專利名稱：三精氨酸胰島素的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，提供了用于糖尿病治療的新的胰島素形式。
目前，糖尿病的主要治療方法涉及用中效和長效胰島素制品進(jìn)行治療。設(shè)計這些制劑是為了控制病人整個夜間的葡萄糖水平，同時給許多病人提供每天注射一次的治療。
所有這些制劑的共同特點在于，它們都是胰島素的不溶性懸浮液。因此，注射劑量可能有很大變化，并且，在皮下注射之后，葡萄糖的控制可能受影響(Skyler，J.S.，MedicalClinicsofNorthAmerica，721337-1354，1988)。許多這種制劑還需要加入大量的魚精蛋白以提供長時間作用，魚精蛋白是一種魚蛋白質(zhì)，已經(jīng)證明它能在一些病人體內(nèi)引起抗體產(chǎn)生(Ellerhorst，J.A.等，TheAmericanJournaloftheMedicalSciences，299298-301，1987)。
隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，已經(jīng)合成了大量能在制劑中完全保持可溶性的胰島素類似物，它們比天然胰島素有著更快或者更長的作用(Markussen，J.等，ProteinEngineering，1215-223，1987)。對于得到更為長效的胰島素類似物而言，一個最有希望的方法是將它們配制成在低pH(pH3-4)條件下完全可溶的制劑。在皮下注射后，由于迅速調(diào)整到機(jī)體內(nèi)環(huán)境的天然pH值(pH7.4)，使這些類似物沉淀或結(jié)晶。它們在pH7.4條件下緩慢地重新溶解，使作用時間達(dá)到所需的延長。
在上述方法中存在下面兩個問題。首先，長期施用酸性很強(qiáng)的溶液會引起疼痛、皮膚壞死和腐肉形成(DeLuca，P.P.和Rapp，R.P.PharmaceuticsandPharmacyPractice;Banker，G.S.和Chalmers，R.K.編;238-278，1982，J.B.LippencottCo.，Philadelphia，PA)。從這一點考慮，更接近中性的溶液(pH6-7)顯然更為理想。其次，因為胰島素類似物對機(jī)體來說是非天然的，所以機(jī)體會將它們視為異己，產(chǎn)生針對這些胰島素類似物的抗體，從而干擾病人的胰島素療法或引起其它問題(Patterson，R.等，AnnalsofAllergy，64459-462，1990)。盡可能減少這類蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變異可能會避免這一潛在的問題。
已有人描述了一種稱為二精氨酸胰島素的胰島素類似物，它具有中效作用以及在pH4-5易于溶解的特點(Zeuzem，S.等，Diabetologia，3365-71，1990)。但是二精氨酸胰島素缺乏本發(fā)明的優(yōu)點之一，即在pH6附近可溶。本發(fā)明還顯示出了優(yōu)于二精氨酸胰島素的長效作用特點。
除了前文提及的強(qiáng)酸性制劑的生理性問題外，天然胰島素樣分子在低pH條件下還存在另一個問題。在酸性條件下，A鏈第21位(A21)上的天冬酰胺殘基非常易于發(fā)生脫酰胺作用和其它副反應(yīng)，從而形成不希望有的二聚體和多聚體(Markussen，J.等，ProteinEngineering，2157-166，1988)。這些反應(yīng)最好在低于pH4的條件下進(jìn)行，而在大于pH5的條件下幾乎不存在(引文同前)。因此，在進(jìn)行人體治療方面，最希望制備一種具有長效降血糖作用、低免疫原性且在高于pH6的條件下其制劑可溶的胰島素樣分子。
本發(fā)明是基于以下發(fā)現(xiàn)本文稱作三精氨酸胰島素和三精氨酸胰島素類似物的一些胰島素類似物，具有附加了三個額外精氨酸殘基的胰島素天然結(jié)構(gòu)，在動物模型中具有長效降血糖活性，并在pH達(dá)到6.1時仍能配制成溶液。
本發(fā)明涉及具有下式的化合物或其可藥用無毒鹽
其中X和Z選自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，Y選自His、Asp或Glu。最優(yōu)選的化合物是那些在可變位置上含有天然存在的氨基酸的化合物，即其中的X是Asn，Y是His，Z是Asn。
本發(fā)明還包括由人胰島素原組成的斷裂(64)胰島素原三精氨酸類似物或其可藥用鹽，其中B鏈第3位殘基(B3)和A鏈第21位殘基(A21)選自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val;B鏈第10位殘基(B10)選自His、Asp或Glu;C肽第64位殘基(Lys-64)與C肽第65位殘基(Arg65)之間的酰胺鍵(肽鍵)被打開。
在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明包括由去掉了Lys-64的斷裂(64)胰島素原三精氨酸類似物組成的去(64)胰島素原三精氨酸類似物或其可藥用鹽。最優(yōu)選的化合物是在可變位置上含有天然存在的氨基酸的化合物，即其中的B3和A21殘基是Asn，B10殘基是His。
本發(fā)明的另外一個實施方案是制備人三精氨酸胰島素的方法，該方法包括a)使人胰島素原與胰蛋白酶和羧肽酶B接觸，產(chǎn)生去(64)人胰島素原;
b)分離去(64)人胰島素原;
c)使去(64)人胰島素原與胰蛋白酶接觸;
d)分離三精氨酸胰島素。
本發(fā)明另外一個實施方案是制備人三精氨酸胰島素的方法，該方法包括a)在優(yōu)先打開人胰島素原Lys-64和Arg-65之間肽鍵的條件下，使人胰島素原與賴氨酸內(nèi)肽酶接觸，產(chǎn)生斷裂(64)人胰島素原;
b)分離斷裂(64)人胰島素原;
c)使斷裂(64)人胰島素原與胰蛋白酶接觸;
d)分離人三精氨酸胰島素。


圖1說明三精氨酸胰島素和三精氨酸胰島素類似物的一級氨基酸順序，并顯示出三個二硫鍵。每一個殘基下面的數(shù)字對應(yīng)于該殘基在順序中從氨基末端算起的位置。B鏈第3位上的符號X代表20種天然存在的氨基酸中的任何一種。B鏈第10位上的符號Y代表His、Asp或Glu，A鏈羧基末端的符號Z代表20種天然存在的氨基酸中的任何一種。
圖2顯示人胰島素原的一級氨基酸順序。以黑色顯示的殘基表示天然人胰島素，以白色顯示的殘基表示天然人胰島素原的連接肽(C肽)。
為了本文表述方便起見，常見于天然存在蛋白質(zhì)中的20種L-氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)的三字母縮寫形式表示(參見《CodeofFederalRegulations》第37卷第1.822節(jié))。同樣為了本文表述方便起見，一些術(shù)語按下列定義使用。
術(shù)語“三精氨酸胰島素”定義為在B鏈的羧基末端含有兩個額外精氨酸殘基(如圖1和圖2所示的Arg-31和Arg-32)，在A鏈的氨基末端含有一個額外精氨酸殘基(如圖1所示的A鏈Arg-0或如圖2所示的Arg-65)的人胰島素。
術(shù)語“三精氨酸胰島素類似物”定義為三精氨酸胰島素中B3或A21位或這兩個位置被20種天然存在氨基酸中的任意一種所置換，而B10位可以被His、Asp或Glu置換。
術(shù)語“胰島素原三精氨酸類似物”指的是在B3、B10和A21位上含有與本發(fā)明一致的任何可能置換的人胰島素原。
術(shù)語“斷裂(64)胰島素原”定義為Lys-64和Arg-65(A鏈Arg-O)間的肽鍵被打開(見圖1和圖2)的人胰島素原。
術(shù)語“斷裂(64)胰島素原三精氨酸類似物”定義為在B3、B10或A21位上發(fā)生了與本發(fā)明一致的一個或更多個氨基酸置換的斷裂(64)胰島素原。
術(shù)語“去(64)胰島素原”定義為去掉了Lys-64的斷裂(64)胰島素原(見圖1和圖2)。
術(shù)語“去(64)胰島素原三精氨酸類似物”定義為在B3、B10或A21位上發(fā)生了與本發(fā)明一致的一個或更多個氨基酸置換的去(64)胰島素原。
術(shù)語“可藥用無毒酸加成鹽”包括有機(jī)酸和無機(jī)酸加成鹽，包括例如由下列酸制得的鹽鹽酸、硫酸、磺酸、酒石酸、富馬酸、氫溴酸、乙醇酸、檸檬酸、馬來酸、磷酸、琥珀酸、乙酸、硝酸、苯甲酸、抗壞血酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸、丙酸、碳酸等，或諸如碳酸氫銨等鹽類。酸加成鹽最好是由鹽酸、乙酸或碳酸制得的鹽。可以通過常規(guī)方法制備上述任何一種鹽。
術(shù)語“羧酸鹽”包括例如鋅鹽、銨鹽、堿金屬鹽(如鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽和鋰鹽)等。優(yōu)選的羧酸鹽是鋅鹽和鈉鹽。
本發(fā)明涉及許多人胰島素類似物及從胰島素原和胰島素原三精氨酸類似物制備人胰島素類似物的方法。屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的化合物的一般結(jié)構(gòu)如圖1如示，其氨基酸順序列于1-4號順序中。本發(fā)明的化合物包括其可藥用的無毒酸加成鹽及其可藥用的無毒羧酸鹽。
使本發(fā)明的化合物具有若干意想不到的有益性質(zhì)的一個基本特征是存在三個額外的精氨酸殘基。其中二個殘基見于B鏈的羧基末端(Arg-31和Arg-32，如圖1和圖2所示)，第三個額外的精氨酸殘基位于A鏈的氨基末端(A鏈Arg-0，如圖1所示;或Arg-65，如圖2所示)。這三個精氨酸殘基存在于天然人胰島素原的結(jié)構(gòu)中，但不存在于天然存在的人胰島素中(參見圖2)。
已知胰島素B鏈的第3位(B3)可以用其它天然存在氨基酸置換，而對胰島素結(jié)構(gòu)無不利影響，也不消除其生物活性。因此，該位置上的任何天然存在的氨基酸都是與本發(fā)明一致的。但是，為了減少產(chǎn)生免疫原性的可能性，優(yōu)選Asn，因為天然胰島素中該位置上是Asn。
上述情況對A鏈的羧基末端殘基(A21)也是適合的。因此，A21位上的任何天然存在的氨基酸都是與本發(fā)明一致的。但是，為了減少產(chǎn)生免疫原性的可能性，優(yōu)選Asn，因為天然胰島素中A21位上是Asn。
第三個可以發(fā)生氨基酸置換的位點是B鏈的第10位(B10)。已有文獻(xiàn)報道在B10位含有Glu或Asp的胰島素類似物，并證明其效力增強(qiáng)(Burke，G.T.等，BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications，173982-937，1990)。因此，可認(rèn)為在本發(fā)明中Glu、Asp和His可占據(jù)B10位。然而，為了減少產(chǎn)生免疫原性的可能性，優(yōu)選His，因為在天然胰島素中B10位上是His。
如同天然人胰島素一樣，為了形成合適的回級結(jié)構(gòu)，三精氨酸胰島素和三精氨酸胰島素類似物需要三個二硫鍵。有兩個二硫鍵連接A鏈和B鏈(A7-B7和A20-B19)，在A鏈中形成一個鏈內(nèi)二硫鍵(A6-A11)，如圖1所示。
利用公知的蛋白質(zhì)化學(xué)原理和重組DNA方法，可以經(jīng)多種途徑制備三精氨酸胰島素和三精氨酸胰島素類似物。下面簡要列舉合成三精氨酸胰島素和三精氨酸胰島素類似物的幾個基本途徑。所列途徑并非窮舉，因為基本方案的許多其它改變都是可能的。
1)如實施例1所述，用胰蛋白酶和羧肽酶B處理人胰島素原。
2)如實施例2所述，用在賴氨酸處切割的內(nèi)肽酶在人胰島素原的Lys-64和Arg-65殘基之間進(jìn)行選擇性切割，隨后用胰蛋白酶溫和地切割優(yōu)選的Arg-32-Glu-33肽鍵。
3)通過重組DNA技術(shù)合成A鏈Arg-0和B鏈Arg-31、32，然后再通過已知的二硫鍵化學(xué)法使其組合。這類二硫鍵化學(xué)法的細(xì)節(jié)參見美國專利4，421，685，該專利并入本文作為參考。
4)用化學(xué)法合成A鏈Arg-0和B鏈Arg-31、32，然后再通過已知的二硫鍵化學(xué)法使其組合。
5)用重組DNA技術(shù)制備由肽順序B鏈-Arg-31-Arg-32-Arg-33-A鏈組成的單鏈小型胰島素原分子。二硫鍵形成之后，用胰蛋白酶樣酶類選擇性地或在某種程度上優(yōu)先地切割A(yù)rg32和Arg33之間的肽鍵，生成三精氨酸胰島素。
6)結(jié)構(gòu)為X-B鏈-Arg-Arg-Y-Arg-A鏈的小型胰島素原分子，其中X和Y可以是Arg或Lys以外的任何天然存在的氨基酸。該小型胰島素原由重組DNA技術(shù)制得，并以正確的二硫鍵排列進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼郫B。預(yù)計胰蛋白酶對該單鏈肽的切割首先發(fā)生于Arg-Y之間，接著通過Edman法分別從B鏈和A鏈的氨基末端去掉X和Y，生成三精氨酸胰島素。
對每一種上述方案都可以進(jìn)行多種多樣的小改動。最顯著的改動是在B3、B10和A21位上發(fā)生所有可能的氨基酸置換。
例如，可以改動方法1，用化學(xué)方法或重組方法首先合成一種人胰島素原三精氨酸類似物。通過對所說三個位置中每一位置上所有可能的氨基酸置換進(jìn)行混合和配對，可產(chǎn)生近1200種不同的胰島素原三精氨酸類似物，用方法1即可從中制備三精氨酸胰島素類似物。
作為另外一個例子，可如下改動方法1，首先制備具有前導(dǎo)順序的編碼B鏈的DNA化合物。在翻譯之后，可通過酶解切下所得的肽前導(dǎo)順序，并如上所述完成該方法。該方法的其它變化包括加上產(chǎn)生可切割肽的尾隨順序，生成三精氨酸胰島素或三精氨酸胰島素類似物。
分子生物學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)已提供了以任何給定的氨基酸置換蛋白質(zhì)順序中的另一種氨基酸的方法。利用公知技術(shù)，如位點特異性突變，可以隨意改變編碼胰島素原的DNA順序，產(chǎn)生所選擇的氨基酸置換。因此，現(xiàn)有技術(shù)使技術(shù)人員能制備出胰島素原三精氨酸類似物。所以，方法1可用于制備含有任何一個或更多個包括于本發(fā)明中的氨基酸置換的三精氨酸胰島素類似物。
還可以用另一種方法完成在三個可變位置上的所需氨基酸置換。肽合成化學(xué)的現(xiàn)有技術(shù)提供的方法，例如Merrifield技術(shù)，可用于從單個氨基酸合成至少32個殘基的肽。因此，利用上述的方法3，可以合成在可變位置上含有任何可能的氨基酸置換的胰島素A鏈和B鏈。
用于制備三精氨酸胰島素和三精氨酸胰島素類似物的方法和中間體，是本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案。通過乙?；鹊鞍酌负汪入拿窧的作用，實施例1所述的方法產(chǎn)生了作為中間體的去(64)胰島素原，但發(fā)現(xiàn)去(64)胰島素原本身就具有降血糖活性。實施例1所述的方法也可以從相應(yīng)的胰島素原三精氨酸類似物起始而生成去(64)胰島素原三精氨酸類似物中間體。
實施例2所述的方法通過用賴氨酸內(nèi)肽酶處理人胰島素原而產(chǎn)生斷裂(64)胰島素原中間體。該方法也可以從相應(yīng)的胰島素原三精氨酸類似物起始而產(chǎn)生斷裂(64)胰島素原三精氨酸類似物中間體。同樣也發(fā)現(xiàn)斷裂(64)胰島素原本身就具有降血糖活性。
賴氨酸內(nèi)肽酶C是有著廣泛商業(yè)來源的賴氨酸內(nèi)肽酶，例如，它可來自Lysobacterenzymogenes(Boehringer-Mannheim;Indianapolis，IN)、銅綠假單胞菌(Promega;Madison，WI)和AchromobacterLyticus(WakoPureChemical;Dallas，TX)。它特異切割賴氨酸殘基的羧基末端。為了從胰島素原產(chǎn)生高產(chǎn)率的斷裂(64)胰島素原，有必要在切割Lys-29位羧基末端之前優(yōu)先切割Lys-64位的羧基末端。在這方面，發(fā)現(xiàn)來自銅綠假單胞菌的賴氨酸內(nèi)肽酶C是優(yōu)選的來源，得自Lysobacterenzymogenes的酶是最優(yōu)選的來源。
下面的實施例用于理解本發(fā)明及如何實施本發(fā)明。這些實施例僅用于說明目的而決不是對本發(fā)明進(jìn)行限制。
實施例1通過去(64)人胰島素原中間體制備三精氨酸胰島素用豬羧肽酶B(Promega;Madison，WI)和乙?；Ｒ鹊鞍酌?其制法參見EuropeanJ.Biochem.，2215-223，1967)處理在大腸桿菌中制得的重組人胰島素原，其中，酶和底物溶于20mM甘氨酸緩沖液中(pH8)，其重量比分別是約1∶1000和1∶20，000。反應(yīng)在8℃進(jìn)行約27小時，加入1倍體積的7M尿素終止反應(yīng)。然后將所得的溶液上樣到預(yù)先用7M尿素、10mM Tris(三羥甲基氨基甲烷，Sigma;st.Louis，MO)、1mM連四硫酸鉀(pH8.1)平衡過的Q-Sepharose Fast FlowTM樹脂柱上。用含有25mM氯化鈉的相同緩沖液洗柱，然后用25-65mM氯化鈉在平衡緩沖液中的線性梯度進(jìn)行洗脫。收集各流出級份，并在收集之后立即用冰醋酸滴定至約pH4.0。
合并經(jīng)分析性HPLC測定含有去(64)胰島素原的級分，并用AmiconS1Y3螺旋纏繞式濾筒(Amicon;Danvers，MA)進(jìn)行濃縮。用1M醋酸(約pH2.5)在約5℃對保留物進(jìn)行透濾。用等體積的水稀釋所得的溶液，再通過0.2μm的濾器過濾，并真空冷凍干燥至干。
在室溫下，將2.91g去(64)人胰島素原溶解于含0.02M CaCl2并用1N HCl調(diào)至pH8的291ml 0.05M Tris緩沖液中。然后將該溶液冷卻至5℃。加入約364μl溶于水中的豬胰蛋白酶(1mg/ml)(Sigma;st.Louis，MO)，使酶底物重量比為1∶8000?；旌虾?，將溶液貯存于5℃。
4.5小時后，加入10ml 1N HCl停止反應(yīng)。將整個透明溶液泵至5.5×30cm C-18 VydacTMHPLC柱中。水洗后，用在0.5%三氟乙酸(TFA)緩沖液中的22.5-42.5%乙腈梯度，以2.5ml/分的流速洗脫蛋白質(zhì)24小時。用276nm處的光吸收監(jiān)測流出液。以20ml為一級分進(jìn)行收集，借助HPLC，用C-8ZorbaxTM柱以在0.1M磷酸二氫鈉緩沖液(pH2.1)中的乙腈梯度對若干級份進(jìn)行分析性檢測。
合并含有級分(116-128)的三精氨酸胰島素，冰凍干燥后得到0.94g產(chǎn)物，HPLC純度為87%。該產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)通過氨基酸組成、N-末端順序分析及快原子轟擊質(zhì)譜(FAB-MS)加以證實。
實施例2通過斷裂(64)人胰島素原中間體制備三精氨酸胰島素將800mg人胰島素原溶解于含有25mM Tris和1mM EDTA的80ml緩沖液(pH7.7)中。用同樣的緩沖液將銅綠假單胞菌賴氨酸內(nèi)肽酶C(Promega;Madison，WI)制成0.1mg/ml，并取200μl加至胰島素原溶液中，使得酶底物重量比為1∶40，000。反應(yīng)液充分混勻后于37℃下保溫9.5小時。加入1N HCl將溶液酸化至pH3.0，然后加到用0.5%TFA平衡過的5.5×30cm VydacTMC-18制備性HPLC柱上。用0-40%乙腈在TFA緩沖液中的梯度洗脫純化的蛋白質(zhì)20小時。合并相應(yīng)于斷裂(64)胰島素原的級份，冰凍干燥后得到237mg產(chǎn)物，該產(chǎn)物的本質(zhì)通過氨基酸分析、FAB-MS和N末端順序分析加以證實。
用25mM Tris、1mM EDTA緩沖液(pH7.7)將一部分?jǐn)嗔?64)胰島素原制成1mg/ml，并用相同的緩沖液將牛胰蛋白酶(Sigma;St.Louis，MO)制成0.1mg/ml。向700μl斷裂(64)胰島素原中加入7μl胰蛋白酶溶液，使酶底物重量比為1∶1，000。在室溫下攪拌反應(yīng)物30分鐘。然后在4.6×250mm ZorbaxTMC-8柱上以乙腈在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH2.1)中的短梯度對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析。分析結(jié)果表明，基本上所有的斷裂(64)胰島素原都被消化，主要產(chǎn)物是三精氨酸胰島素。
實施例3制備Asp(A21)-三精氨酸胰島素類似物將如實施例1制備的三精氨酸胰島素(40mg)溶解于4ml 0.01NHCl中，并在室溫下保存12天。然后將溶液在37℃下再保溫16天。用制備性HPLC純化最終溶液中的主要成分。將5份溶液(每份0.5-1.0ml)注入預(yù)先用含有26%乙腈的0.1M硫酸鈉緩沖液(pH2.3)平衡過的21.5×250mm ZorbaxTMC-8HPLC柱中。用26-30%乙腈在硫酸鈉緩沖液中的梯度洗脫樣品的各成份。將這5次操作所得的含主要成份的流出液級份混合，用等體積的水稀釋，并在C-18Sep-PakTM濾筒(Millipore;Bedford，MA)上脫鹽。洗脫純化的肽，在50%乙腈和50%TFA(0.5%)緩沖液中濃縮，并冰凍干燥。通過對單個A鏈和B鏈的氨基酸分析、FAB-MS和HPLC分析，證實純化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。分析性HPLC表明，Asp(A21)-三精氨酸胰島素類似物的純度為95%。
實施例4三精氨酸胰島素的生物活性用0.05M乙酸鈉緩沖液制備2-4ml三精氨酸胰島素溶液(40U/ml)，使最終蛋白質(zhì)濃度為約2.0mg/ml。制備不同含鋅量(0-2.4mg/ml)(氯化鋅形式)的溶液。用冰醋酸溶解每一種溶液至最終pH值范圍為pH4-6。根據(jù)相對于人胰島素估算的70%的生物效力(胰島素受體結(jié)合作用)和人胰島素的標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值28.85U/mg，在測試溶液的制備中使用下列公式。
2mg/ml×28.85U/mg蛋白×70%效力＝40U/ml用于實驗的新西蘭白兔絕大多數(shù)為雌性，體重均為2.7-4Kg，年齡0.5-4歲，在施用樣品之前禁食16小時。分別用下列溶液(40U/ml)以0.2U/Kg的劑量給10只兔作頸背部皮下注射三精氨酸胰島素、Asp(A21)-三精氨酸胰島素類似物、斷裂(64)胰島素原(pH7.35)、去(64)胰島素原(pH7.46)、二精氨酸胰島素(制備方法參見Zeuzem等，Diabetologia，3365-71，1990)、Humulin LTM(中效人胰島素，伊來利利公司;Indianapolis，IN)或Humulin UTM(長效人胰島素，伊來利利公司;Indianapolis，IN)。
在不同時間從兔耳緣靜脈抽取100μl血，與900μl抗凝劑(EDTA-氟化鈉)混合，并分析葡萄糖含量。將葡萄糖值標(biāo)準(zhǔn)化以反映在注射樣品之前測得的原始血糖的百分比。結(jié)果如表1所示。
表1原始血糖的百分比n=10注射樣品后的時間(小時)加鋅量胰島素mg/ml1246Humulin L058.248.090.696.2Humulin U053.455.385.392.5三精氨酸胰島素051.156.086.995.3Asp(A21)-三精氨酸胰島素067.484.294.889.8去(64)人胰島素原063.170.590.690.0斷裂(64)人胰島素原061.783.894.894.1二精氨酸胰島素060.685.498.199.8
表1(續(xù))原始血糖的百分比n=10注射樣品后的時間加鋅量胰島素mg/ml1246三精氨酸胰島素0.01443.350.390.594.9三精氨酸胰島素0.0551.457.788.295.1三精氨酸胰島素0.1461.652.176.196.5三精氨酸胰島素0.3376.267.788.591.9三精氨酸胰島素0.571.865.088.486.9三精氨酸胰島素1.483.771.175.391.4三精氨酸胰島素2.479.271.174.570.1Asp(A21)-三精氨酸胰島素2.484.270.384.491.9二精氨酸胰島素2.476.373.495.596.7實施例5根據(jù)276nm波長處的光密度(O.D.)比較三精氨酸胰島素和二精氨酸胰島素的百分溶解度。用2mM硼酸鹽-檸檬酸鹽-甘氨酸緩沖液(pH9.5)配制1mg/ml的三精氨酸胰島素溶液(如實施例1制備)或二精氨酸胰島素溶液(制備方法參見Zeuzem等，Diabetologia，3365-71，1990)。滴加5NHCl或者5NNaOH，將取自每個溶液的樣品調(diào)至不同的pH值，并用數(shù)字式pH計測量。然后將每個樣品于約10，000rpm離心30分鐘。然后移出上清液，用分光光度計測量每個樣品在276nm處的O.D.值。用0.98作為1mg/ml溶液的預(yù)期O.D.值，由O.D.值計算濃度。用離心后的濃度除以原始濃度計算出可溶物的百分比。結(jié)果如表2所示。
表2二精氨酸胰島素三精氨酸胰島素pH可溶物百分比pH可溶物百分比3.4695.2--4.0882.9--4.5173.04.9487.45.5619.05.5653.85.938.15.9225.36.4710.16.5610.57.0222.26.999.17.5444.47.5310.78.06102.08.0521.2
這些數(shù)據(jù)表明，三精氨酸胰島素在所希望的配制pH(pH5-6)下具有較高的溶解度，但在皮下注射后的生理pH(pH7.4)下溶解度較低。因此，三精氨酸胰島素可以在比二精氨酸胰島素更高、更優(yōu)選的pH下配制。所以，預(yù)計三精氨酸胰島素在皮下注射后的溶解度特性能使其作用時間比二精氨酸胰島素素更長。
順序表1.概況(i)申請人:Hoffmann,James A.
Lambooy,Peter K.
(ii)發(fā)明名稱:三精氨酸胰島素(iii)順序數(shù):4(iV)通信地址:
(A)地址:伊來利利公司(B)街道:利利總部(C)城市:印第安那波利斯(D)州:印第安那(E)國家:美國(F)郵政編碼:46285(V)計算機(jī)可讀形式:
(A)介質(zhì)類型:Floppy盤(B)計算機(jī):IBM PC兼容機(jī)
(C)操作系統(tǒng):PC-DOS/MS-DOS(D)軟件:PatentIn Release#1.0,Version 1.25(Vi)本申請資料:
(A)申請?zhí)?
(B)申請日:
(C)分類:
(Viii)專利代理人情況(A)姓名:Boone Ph. D.,David E.
(B)登記號:27,857(C)案號:X-8164(iX)電訊資料(A)電話:317-276-1664(B)傳真:317-276-12942.1號順序資料:
(i)順序特征:
(A)長度:32個氨基酸(B)類型:氨基酸(C)成鏈性:單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:7..8
(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-Linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素B鏈)的Cys7以二硫鍵與三精氨酸胰島素A鏈的Cys8連接。"(iX)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:19..20(D)其它資料:/標(biāo)記=Cros-linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素B鏈)的Cys19以二硫鍵與三精氨酸胰島素A鏈的Cys21連接。"(Xi)順序描述:1號順序:
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu151015Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr202530Arg Arg(2)2號順序資料:
(i)順序特征:
(A)長度:32個氨基酸(B)類型:氨基酸(C)成鏈性:單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:7..8(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-Linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素B鏈)的Cys7以二硫鍵與三精氨酸胰島素A鏈的Cys8連接。"(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:19..20(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-Linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素B鏈)的Cys19以二硫鍵與三精氨酸胰島素A鏈的Cys21連接。"(Xi)順序描述:2號順序:
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu151015Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr202530Arg Arg(2)3號順序資料:
(i)順序特征:
(A)長度:32個氨基酸(B)類型:氨基酸(C)成鏈性:單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性
(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:7..8(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素B鏈)的Cys7以二硫鍵與三精氨酸胰島素A鏈的Cys8連接。"(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:19..20(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-Linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素B鏈)的Cys19以二硫鍵與三精氨酸胰島素A鏈的Cys21連接。"(Xi)順序描述:3號順序:
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser Glu Leu Val Glu Ala Leu151015Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr202530Arg Arg(2)4號順序資料:
(i)順序特征:
(A)長度:22個氨基酸(B)類型:氨基酸
(C)成鏈性:單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Disulfide-bond(B)位置:7..12(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:8..9(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-Linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素A鏈)的Cys8以二硫鍵與三精氨酸胰島素B鏈的Cys7連接。"(iX)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:Cross-links(B)位置:21..22(D)其它資料:/標(biāo)記=Cross-linkage/注="該順序(三精氨酸胰島素A鏈)的Cys21以二硫鍵與三精氨酸胰島素B鏈的Cys19連接。"(Xi)順序描述:4號順序:
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr151015Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20
權(quán)利要求
1.一種制備下式的三精氨酸胰島素類似物的方法
其中，X和Z選自Ala、Arg、Asx、Cys、Glx、Gly、His、He、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，Y選自His、Asp或Glu，其中所說化合物由方法(A)或(B)制備(A)i)用胰蛋白酶和羧肽酶B與人胰島素原三精氨酸類似物接觸，生成去(64)人胰島素原三精氨酸類似物；ii)分離去(64)人胰島素原三精氨酸類似物；iii)用胰蛋白酶與去(64)人胰島素原三精氨酸類似物接觸；iv)分離三精氨酸胰島素類似物；(B)i)在優(yōu)先斷裂人胰島素原三精氨酸類似物L(fēng)ys-64和Arg-65間肽鍵的條件下，用賴氨酸內(nèi)肽酶與人胰島素原三精氨酸類似物接觸，生成斷裂(64)人胰島素原三精氨酸類似物；ii)分離斷裂(64)人胰島素原三精氨酸類似物；iii)用胰蛋白酶與斷裂(64)人胰島素原三精氨酸類似物接觸；iv)分離人三精氨酸胰島素類似物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備三精氨酸胰島素的方法，其中人胰島素原三精氨酸類似物是人胰島素原;去(64)人胰島素原三精氨酸類似物是去(64)人胰島素原;斷裂(64)人胰島素原三精氨酸類似物是斷裂(64)人胰島素原;人三精氨酸胰島素類似物是人三精氨酸胰島素。
3.一種制備藥物制劑的方法，該方法包括，將三精氨酸胰島素類似物、三精氨酸胰島素、去(64)人胰島素原三精氨酸類似物、去(64)人胰島素原、斷裂(64)人胰島素原三精氨酸類似物、或斷裂(64)人胰島素原，與一種或更多種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及人胰島素類似物(三精氨酸胰島素)，包括兩種制備三精氨酸胰島素的酶方法。這些化合物在pH達(dá)6.1時仍可配制成可溶性制劑，并具有長效降血糖活性。三精氨酸胰島素具有天然人胰島素的基本結(jié)構(gòu)加上三個額外的精氨酸殘基。其中的二個額外精氨酸殘基串聯(lián)位于胰島素B鏈的羧基末端，第三個精氨酸殘基位于胰島素A鏈的氨基末端。在B3、B10和A21位上具有某些氨基酸置換的三精氨酸胰島素類似物也包括在本發(fā)明內(nèi)。
文檔編號C07K14/575GK1072723SQ92113309
公開日1993年6月2日 申請日期1992年11月25日 優(yōu)先權(quán)日1991年11月26日
發(fā)明者J·A·霍夫曼, P·K·蘭布伊 申請人:伊萊利利公司