專利名稱：傳染性支氣管炎病毒疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼傳染性支氣管炎病毒(IBV)的刺突蛋白多肽的一種核酸順序、含有這種核酸順序的重組核酸分子、含有所述核酸順序的載體或宿主細胞、含有IBV刺突蛋白多肽的氨基酸順序的多肽、與所述多肽起免疫反應的抗體或抗血清以及用于保護動物使之免受IBV感染的疫苗。
IB病毒能使雞產(chǎn)生急性傳染病，其特點是典型的呼吸癥狀，如氣管啰音、氣喘、咳嗽和流鼻涕。IB能引起很高的死亡率，特別是在幼雞中。除此之外，腎臟和生殖器官系統(tǒng)也會受到影響，后者的損害會引起產(chǎn)卵雞或雌種雞產(chǎn)蛋率下降。雞易受IB感染，尤其是適于烤制的小雞更易受某些大腸桿菌菌株的傳染，結果增加了死亡率。
過去雞被認為是唯一的IB病毒宿主，但近來從火雞中也分離出了這種病毒。
IBV是冠狀病毒中的一種，它是一組含有由大約20kd單鏈RNA組成的基因組的被膜病毒。尤其是該基因組編碼三種主要的結構蛋白刺突蛋白(S)，膜蛋白(M)和殼包核酸蛋白(N)。糖基化的刺突蛋白的155KD母體在兩個結構不相關的亞單位S1和S2中轉譯以后被裂解。S1和S2各自的兩個或三個拷貝體形成特殊的IBV表面結構，即刺突或外包膜突起。刺突蛋白及其亞單位片段在傳染的禽類中誘導循環(huán)病毒中和抗體方面起著很重要的作用。
目前借助于活的減毒病毒疫苗保護雞使之免受IBV感染，然而，這種類型的疫苗具有許多缺陷，這些缺陷包括穩(wěn)定性差以及對腎臟、呼吸和生殖器官可能有壞影響，除此之外，使用減毒的活疫苗牽涉到使用部分減毒的致病病毒去接種動物的危險。另外減毒病毒還可能返復到毒性狀態(tài)，從而導致接種動物生病并且有可能在家禽中傳播該毒性病毒。
使用活的病毒疫苗還會遇到另外一個問題，就是用來培養(yǎng)疫苗病毒的細胞培養(yǎng)物可能會受到其它病毒的玷污。
通常，失活的病毒疫苗只能誘導低水平的免疫力，尤其是當需要局部保護呼吸和腸道系統(tǒng)的活性時，例如在本發(fā)明的情況下，這種疫苗還需要進行附加免疫(加強劑)。另外，失活處理可能會使病毒抗原決定子(誘導中和反應)發(fā)生變化，從而降低了病毒的保護能力。
目前用于對付IB的疫苗病毒是根據(jù)它們的抗原譜和誘導致病性(活的病毒疫苗)對其免逸原特性進行篩選的，疫苗中可以含有特殊的血清型如Connecticut(如Connecticut分離物A5968)或只對同源物起保護作用的Massachusetts(例如菌株Beau dette，M41和M42)，這些疫苗也可以使用具有廣譜抗原的特殊病毒菌株，例如Holland(H)菌株(如H120和Ma5)。然而人已經(jīng)知道上述疫苗對于屬于Arkansas血清型的IB病毒的傳染不能提供基本的免疫，它還需用Arkansas血清型IBV菌株對禽類進行附加接種免疫。這種血清型的存在首次為D.B.Fields(1973)所描述。
按照本發(fā)明，可以將主要編碼屬于Arkansas血清型IBV菌株的刺突蛋白多肽或其抗原片段的核酸順序用于制備一種疫苗，該疫苗可用來免疫接種受Arkansas血清型IBV菌株感染的禽類，而且這種疫苗沒有上述活的病毒或失活IBV疫苗所存在的缺陷。
為了確定特異病毒菌株是否屬于Arkansas血清型，即屬于與IBV菌株DPI 3186同樣的血清型，應該使用Cowen和Hitchner(1975)和Gelb等人(1981)所述的病毒一中和測試法。
用于本發(fā)明的“核酸順序”系指任意長度的核苷酸的一種聚合型，它可以指核糖核酸順序也可以指脫氧核糖核酸順序。原則上，該術語指的是分子的基本結構，因此，該述語包括雙鏈和單鏈DNA和單鏈RNA及其變體。
更進一步說，可以使用的本發(fā)明的核酸順序是那些基本上編碼由IBV產(chǎn)生的菌株DPI 3168的刺突蛋白多肽或其抗原片段的核酸順序。
優(yōu)選的用于本發(fā)明的核酸順序是基本上編碼具有氨基酸順序1-1168(示于SEQ ID NO1中)的多肽或其抗原片段的核酸順序。
編碼屬于Arkansas血清型的IBV菌株刺突蛋白多肽的抗原片段的核酸順序也包括在本發(fā)明的范圍之內。
特別是所述的核酸順序編碼由IBV產(chǎn)生的菌株DPI刺突蛋白多肽的抗原片段。
本發(fā)明中所用的術語“抗原片段”表示具有一定分子結構的所述IBV刺突蛋白多肽的片段，當該分子結構以適當形式存在時，它能在患病動物體內對所述的IBV刺突蛋白誘發(fā)免疫應答，此外，所述的片段對于屬于Arkansas血清型的IBV是特異的。
本發(fā)明的核酸順序編碼抗原片段如屬于Arkansas血清型的IBV菌株刺突蛋白多肽的亞單位S1或S2，這些核酸順序構成本發(fā)明的一部分。
尤其是，本發(fā)明的核酸順序基本上編碼刺突蛋白多肽的亞單位所述的亞單位具有與示于SEQ ID NO1中氨基酸順序1-539或545-1168相對應的氨基酸編碼區(qū)，它也可以編碼該亞單位的一部分，上述這些核酸順序包括在本發(fā)明的范圍內。
接合區(qū)，即編碼連接S1和S2亞單位的氨基酸順序的核酸順序，尤其是示于SEQ ID NO1中的氨基酸540-544也可能形成部分編碼S1和S2亞單位的核酸順序，或編碼在SEQ ID NO1中分別表示為氨基酸順序，1-539，545-1168的氨基酸順序。
此外，可以將編碼這些亞單位抗原片段的核酸順序用來制備一種用于接種家禽使之免受IBV感染的疫苗或用于診斷目的。這些核酸順序也構成了本發(fā)明的一部分。
用于在已知氨基酸順序中測試這種有用的多肽片段(稱為表位)的各種方法是已知的，根據(jù)已知的氨基酸順序，可以用實驗方法測定這些表位，例如借助于如WO84/03564和WO86/06487號專利出版物中所述的篩選技術。
另外，許多具有所述氨基酸順序的多肽片段可以根據(jù)理論研究結果以及與已知表位結構的一致性將其設計成表位，這些區(qū)段可以根據(jù)J.P.HOPP和K.R.Woods(1981)所述的親水性準則以及P.Y.Chou和G.D.Fasman(1987)所述的第二結構特征而確定。
確認含表位區(qū)域的另一種方法是使用所謂的“mar”突變體(單克隆抗體抗性突變體)對于抵抗中和單克隆抗體的變性IBV病毒，對其基因組上特定部分的核酸順序進行分析，結果將在一種多肽內找到該位置，該位置對于所述多肽的中和-誘導活性是必需的。
下列區(qū)段中含有的表位對于抗體反應的中和活性(對刺突蛋白多肽的)是特別重要的
Val 52-Tyr 72Gly 118-His 147。
編碼IBV菌株DPI3168的刺突蛋白多肽的脫氧核酸順序被示于SEQ ID NO1中，該cDNA順序的長度為3504個核苷酸，位于核酸151-1767和1783-3654之間的順序片段分別編碼S1和S2亞單位，所述順序由很小的接合區(qū)連接起來?；旧嫌伤龅腃DNA順序或其片段組成的核酸順序，優(yōu)選地一種含有介于核苷酸151-1767之間的S1亞單位編碼區(qū)或介于核苷酸1783-3654之間的S2單位編碼區(qū)的片段(示于SEQ ID NO1)(任選地還含有接合區(qū)順序)也構成本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明優(yōu)選的核酸順序中包含編碼刺突蛋白多肽片段的遺傳指令，該核酸順序基本上編碼S1亞單位，更進一步說，它是由位于SEQ ID NO1中的核酸順序151-1767組成的。
本發(fā)明所提供的指令，雖然是由一種屬于Arkansas血清型的IBV菌株獲得的，但它足以使所屬技術領域內一般技術人員分離和識別編碼刺突蛋白多肽或其抗原片段的核酸順序，所述的多肽來源于屬于Arkansas血清型例如Arkansas 99的其它天然存在的IBV變性菌株。
示于SEQ ID NO1中的cDNA順序，或其片段能用于此目的通過在適當嚴格的條件下進行雜交，該核酸順序能用來篩選cDNA基因庫。
這些cDNA基因庫是由屬于Arkansas血清型的其它IBV菌株的基因組RNA制成的(Slater，R.J.，1986，Chap.5和8;Singer-Sam，J.等人，1983;Maniatis，T.等人，1989)。
本發(fā)明概述了構建cDNA基因庫和進行雜交的方法。
作為已知技術，遺傳密碼子的簡并性允許堿基在密碼子內置換從而產(chǎn)生另一種密碼子，然而它仍然編碼同樣的氨基酸，例如對于氨基酸谷氨酸的密碼子是GAT和GAA兩個，因此，很清楚，為了表達具有如SEQ ID NO1所示的氨基酸順序的多肽或其抗原片段，可以使用核酸順序不同于SEQ ID NO1中所示的核酸順序的、由替換密子組成的核酸順序。
包括在本發(fā)明范圍內的還有一種核酸順序，該順序在嚴格的條件下能與示于SEQ ID NO1中的核酸順序雜交，所述的可雜交核酸順序與示于SEQ ID NO1中的核酸順序或其片段基本上是同源的，然而該核酸順序中可以含有核苷酸置換物，突變體、插入體、缺失、轉化體等等，并且它可以編碼一種蛋白或多肽，該蛋白或多肽的功能與屬于Arkansas血清型的IBV的刺突蛋白多肽或其抗原片段是等價的，即該相似多肽的氨基酸順序與IBV菌株DPI3168的刺突蛋白多肽或其抗原片段的氨基酸順序是不一樣的，但其與免疫特性有關的特征則是屬于Arkansas血清型的IBV菌株的刺突多肽或其抗原片段所特有的。
當然對于本發(fā)明所述的IBV菌株DPI3168的特定的多肽來說，在獨特的多肽DPI3168病毒單體之間或在Arkansas血清型菌株之間發(fā)生一些自然變異是有可能的，這些變異可以是整個順序中氨基酸的一個或多個差異、或所述順序中的一個或多個氨基酸的缺失、置換、插入、倒位或添加。編碼這些衍生物的核酸順序也包括在本發(fā)明的范圍內。然而仍有可能用重組DNA技術制備編碼這些多種衍生物的核酸順序。
優(yōu)選地，本發(fā)明的核酸順序可以由從市場上買來的DPI3168菌株的分離物產(chǎn)生。
所有這些產(chǎn)生如SEQ ID NO1中所示的核酸順序衍生物的變體都包括在本發(fā)明的范圍內。
本發(fā)明還包括IBV菌株的一種多肽，這種多肽由上述核酸順序編碼并能用于家禽抗IBV免疫。
此外，一種實際上包含Arkansas血清型IBV，尤其是DIP 3618菌株的刺突蛋白多肽的氨基酸順序的多肽或其抗原片段，優(yōu)選地如S1或S2亞單位也包括在本發(fā)明中。
在優(yōu)選的實施例中，使用了一種多肽或其片段，它主要含有如SEQ ID NO1所示的大約1-1168的氨基酸順序，例如大約1-539或545-1168的氨基酸順序。
更進一步說，用于本發(fā)明的多肽由示于SEQ ID NO1中的約1-539的氨基酸順序組成。
術語“多肽”系指一種氨基酸分子鏈，但不是指特殊長度的產(chǎn)物，因此，寡聚肽和蛋白包括在多肽范圍內。
應該明白，對于示于SEQ ID NO1中的特殊刺突蛋白多肽來說是可以存在一些自然變異的，這些變異可以是整個順序中氨基酸的一種或多種差異，或所述多肽中的一種或多種氨基酸缺失、置換、插入、倒位或添加。
此外，還有可能用重組DNA技術制備示于SEQ ID NO1中的刺突蛋白多肽的各種衍生物，所述的各種衍生物是通過對產(chǎn)物進行單個或多個氨基酸置換、缺失、添加或取代改性而成的。只要示于SEQ ID NO1中的多肽或其抗原片段基本未受影響，那么所有導致示于SEQ ID NO1中的刺突蛋白多肽的衍生物的變體皆包含在本發(fā)明的范圍之內。
本發(fā)明的核酸順序可被連接到各種影響復制過程的DNA順序上，優(yōu)選地。這些DNA順序可以含有部分編碼融合蛋白順序、例如β-半乳糖苷酶的DNA順序。結果獲得能用于轉化適當宿主的所謂的重組核酸分子。這種雜交DNA分子，優(yōu)選地是由例如質粒或噬菌體、衛(wèi)星細胞(Cosmids)或病毒中的核酸順序衍生出來的，能用于克隆本發(fā)明的核酸順序的特異載體在本領域內是已知的(例如參見Rodriquez，R.L和D.T，Denhardt，1988)用于構建本發(fā)明的重組核酸分子的方法對于所屬技術領域的一般技術人員來說是已知的并且特別被Maniotis，T等人(1982)所公開。本發(fā)明所使用的術語“轉化”系指將異源核酸順序導入宿主細胞中，它與所用方法無關，例如直接吸收或轉導異源核酸順序可以通自主復制而保留，或者換句話說，可以被整合到宿主基因組中。如果需要的話，該重組DNA分子可以通過與所用宿主相匹配的適當?shù)目刂祈樞蚨峁?，該控制順序能夠調節(jié)插入的核酸順序的表達。
合適的宿主細胞是這樣一種細胞，該細胞能被編碼多肽的核酸順序轉化，或者被包括該核酸順序的重組核酸分子轉化，并且如果需要的話，該細胞能被用來表達由所述核酸順序編碼的多肽。該宿主細胞可以是原核生物源的、例如象大腸桿菌(E.CoLi)、枯草桿菌(B.Subtilis)和假單胞菌(Pseuclomonas)族那樣的細菌;或是真核生物源的，如酵母，例如啤酒酵母或高級真核生物細胞例如昆蟲、植物或哺乳類動物細胞，包括Hela細胞和中國倉鼠卵巢(CHD)細胞。昆蟲細胞包括草地貪夜蛾的Sf9細胞系。有關將本發(fā)明的核酸順序在真核生物克隆系統(tǒng)中克隆和表達的信息可以從Esser，K等人(1986)處找到。
通常，在構建對本發(fā)明有用的載體方面，優(yōu)選的用來克隆DNA順序的是真核生物。
為了表達，可以將本發(fā)明的核酸順序與表達控制順序相連接，該控制順序可以由啟動子、操縱子、強化因子、誘導物、核糖體結合部位等等組成。
當宿主細胞是細菌時，一些有用的表達控制順序包含trp啟動子和操縱子(Goeddel等人，1980);lac啟動子和操縱子(Cheng等人，1978);外層膜蛋白啟動子(Nakrmura和Inouge，1982);噬菌體λ啟動子和操縱子(Rcmant等人1983);α-淀粉酶(枯草桿菌B.Subtitis)啟動子和操縱子，終止順序和其它與選擇的宿主細胞相匹的表達增強及控制順序。當宿主細胞是酵母時，一些有用的表達控制順序包括例如α-雜交因子，對于昆蟲細胞可以使用多聚六面體啟動子(Smith G.E.等人，1983)，當宿主細胞是哺乳動物時，一些有用的表達控制順序包括例如SV-40啟動子(Berman.P.W.等人，1983)或者如金屬硫
啟動子(Brinster，R.L等人，1982)或熱休克啟動子(Noellmy等人，1985)。此外，還可以使用IBV中的表達控制順序，尤其是調整DPI 3186刺突蛋白表達的那些順序。
家禽抗IBV感染的免疫作用，可以通過向禽類施用本發(fā)明的多肽，即所謂的亞單位疫苗來完成，本發(fā)明的亞單位疫苗可以是純多肽，也可以任選地有一種藥物允許的載體存在，任選地，該多肽可以與一種不相關的蛋白共價結合在一起，這種不相關蛋白可能對融合產(chǎn)物的提純有利，例如它可以是β-半乳糖苷酶、蛋白A、前凝乳酶、血凝結因子Xa等等。
在某些情況下，提高中和抗體(對這些多肽本身)的能力可能是很低的，小片段最好與載體分子結合起來，以便提高它們的免疫性能，適用于此目的的載體是大分子，例如天然聚合物(蛋白質，如KLH鑰孔
血藍素、清蛋白、毒素)、人工合成聚合物，如聚氨基酸(聚賴氨酸、聚丙氨酸)或者兩親化合物分子團，如皂草苷。此外，這些片段可以以其聚合物形式提供，最好是線性聚合物。
用于這種亞單位疫苗中的多肽，可以采用本領域已知的方法來制備，例如通過由IBV分離出所述的多肽，通過重組DNA技術或通過化學合成。
如果需要的話，可以對用于疫苗中的本發(fā)明的多肽進行體外或體內改性，例如通過糖基化、酰胺化，羧化和磷酸化作用。
亞單位疫苗的替換物是活載體疫苗用重組DNA技術將本發(fā)明的核酸順序引入微生物(如細菌或病毒)中，其引入方式能使該重組微生物仍能復制，從而表達由插入的核酸順序編碼的多肽。然后，向禽類施用該重組微生物從而實現(xiàn)免疫，之后，該微生物本身在接種的禽類體內保持一段時間，或者甚至進行復制。由插入的本發(fā)明的核酸順序編碼的多肽在接種的禽類體內發(fā)生表達，結果將對接種禽類的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激。適用于引入本發(fā)明的核酸順序的載體是由下列生物獲得的例如痘病毒，如禽痘病毒，例如雞痘病毒;皰疹病毒，如Marek氏病毒或火雞皰疹病毒、腺病毒，流行性感冒病毒或細菌，如大腸桿菌E.Coli或特殊的沙門氏菌。使用這種類型的重組微生物，宿主細胞內合成的多肽能象表面抗原那樣對外暴露，在此條件下，所述多肽與OMP蛋白或大腸桿菌毛發(fā)蛋白的結合、或信號和定位順序(用該生物識別)的合成供應都是可以考慮的。如果所述的免疫原多肽需要作為較大整體的一部分的話，則它可以在免疫動物體內被釋放出來。在所有這些情況下，均有可能表達一種或多種免疫原產(chǎn)物，這些產(chǎn)物將對各種病原體和/或各種給定病原體抗原產(chǎn)生保護作用。
本發(fā)明的疫苗可以通過下列方式制備即將受包含本發(fā)明的核酸順序的載體病毒感染的宿主細胞培養(yǎng)，此后，收集在該細胞中生長的載體病毒，任選地，它們可以是在有細胞的情況下或以純細胞的形式，最后將它們制成為凍干形式的疫苗。
包含本發(fā)明的核酸順序的上述宿主細胞，還能在有利于表達由所述核酸順序編碼的多肽的條件下培養(yǎng)。雖然在另一實施例中疫苗中用較純的本發(fā)明的多肽制成的，但也可以用未經(jīng)加工處理的培養(yǎng)物、宿主細胞溶解產(chǎn)物或宿主細胞提取物的樣品來制備疫苗。這一點將視其用途而定。為了提純所產(chǎn)生的多肽，將含有本發(fā)明的核酸順序的宿主細胞以適當?shù)捏w積培養(yǎng)并且將所產(chǎn)生的多肽與該細胞分離，或者當該蛋白質被分泌以后，從其培養(yǎng)基中分離出這種多肽，分泌到培養(yǎng)基中的多肽可以來用標準方法，例如鹽分級分離法、色譜法、離心法分離并提純，而細胞內多肽的分離需要首先收集所述的細胞，溶解該細胞，而后再從其它細胞內組分中分離出多肽，并將該多肽制成疫苗。
不言而喻，已經(jīng)感染IBV的禽類可以用針對所述IBV的抗體進行治療，對本發(fā)明的多肽有特異性的抗血清或抗體能用于治療IBV感染，所述的特異性抗血清或抗體可以通過用其它已知的血清型IB病毒混合物培養(yǎng)由本發(fā)明的多肽產(chǎn)生的抗血清來制備，對本發(fā)明的多肽無特異性的抗體吸附在添加的病毒物質上，由此將它們與培養(yǎng)混合物分離，例如可以用離心法，所述的培養(yǎng)混合物產(chǎn)生對本發(fā)明的多肽有特異性的多克隆抗體制劑。
針對本發(fā)明的多肽的單克隆抗體也能用于治療傳染上IBV的禽類，所述的用于此目的的單克隆抗體可以用本領域已知的方法生產(chǎn)，例如用所述的多肽免疫接種小鼠，使小鼠的脾細胞存活并且從中挑選出能產(chǎn)生有用抗體的雜交瘤，產(chǎn)生抗體的存活的細胞系還可以通過用致瘤基因DNA直接轉化B淋巴細胞或用Epstein-Barr病毒轉染而產(chǎn)生。
更進一步說，通過本領域已知的方法，可以將單克隆抗體用于培養(yǎng)抗遺傳型抗體，這些抗遺傳型抗體對于防止禽類受IBV感染也是有用的。
上述抗血清和單克隆抗體也可用于對感染IBV的禽類進行免疫診斷。
本發(fā)明的疫苗可以用常規(guī)的活性免疫方式使用以與劑量配方相匹配的方式一次用藥或重復用藥并且其用量足以產(chǎn)生有效預防和/或治療效果，并能致免疫。這種疫苗可以通過例如皮內、皮下、肌肉內、靜脈內或鼻內給藥。
另外，該疫苗還可以含有含水介質或含水的懸浮物，它經(jīng)常與其它成分混合，例如為了提高活性和/或適用期。這些成分可以是鹽、PH緩沖劑、穩(wěn)定劑(例如脫脂乳或酷蛋白水解產(chǎn)物)、乳化劑、用于改善免疫應答的輔助劑，例如礦物油、胞壁酰二肽、氫氧化鋁、皂草苷、聚陰離子和兩親物質)和保藏劑。
很清楚，本發(fā)明的疫苗也可含有與其它IBV血清型或其它疾病相關的免疫原，或含有編碼這些免疫原的核酸順序，這些免疫原例如Massachusatts血清型IBV抗原，新城病病毒(NDV)、傳染性粘液囊疾病(Bursal Diease)病毒(IBDV)抗原和Marek氏疾病(Marek′s Disease)病毒(MDV)抗原，從而產(chǎn)生多價的疫苗。
例1基因病毒DNA的制備通過用104EID50/蛋接種尿囊腔，將由19代IB菌株DPI 3186獲得的病毒(Gelb等人，1981，和Gelb與Cloud，1983)生長在10天大的胚胎蛋中，在37℃下保溫24小時后，將蛋在4℃下冷卻一整夜，收集尿囊液后，小心地將它放在冰上冷卻，通過在4℃下以6000×g的轉速離心30分鐘，除去其中的紅血細胞和殘渣。
在4℃下，將由上清液提取的病毒在Beckmann19型轉筒內，以54.000×g的轉速球化4小時，采用重復通過注射器針頭的辦法使病毒顆粒重新懸浮在冷的TNE(10mM Tris-Hcl，100mM Nacl，1mM EDTA、PH7.5)中，再將它往32毫升、線性梯度為20-60%的蔗糖溶液(在TNE中上)倒上一層。
在SW28轉筒內，以24.000轉/分的轉速在4℃下離心一整夜，用注射器通過側壁穿孔管收集病毒，在用兩倍體積的TNE稀釋以后，在4℃下將該病毒在轉速為18000轉/分的SW28轉筒中球化90分鐘。
將該物料再次懸浮于少量的TNE中，并加入十八烷基磺酸鈉，使其最終濃度達到0.5%，在37℃下，用200微克/毫升的蛋白酶K(Boehinger)消化該制劑2小時，并用1∶1的乙醇/氯仿混合物將它萃取兩次。
在-20℃下，在0.1M醋酸鈉(PH6.0)存在下，用2倍體積的乙醇將水相中的病毒RNA沉淀、離心并用乙醇漂洗，真空干燥病毒粒子，并將它再次溶解于無菌水中，使RNA濃度達到0.5微克/毫升。當用瓊脂糖凝膠電冰進行檢測時，制劑中含有90%以上的IBV基因RNA，然后將它儲存在-20℃下。
對基因RNA進行cDNA克隆第一條鏈的合成是利用5微克病毒RNA(在75微升的反應體積中)、在AMV逆轉錄酶存在下由寡聚(dT)12-18引發(fā)的，在44℃下培養(yǎng)30分鐘后，通過在100℃下加熱3分鐘使DNA/RNA雜種變性，接著在由大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ產(chǎn)生的大片段存在下，將反應在20℃下保溫2小時，從而合成第二條鏈。用乙醇沉淀cDNA，并在37℃下，在200微升反應體積內用10單位S1-核酸酶，將它消化30分鐘。向3.2毫升、濃度梯度為5-20%的蔗糖溶液(在10mM Tris-Hcl，5mM EDTA、500mM NaCl、PH7.5中)上覆上一層反應產(chǎn)物，并將它在轉速為30000轉/分的SW65轉筒內，在15℃下離心16小時。
收集大小在500-50000堿基對的沉淀物料，將它用乙醇沉淀后再溶解于20微升的0.1 SSC(15mM NaCl、1.5mM檸檬酸鈉)中。
按照酶提供者所推薦的條件，在30微升反應體積中用15單位的末端轉移酶(Gibco-ERL)，通過在37℃下保溫2分鐘，使雙鏈DNA的末端從10個dG殘基延伸到15個dG殘基，用5mM EDTA將該反應中止。
將10毫微克末端cDNA與20摩爾過量的磷酸化的合成寡聚物5′-d AATTCCCCCCCCCCC-3′(在終體積為10微升的TEN中)一起在65℃下加熱2分鐘，然后通過在50℃下保溫一整夜而一塊退火。
與10微克經(jīng)EcoRI消化的λgt 10 DNA(Hugnh，等人，1985)的連接是在20微升的30mM Tris-Hcl，PH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，0.1mM ATP中進行的，通過添加1個單位的T4DNA連接酶，并在4℃下保溫一整夜而實現(xiàn)連接，將DNA加入到體外封裝的反應混合物(Rro mega)中，并且由IBV菌株DPI 3168，通過在大腸桿菌的hflA菌株上平板培養(yǎng)后選擇重組噬菌體而得到cDNA庫。
編碼刺突蛋白片段的cDNA克隆的分離將100～200 pfu.DNA庫放入佩特里細菌培養(yǎng)皿(在大腸桿菌細布上)內培養(yǎng)，制備雙份的硝化纖維素濾物(Benton和Davis，1978)，并將它在含有10mM Tris-Hcl，PH7.5，1M NaCl，0.1%SDS和4×Denhardt溶液的雜交溶液(Maniatis等人，1982)中，用經(jīng)32P-標記的合成寡聚物于42℃下培養(yǎng)一整夜。
在這些雜交過程中用作為探針的三種合成寡聚物含有下列核苷酸順序結構Ⅰ、5′－dTTCCAACATCTCTAACCAGTAATTTACCGT－3′Ⅱ、5′－dTACCTACTAATTTACCACCACCTGAAACTACAAACTGCTG－3′Ⅲ、5′－dTGGATCATTAAACAGACTTTTTAGGTCTGTATTGTT－3′將能產(chǎn)生具有一種或最好兩種這類探針信號的重組噬菌體篩選出來，并用標準方法提純噬菌斑(Maniatis等人，1982)，由λ-噬菌體重組體產(chǎn)生的cDNA片段的側面是EcoRI限制性部位，而且該自段可以被轉移到由質?？寺≥d體PGEM4I(Promegs)產(chǎn)生的EcoRI部位中。
對兩種待選物進行限制性分析以及局部順序分析，結果表明其中一種編碼完整的S1，而另一種則編碼刺突基因的S2部分。
這兩種DNA片段的順序彼此部分重疊，尤其是在位于S1/S2接合處的特有的XbaI-限制性部位上。該部位而后用來組裝上述兩個片段，從而產(chǎn)生攜帶編碼刺突蛋白多肽的完整基因的質粒構建物pIB14，所述的基因是在質粒載體pGEM42中由IBV菌株DPI產(chǎn)生的。
DNA-順序分析在這些實驗中，根據(jù)Henikoff(1984)所述，用酶核酸外切酶-Ⅲ來除去S-基因的一端的增長部分，為此需要從DPI 3186制備出S-基因，這時可以將pIB14的EcoRⅠ-HindⅢ片段插入到經(jīng)過EcoRⅠ-HindⅢ消化和脫磷化(clefosforylated)的pGEM7Zf+載體質粒中，該構建物稱為pIB15，用ApaⅠ消化5微克的pⅠB15，留下3′突出端用于阻止Exo-Ⅲ消化TT-聚合酶引物部位以及EcoRⅠ，產(chǎn)生的5′突出端對于Exo-Ⅲ消化過程是有效的，在30秒鐘的時間間隔內，由消化混合物取出樣品，用S1-核酸酶和Klenow酶處理該樣品，從而產(chǎn)生末端鈍化的DNA片段。在有TA-DNA連接酶存在下，將該片段環(huán)化并轉化成活性大腸桿菌細胞。
在篩選抗α-氨基芐青霉素的大腸桿菌菌落以后，挑選了幾乎復蓋整個刺突基因的120S-基因，按Sanger等人(1977)所述的方法，直接在由微量制劑獲得的雙股質粒DNA上，用雙脫氧鏈-中止技術進行DNA順序分析。順序由pGEM7Zft中的T7和Spb啟動子部位開始，并通過在標記反應中使用[α32-P]dATP進行放射性自顯影來對反應產(chǎn)物進行觀察。
留在核苷酸2500和2600間的間隙，用在2834位雜交的15堿基合成引物填充，將順序數(shù)據(jù)收集、裝配并在IBM PC上、用Gene-Master程序(Bio-Rad)進行分析。
例2將編碼IBV菌株DPI 3186的刺突蛋白基因插入火雞皰疹病毒(HVT)的病毒基因組中根據(jù)Igarashi等人(1987)所述的HVT基因組結構，在該病毒的特短順序成分(US)中挑選出適于外來基因插入的區(qū)段，從λEMBL3庫中篩選出相應的DNA片段，λEMBL3庫是通過部分消化由受HVT傳染的CEF產(chǎn)生的全部DNA而構成的。
λ-分離物的一種插入物，其特征是不存在任何BammHI限制性部位，它被命名為λHVT04，并通過物理定位分析而被詳細地分析(

圖1)。存在于17.5kb插入片段中的順序代表Vs區(qū)段的主要部分，該區(qū)段包括部分插入的重復結構Igarashi等人，1987)。
在用SalⅠ消化過的pGEM3 Z/中，將來自λHVT04的1.2kb×hoⅠ限制性片段亞克隆，結果產(chǎn)生質粒pMD07，它含有適于插入DNA片段的特有的BglⅡ部位。
由勞氏肉瘤病毒(RSV)的長末端重復(LTR)順序中挑選出一種強啟動子，在插入HVT病毒基因組以后，該強啟動子能使外來基因組獲得表達，在580bp來自pRSVcat(Gorman等人，1982)的NdeⅠ/HindⅢ限制性片段上確定該啟動子的位置，并且借助于該片段兩側的雙鏈人工合成接頭，可以將該啟動子插入pGEM3Z(Promega，Madison，USA)的HindⅢ和PstⅠ部位之間，來自載體pGEM3Zr HindⅢ部位和攜帶LTQ-啟動子的RSV片段NdeⅠ部位之間的聯(lián)接是用30bp接頭完成的，該接頭含有一些粘性末端，這些末端與一個部位上的HindⅢ和另一部位上NdeⅠ相匹配。然而，在連接之后，通過細心地調整，可以除去這兩個限制部位，使之不再存留在該6個堿基識別順序中的外層核苷酸中。除了除去這兩個部位以外，在相應的位置上產(chǎn)生了存在于接頭內的新的限制性部位(BamHI)。合成第二種20bp接頭，它將來自LTR片段的HindⅢ部位與來自pGEM3Z的PstⅠ部位連接起來。在這種情況下，任何一個末端上的識別順序均不會遭到破壞，并且還將三個方便、特有的限制性部位BglⅡ、XhoⅠ和EcoRV添加到那些早已存在于pGEM3Z多聚接頭中的部位，例如PstⅠ、SalⅠ、XhoⅠ和Bam HI中。所得到的pGEM 3Z的衍生物被稱為PVE col，它含有650bp帶有LTR啟動子順序的限制性片段，緊接著該啟動子順序的是插入外來基因所需的7個限制性部位，該650bp片段的任一末端均與Bam HI限制性部位側面相接，將該片段轉移到存在于1，2kb HVT插入物中的特有的BglE部位上，該HVT插入物是由PMD07產(chǎn)生的，由這兩個限制性酶產(chǎn)生的粘性末端是相互匹配的，但是，對于BglE或Bam HI來說，連接并不會使其任何一個原始識別順序保留下來，所產(chǎn)生的構建物中，有一種在朝TRS′的方向上帶有LTR，該物質被稱為PVE CO4，用限制性定位圖對其進行檢驗(圖2)。這種多用途的HVT重組載體的結構使外來基因能夠緊靠著LTR啟動子的下游插入，并且隨后通過體內重組完整地將該表達暗盒整合到HV基因組中。位于LTR下游的不同的限制性部位的位置，尤其是用于酶BglⅠ、XhoⅠ和EcoRV的那些位置應以這樣一種方式設計，即可以進行多次基因插入。將來自帶有DPI 3168刺突基因的PIB15的3.8kb Sali/XhoⅠ限制性片段插入到位于LTR啟動子下游的PVE CO4特有的xhoⅠ部位中，通過限制性定位分析，對其中一種待選物進行分析，以確認其結構是否正確，所述的這種待選物具有相對于LTR啟動子定向正確的插入基因，這種質粒被稱為PIB27，并且隨后被用在對雞胚胎成纖維細胞(CEF)的共轉染過程中。
重組HVT病毒是用一種抗體探針、通過對感染的細胞培養(yǎng)物進行免疫螢光染色而識別的，所述的這種探針專門識別來自IBV菌株DPI 3168的刺突蛋白，同源重組HVT病毒的制備過程可以用標準方法進行，例如通過有限稀釋技術或單級噬菌斑分離。
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Sequence ListingSEQ ID NO 1Sequence type nucleotide with correspondingproteinSequence length 3824 base pairs;1168 amino acidsstrandness source is single strandedTopology linearMolecule type cDNA to genomic RNAOriginal sourceOrganism Infectious Bronchitis VirusImmediate experimentalsource λgt10 cDNA libraryProperties spike protein.
權利要求
1.核酸順序，它基本上編碼屬于Arkansas血清型的IBV菌株的刺突蛋白多肽或其抗原片段。
2.權利要求1所述的核酸順序，其特征在于它基本上編碼來自IBV的菌株DPI 3168刺突蛋白多肽，或其抗原片段。
3.權利要求2所述的核酸順序，其特征在于所述順序編碼一種具有如SEQ ID NO1中所示的氨基酸順序的多肽，或其衍生物或抗原片段。
4.權利要求3所述的核酸順序，其特征在于所述的順序至少與如SEQ ID NO1所示的脫氧核酸順序的片段或其衍生物相對應。
5.重組核酸分子，它由權利要求1-4所述的核酸順序組成，所述的順序優(yōu)選地可與一種表達控制順序人工相連。
6.載體病毒，它含有權利要求5所述的重組核酸分子。
7.宿主細胞，它含有權利要求1-4所述的核酸順序，或含有權利要求5所述的重組核酸分子，或含有權利要求6所述的載體病毒。
8.多肽，它具有一種氨基酸順序，該順序中至少有一部分是由權利要求1-4所述的核酸順序編碼的。
9.多肽，它至少是由如SEQ ID NO1中所示的氨基酸順序的一部分或其衍生物組成的。
10.抗體或抗血清，它與權利要求8或9所述的多肽起免疫反應。
11.藥物制劑，它由權利要求10所述的抗體或抗血清組成。
12.用于保護禽類，使之免受IBV感染的疫苗，其特征在于它是權利要求1-4所述的核酸順序組成，或由權利要求5所述的重組核酸分子組成，或由權利要求6所述的載體病毒組成，或由權利要求7所述的宿主細胞組成，或由權利要求8-9所述的多肽組成。
13.制備IBV疫苗的方法，其特征在于將權利要求7所述的宿主細胞培養(yǎng)，然后收集含有IBV的物料，并將它制成一種具有免疫活性的藥物制劑。
14.制備IBV疫苗的方法，其特征在于將權利要求8-9所述的多肽制成一種具有免疫活性的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種多肽，它由屬于Arkansas血清型的IBV菌株刺突蛋白多肽或其抗原片段的氨基酸順序組成，這種多肽能用于對禽類進行免疫，使之抗IBV感染。本發(fā)明還涉及編碼一種多肽的核酸順序，所述的核酸順序特別適用于制備載體疫苗。
文檔編號C07K16/00GK1053642SQ9010951
公開日1991年8月7日 申請日期1990年10月20日 優(yōu)先權日1989年10月20日
發(fā)明者巴洛思·J·安東尼, 約翰·A·約瑟夫 申請人:阿克佐公司