專利名稱：抑制t—淋巴細胞成熟和巨噬細胞活性的新穎肽含有這些肽的藥用組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及及式(1)到(20)的新穎肽Arg-Lys(Chc)-Asp-Val(1)Arg-Lys(Chc)-Asp(2)Arg-Sar-Asp-Val(3)Arg-Sar-Asp-(4)Orn-Lys-Asp-Val(5)Orn-Lys-Asp(6)Arg-Lys-Aad-Val(7)Arg-Lys-Aad(8)[Arg-Lys-Asp-NH-CH2-]2(9)Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2|Arg-Lys-Asp-NH-CH2(10)[Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-]2(11)[Arg-Lys-Asp-Cys-NH2-]2(12)Lys-Ser-Lys-Leu(13)Ser-Lys-Leu(14)Ser-Ser-Ser-Thr(15)Lys-Glu-Thr(16)Lys-Thr-Glu-Thr(17)Pro-Lys-Leu-Thr(18)
Lys-Lys-Thr-Glu(19)Lys-His-Leu-NH2(20)它們的含有這些肽的酸性加成鹽和藥用組合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可以提供制備式(1)到(20)新穎肽的制備方法及含有它們的藥用組合物上述式(1)到(20)的肽能抑制T-淋巴細胞的成熟和巨噬細胞的活性。
本發(fā)明進一步涉及通過服用上述式(1)到(20)本身的有效劑量的一個或多個化合物或以藥用組合物形式的藥物來影響被治療的人或動物的免疫系統(tǒng)功能以治療(活的)動物(包括人類)的方法。
對健康的有機體來說，免疫系統(tǒng)的平衡功能可維持強有力的保護機制，它能殺滅微生物，達到破壞異物和腫瘤細胞，以及從有機體中除去它們，而有機體本身的健康細胞卻不受傷害。
當(dāng)免疫系統(tǒng)功能減弱(最適度以下)時，感染性的外源的或腫瘤的細胞就能繁殖，最終導(dǎo)致宿主有機體功能的全面破壞;而且，當(dāng)免疫反應(yīng)過份增大時，健康組織也可能會受傷害(自身免疫和變態(tài)反應(yīng)性疾病)，例如在器官移植過程中，植入的器官或組織可以會被機體的天然防御反應(yīng)(應(yīng)答)所拒絕。
胸腺產(chǎn)生的淋巴細胞，即所謂T-細胞，它在起動、維持和中止免疫反應(yīng)中起到主要作用。眾所周知，由于信息傳遞，活的有機體中的免疫系統(tǒng)的功能受到許多肽和蛋白質(zhì)的影響。由免疫細胞所產(chǎn)生的胸腺激素和信息傳遞因素(細胞分裂素)在治療腫瘤和免疫疾病方面曾被作過廣泛研究(《未來的醫(yī)藥》“DrugsoftheFuture”11，784(1984);《醫(yī)藥實驗臨床研究》“DrugsExp.Clin.Res.”13，327(1987))。這種因素為如所謂的胸腺素級分5，一種從含有已知胸腺激素的牛犢胸腺中獲得的部分純化提取物(“CancerImmunol.Immunther.”18，185(1984))。通過利用由遺傳工程技術(shù)制得的細胞分裂素(Cytokin)來治療癌癥疾病已獲得了良好的效果(“N，Engl.J.Med.”313，1485(1985))。
對于醫(yī)藥用的組合物，需要建立更加嚴(yán)格的質(zhì)量要求。當(dāng)器官提取物和生物合成高分子不足夠純而不能使其均質(zhì)化時，則污染物(雜質(zhì))將會引起不希望有的副作用。由于這個理由，人們都應(yīng)盡力在治療中采用具有精確確定結(jié)構(gòu)和高純度的組合物。上述的與高分子有關(guān)的免疫刺激作用也可以通過使用較小的肽來達到(美國專利說明書專利號4，190，646、4，215，112、4，232，008、4，261，886、4，395，404和4，442，031;德國專利說明書專利號2，938，420、3，001，775和3，100，974;匈牙利專利說明書專利號4827/86)。
在上面引用的參考資料中所描述的短肽表明了T-和B-細胞的增生現(xiàn)象，并具有一種總的免疫刺激效應(yīng)。為了再現(xiàn)天然免疫調(diào)整劑的整個反應(yīng)譜，就需要一些物質(zhì)，它們在總的免疫反應(yīng)的各個不同時期可發(fā)揮它們的作用，并且其作用方式不同于已知的免疫刺激劑。
本發(fā)明的肽對免疫系統(tǒng)功能能發(fā)揮一個總的抑制效果，并且特別是它們能抑制T-細胞的成熟和巨噬細胞的活性。這種作用使得利用這些肽來治療與免疫系統(tǒng)功能亢進有關(guān)的癥狀成為可能。目前在治療中所用的免疫抑制藥物如環(huán)磷酰胺，即2-[雙(2-氯乙基)氨基]-四氫-2H-1，3，2-噁嗪膦-2-氧化物;硫唑嘌呤，即6-(1-甲基-4-硝基-5-咪唑基硫代)嘌呤;皮質(zhì)甾類或環(huán)葚孢菌素(cyclosporin)，它們具有治療指數(shù)低于10，即就是其治療劑量與毒性的藥物劑量沒有很大的差別，因此，它們只能在嚴(yán)格的醫(yī)學(xué)控制下使用。
免疫抑制性肽的一個特殊優(yōu)點是它們在有機體中分解非?？欤粫e累在組織和細胞中;然而，雖然它們存在時間短暫，但它們能產(chǎn)生導(dǎo)致重大作用的復(fù)合過程。它們的特點在于低毒性[LD50＞1000毫克/公斤靜脈內(nèi)(i.v)]。
人們已發(fā)現(xiàn)，式(1)到(20)的新穎肽能夠抑制T-細胞依賴性產(chǎn)生抗體的細胞的成熟，減少了新生小鼠的抗體產(chǎn)生細胞的活性，并且可抑制吞噬作用和減少遲發(fā)過敏性反應(yīng)。這些肽的抑制效應(yīng)據(jù)推測是建立在下列現(xiàn)象的基礎(chǔ)上的。即它們在免疫過程中能抑制巨噬細胞的抗原表現(xiàn)和/或T-細胞的抗原識別。實際上，免疫反應(yīng)的復(fù)合機制是通過這些過程和相互作用開始的;因此，可以設(shè)想這些肽的免疫抑制作用在免疫反應(yīng)的開始降段是非常有效的。
本發(fā)明式(1)至(20)的新穎肽的制備方法是如在肽化學(xué)中所知道的連續(xù)地應(yīng)用活性酯、混合酸酐和/或疊氮化合物法的偶聯(lián)步驟在溶液中使鏈分步加長，接著使α-和/或ε-氨基脫保護作用。由此，可由含有羧基的氨基酸衍生物開始，通過可藉氫化作用或酸解作用去除的保護基來酯化，并且一個任意經(jīng)保護的側(cè)鏈羥基和/或氨基和/或C-末端接羧基可通過藉氫化作用而可除去的保護基來胺化或酯化;或者由1，2-二氨基乙烷、它的單-L-纈氨酸衍生物或L-胱氨酸二酰胺開始，式(1)至(20)的肽的衍生物的形成是，通過藉氫化或酸解作用可去除的保護基，在它們的C-末端羧基上進行胺化或酯化，通過藉氫化或酸解作用可除去的保護性基在它們的其他羧基上進行酯化，它們含有肽鏈上不涉及的它們氨基上的保護基Boc或Z，和/或在它們的羥基上進行保護;然后通過催化氫化和/或酸性處理除去存在的保護基;并且假如需要，可通過適用的酸處理，將式(1)至(20)的游離肽轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊乃峒映甥};和或，假如需要，式(1)至(20)的游離肽，可以以它們的鹽的形式得到，和/或與其他酸轉(zhuǎn)變?yōu)樗纬傻柠}。
在某些情況下，在合成中結(jié)合使用保護基，如使其可能選擇性地去除氨基保護基，然后在合成快結(jié)束時以一步或二步的方式除掉所有的保護基。為了要形成肽鍵，可采用利用N-羥基一琥珀酰亞胺酯的方法(WunschSyntheseVonPeptidenVol.2，GeorgThiemeVerlag，Stuttgart，1974，page14)，采用五氟代苯基酯的方法(匈牙利專利說明書專利號168，431)，或采用混合酸酐的方法(匈牙利專利說明書專利號183，579)。
為了合成式(9)至(12)的二聚物型化合物，可采用1，2-二氨基乙烷或其單-L-纈氨酸衍生物或L-胱氨酸二酰胺作為起始物質(zhì)。在分步方式使鏈加長方法中，可使用約2摩爾的酰化氨基酸衍生物，以1摩爾的上述起始物質(zhì)來計算(實際摩爾比取決于反應(yīng)物中的哪一個反應(yīng)物應(yīng)該適當(dāng)過量使用)。
很明顯，在式(9)、(11)和(12)的化合物的合成中，每一個中間物具有一對稱結(jié)構(gòu)，而式(10)的中間物為不對稱的。
氨基可由Boc或Z基保護，而羧基具有叔丁基，芐基或4-硝基芐基酯保護基。
在合成完成后，任意地將存在的保護基從用上述方式獲得的被保護的肽中除去。然后，假如需要，游離肽可用酸處理使其轉(zhuǎn)變?yōu)樗乃峒映甥}。催化氫化作用或酸解作用可用于去除保護基。這樣獲得的肽通常是非常純的，可作治療用，并且不需要進一步提純處理。然而，若需要，它們可通過在硅膠上進行柱色譜法(色層分離法)來提純。以溶液形式所獲得的肽可通過溶液的蒸發(fā)或冷凍干燥的方法來分離。游離肽可被轉(zhuǎn)變?yōu)槿我獾柠}。
最終產(chǎn)物的純度可用高性能液體色譜法(HPLC)分析來核驗。
靶子化合物對免疫系統(tǒng)的作用將在下述試驗中加以研究。
1.對新生大鼠產(chǎn)生抗體的細胞的作用本研究是按照Canningham的方法用得自新生大鼠的脾細胞來進行的，(HandbookofExperimentalImmunology，Ed，D.M.Weir，Vol.2.Black-wellOxford-London，page285，1978)。對來自枯葉層的十二只Wister(LATI)大鼠，在它們出生12小時內(nèi)，采用7.5微克(μg)的試驗物質(zhì)，劑量為1毫克/公斤(mg/kg)進行腹腔內(nèi)(i.p)注射處理。在出生后的第14天，將這些動物用0.5毫升的1%綿羊紅細胞懸浮液進行腹腔內(nèi)免疫接種，然后7天后用斷頭術(shù)放血。從得自該小動物的脾細胞，用綿羊紅細胞懸浮液和補體制備均勻的懸浮液，然后將其放置于適宜獲得單細胞層的小室內(nèi)。該小室用石蠟密封，在37℃下培育45分鐘。在產(chǎn)生抗體的脾細胞的周圍，形成溶解區(qū)(lyticareas)，即所謂空斑。在用抑制物質(zhì)處理的影響下，空斑形成細胞(PFC)的數(shù)目被減少了。表1中歸納的數(shù)據(jù)表明這種百分?jǐn)?shù)的減少量是根據(jù)得自未處理的對照動物的細胞基礎(chǔ)來計算的。在同樣情況下，空斑形成細胞的數(shù)目可通過使用免疫刺激肽而表1抗體產(chǎn)生的抑制肽變化%(1)Arg-Lys-(Chc)-Asp-Val-14.4(2)Arg-Lys-(Chc)-Asp-27.1(3)Arg-Sar-Asp-Val-25.5(4)Arg-Ssr-Asp-21.5(5)Orn-Lys-Asp-19.5(8)Arg-Lys-Aad-10.6(10)Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-22.4
|Arg-Lys-Asp-NH-CH2(11)(Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2)2-21.2(16)Lys-Glu-Thr-36.8(17)Lys-Thr-Glu-Thr-23.2(18)Ppo-Lys-Leu-Thr-19.4(19)Lys-Lys-Thr-Glu-22.9(20)Lys-His-Leu-NH2-25.3AArg-Lys-Asp+68.6BArg-Lys-Asp-Val+58.0CArg-Lys-Asp-Val-Tyr+46.92.對新生大鼠初次抗體產(chǎn)生的影響該研究是建立在凝集現(xiàn)象的基礎(chǔ)上的。一種特定的抗血清粘附于抗原形成的大顆粒的表面并快速沉降(凝集)。
將新生Wistar(LATI)大鼠在出生后12小時內(nèi)，用1毫克/公斤劑量的試驗物質(zhì)進行腹腔內(nèi)(i.p)處理。在第14天，用0.5毫升的1%綿羊紅細胞懸浮液對小動物進行腹腔內(nèi)免疫接種。隨著免疫作用的第7天，后眼眶取血，30分鐘后，用離心法分離血清，并按Takatsy法測定血細胞凝集素滴定度[ActaMicrobiol.Acad.Sci.Hung.3，191(1955)]。從二只大鼠的混合血清(50微升(μl)，以12個步驟制備對半稀釋液。每個試樣給以25微升(μl)的2%綿羊紅細胞懸浮液。將該混合物在37℃下培育1小時以評價凝集作用。表2中歸納的這些數(shù)據(jù)表明該化合物對初次抗體產(chǎn)生的抑制作用以相對于未處理動物的百分比來表示。免疫刺激物質(zhì)在此試驗中正好表現(xiàn)出其相反作用。
表2對初次抗體產(chǎn)生的作用肽相對于未處理對照物的變化%(3)Arg-Sar-Asp-Val-17.9(4)Arg-Sar-Asp-10.7(11)(Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2)2-14.9(12)(Arg-Lys-Asp-Cys-NH2)2-10.7(19)Lys-Lys-Thr-Glu-10.8AArg-Lys-Asp+13.7BArg-Lys-Asp-Val+28.1CArg-Lys-Asp-Val-Tur+41.33.靜止巨噬細胞吞噬能力的抑制作用靜止巨噬細胞的吞噬能力在小鼠身上已作過研究[J.Immunophamacol，4，265(1982-1983)]。重22-28克的雄性CFLP(LAT)小鼠，每日用1毫克/公斤劑量的試驗物質(zhì)進行皮下(S.C.)處理7天。給動物放血后，它們的腹膜用8毫升PBS緩沖溶液(磷酸鹽緩沖鹽水，pH＝洗滌，每次含有10個國際單位(IU)的肝素。從腹腔內(nèi)洗出的細胞懸浮液用蒸餾水搖蕩的方法使其成為無紅細胞，然后用PBS緩沖溶液洗滌3次。二次洗滌間的沉淀是通過在1000轉(zhuǎn)/分下離心作用5分鐘來達到的。每次細胞懸浮液的濃度調(diào)整至10細胞/毫升，并且將該懸浮液在含有5%二氧化碳的氣氛下、溫度為37℃的Boyden-室內(nèi)沉降30分鐘。粘附于玻璃壁的巨噬細胞的上面產(chǎn)生一層調(diào)理酵母。在除去非吞噬的顆粒后，在每個細胞中對由巨噬細胞并入的那些粒子進行計數(shù)。表3給出了相對于從作為對照的未處理動物分離出的巨噬細胞的吞噬的酵母細胞的數(shù)目減少的百分比。
表3肽變化%(1)Arg-Lys-(Chc)-Asp-Val-11.2(2)Arg-Lys-(Chc)-Asp-47.3(3)Arg-Sar-Asp-Val-10.5(4)Arg-Ssr-Asp-22.7(7)Arg-Lys-Aad-Val-28.7(8)Arg-Lys-Aad-29.1(9)(Arg-Lys-Asp-NH-CH)-11.6(11)(Arg-Lys-Asp-Val-NH_CH)-16.5(12)(Arg-Lys-Asp-Cys-NH)-40.1(14)Ser-Lys-Leu-14.0(17)Lys-Thr-Glu-Thr-17.5(18)Pro-Lys-Leu-Thr-11.8(19)Lys-Lys-Thr-Glu-18.6(20)Lys-His-Leu-NH-39.6環(huán)磷酰胺其腹腔內(nèi)劑量為150毫克/公斤-75.04.對遲發(fā)過敏性(DTH)反應(yīng)影響該試驗是在重25-30克的雄性CFLP(LATI)小鼠身上進行的。在實驗開始時，將小鼠用3%的噁唑酮在無水乙醇中的溶液進行處理，在每只小鼠的雙耳和前爪上涂敷20微升的該種溶液。在處理的第7天，這些動物再用溶解于生理鹽水的化合物在其腹腔內(nèi)進行處理，劑量為1毫克/公斤。對照小鼠僅用鹽水處理之。在實驗的第10天，用20微升(μl)的2.5%噁唑酮的橄欖油溶液涂抹該小動物的每只耳朵。耳朵的厚度測量二次，即在引入抗原前如引入抗原后24小時。雙耳厚度的測量是在耳垂的中部位置，測量精確度至0.01毫米。其變化與對照組進行比較而得。有關(guān)DTH反應(yīng)發(fā)展的抑制作用的數(shù)據(jù)以百分比值給出于表4中。
表4肽抑制作用%(1)Arg-Lys-(Chc)-Asp-Val39.1(5)Orn-Lys-Asp-Val28.3(6)Orn-Lys-Asp39.6(8)Arg-Lys-Aad36.8(11)(Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2)227.0(12)(Arg-Lys-Asp-Cys-NH2)235.3(13)Lys-Ser-Lys-Leu28.2(14)Ser-Lys-Leu22.7(15)Ser-Ser-Ser-Thr18.0(16)Lys-Glu-Thr27.5(17)Lys-Thr-Glu-Thr35.5環(huán)磷酰胺其腹腔內(nèi)劑量為150毫克/公斤72
上表作為比較用的肽“A”、“B”和“C”是已知的;“A”和“B”在匈牙利專利號185，263的說明書中有所描述;“C”可從美國專利號4，190，646的說明書中得知。
本發(fā)明的化合物及它們的酸加成鹽可以普通藥用組合物形式，被應(yīng)用在任何需要減少免疫系統(tǒng)活性的治療領(lǐng)域。式(1)至(20)的肽可以其本身或它們的鹽的形式被應(yīng)用，很適宜的是通常在治療中以醫(yī)藥配方來應(yīng)用。這些配方(藥方)可以為固體或液體狀態(tài)，并且可通過使用填料、稀釋劑、穩(wěn)定劑、pH影響劑和滲透壓影響劑，以及通常用于這些配方的能促進配方的添加劑。
本發(fā)明通過下述的而并非限制的實施例作詳細說明。
在敘述中所用的縮寫相當(dāng)于通常在文獻中已知的縮寫[Biochem.J.219，345(1984)]。“Chc”意指環(huán)己基氨基甲?；汀癆ad”為α-L-氨基己二?；?。熔點是在Dr.Tottoli裝置(由瑞士Büchi制造)內(nèi)測定。薄層色譜法檢查是通過使用備用的吸收劑(DC-Fertigplatten，由FRG，Merck制造)及以下的溶劑混合物(此處原液為20∶6∶11的吡啶/乙酸/水的混合物)1.乙酸乙酯/原液19∶1;
2.乙酸乙酯/原液9∶1;
3.乙酸乙酯/原液4∶1;
4.乙酸乙酯/原液7∶3;
5.正丁醇/原液3∶7;
6.正丁醇/原液1∶4;和7.正丁醇/乙酸/乙酸乙酯/水1∶1∶1∶1.
(比率為體積比)色譜用水合茚三酮來測定，或者在氯化作用后，用碘化鉀/聯(lián)甲苯胺試劑來測定。
HPLC分析是可通過采用裝有Labor-MIN DE975型具有可變波長的紫外探測器、Altex泵和KUTESZ175型記錄器的裝置來進行。為了便于分離，使用具有由C18烷基烷基化了的硅凝膠靜止相的長250毫米、內(nèi)徑4.6毫米填料。
下面的混合物作為洗脫之用A.含有25毫升的甲醇和75毫升的含0.5%(體積)三氟代乙酸的0.01摩爾硫酸鈉水溶液的混合物;
B.1.5∶1.0∶97.5的乙腈/三氟代乙酸/蒸餾水的混合物。
測量是在流量為1毫升/分鐘下完成的，并且溶液的吸附在212毫微米(nm)處測得。該色譜通過面積標(biāo)準(zhǔn)化法來評定。
靶化合物的純度根據(jù)HPLC和薄層色譜法(TLC)分析兩者測得，高于95%。
特有的旋光度可由Perkin-Elmer241型旋光計來測定。所有的溶劑可由在40℃水浴中的Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器來除去或蒸發(fā)掉。
靶化合物的氨基酸分析是在BiotronikLC5001型裝備中進行。將試樣在110℃6摩爾濃度的鹽酸溶液中水解24小時。分析結(jié)果在所有情況下為在±5%的誤差極限之內(nèi)。
合成的起始物質(zhì)在一般在文獻中是共知的。
實施例1Arg-Sar-Asp-Val的制備(方法“A”)將1.68毫升(12.0毫摩爾)的三乙胺加入到含2.58克(12.0毫摩爾)的H-Val-OtBu.HCl和4.62克(11.0毫摩爾)的在25毫升二甲基甲酰胺(DMF)中的Z-Asp(OtBu)的懸浮液中。將反應(yīng)混合物留置過夜，然后在減壓下蒸發(fā)。將殘留物與50毫升乙酸乙酯混合，所得的懸浮液接連地用25毫升的水洗滌，用25毫升的1摩爾/升鹽酸(每次)洗滌3次，再用25毫升的5%碳酸氫鈉水溶液(每次)洗滌3次，最后用25毫升水洗滌，用無水硫酸鈉干燥之，并在減壓下蒸發(fā)，獲得4.3克(81.7%)的油狀Z-Asp(OtBu)-Val-OtBu保護的二肽，R1f＝0.85。
把4.07克(8.5毫摩爾)上述被保護的二肽溶解于40毫升甲醇中，并通過有1.0克鈀(在碳上)存在下的溶液，在攪拌的同時使氫起泡方法來氫化。氫化作用在2小時內(nèi)完成，然后濾掉催化劑，將濾液在減壓下蒸發(fā)，將殘留物溶解于50毫升乙醚中，并通過加入6摩爾/升濃度的二噁烷的鹽酸溶液以調(diào)節(jié)pH值至4。濾出沉淀物以獲得3.2克(91.5%)的H-Asp(OtBu)-Val-OtBu.HCl游離二肽氫氯化物，熔點為187-189℃，R2f＝0.40。
將3.0克(10.0毫摩爾)的Z-Sar-O Su和3.05克(8.0毫摩爾)的在30毫升DMF中的H-Asp(OtBu)-Val-OtBu.HCl在有1.40毫升(10.0毫摩爾)的三乙胺參與下發(fā)生反應(yīng)。次日將該反應(yīng)混合物在減壓下蒸發(fā)，其殘留物被溶解于50毫升乙酸乙酯中，所得的懸浮液接連地用20毫升水洗滌、每次再用20毫升的1摩爾/升鹽酸(每次)洗滌，共2次，每次再用20毫升的5%碳酸氫鈉溶液(每次)洗滌共2次，并最后用20毫升水洗滌，通過無水硫酸鈉干燥之，并在減壓下蒸發(fā)。
所得的油狀Z-Sar-Asp(OtBu)-Val-OtBu被保護的三肽，其產(chǎn)量為4.2克(7.6毫摩爾)(R1f＝0.75)，溶解于40毫升的甲醇中，并在加入0.8克的鈀(在碳上)催化劑后，用一般方法使混合物氫化。濾去催化劑后，將1.0克(8.0毫摩爾)的草酸二水化物加入到濾液中，蒸發(fā)溶液，加入乙醚使殘留物固化，得到2.24克的H-Sar-Asp(OtBu)-Val-OtBu草酸鹽(游離三肽草酸鹽)，熔點為190-192℃，R3f＝0.30。
將1.14克(3.5毫摩爾)的在10毫升DMF中的Boc-Arg(HC1)-OH.H2O溶液冷卻至-10℃，加入0.55毫升(4毫摩爾)的氯甲酸異丁酯，在同一溫度下再加入0.44毫升(4毫摩爾)的溶解于5毫升DMF中的N-甲基嗎啉溶液。將所得的混合酸酐在-10℃下攪拌10分鐘，然后在相同溫度下加入上面所得的1.5克(3毫摩爾)的游離三肽草酸鹽溶液，和0.84毫升(6毫摩爾)的在5毫升DMF中的三乙胺。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝兀⒘糁眠^夜。在減壓下使溶劑蒸發(fā)，將殘留物溶解于50毫升氯仿中，并將該溶液用20毫升的1摩爾/升鹽酸(每次)洗滌3次，再用20毫升水洗滌，并用無水硫酸鈉干燥。油狀殘留物用加入乙醚的方法使其固化，過濾懸浮液，獲得1.30克(66%)的無定形Boc-Arg(HCl)-Sar-Asp(OtBu)-Val-OtBu，R3f＝0.18，R4f＝0.24;/α/20D＝-37.0℃(C＝1，甲醇)。
將上面得到的1.20克(1.8毫摩爾0的被保護的四肽在40℃下用三氟代乙酸處理2小時，然后加入60毫升乙醚將該混合物稀釋，過濾懸浮液，并用醚洗滌沉淀物。將三氟代乙酸鹽溶解在10毫升水中后，利用5毫升乙酸酯系(DOWE×2×8)的陰離子交換樹脂，使三氟化乙酸酯離子被乙酸酯離子所取代。在減壓下蒸發(fā)溶液后，加入5毫升的90%乙醇水溶液使殘留物固化，獲得0.6克的無定形Arg-Sar-Asp-Val;/α/20D＝-32.3°(C＝1，10%乙酸)。氨基酸分析Asp 1.0303(1)，Val 0.97(1)，Arg 1.00(1)。
實施例2Lys-Glu-Thr的制備(方法“B”)將3.3克(11.0毫摩爾)的H-Thr(tBu.草酸鹽懸浮于60毫升的乙醚中后，將此懸浮液隨同30毫升的5%碳酸氫鉀水溶液共搖動直至溶解。分離有機相，用附加的20毫升的5%碳酸氫鉀水溶液洗滌，然后再用20毫升水洗滌，通過無水硫酸鈉干燥，并在減壓下蒸發(fā)。將4.12克(9.5毫摩爾)的Z-Glu(OtBu)-O Su加入到在20毫升DMF中的油狀殘留物的溶液中。將該混合物在室溫下攪拌2小時，然后在減壓下蒸發(fā)。將該殘留物溶解在50毫升乙酸乙酯中，并接連地每次用15毫升的10%檸檬酸水溶液洗滌共洗滌3次，每次用15毫升的5%碳酸氫鈉水溶液洗滌共2次，最后用15毫升水洗滌，再通過無水硫酸鈉干燥之，并在減壓下蒸發(fā)，獲得4.4克(8.0毫摩爾)的油狀Z-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-OtBu保護的二肽(R1f＝0.85)，將該物溶解于50毫升甲醇中，并如實施例1中描述的方法進行氫化，在濾去催化劑后，蒸發(fā)濾液，產(chǎn)得游離H-Glu(OtBu)-Thr(tBu)二肽(R2f＝0.22)，將它溶解于20毫升DMF中，在加入4.77克(10毫摩爾)的Z-Lys(Boc)-O Su后，將該反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時，并在減壓下蒸發(fā)。在油狀殘留物溶解于50毫升的乙酸乙酯中后，按通常方法經(jīng)多次洗滌來凈化溶液，然后用無水硫酸鈉干燥、并在減壓下蒸發(fā)。油狀蒸發(fā)殘留物在乙醚中重結(jié)晶，產(chǎn)得4.75克(74%)的Z-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)保護的三肽，熔點為114-115℃;R2f＝0.80;/α/20D＝22.8(C＝1，甲醇)。
4.4克(5.6毫摩爾)上述的被保護的三肽被溶解于40毫升甲醇中，如實施例1描述的方法進行催化氫化。在濾去催化劑后，將濾液在減壓下蒸發(fā)，并且將油狀殘留物溶解于40毫升具有6摩爾/升濃度的二噁烷鹽酸溶液中。15分鐘后出現(xiàn)沉淀物。一小時后，該懸浮液用100毫升的乙醚稀釋，過濾，將沉淀物用乙醚洗滌以獲得2.3克(91%)的無定形Lys-Glu-Thr.2HCl三肽二氫氯化物，熔點這213-215℃(隨有分解);/α/20D＝+2.7°(C＝1，1.1%乙酸)。
將上述Lys-Glu-Thr.2HCl三肽二氫氯化物溶解于20毫升水中后，氯化物離子在乙酸酯系(DONE×2×8)的樹脂上被乙酸酯離子所取代，然后將該溶液在減壓下蒸發(fā)，并且加入乙醇使殘留物固化。這樣可獲得2.27克的無定形Lys-Glu-Thr-乙酸酯;α＝+3.5°(C＝1，10%乙酸)。氨基酸分析Glu1.01(1)，Thr1.00(1)，Lys1.00(1)。
實施例3Lys-His-Leu-NH2乙酸酯的制備(方法C)先將2.8毫升(20毫摩爾)的三乙胺和然后再將5.6克(11摩爾)的Z-Lys(Z)-O Su加入到2.42克(10毫摩爾)的在30毫升DMF中的His.OMe.2HCl的溶液中。次日，蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，油狀殘留物被溶解于45毫升氯仿中，將溶液多次用20毫升水洗滌共2次，通過無水硫酸鈉干燥之，并在減壓下蒸發(fā)。加入乙酸乙酯使油狀殘留物固化后，獲得4.54克(80%)的Z-Lys(Z)-His-OMe，熔點為135-136℃，R3f＝0.45。
將4.0克(7毫摩爾)上面得到的保護的二肽酯溶解于40毫升的溫甲醇中，并加入4毫升的水合肼。將該混合物保持在室溫下3天，然后在減壓下蒸發(fā)至其一半體積，再用50毫升的乙醚稀釋。濾出無定形沉淀物，并用乙醚洗滌，獲得3.70克的Z-Lys(H)-His-N2H3保護的二肽肼，熔點為150-153℃;R3f＝0.20。
將含有3.65克(6.0毫摩爾)的在15毫升DMF中的上述Z-Lys(Z)-His-N2H3的溶液冷卻至-10℃，在相同溫度下，以滴入方式加入2.5毫升的具有7摩爾/升濃度的二噁烷氫氯化物和隨后加入0.75毫升(6.6毫摩爾)的在4毫升DMF中的叔丁基亞硝酸酯。將該反應(yīng)混合物在-10℃下攪拌20分鐘后，加入2.0毫升的三乙胺，并且然后滴入1.33克(7毫摩爾)的Leu-NH2乙酸酯溶液和1毫升的在10毫升DMF中的三乙胺。然后將該混合物在0℃下攪拌30分鐘，然后留置于室溫下過夜。反應(yīng)混合物在減壓下蒸發(fā)，并且該殘留懸浮在水中?？色@得3.7克粗產(chǎn)物，使該產(chǎn)物從30毫升的異丙醇中重結(jié)晶，獲得2克(65%)的Z-Lys(Z)-His-Leu-NH2，熔點為110-1113℃，R4f＝0.30;/α/20D＝-20.1°(C＝1，甲醇)。
將1.2克(1.8毫摩爾)上面得到的保護的三肽溶解于20毫升的一種5∶1∶2的甲醇/水/乙酸的混合物中，并且如實施例1描述的方法進行催化氫化。濾掉催化劑后，濾液在減壓下蒸發(fā)。加乙醇于殘留物之后，蒸發(fā)，該殘留物用乙醚研制，以得到0.57克無定形的吸濕性Lys-His-Leu-NH2-乙酸酯;/α/20D＝-5.7°(C＝1，在1摩爾/升乙酸中)。
氨基酸分析Leu0.95(1)，His1.03(1)，Lys1.04(1)。
表5所示的被保護的肽和表6所表明的靶化合物可按照實施例中詳細描述的方法來制備。
權(quán)利要求
1.式(1)至(20)的肽類Arg-Lys(Chc)-Asp-Val(1)Arg-Lys(Chc)-Asp(2)Arg-Sar-Asp-Val (3)Arg-Sar-Asp-(4)Orn-Lys-Asp-Val (5)Orn-Lys-Asp (6)Arg-Lys-Aad-Val (7)Arg-Lys-Aad (8)[Arg-Lys-Asp-NH-CH2-]2(9)
[Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-]2(11)[Arg-Lys-Asp-Cys-NH2] (12)Lys-Ser-Lys-Leu(13)Ser-Lys-Leu(14)Ser-Ser-Ser-Thr(15)Lys-Glu-Thr(16)Lys-Thr-Glu-Thr(17)Pro-Lys-Leu-Thr(18)Lys-Lys-Thr-Glu(19)Lys-His-Leu-NH2(20)以及其酸加成鹽，它們能抑制T-淋巴細胞的成熟和巨噬細胞的活性。
2.一種能抑制T-淋巴細胞成熟和巨噬細胞活性的醫(yī)藥用組合物，它包括有作為活性組分的如權(quán)利要求中規(guī)定的式(1)至(20)的一個或多個肽，它們以游離形式或酸加成鹽形式以治療有效量，與通常在醫(yī)藥工業(yè)所使用的一種或多種醫(yī)藥上可接受的稀釋劑、填料、穩(wěn)定劑、pH影響劑和滲透壓影響劑共混和。
3.制備式(1)至(20)的新穎肽以及它們的酸加成鹽的方法Arg-Lys(Chc)-Asp-Val (1)Arg-Lys(Chc)-Asp (2)Arg-Sar-Asp-Val (3)Arg-Sar-Asp- (4)Orn-Lys-Asp-Val (5)Orn-Lys-Asp (6)Arg-Lys-Aad-Val (7)Arg-Lys-Aad (8)[Arg-Lys-Asp-NH-CH2-]2(9)Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2|Arg-Lys-Asp-NH-CH2(10)[Arg-Lys-Asp-Val-NH-CH2-]2(11)[Arg-Lys-Asp-Cys-NH (12)Lys-Ser-Lys-Leu (13)Ser-Lys-Leu (14)Ser-Ser-Ser-Thr (15)Lys-Glu-Thr (16)Lys-Thr-Glu-Thr (17)Pro-Lys-Leu-Thr (18)Lys-Lys-Thr-Glu (19)Lys-His-Leu-NH2(20)該方法包括如在肽化學(xué)上所熟知的通過連續(xù)地應(yīng)用活性脂，混合酸酐和/或迭氮化物的偶聯(lián)步驟在熔液中使鏈分步加長，隨后通過α-和/或ε-氨基的脫保護，其特征在于由含有羧基的氨基酸衍生物開始，通過藉氫化作用或酸解作用可去除的保護性基被酯化，和任意被保護的側(cè)鏈羥基和/或氨基和/或C-末端羧基，通過藉氫化作用而可除去的保護性基被胺化或酯化;或者1.2-二氨基乙烷、它的單-L-纈氨酸衍生物或L-胱氨酸二酰胺、式(1)至(20)的肽的衍生物的形成是在它們的C-末端羧基上，通過藉氫化或酸解作用可去除的保護基，再在它們的其他羧基上，通過藉氫化或酸解作用可去除的保護基來進行酯化，同時含有它們的在肽鍵中不涉到的、在它們的氨基保護基BOC或Z，和/或在它們的羥基上進行保護;然后通過催化氫化和/或酸性處理去除存在的保護基;并且假如需要，可通過合適的酸來處理，將式(1)至(20)的游離肽轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊乃峒映甥};和/或假如需要，可考慮將式(1)至(20)的游離肽以它們的鹽的形式得到，和/或轉(zhuǎn)變?yōu)榕c其他酸所形成的鹽。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于它包括使用含有可由叔丁基酯化的羧基的被保護氨基酸衍生物。
5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于它包括使用可由在氨基上的Boc基?；谋槐Ｗo氨基酸衍生物。
6.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于它包括使用可由在氨基上的Z基?；谋Ｗo氨基酸衍生物。
7.如權(quán)利要求3至6的任一項所述的方法，其特征在于它包括使用由在羥基上的叔丁基保護的氨基酸衍生物。
8.如權(quán)利要求3至7的任一項所述的方法，用于制備式(1)至(4)和式(7)至(12)的肽，其特征在于它包括使用可由在其胍基上的氯化氫保護的精氨酸衍生物。
9.制備可抑制T-淋巴細胞成熟和巨噬細胞活性的醫(yī)藥用組合物的方法，它包括將作為活性組分的如在權(quán)利要求3中所規(guī)定的式(1)至(20)的一個或多個肽或它們在醫(yī)藥上可接受的鹽，以治療上有效的量，與在醫(yī)藥工業(yè)中通常使用的一種或多種在醫(yī)藥上可接受的稀釋劑，填料、穩(wěn)定劑、pH影響劑和滲透壓影響劑相混合。
10.抑制T-淋巴細胞成熟和巨噬細胞活性的方法，它包括給動物或人類服用治療上有效劑量的一種或多種如權(quán)利要求1中限定的式(1)至(20)的肽和/或它們的酸加成鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及能抑制T-淋巴細胞成熟和巨噬細胞活性的新穎肽及其酸加成鹽，涉及含有這些肽的藥用組合物以及制備這些肽和組合物的方法。該新穎肽對于治療疾病是有用的，在需要對免疫系統(tǒng)功能進行一般抑制作用的場合都可適用。
文檔編號C07K1/06GK1044102SQ8910971
公開日1990年7月25日 申請日期1989年12月30日 優(yōu)先權(quán)日1989年1月13日
發(fā)明者伊思脫凡勛, 奧加奈克尼可帕力納, 拉喬斯開型法羅第, 拉茲路丹尼斯, 邱吉赫瞿斯, 拉茲路司布尼 申請人:理查德奇特昂凡昔的古阿脫