專利名稱：用于免疫診斷結(jié)核病的新的17KDa蛋白抗原及由其衍生的肽片段的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(南印度分離菌SⅡ1)的17KDa蛋白抗原和由其衍生的若干肽片段以及所述抗原和由其衍生的肽片段在人和試驗(yàn)結(jié)核的免疫診斷、免疫治療和免疫預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及編碼所述17KDa抗原的DNA順序、編碼由17KDa抗原衍生的肽片段的DNA順序和以包括17KDa抗原的肽片段順序的17KDa抗原的蛋白質(zhì)順序?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建的DNA和RNA探針。主要的應(yīng)用領(lǐng)域是17KDa抗原及其肽片段在免疫診斷結(jié)核中的應(yīng)用。另一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是17KDa抗原或其肽亞結(jié)構(gòu)在制備抗結(jié)核疫苗中的應(yīng)用。還有一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是通過人體的皮膚試驗(yàn)或離體測(cè)定，將17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)肽應(yīng)用于檢測(cè)T細(xì)胞的增殖。后一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域在通過加強(qiáng)細(xì)胞免疫性有可能治療人體癌癥方面具有重要意義。還有一個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域是17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)肽在實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子和酶方面的應(yīng)用。
由結(jié)核分枝桿菌引起的人體結(jié)核是廣泛發(fā)生在大約1600萬人中的重要的慢性體衰病。正當(dāng)結(jié)核病在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家嚴(yán)重蔓延時(shí)，目前在發(fā)達(dá)國(guó)家中后天獲得性免疫缺陷綜合癥(愛滋病)的傳染已經(jīng)成為包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的分枝桿菌傳染的另一個(gè)難題。
盡管在許多國(guó)家抗藥性已經(jīng)成為一個(gè)問題，但是準(zhǔn)確確診人體結(jié)核病就能夠利用有效的抗菌素進(jìn)行早期治療。因此，結(jié)構(gòu)病的早期診斷意味著能進(jìn)行有效的化學(xué)治療，從而消滅肺結(jié)核患者中活桿菌的傳播。
結(jié)核病的常規(guī)診斷決定于臨床和放射性檢查結(jié)果、結(jié)核桿菌樣品的顯微鏡檢查和結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物的細(xì)菌分離。
由于現(xiàn)有可利用的診斷方法不完整，因此還不能全球性控制結(jié)核病。
雖然包括印度在內(nèi)的許多國(guó)家把所有X光檢查的疑似患者都進(jìn)行抗結(jié)核化學(xué)治療，但是結(jié)核病的許多臨床特征不只對(duì)結(jié)核病具有專一性，而且在印度進(jìn)行的研究(由印度班加羅爾全國(guó)結(jié)核病研究所提供)說明，僅僅30%的X光檢查的疑似患者最后發(fā)展成為結(jié)核病患者。
在野外的條件下，對(duì)結(jié)核樣品進(jìn)行顯微鏡檢查并不容易，并且至少104桿菌/ml需要進(jìn)行篩選。許多結(jié)核樣品，像結(jié)核性腦脊膜炎中的腦脊髓液，并非經(jīng)常含有桿菌。此外，細(xì)菌培養(yǎng)物通常要培養(yǎng)6至8周，作為一種診斷方法而言確太費(fèi)時(shí)。
廣泛使用的結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)則缺乏敏感性和特異性，并且需要大約三天才能完成。由于結(jié)核的化學(xué)治療需要至少6個(gè)月，許多不正常治療的患者都產(chǎn)生了抗藥性，造成活桿菌的傳播?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的BCG疫苗接種，其保護(hù)程度也隨地區(qū)不同而改變。
基于這些因素，許多研究人員和世界衛(wèi)生組織都認(rèn)為，應(yīng)把結(jié)核病的早期診斷視為優(yōu)先研究和開發(fā)的領(lǐng)域。
將分枝桿菌用于加強(qiáng)免疫反應(yīng)的免疫助劑，已經(jīng)證明它對(duì)人和動(dòng)物是有效的抗原?，F(xiàn)已知道，由結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的許多抗原可促使結(jié)核病患者特異性抗體和可增殖的淋巴細(xì)胞的形成(Ivanyi et al.，1988)以及試驗(yàn)動(dòng)物模型的產(chǎn)生。結(jié)核病患者中抗體反應(yīng)的檢測(cè)可應(yīng)用于早期診斷。關(guān)于對(duì)T淋巴細(xì)胞特異性的結(jié)核分枝桿菌的研究，通過皮膚試驗(yàn)和保護(hù)性疫苗的發(fā)展，同樣也可應(yīng)用于早期診斷。
有關(guān)結(jié)核病上述各方面研究的中心集于結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的鑒定和合成。
許多研究人員已經(jīng)鑒定出具有免疫診斷或免疫防護(hù)應(yīng)用可能性的結(jié)核分枝桿菌的蛋白抗原。許多上述抗原的N末端的內(nèi)氨基酸順序已經(jīng)發(fā)表，現(xiàn)將其中有些抗原的N端氨基酸順序列于表1。
表1經(jīng)過鑒定的結(jié)核分枝桿菌蛋白抗原的N端氨基酸順序研究者 抗原和N末端Shinnick et al，1987 65 kDaRGCRHPVYamaguchi et al，1987 MPB 57MAKFNIKPLPattorroyo et al，1987 13 kDaAKVNI18 kDaGDLVGPGAE23 kDaAPKTY30 kDaFSXPGL68 kDaWMTMT77 kDaGKXIAYDGAAMatsuo et al，1988 30 kDaFSRPGLPAshbridge et al，1989 19 kDaEHRVKRGLTVBaird et al，1989 10 kDaAKVNIPKPGarcia et al，1989 70 kDaFQRITRQDLLBorremans et al，1989 32 kDaFSRPGLP據(jù)我們所知，上述抗原中沒有一個(gè)能夠用作免疫診斷的試驗(yàn)產(chǎn)品，其中兩個(gè)抗原即Baird等(1989)的10KDa和Shinnick等(1987)的65KDa同系物已經(jīng)測(cè)定，其用于試驗(yàn)動(dòng)物模型的疫苗對(duì)結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性極差(美國(guó)維斯康辛大學(xué)D.W.Smith，私人通訊)。
使用存在于所有分枝桿菌中的A60抗原診斷結(jié)核病的ELISA盒已經(jīng)用于ANDA診斷(法國(guó))，但是該測(cè)定并不僅對(duì)人體結(jié)核具有特異性。
診斷結(jié)核病的另一方法就是使用DNA探針。通過商業(yè)途徑得到的基因探針盒(1988)已用于鑒定由培養(yǎng)物分離得到的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物的成份，但并未直接用于臨床樣品。這些測(cè)定并不能排除其他分枝桿菌得到正結(jié)果。由Enzo Biochem設(shè)計(jì)的DNA探針(J.Clin.Microbiol.1988，Dec.)已用于1000堿基或更長(zhǎng)的特異性DNA順序并要求具有更高的特異性。以DNA為基礎(chǔ)的所有探針的主要問題在于用患者的樣品是否能得到真實(shí)的正結(jié)果，從而避免繁復(fù)的桿菌培養(yǎng)。
在南印度分離得到的結(jié)核分枝桿菌菌株中(Naganathan et al.，1987)，已經(jīng)知道有毒性的表型變異，其分子基礎(chǔ)還不清楚。Abou Zeid等(1988)發(fā)現(xiàn)，13KDa蛋白抗原存在于噬菌體Ⅱ型毒性結(jié)核分枝桿菌中，但在噬菌體Ⅰ型南印度低毒性結(jié)核桿菌中卻不存在。而對(duì)該抗原和毒性間的關(guān)系至今還未詳細(xì)研究。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在結(jié)核分枝桿菌的分離物中存在17KDa蛋白抗原，本發(fā)明公開了其免疫化學(xué)特征。
因此，本發(fā)明涉及如下各個(gè)方面1.如下所述的結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)的17KDa蛋白抗原及其若干亞結(jié)構(gòu)(肽)。
2.編碼結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)中的17KDa抗原的DNA順序。
3.編碼結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)中的17KDa抗原亞結(jié)構(gòu)(肽)的DNA順序。
4.將所述17KDs蛋白或所述亞結(jié)構(gòu)(肽)用于制備與所述17KDa蛋白抗原或其亞結(jié)構(gòu)反應(yīng)的單克隆或多克隆抗血清。所述抗體可在用于多克隆的諸如小鼠、兔和羊一類的哺乳動(dòng)物中和在用于單克隆的小鼠中產(chǎn)生。
5.將所述亞結(jié)構(gòu)(肽)的17KDa蛋白抗原用于檢測(cè)免疫診斷的人和動(dòng)物樣品中的抗體。檢測(cè)方法是本領(lǐng)域已知的方法，例如ELISA、放射免疫測(cè)定(RIA)和被動(dòng)逆轉(zhuǎn)血紅細(xì)胞凝集(RPHA)等方法。
6.17KDa蛋白抗原或其亞結(jié)構(gòu)(肽)在治療結(jié)核病中的應(yīng)用。
7.17KDa蛋白抗原或其亞結(jié)構(gòu)(肽)在制備抗結(jié)核疫苗中的應(yīng)用。
8.17KDa蛋白抗原或其亞結(jié)構(gòu)(肽)在制備用于皮膚試驗(yàn)免疫診斷結(jié)核病的試劑中的應(yīng)用。
9.以17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)(肽)的蛋白質(zhì)順序?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建用于診斷結(jié)核病的DNA或RNA探針。這類探針可按本領(lǐng)域已知方法構(gòu)建和標(biāo)記，例如摻入放射性同位素或用生物素進(jìn)行非放射性標(biāo)記。
10.通過諸如待診斷患者的血清、CSF和胸膜液等體液與3所述的17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)(肽)的單克隆抗體反應(yīng)，診斷人體結(jié)核病的方法。
11.通過待診斷患者的體液(例如血清)與5所述的17KDa蛋白反應(yīng)，診斷人體結(jié)核病的方法。
12.通過待診斷患者的體液(例如痰、血清、CSF和胸膜液)與9所述的DNA或RNA探針反應(yīng)，診斷人體結(jié)核病的方法。
13.體外檢測(cè)人體結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液(例如痰、CSF、胸膜液或血清)樣品與10所述的經(jīng)過標(biāo)記的單克隆抗體接觸。
14.體外檢測(cè)人體結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液(例如痰、CSF、胸膜液或血清)樣品與10所述的經(jīng)過標(biāo)記的單克隆抗體接觸。
15.體外檢測(cè)人體結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液(例如痰、CSF、胸膜液或血清)樣品與3所述的經(jīng)過標(biāo)記的多克隆抗體接觸。
16.使用3所述的17KDa抗原的單克隆抗體實(shí)施免疫診斷結(jié)核病的藥盒。
17.使用5所述的17KDa抗原或肽亞結(jié)構(gòu)實(shí)施免疫診斷結(jié)核病的藥盒。
18.使用9所述的DNA或RNA探針實(shí)施診斷結(jié)核病的藥盒。
19.表達(dá)1所述的17KDa蛋白或其亞結(jié)構(gòu)的微生物。
20.以1所述的17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)肽為基礎(chǔ)研制的抗結(jié)核疫苗。這類疫苗可以是通過遺傳工程方法處理過的有機(jī)體(例如沙門氏菌屬和牛痘病毒等)的產(chǎn)物。
本發(fā)明通過例舉疾病的診斷、治療和預(yù)防，特別是結(jié)核分枝桿菌傳染病的診斷予以說明，但并不是以這些實(shí)施例限制本發(fā)明。本申請(qǐng)公開的內(nèi)容，其應(yīng)用方面可包括流行病檢查、法醫(yī)調(diào)查、食品污染測(cè)定、公共衛(wèi)生檢查、預(yù)防藥物和農(nóng)畜牧業(yè)等傳染原的診斷檢查。
實(shí)施例117KDa抗原的分級(jí)分離和純化聲波處理抗原粗制品，在37℃下，將結(jié)核分枝桿菌置于Kirchner培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，收集到的桿菌在4℃下和冷丙酮中經(jīng)18小時(shí)殺死。桿菌用鹽水洗滌3次，取10mg桿菌的鹽水[5ml]懸浮液用Branson超聲波儀微型探測(cè)器在40瓦輸出功率下經(jīng)聲波處理，然后在20000×g下離心30分鐘，再用Lowry方法測(cè)定其上清液中蛋白質(zhì)含量后，在-70℃下冷凍貯藏。
分級(jí)分離和純化取500μg經(jīng)聲波處理的粗制品，在按Hunkapi-ller和Lujan(1986)所介紹的12.5%聚丙烯酰胺凝膠上分級(jí)分離。用考馬斯亮蘭簡(jiǎn)單染色，即可目視到蛋白帶。用0.1%SDS和0.05M碳酸氫銨將17KDa抗原進(jìn)行電洗脫，然后用0.02%SDS和0.01M碳酸氫銨電滲析，洗脫的蛋白用氯仿-甲醇提取，除去SDS，將沉淀物干燥。
取5μg該沉淀物，用Lichrosorb RP18柱(LKB)進(jìn)行HPLC檢測(cè)，分析洗脫蛋白的純度。在45%B和26分鐘處洗脫物呈現(xiàn)的一個(gè)峰值，含有免疫反應(yīng)抗原。圖1表示17KDa抗原的HPLC圖形。
實(shí)施例217DKa抗原的氨基酸順序分析關(guān)于17KDa抗原的肽譜法，本文給出胰蛋白酶圖和V8蛋白酶圖。
胰蛋白酶圖取30μg的17KDa蛋白，在37℃下，于0.1M碳酸氫銨緩沖液(pH7.8)中，用經(jīng)TPCK處理過的胰蛋白酶(酶與底物比為1∶50)消化5小時(shí)。在經(jīng)溶劑A(0.1%TFA水溶液)平衡過的RP18柱(0.46×25cm)上用HPLC分級(jí)分離胰蛋白酶消化物，并用0-65%的梯度溶劑B(含0.085%TFA的70%乙腈溶液)將肽洗脫60分鐘。胰蛋白酶圖示于圖2。
V8蛋白酶圖取30μg的17KDa抗原，在37℃下，于0.07%的氨中，用葡萄球菌V8蛋白酶處理48小時(shí)。酶與底物的摩爾比為1∶25。在用于蛋白酶圖的條件下，在HPLC柱上純化酶消化物中的各種肽。肽圖示于圖3。
17KDa抗原的順序分析用與477A型蛋白質(zhì)順序儀(Applied Bios-ystems Inc.，USA)相連接的PTH氨基酸分析器進(jìn)行蛋白和肽的氨基酸順序分析。將樣品溶于10%甲酸中，固定在經(jīng)TFA處理過的涂有Polybre-ne(1mg)的玻璃纖維盤上，用于定序。
用完全蛋白測(cè)定N端的前18個(gè)氨基酸。根據(jù)胰蛋白酶分解的肽段的氨基酸順序，選擇V8蛋白酶產(chǎn)生能夠與胰蛋白酶分解的肽段重疊的肽。胰蛋白酶和V8蛋白酶分解的肽段連成直線，得到17KDa抗原的完整順序。重疊的詳細(xì)情況示于圖4。
17KDa抗原的氨基酸組份蛋白質(zhì)具有A9、C3、D11、E10、F9、G8、H2、I7、K4、L11、M2、P9、Q2、R12、S8、T9、V11和Y4。顯然其中沒有色氨酸和天冬酰胺。由于該蛋白質(zhì)的酸性氨基酸(D+E＝21)比堿性氨基酸總數(shù)(R+K＝16)多5個(gè)，所以呈酸性。該蛋白具有131個(gè)氨基酸，分子量為14762。
實(shí)施例317KDa抗原的免疫反應(yīng)性在結(jié)核分枝桿菌菌株中呈現(xiàn)17KDa抗原的免疫顯性結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)ATCC 27294，草分枝桿菌(M.phlei)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、Kanasasii分枝桿菌(M.kanasasii)、胞內(nèi)烏分枝桿菌(M.avium intracellulare)和scrofulaceum分枝桿菌(M.scrofulace-um)在Kirchner培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，將收集到的桿菌置于冷丙酮中殺死。按實(shí)施例1所述，由每個(gè)菌種制備經(jīng)過聲波處理的抗原，然后在12.5%凝膠中對(duì)這些抗原進(jìn)行SDS PAGE分析。經(jīng)考馬斯蘭染色的凝膠證明，17KDa抗原僅存在于結(jié)核分枝桿菌菌株中。在Western影印法中，結(jié)核分枝桿菌SⅡ1的兔抗血清也被用于探查這些聲波處理物。在Weste-rn影印法中。呈現(xiàn)17KDa顯性帶。
在試驗(yàn)動(dòng)物中得到17KDs抗體經(jīng)電洗脫的17KDa抗原(10μg于100μl鹽水中)用等體積的弗羅得氏不完全佐劑(FICA)乳化，并用于10BALB/C小鼠的腹膜內(nèi)免疫。免疫30天后，從這些小鼠中收集血清，識(shí)別經(jīng)聲波處理過的結(jié)核分枝桿菌SⅡ1抗原中的17KDa帶。
該試驗(yàn)確認(rèn)，在經(jīng)識(shí)別17KDa抗原的蛋白結(jié)構(gòu)及其亞結(jié)構(gòu)(肽)的小鼠中，能夠產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體。這類抗體，特別是單克隆抗體如同ELISA方法一樣，可用于檢測(cè)人體結(jié)核病樣品中17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)的抗原檢測(cè)方法，從而能夠進(jìn)行結(jié)核病的免疫診斷。
17KDa抗原與人結(jié)核病患者血清反應(yīng)的證明從24個(gè)健康的人和20個(gè)已證實(shí)為結(jié)核病患者的培養(yǎng)物得到的血清按如下所述與17KDa抗原進(jìn)行滴定。在22℃下，用1μg/ml經(jīng)電洗脫的17KDa抗原的PBS涂敷PVC Dynatech平皿24小時(shí)。然后PBS-BSA封阻的平皿用在22℃下溫育2.5小時(shí)的血清重復(fù)(1/200)稀釋液滴定。洗滌平皿1.5小時(shí)內(nèi)得到抗人IgGHRP結(jié)合物。洗滌平皿，用鄰苯二胺底物測(cè)定并在492nm處讀數(shù)。表Ⅱ給出17KDa抗原的敏感性達(dá)70%，特異性達(dá)85%。
表Ⅱ在結(jié)核病患者和對(duì)照的血清上ELISA微量測(cè)定17KDa抗原血清 n ELISA+ ELISA- 敏感性 特異性健康的人 24 4 20 - 85%結(jié)核病患者 20 14 6 70% -敏感性已知結(jié)核病患者為陽性特異性已知健康對(duì)照組為陰性ELISA+OD 492 nm＞＝0.3(1/200稀釋)健康對(duì)照組＝平均+2SDOD 492 nm，n＝24)。
因此，這個(gè)試驗(yàn)肯定了結(jié)核分枝桿菌菌株中的17KDa抗原能夠用于免疫診斷人體結(jié)核病的微量ELISA系統(tǒng)。
17KDa蛋白抗原其限定的抗體表位的證明由胰蛋白酶消化(實(shí)施例2，圖2)的17KDa抗原產(chǎn)生的肽片段，按以上所述分別用健康人和結(jié)核病患者的血清滴定。在被測(cè)定的14個(gè)肽中，具有RATYDK，YEVR，LEDEMK，LMR，DFDGR和SEFAYGSFVR順序的肽顯示抗體結(jié)合活性的敏感性為17-36%。為了測(cè)定這些肽是否形成線性或構(gòu)象抗體表位，用17KDa抗體的小鼠抗血清并參照其他5個(gè)肽測(cè)定另一個(gè)肽，即進(jìn)行ELISA的抑制測(cè)定。YEVR和ATYDK兩個(gè)肽相互抑制，從而說明它們是完整抗體表位的一部份，并且還按實(shí)施例2和圖4所述，通過17KDa抗原的完整結(jié)構(gòu)的測(cè)定予以肯定。對(duì)抗體表位說明，其他四個(gè)肽都呈線性肽，并可能呈構(gòu)象肽。在帶肽的上述6個(gè)抗體表位中，下述氨基酸順序的肽是按Merrifi-eld的固相法合成的，并且含有特異性和敏感性的抗體結(jié)合活性
RATYDKRYEVR敏感性65%，特異性95%SEFAYGSFVR敏感性66%，特異性95%如上所述的抗體表位圖譜法說明了限定的17KDa抗原的亞結(jié)構(gòu)或肽能夠被合成，并且采用微量ELISA法，能夠?qū)⑵溆糜诿庖咴\斷人體結(jié)核病。
順序?yàn)镽ATYDKRYEVRDFDGRAEL的肽已被合成，在對(duì)已被證實(shí)為結(jié)核病患者和對(duì)照的培養(yǎng)物的CSF樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，其敏感性為86.6，特異性為100%。因此這個(gè)肽特別適宜用于代替ELISA測(cè)定中的17KDa抗原。
17KDa抗原能使淋巴增殖將健康供體和結(jié)核病患者的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)進(jìn)行分級(jí)分離，取2×106細(xì)胞在含10%自身血清的RPMl1640培養(yǎng)基中，在含或不含(對(duì)照)1μg的17KDa抗原條件下培養(yǎng)3天。在收集培養(yǎng)物前24小時(shí)，先用1μci的3H胸苷沖洗。表Ⅲ說明，17KDa抗原能使結(jié)核病患者的淋巴細(xì)胞的淋巴增殖(僅2個(gè)患者的數(shù)據(jù))。
表Ⅲ用17KDa抗原測(cè)定淋巴增殖PBL源 加入3H胸苷 每分鐘計(jì)數(shù)，3個(gè)重復(fù)培養(yǎng)物的平均健康供體 對(duì)照90 抗原121結(jié)核病患者 對(duì)照110 抗原65017KDa抗原除了具有使淋巴增殖的性質(zhì)外，預(yù)測(cè)T細(xì)胞刺激性表位的方法(Rothbard和Taylor，1988)也可用于繪出17KDa抗原結(jié)構(gòu)中的可能位點(diǎn)。這些T細(xì)胞表位位于SEFAYGSFVR和AELPGVDPDCDVCITR順序的肽上。
因此，這個(gè)試驗(yàn)說明，17KDa抗原或亞結(jié)構(gòu)(肽)能夠用于刺激人外周血淋巴細(xì)胞。由于受刺激的淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生有助17KDa抗原或其亞結(jié)構(gòu)的疫苗效應(yīng)的若干細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子，所以17KDa抗原首先能用作結(jié)核疫苗，而且還可以非特異性地加強(qiáng)細(xì)胞免疫。
圖5表示含有生物活性區(qū)的結(jié)核分枝桿菌的17KDa抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，但在未標(biāo)出區(qū)中并不需要排除類似的活性。
測(cè)定結(jié)果的討論和總結(jié)本發(fā)明介紹了結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1菌株)中新的17KDa蛋白抗原的免疫化學(xué)性質(zhì)。結(jié)核分枝桿菌造成了世界范圍的1600萬人的結(jié)核病。由于現(xiàn)有診斷方法存在的缺陷，目前這種疾病還未能被消滅。由于傳統(tǒng)的BCG疫苗僅能部份預(yù)防結(jié)核病，所以近幾年來的研究集中于開展檢測(cè)早期結(jié)核病的免疫診斷方法和鑒定適當(dāng)?shù)姆酪呤侄巍?br> 本發(fā)明所介紹的研究說明，由結(jié)柿分枝桿菌產(chǎn)生的新的17KDa抗原具有抗原活性，其抗原性質(zhì)和抗原化學(xué)已進(jìn)行了研究。
提供了蛋白抗原的生物活性蛋白，研究了早期檢測(cè)結(jié)核病的免疫診斷方法。
因此，發(fā)現(xiàn)了具有131個(gè)氨基酸的17KDa蛋白抗原含有RATYDKRYE-VR和SEFAYGSFVR順序的兩種肽，帶有診斷結(jié)核病的抗體結(jié)合表位。此外，還含有在SEFAYGSFVR和AELPGVDPDCDVCITR順序中帶預(yù)測(cè)T細(xì)胞刺激區(qū)的兩種肽。后兩種肽可能增加本發(fā)明所述整個(gè)17KDa抗原的T細(xì)胞刺激性質(zhì)。17KDa抗原及其亞結(jié)構(gòu)肽的T細(xì)胞刺激性質(zhì)意味著它們能用于結(jié)核病的治療和預(yù)防。


如下圖1經(jīng)電洗脫后的結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)的17KDa蛋白抗原的HPLC分析。
HPLC條件RP18柱(LKB，10μm孔徑)，A＝0.1% TFA水溶液，B0.085%TFA的乙腈(70%)溶液，梯度0-65%，B，40分鐘，敏感性0.08，220nm。
圖2經(jīng)RP18(LKB，10μm孔徑)的HPLC分級(jí)分離結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)的17KDa蛋白抗原的胰蛋白酶肽。
分級(jí)分離A0.1%TFA水溶液，B0.085%TFA的70%乙腈溶液，梯度0-65%B，60分鐘，敏感性0.08.220nm。
氨基酸順序給出各個(gè)肽所測(cè)定的順序。
圖3經(jīng)RP18(LKB，孔徑10μm)的HPLC分級(jí)分離的結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)的17KDa蛋白抗原的V8蛋白酶肽。
分級(jí)分離A0.1%TFA水溶液;B0.085%TFA的70%乙腈溶液，梯度0-65%，60分鐘，敏感性0.082，220nm。
圖4表示肽直線連接的結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)的17KDa抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)。Trp胰蛋白酶，V8金黃色葡萄球菌V8蛋白酶。標(biāo)在上面的箭頭表示完全蛋白得到的氨基酸順序。
(單字母密碼用于氨基酸)。
圖5;給出生物活性區(qū)的結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)的17KDa抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
AA68-77表示抗體和T細(xì)胞表位。
AA91-101表示抗體表位。
AA107122表示2個(gè)T細(xì)胞的表位。
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權(quán)利要求
1.下列結(jié)構(gòu)的蛋白1 40ATTLPVQRHPRSLFPEFSELFAAFPSFAGLRPTFDTRELM30RSIQITIKLEDEMKGIYLPVAKHGELRSEFAYGSFVRTVS131LPVGADEDDIRATYDKRYEVRDFDGRAELPGVDPDCDVCITRGILTVSVCV
2.下列結(jié)構(gòu)的肽和權(quán)利要求1的蛋白的片段RATYDKRYEVRDFDGRAELAELPGVDPDCDVCITR包括一個(gè)或多個(gè)該肽的順序。
3.編碼權(quán)利要求1定義的蛋白的DNA順序。
4.編碼權(quán)利要求2定義的肽的DNA順序。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2定義的蛋白或肽或權(quán)利要求3或4的DNA順序構(gòu)建的DNA或RNA雜交探針，所述探針可任意進(jìn)行標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2定義的蛋白或肽的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的抗體，它是多克隆或單克隆抗體，所述抗體可任意進(jìn)行標(biāo)記。
8.實(shí)施免疫診斷結(jié)核病的藥盒，它包括權(quán)利要求1或2的蛋白或肽。
9.實(shí)施免疫診斷結(jié)核病的藥盒，它包括權(quán)利要求7的單克隆抗體。
10.實(shí)施以DNA為基礎(chǔ)的診斷結(jié)核病的藥盒，它包括權(quán)利要求5的雜交探針。
11.能夠表達(dá)權(quán)利要求1或2的蛋白或肽的微生物。
12.結(jié)核疫苗，包括權(quán)利要求1或2的蛋白或肽。
13.診斷人結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液，例如血清，與權(quán)利要求1或2的蛋白或肽相互反應(yīng)。
14.診斷人結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液，例如痰、CSF、胸膜液或血清，與經(jīng)過標(biāo)記的權(quán)利要求7的單克隆抗體相互反應(yīng)。
15.診斷人結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液，例如痰、CSF、胸膜液或血清，與經(jīng)過標(biāo)記的權(quán)利要求5的DNA探針相互反應(yīng)。
16.體外檢測(cè)人結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液樣品，例如痰、CSF、胸膜液或血清，與經(jīng)過標(biāo)記的權(quán)利要求7的多克隆抗體接觸。
17.體外檢測(cè)人結(jié)核病的方法，該方法包括患者的體液樣品，例如痰、CSF、胸膜液或血清，與經(jīng)過標(biāo)記的權(quán)利要求7的單克隆抗體接觸。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白或肽，其在治療人或動(dòng)物體的方法中應(yīng)用于人結(jié)核病的免疫診斷、治療或接種預(yù)防。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白或肽，其在治療人或動(dòng)物體的方法中應(yīng)用于在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生用于像ELISA方法的免疫診斷方法的哺乳動(dòng)物的多克隆抗體或單克隆抗體，該方法可檢測(cè)人結(jié)核病中的如權(quán)利要求1所述的蛋白。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白或肽，其在治療人或動(dòng)物體的方法中，通過早期檢測(cè)結(jié)核病的血清液方法，用于檢測(cè)結(jié)核病樣品中的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或2的蛋白或肽，其在治療人或動(dòng)物體的方法中為了通過皮膚獲得免疫診斷或?yàn)榱双@得接種預(yù)防結(jié)核病的手段，用于檢測(cè)結(jié)核樣品中T細(xì)胞的增殖。
22.權(quán)利要求1或2的蛋白用于人結(jié)核病的免疫診斷、治療和預(yù)防接種。
23.權(quán)利要求1或2的蛋白或肽用于開發(fā)通過T細(xì)胞的增殖治療結(jié)核感染的試劑。
24.權(quán)利要求1或2的蛋白或肽應(yīng)用于通過T細(xì)胞增殖測(cè)定，產(chǎn)生生長(zhǎng)分化因子。
25.權(quán)利要求5的DNA或RNA探針用于檢測(cè)人結(jié)核樣品中的結(jié)核分枝桿菌DNA，以利獲得早期檢測(cè)結(jié)核病。
26.權(quán)利要求5的DNA或RNA探針應(yīng)用于鑒定培養(yǎng)分離物中的分枝桿菌DNA和實(shí)驗(yàn)室研究。
全文摘要
本申請(qǐng)公開了分級(jí)分離、純化和定序結(jié)核分枝桿菌(SⅡ1)氨基酸的17KDa蛋白抗原的免疫化學(xué)特性。具有N末端ATTLPVQR(aa1-8)的17KDa蛋白抗原至少具有3個(gè)位于線性順序RATYDKRYEVR(aa91-101)和SEFAYGSFVR(aa68-77)肽的特異性抗體結(jié)合的抗原決定部位。促人體結(jié)核外周血淋巴細(xì)胞有絲分裂的17KDa蛋白原含有3個(gè)預(yù)測(cè)的位于線性順序SEFAYGSFVR(aa68-77)和AELPGVDPDCDVCITR(aa107-122)肽的T細(xì)胞抗原決定部位。17KDa蛋白抗原可能用于人體結(jié)核病的免疫診斷、治療和預(yù)防。
文檔編號(hào)C07K16/12GK1060310SQ9110123
公開日1992年4月15日 申請(qǐng)日期1991年3月27日 優(yōu)先權(quán)日1990年3月27日
發(fā)明者C·賈甘納特, M·包爾甘納什, B·R·斯里尼瓦沙 申請(qǐng)人:阿斯特拉公司