02)、21%(P＜0.01)和20%(P＜0.01)，此高于喂飼D-Lacp之小鼠的相應(yīng)值，即分別為12%(P＜0.01)、7%(P＜0.05)、20%(P＜0.001)和20%(P＜0.001)，此又高于喂飼酪蛋白之小鼠的相應(yīng)值，即分別是4%(N.S)、10%(P＜0.02)、21%(P＜0.001)和19%(P＜0.01)，此又高于喂飼卵清蛋白質(zhì)之小鼠的相應(yīng)值。
圖2和3喂飼不同食物的雄性C57BL/6NIA小鼠的肝和心臟谷胱甘肽含量。
各數(shù)值均代表平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)U-LACP未變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物D-LACP變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物食物消耗量、體重和血清蛋白無組間差異圖2中，U-LACP＞Purina，酪蛋白，卵清ANOVA(Sheffe試驗(yàn))分析P＜0.05U-LACP＞D-LACPANOVA(Sheffe試驗(yàn))分析P＜0.01圖3中，U-LACP＞酪蛋白，卵清ANOVA(Sheffe試驗(yàn))分析P＜0.05U-LACP＞D-LACP，PurinaANOVA(Sheffe試驗(yàn))分析P＜0.01圖4在喂飼含有未變性乳清蛋白質(zhì)濃縮物的食物之小鼠中，其對(duì)SRBC的脾細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)。
U-Lacp未變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物D-Lacp變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物“DanmarkProtein”生產(chǎn)的Lacprodan-80
U-Lacp＞D-Lacp，酪蛋白，酪蛋白+CYS，卵清蛋白P＝0.0004圖5谷胱甘肽在食物乳清蛋白之免疫增強(qiáng)效應(yīng)中的作用。
圖5給出了用106個(gè)羊紅血細(xì)胞(SRBC)免疫后第5天顯示空斑形成細(xì)胞產(chǎn)生之峰值的空斑形成細(xì)胞/脾(PEC)數(shù)值。用20gU-Lacp丁硫堇硫氧亞胺(BSO)或酪蛋白(C)/100g食物進(jìn)行飲食治療3周后的效果。各數(shù)值均代表均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)U-Lacp+BSO或酪蛋白P＜0.005。右用5×106個(gè)羊紅血細(xì)胞(SRBC)免疫后第4天顯示谷胱甘肽(GSH)之峰值的脾SH含量。用20g U-Lacp+BSO或酪蛋白(C)/100g食物進(jìn)行飲食治療3周后的效果。各數(shù)值均代表均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(n＝10)。U-Lacp對(duì)U-Lacp+BSO或酪蛋白p＜0.0005。U-Lacp＝未變性的乳清蛋白質(zhì)濃縮物(Lacprodan-80)。
表1牛和人乳的蛋白質(zhì)組成。
表2乳清蛋白質(zhì)濃縮物和卵清蛋白質(zhì)的氨基酸組成。
探索了食物蛋白質(zhì)、GSH與宿主免疫反應(yīng)的相互關(guān)系。即研究了是否不同的蛋白質(zhì)源如含與乳清蛋白質(zhì)濃縮物同樣高水平半胱氨酸的卵清(表2)，具有相似的增加GSH組織含量的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵清蛋白食物并不能使宿主免疫反應(yīng)提高到平均水平以上。盡管喂飼三周U-Lacp(未變性的乳清蛋白質(zhì))并未改變脾臟中靜止不變的GSH水平，但在成年C3H小鼠中所作的這項(xiàng)研究表明，在喂飼U-Lacp的小鼠中，其對(duì)SRBC的脾細(xì)胞免疫反應(yīng)增強(qiáng)(圖4)是與抗原引發(fā)的淋巴細(xì)胞克隆擴(kuò)增期間脾細(xì)胞GSH的持續(xù)高水平相關(guān)聯(lián)的，相比之下，喂飼營(yíng)養(yǎng)等價(jià)物D-Lacp(變性的乳清蛋白質(zhì))、酪蛋白、富半胱氨酸酪蛋白、或卵清蛋白質(zhì)食物的小鼠則呈現(xiàn)脾GSH水平降低的圖形(圖1)。后四組也顯示較低的免疫反應(yīng)(圖4)。給予S-(正丁基)同型半胱氨酸硫氧亞胺可使喂飼乳清蛋白質(zhì)(U-Lacp)食物的小鼠脾谷胱甘肽水平降低一半，同時(shí)其體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生顯著降低。該試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了谷胱甘肽在食物乳清蛋白質(zhì)之免疫增強(qiáng)效應(yīng)中的重要作用(圖5)。
組織谷胱甘肽檢測(cè)法在5-磺基水楊酸(5%W/V)中勻漿處理90毫克小鼠心臟或肝臟。在微量離心管中以10，000g將勻漿離心5分鐘。按照Anderson方法在同一天使用上清液進(jìn)行檢測(cè)。數(shù)值以每克濕組織中的微摩爾數(shù)(μmol)表示(圖2和3)。
結(jié)果表明在17月齡開始喂飼三個(gè)月后，喂飼U-Lacp小鼠肝和心臟谷胱甘肽含量比喂飼D-Lacp、酪蛋白、卵清蛋白質(zhì)或Purina食物者高(圖2和3)。喂飼Purina實(shí)驗(yàn)室食物的小鼠在10周、17、20、21月齡對(duì)心和肝臟中GSH值是相近的。連續(xù)喂飼U-Lacp食物3和4個(gè)月后，心和肝臟GSH含量提高到“正?！敝狄陨?圖2和3)。總之，在給成年C3H/HeN小鼠喂飼U-Lacp食物3周后，在其淋巴細(xì)胞的抗原引發(fā)的克隆擴(kuò)增期間，脾GSH含量得以增加，相比之下，喂飼D-Lacp、酪蛋白或卵清蛋白質(zhì)食物的對(duì)照組則呈現(xiàn)GSH水平降低(圖1)。在老齡C57BL/6N1A小鼠中，長(zhǎng)期喂飼U-Lacp食物可導(dǎo)致肝和心臟GSH水平的溫和但持久的增加(圖2和3)。WPC(乳清蛋白質(zhì)濃縮物)的GSH增加活性只限于它的未變性形式(U-Lacp)。這一特性不僅是由于WPC的高半胱氨酸含量造成的;因?yàn)榫哂邢嗨瓢腚装彼岷康钠渌鞍踪|(zhì)(卵清)并未表現(xiàn)出這一生物學(xué)活性。U-Lacp的這一特性并不是特異地依賴于它的根據(jù)體重、血清蛋白量和食物消耗量所估計(jì)的營(yíng)養(yǎng)效率，而似乎是依賴于天然形式之蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。
圖2和3的數(shù)據(jù)表明，喂飼Purina食物的對(duì)照小鼠中，心和肝臟谷胱甘肽濃度可較長(zhǎng)期保持恒定。另一方面，喂飼營(yíng)養(yǎng)上等價(jià)的未變性乳清蛋白質(zhì)(U-Lacp)食物的小鼠，則記錄到組織GSH的適度但持久的升高。只有很小量的谷胱甘肽和屬于谷胱甘肽的非分解產(chǎn)物由尿中排出?？赡苓_(dá)到的細(xì)胞谷胱甘肽濃度的改變程度是相當(dāng)有限的，此大概也反應(yīng)了這種分子的極端重要性，以及密切連帶的調(diào)控機(jī)制。谷胱甘肽本身作為GSH合成酶的負(fù)反饋因素，其顯然可限制細(xì)胞增加GSH濃度的能力。谷胱甘肽還原酶使GSH主要以其還原態(tài)存在(＞90%)。這便可使之即保持其功能狀態(tài)，又可控制細(xì)胞濃度，因?yàn)檫€原態(tài)谷胱甘肽(GSH)不能穿過細(xì)胞膜，而氧化態(tài)谷胱甘肽(GSSG)可穿越細(xì)胞膜并流失，導(dǎo)致谷胱甘肽總量降低。除了這些酶以外，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)在GSH代謝也起著重要作用。GGT可在細(xì)胞膜水平上用作谷氨酰部分的補(bǔ)救途經(jīng)，使之返回胞漿內(nèi)用于GSH合成。在許多細(xì)胞系和惡性腫瘤組織中，這種酶增高活性與升高的GSH濃度有關(guān)。
細(xì)胞GSH小量增加的效應(yīng)要比預(yù)期的大。例如，已有許多關(guān)于選擇的人和小鼠腫瘤細(xì)胞系于體外可對(duì)抗各種化學(xué)治療劑的報(bào)告。在這些細(xì)胞系中，與藥物敏感性親代細(xì)胞系比較，它們的細(xì)胞GSH含量增加達(dá)2倍，盡管其藥物抗性的水平常常更高，如高出30倍。在這些細(xì)胞系中，通過選擇性地抑制合成作用使細(xì)胞GSH含量減少，即可恢復(fù)抗性細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性。這只有在整個(gè)藥物治療期間維持GSH的缺乏才是有效的。
事實(shí)上，細(xì)胞GSH水平是受到嚴(yán)密調(diào)控的，2倍增加量可能是最大的，而且可通過各種GSH利用酶(如谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)放大GSH小量增加的效應(yīng)，在喂飼富乳清食物之動(dòng)物中觀察到可再現(xiàn)的GSH濃度改變，可能具有重要的生物學(xué)意義。這種增加的長(zhǎng)期性可能對(duì)上述效益有重要意義。
與本發(fā)明相關(guān)聯(lián)的是，最近資料表明，老年動(dòng)物中GSH不足的原因是GSH前體即半胱氨酸的缺乏，而不是生物合成酶活性的降低，相似地，長(zhǎng)期少量喂飼乙醇的大鼠，肝細(xì)胞漿中GSH的降低似乎并不是因限制了γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性引起的。
本

發(fā)明內(nèi)容
的總結(jié)和意義a.食物乳清蛋白質(zhì)濃縮物的谷胱甘肽促增活性，依賴于含在β-乳球蛋白和血清白蛋白部分以及可能含在IgG部分中的谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)。
b.保存二硫鍵(其涉及半胱氨酸)，對(duì)于消化后釋放完整的谷氨酰半胱氨酸肽以便被小腸粘膜吸收是至關(guān)重要的。另一方面，通過伸展蛋白質(zhì)分子使之變性，將使谷氨酰半胱氨酸序列暴露于消化酶，繼而釋放單個(gè)氨基酸或其他肽混合物。對(duì)此，始終可觀察到變性形式的乳清蛋白質(zhì)濃縮物是沒有谷胱甘肽促增活性的。
本發(fā)明提供了一種由乳清蛋白質(zhì)中除去α-乳白蛋白的方法(表1)。
發(fā)現(xiàn)口服乳清蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)組分，經(jīng)消化后可釋放出大部分谷氨酰半胱氨酸，達(dá)到增加宿主細(xì)胞谷胱甘肽的目的。所需要的總量明顯少于為達(dá)到相似目的所需要的未變性乳清蛋白質(zhì)濃縮物的量。因此本產(chǎn)品可以其膠囊或易(未變性的)溶于水或其他液體之粉末形式給藥。


權(quán)利要求
1.含相當(dāng)量乳清蛋白質(zhì)濃縮物的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中所說的乳清蛋白質(zhì)濃縮物含帶有谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)之蛋白質(zhì)和/或肽成分的乳清蛋白質(zhì)離析混合物，所說的成分是以基本上未變性的狀態(tài)存在的，且其中乳清蛋白質(zhì)濃縮物的生物學(xué)活性只限于其未變性的構(gòu)象。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中所說的乳清蛋白質(zhì)離析混合物有β-乳球蛋白和/或血清白蛋白和/或免疫球蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中除去了α-乳白蛋白部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中乳清蛋白質(zhì)離析混合物被進(jìn)一步濃縮并精制成醫(yī)藥純。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中乳清蛋白質(zhì)濃縮物含有不耐熱的并且是對(duì)消化作用不敏感的免疫增強(qiáng)作用蛋白質(zhì)，其中免疫增強(qiáng)性質(zhì)依賴于含在所說乳清蛋白質(zhì)混合物中的肽和蛋白質(zhì)的未變性狀態(tài)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中乳清蛋白質(zhì)濃縮物是牛和/或山羊和/或綿羊和/或人乳清蛋白質(zhì)濃縮物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中所說的相當(dāng)量乳清蛋白質(zhì)濃縮物是18至28g乳清蛋白質(zhì)、特別是20g乳清蛋白質(zhì)/100g食物的治療或預(yù)防量。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的乳清蛋白質(zhì)組合物，其含有所說的乳清蛋白質(zhì)濃縮物及超過每日最小需要量的維生素B1和B2。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的乳清蛋白質(zhì)組合物，維生素B1量為1.5至2.0mg，維生素B2量為1.5至2.0mg。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8的乳清蛋白質(zhì)組合物，其中沒有乳糖。
11.生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1至7和10之生物學(xué)活性乳清蛋白質(zhì)濃縮物組合物的方法，該方法包括下列步驟a)擠奶后立即將其冷卻到2℃至10℃，最好是4℃，并除去污染物。b)再次凈化后，于20℃下首先用乳酸降低pH至大約4.6使凝乳塊沉淀，c)加入凝乳酶，升高溫度至大約30℃，保持20分鐘以促進(jìn)從凝乳塊中除去乳清，得以在桶內(nèi)低速攪拌以使之解析，d)在桶內(nèi)對(duì)余留的產(chǎn)物作熱處理以進(jìn)行巴氏滅菌并高速攪拌，e)照射并分離乳清，f)使用截留分子量約10，000或小于10，000的膜超濾乳清，或g)使用截留分子量大致為17，000或小于17，000的膜超濾乳清，以保留β-乳球蛋白和血清白蛋白，該方法的特征在于乳清蛋白質(zhì)濃縮物部分未經(jīng)加熱，且由之得到該濃縮物組分的材料被緩慢攪拌以盡可能減少蛋白變性，而所說的超濾是在包括支撐許多所說膜的多達(dá)20個(gè)框架式鑄模的生產(chǎn)線中進(jìn)行的，從而得到一種最終未變性的蛋白質(zhì)濃縮物干燥制品，其中所說的超濾是在4℃至20℃，尤其是在4℃下進(jìn)行的。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，特征在于乳清蛋白質(zhì)濃縮物是使用截留分子量大致為100，000的膜對(duì)乳清、液體乳清蛋白質(zhì)濃縮物或加水復(fù)原的乳清蛋白質(zhì)濃縮物粉末進(jìn)行超濾處理而生產(chǎn)的。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，特征在于乳清蛋白質(zhì)濃縮物是使乳清、液態(tài)乳清蛋白質(zhì)濃縮物或加水復(fù)原的乳清蛋白質(zhì)濃縮物粉末通過截留分子量大致為500，000的膜超濾而生產(chǎn)的。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求11至13中任一項(xiàng)的方法，特征在于使通過截留分子量為10，000或小于10，000的膜超濾得到的截留物再通過截留分子量大致為500，000和/或100，000的膜進(jìn)一步超濾，以形成可進(jìn)一步干燥成粉末的濃縮物。
15.根據(jù)權(quán)利要求11至14中任一項(xiàng)的方法，特征在于使乳清、乳清蛋白質(zhì)濃縮物或復(fù)原的乳清蛋白質(zhì)濃縮物粉末經(jīng)受陰離子交換樹脂的作用以得到流出物，該乳清蛋白質(zhì)比原來未經(jīng)處理的乳清或乳清蛋白質(zhì)濃縮物或復(fù)原的粉末含有更高比例的β-乳球蛋白和/或血清白蛋白和/或免疫球蛋白，以及其乳清蛋白質(zhì)內(nèi)容物含有較低比例之β-乳球蛋白和/或血清白蛋白和/或免疫球蛋白的洗脫物，并且至少要超濾濃縮流出物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的乳清蛋白質(zhì)組合物以適當(dāng)濃度作為牛乳或牛乳蛋白質(zhì)之代用品的應(yīng)用。
17.根據(jù)權(quán)利要求10的乳清蛋白質(zhì)組合物作為欲用于有乳糖吸收障礙者之食品的代用品的應(yīng)用。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至10的乳清蛋白質(zhì)組合物作為乳制品、人或動(dòng)物食物之代用品或補(bǔ)充品的應(yīng)用。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至10的乳清蛋白質(zhì)組合物作為藥物的應(yīng)用。
20.根據(jù)權(quán)利要求1到10的乳清蛋白質(zhì)組合物在增加人和動(dòng)物器官內(nèi)谷胱甘肽的合成速率，補(bǔ)充速率，和/或濃度水平之方法中的應(yīng)用，該方法包括給人或動(dòng)物口服治療或預(yù)防有效量的乳清蛋白質(zhì)組合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到10的乳清蛋白質(zhì)組合物在改善人和動(dòng)物宿主抵抗力之方法中的應(yīng)用，該方法包括給人或動(dòng)物口服治療或預(yù)防有效量的乳清蛋白質(zhì)組合物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的乳清蛋白質(zhì)組合物的應(yīng)用，其中改善了的宿主抵抗力包括提高了對(duì)細(xì)菌感染的抵抗力和/或提高了對(duì)慢性生長(zhǎng)的癌瘤的抵抗力和/或提高了對(duì)老化過程的抵抗力和/或上述改善的結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求1到10的乳清蛋白質(zhì)組合物作為抗腫瘤療效組合物的應(yīng)用。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的乳清蛋白質(zhì)組合物的應(yīng)用，其中抗腫瘤組合物被用于預(yù)防結(jié)腸癌。
25.含有根據(jù)權(quán)利要求1到10之乳清蛋白質(zhì)組合物的適于特殊營(yíng)養(yǎng)需要的食品或食品添加劑。
26.含有根據(jù)權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)之乳清蛋白質(zhì)組合物的人或動(dòng)物的療效營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品。
27.含有根據(jù)權(quán)利要求1到10之乳清蛋白質(zhì)組合物及適于經(jīng)口喂飼之中性載體的療效食品。
28.含有根據(jù)權(quán)利要求1到10之乳清蛋白質(zhì)組合物及適于經(jīng)口喂飼之中性載體的強(qiáng)化保健食品。
29.含有根據(jù)權(quán)利要求1到10之乳清蛋白質(zhì)組合物及適于經(jīng)口喂飼之中性載體的醫(yī)藥組合物。
30.含有根據(jù)權(quán)利要求1到10之乳清蛋白質(zhì)組合物及適于經(jīng)口喂飼之中性載體的抗腫瘤療效組合物。
31.含有基本上呈未變性形式之乳清蛋白質(zhì)組分或其變體的組合物，其中所說的組分或其變體含有谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)，并且是由乳或乳清中除去即通過在華氏100°到140°(37.8℃到87.8℃)的溫度下處理30分鐘而變性失活的。
32.含有基本上呈未變性形式之乳清蛋白質(zhì)組分或其變體的組合物，其中所說的組分或變體含有谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)，并且是由原料乳或乳清中除去即在148℃下經(jīng)間接蒸汽處理2.5秒鐘而變性失活的。
33.含有基本上呈未變性形式之乳清蛋白質(zhì)組分或其變體的組合物，所說的組分或其變體含有谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)，并且是由原料乳或乳清中除去即于77℃下巴氏滅菌15秒鐘而變性失活的。
34.含有基本上呈未變性形式之其他食用蛋白質(zhì)的組合物，所說的蛋白質(zhì)含有Glu-Cys基團(tuán)，如雞卵清卵糖蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及含相當(dāng)量乳清蛋白質(zhì)濃縮物的生物學(xué)活性乳清蛋白質(zhì)組合物，該乳清蛋白質(zhì)濃縮物含有帶谷氨酰半胱氨酸基團(tuán)之蛋白質(zhì)和/或肽組分的乳清蛋白質(zhì)離析混合物，其中所說的組分是以基本上未變性的狀態(tài)存在的，并且其中乳清蛋白質(zhì)濃縮物的生物學(xué)活性限于其未變性的構(gòu)象；本發(fā)明還涉及生產(chǎn)生物學(xué)活性乳清蛋白質(zhì)濃縮物組合物的方法。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1044660SQ8910944
公開日1990年8月15日 申請(qǐng)日期1989年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1988年12月23日
發(fā)明者古斯塔夫·鮑諾思, 菲爾·古爾德 申請(qǐng)人:古斯塔夫·鮑洪恩