專(zhuān)利名稱(chēng)：人體免疫缺陷病毒抗原的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于人體免疫缺陷病毒(HIV)抗原的。更具體地說(shuō)，本發(fā)明是關(guān)于一種基本純的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原的，其中所說(shuō)的融合蛋白是由以羧基末端融合在特異的Env肽上的特異的Gag肽組成的，所說(shuō)的抗原不僅具有優(yōu)良的抗原性，而且還達(dá)到了迄今未曾達(dá)到的水平;本發(fā)明還涉及生產(chǎn)該抗原的方法。本發(fā)明的HIV抗原可用作艾滋病(AIDS)(后天免疫缺陷綜合癥)診斷劑、疫苗、抗體制劑和治療劑的活性組分。
正如本領(lǐng)域眾所周知的那樣，自1981年報(bào)導(dǎo)了第一例AIDS病患者后，該病患者人數(shù)正以幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)。到1992年4月止，AIDS病患者的總?cè)藬?shù)高達(dá)500，000。盡管對(duì)該疾病的預(yù)防和藥物治療研究工作已在全世界廣泛而深入地展開(kāi)，但在實(shí)際應(yīng)用中尚無(wú)任何行之有效的防治措施。由于缺少確實(shí)可靠的防治辦法，AIDS病已在全球擴(kuò)散，成為目前世界性的嚴(yán)重問(wèn)題。另一方面，1983年首次分離和鑒定了AIDS病毒，從此之后，在病毒學(xué)領(lǐng)域，對(duì)AIDS病的基礎(chǔ)和臨床研究變得非常活躍(參見(jiàn)Nature，326，P435-436，1987)。其結(jié)果是，對(duì)AIDS病的診斷有了顯著的進(jìn)步，診斷用的免疫性診斷劑及其生產(chǎn)方法迅速得以改進(jìn)。AIDS病毒已從人體、猴和貓中分離出來(lái)，其中從人體中分離出來(lái)的病毒稱(chēng)為“人體免疫缺陷病毒(HIV)”。HIV主要分為HIV-1和HIV-2兩類(lèi)。HIV-1正在世界范圍內(nèi)，即美國(guó)、歐洲、中非和世界上其它許多國(guó)家傳播，而HIV-2還只在西非慢延。HIV是一種直徑為100-140nm的球形病毒，有被膜(Env)。該Env是由橫膜蛋白(gp41)和70-80個(gè)呈圓棒鼓出狀的被膜突起(gp120)組成的，每一突起直徑15nm，高9nm，存在于病毒顆粒的表面。在病毒顆粒芯部，兩條單鏈病毒基因組RNA分子與逆轉(zhuǎn)錄酶和作為病毒粒芯的結(jié)構(gòu)蛋白形成了一復(fù)合物，并存在有引物tRNA。病毒基因組長(zhǎng)度大于9Kb，由約10個(gè)不同的基因組成。病毒基因組實(shí)質(zhì)上包括下述三個(gè)主要基因，正是這三個(gè)基因負(fù)責(zé)編碼基本病毒成分，使病毒增殖(1)編碼p55的gag(基團(tuán)特異的抗原)基因，p55是病毒粒芯三種結(jié)構(gòu)蛋白p17、p24和p15的前體蛋白;
(2)pol(聚合酶)基因，該基因負(fù)責(zé)編碼三種不同酶即蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶的前體;
(3)編碼gp160的env(被膜)基因，gp160是形成病毒被膜的兩種糖蛋白gp120和gp41的前體。
病毒基因組中的這些基因以5′末端→3′末端方向按gag·pol…env順序排列。
其余七個(gè)基因，即所謂的輔助基因，據(jù)信參與控制HIV感染、增殖和成熟，以及病情的發(fā)展。
通過(guò)培養(yǎng)HIV可以生產(chǎn)出用于AIDS病基礎(chǔ)研究及研制治療劑、診斷和疫苗用的各種HIV抗原和基本酶類(lèi)。然而，培養(yǎng)HIV會(huì)伴隨出現(xiàn)致死生物的危險(xiǎn)。因此，業(yè)已進(jìn)行了各種研究和嘗試以期開(kāi)發(fā)出不用培養(yǎng)HIV就能生產(chǎn)出大量所說(shuō)抗原和酶的技術(shù)。例如，就gag和pol基因而言，采用能夠在大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)基因并加工所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的技術(shù)，已經(jīng)成功地高產(chǎn)率地生產(chǎn)出了各種HIV抗原和酶，如Gag蛋白p17、p24和p15(參見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289號(hào)說(shuō)明書(shū))，以及pol基因產(chǎn)物，如蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和整合酶(參見(jiàn)日本特許公開(kāi)2-265481號(hào)說(shuō)明書(shū))，一些抗原和酶已用于實(shí)踐。
另一方面，關(guān)于HIV的env基因表達(dá)，與gag和pol基因表達(dá)相比，專(zhuān)一高效表達(dá)env基因是極為困難的，且其原因尚不清楚。因此，在許多情況下，HIV的env基因是以與一外源基因嵌合的形式表達(dá)的，由此生成表達(dá)為蛋白質(zhì)的Env肽，在蛋白質(zhì)中，Env肽融合在一外源肽上，例如，已知以與脊髓灰質(zhì)炎病毒嵌合的形式表達(dá)env基因，由此產(chǎn)生一融合蛋白，在該融合蛋白中，Env肽融合在了脊髓灰質(zhì)炎病毒抗原肽上(見(jiàn)JournalofVirology，65，P2875-2883，1991)。又如已知env基因借助大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pEV-vrf以與gag基因嵌合的形式表達(dá)，由此而產(chǎn)生了Env肽融合在Gag肽上的Gag-Env融合蛋白(AnalyticalBiochemistry，161，P370-379，1987)。在上述這些情況中，憑藉外源基因或結(jié)構(gòu)基因編碼的肽以其羧基末端融合在Env肽上，其中所說(shuō)的編碼的肽在表達(dá)質(zhì)粒中位于啟動(dòng)子的下游。當(dāng)Env肽融合到一外源肽上時(shí)，Env肽在與血清的反應(yīng)中很可能表現(xiàn)出非特異性。因此，融合到外源肽上的Env肽與純HIV抗原相比無(wú)論質(zhì)量和作為HIV抗原使用的可靠性方面都要差。另外，融合到外源肽上的Env肽其產(chǎn)率也不高。
為了去掉外源肽，可以設(shè)想在Env肽和外源肽的接合部位切割融合蛋白。但是用此方法不可能獲得高產(chǎn)率低成本的無(wú)外源肽的純的目的Env肽。
另外，將Env肽表達(dá)為由融合在Env肽上的Gag肽所組成的Gag-Env融合蛋白(參見(jiàn)日本特許公開(kāi)1-179687號(hào)說(shuō)明書(shū);Virology，180，P811-813，1991;歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No307149)是已知的。但是，傳統(tǒng)的Gag-Env融合蛋白收率往往較低，因而成本提高。再則，所說(shuō)的Gag-Env融合蛋白抗原性差，因此作為HIV抗原的可靠性也就低。
因此，傳統(tǒng)的HIV抗原存在著質(zhì)量差、可靠性低和收率少的缺點(diǎn)。由此，從實(shí)用和商業(yè)的角度講迫切要求一種新的全無(wú)上述缺點(diǎn)的HIV抗原，該新HIV抗原的研制已成為本領(lǐng)域的緊迫任務(wù)。
如上所述，表達(dá)為融合蛋白形式的Env肽已經(jīng)按照傳統(tǒng)方法大量地生產(chǎn)出來(lái)了，其中在所說(shuō)的融合蛋白中，Env肽融合在外源肽上，但是常規(guī)獲得的表達(dá)為融合蛋白的Env肽在抗原-抗體反應(yīng)中很可能表現(xiàn)為非特異性，從而使融合蛋白作為HIV抗原使用在質(zhì)量和可靠性上都不能令人滿意。這種融合蛋白不適用于AIDS病的實(shí)際診斷。應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，通過(guò)克服現(xiàn)有技術(shù)的一系列問(wèn)題而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明，上述現(xiàn)有技術(shù)即是甚至當(dāng)gag基因和env基因互相融合，并通過(guò)常規(guī)遺傳工程技術(shù)表達(dá)時(shí)，作為HIV抗原是非?？煽康腉ag-Env融合蛋白其收率也不可能高。
本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛而深入細(xì)致的研究，通過(guò)開(kāi)發(fā)一種新的HIV抗原來(lái)解決上述問(wèn)題。結(jié)果，本發(fā)明人成功地研制出了一種新的HIV抗原，該抗原在質(zhì)量、可靠性和產(chǎn)率方面都很好，因此從實(shí)際使用和商業(yè)觀點(diǎn)看是極為有益的。更具體地說(shuō)，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了一種基本純的含Gag-Env融合蛋白的特異性HIV抗原，所說(shuō)的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合到Env肽上的Gag肽組成的，其中Gag肽包括本發(fā)明所限定的由Gag(308-437)代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列，Env肽包括本發(fā)明限定的由Env(512-699)代表的氨基酸序列中的至少一部分，所說(shuō)的部分包含至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)活性的表位。上述抗原不僅具有良好的抗原性，而且其產(chǎn)率能達(dá)到常規(guī)所不能達(dá)到的高度。
進(jìn)一步說(shuō)，在設(shè)計(jì)本發(fā)明的含特異Gag-Env融合蛋白的上述HIV抗原過(guò)程中，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，作為HIV抗原，通過(guò)將編碼Gag蛋白完整氨基酸序列的gag基因表達(dá)為一不成熟蛋白而獲得的Gag蛋白，與Gag蛋白p17、p24和p15，即成熟蛋白且已知為傳統(tǒng)診斷AIDS病用的抗原相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)對(duì)HIV抗體有廣譜反應(yīng)性，在抗原-抗體反應(yīng)中反應(yīng)性強(qiáng)。
本發(fā)明是基于這些新的發(fā)現(xiàn)而完成的。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種基本上純的HIV抗原，其質(zhì)量?jī)?yōu)良，不會(huì)表現(xiàn)出免疫學(xué)非特異性反應(yīng)性，可很好地用于制備HIV試驗(yàn)試劑，HIV抗體，診斷AIDS病用的試劑和AIDS病疫苗等等。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供高產(chǎn)高效生產(chǎn)HIV抗原的方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種用于高產(chǎn)高效生產(chǎn)HIV抗原的重組DNA分子。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種AIDS病診斷劑。
本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種AIDS病疫苗。
本發(fā)明的上述和其它目的，特征以及優(yōu)點(diǎn)可從下面的詳細(xì)說(shuō)明、所附權(quán)利要求及有關(guān)附圖中清楚地看到。


圖1-(1)至1-(2)示出了Gag蛋白的完整氨基酸序列，該蛋白是由含完整HIV-1基因組的質(zhì)粒中所含的完整gag基因區(qū)編碼而成的。
圖2-(1)至2-(3)示出了Env蛋白的完整氨基酸序列，該蛋白是由含完整HIV-1基因組的質(zhì)粒中所含的完整env基因區(qū)編碼而成的。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種含Gag-Env融合蛋白基本純的HIV抗原，其中Gag-Env融合蛋白由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽組成。
在本發(fā)明的HIV抗原中，Gag肽包含Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列，其中括號(hào)內(nèi)數(shù)值范圍中的每個(gè)數(shù)系圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)。Env肽包含至少一部分由Env(512-699)代表的氨基酸序列，所說(shuō)的部分包括至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)活性的表位，其中括號(hào)內(nèi)數(shù)值范圍中的每個(gè)數(shù)即是圖2-(1)至2-(3)所示HIV的Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)。
在本發(fā)明中，每一不同Gag肽中的氨基酸序列區(qū)和每一不同Env肽中的氨基酸序列區(qū)均如上所示加括號(hào)表示。就Gag肽而言，括號(hào)中的每一數(shù)值系圖1-(1)至1-(2)中所示的HIV的Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)，同樣，對(duì)Env肽來(lái)說(shuō)，括號(hào)內(nèi)給出的每一數(shù)值為圖2-(1)至2-(3)中所示HIV的Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)。
在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的左右端分別為氨基末端和羧基末端。在氨基酸序列中，Asp代表天冬氨酸殘基，Glu為谷氨酸殘基，Lys為賴(lài)氨酸殘基，Arg為精氨酸殘基，His為組氨酸殘基，Asn為天冬酰胺殘基，Gln為谷氨酰胺殘基，Ser為絲氨酸殘基，Thr為蘇氨酸殘基，Tyr為酪氨酸殘基，Cys為半胱氨酸殘基，Trp為色氨酸殘基，phe為苯丙氨酸殘基，Gly為甘氨酸殘基，Ala為丙氨酸殘基，Val為纈氨酸殘基，Leu為亮氨酸殘基，Ile為異亮氨酸殘基，pro為脯氨酸殘基，Met為蛋氨酸殘基。
在本發(fā)明的含上述限定的Gag-Env融合蛋白的HIV抗原中，優(yōu)選在部分Env肽中所包含的至少一個(gè)表位是由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
在本發(fā)明中，Gag-Env融合蛋白中的Gag肽包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。Gag肽優(yōu)選包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少30個(gè)，最好至少50個(gè)，更優(yōu)選至少70個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。最佳的是，Gag肽包含由Gag(308-406)或Gag(308-437)所代表的氨基酸序列。關(guān)于此，應(yīng)該注意到，當(dāng)Gag-Env融合蛋白中的Gag肽包含Gag蛋白完整氨基酸序列中的第307個(gè)氨基酸的N末端位之前的氨基酸序列和/或Gag蛋白完整氨基酸序列中的第438個(gè)氨基酸的C末端位之后的氨基酸序列時(shí)，Gag-Env融合蛋白的產(chǎn)率明顯降低。
從改善Gag-Env融合蛋白的抗原性和產(chǎn)率的角度考慮，要求Env肽包含至少一部分由Env(512-699)所代表的氨基酸序列，所說(shuō)的部分含至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)活性的表位。Env肽上的表位優(yōu)選包含由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)，最好至少10個(gè)，更好是至少15個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
利用遺傳工程技術(shù)可以生產(chǎn)出本發(fā)明的HIV抗原中的Gag-Env融合蛋白，其方法包括將負(fù)責(zé)編碼包含至少一個(gè)HIV抗原表位的上述特異Env肽的env基因連接到負(fù)責(zé)編碼上述特異Gag肽的gag基因的下游，由此得到包含gag-Env融合基因的重組DNA分子，表達(dá)該gag-env融合基因。按照本發(fā)明，通過(guò)表達(dá)上述特異gag-env融合基因，首次生產(chǎn)出了一種新的抗原性好的能極其精確地檢測(cè)HIV抗體的HIV抗原。本發(fā)明的HIV抗原還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即其產(chǎn)率之高是傳統(tǒng)所不能達(dá)到的。
本發(fā)明HIV抗原中的Gag-Env融合蛋白可以與所有受試HIV攜帶者的血清反應(yīng)，因此，本發(fā)明HIV抗原中的Gag-Env融合蛋白不僅極為適合作為生產(chǎn)診斷劑用的抗原，而且可以用作HIV疫苗的活性組分。
如上所述，對(duì)Gag蛋白上各局部肽的用途已有報(bào)導(dǎo)(如見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289號(hào)說(shuō)明書(shū))，但就完整的Gag蛋白(p55)，即其完整的氨基酸序列的用途尚未有過(guò)報(bào)導(dǎo)。事實(shí)上，Gag蛋白p55的用途未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)的原因在于p55是一種極為不穩(wěn)定的未成熟蛋白質(zhì)，這種沒(méi)有成熟的蛋白質(zhì)是在HIV顆粒形成的過(guò)程中產(chǎn)生的，并且通常很快就分化成成熟蛋白質(zhì)p17，p24和p15。按傳統(tǒng)說(shuō)來(lái)，用這種未成熟的蛋白質(zhì)作為HIV抗原是難以想象的。如在后面所描述的實(shí)例2的步驟2表明的，本發(fā)明人通過(guò)重組DNA技術(shù)獲得了p55、p17、p24和p15，并就它們與HIV攜帶者血清中的抗體的反應(yīng)活性進(jìn)行了比較。結(jié)果令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在這些蛋白質(zhì)中，p55與HIV抗體的反應(yīng)活性最強(qiáng)，檢測(cè)抗體所必須的最低用量亦比上述那些成熟Gag蛋白都要少。這就是說(shuō)，既使單獨(dú)使用Gag蛋白p55也可以作為診斷AIDS病的有效抗原。另外，當(dāng)Gag蛋白p55與上述Gag-Env融合蛋白一起以混合物的形式使用時(shí)，與HIV抗體反應(yīng)的可靠性得到加強(qiáng)。
據(jù)此，本發(fā)明的另一方面是提供一種包括有HIV抗原混合物的HIV抗原，所說(shuō)的混合物含有上述Gag-Env融合蛋白和以基本分離形式存在的Gag蛋白，Gag蛋白含Gag(1-500)所代表的氨基酸序列，即圖1-(1)至1-(2)所示的Gag蛋白完整的氨基酸序列，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值系圖1-(1)至1-(2)中氨基酸的位置編號(hào)。
另外，本發(fā)明還提供了一種基本純的HIV抗原，該抗原含有以基本分離形式存在的含Gag(1-500)代表的氨基酸序列的，即圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整的氨基酸序列的Gag蛋白，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值系為圖1-(1)至1-(2)中的氨基酸位置編號(hào)。
下面是對(duì)本發(fā)明更詳細(xì)的說(shuō)明。
本發(fā)明的HIV抗原基本上可按照下述程序Ⅰ-Ⅲ來(lái)制備。
程序Ⅰ.確定Env蛋白上能與HIV抗體反應(yīng)的區(qū)域?qū)⒏鞣Nenv基因片段分別地融合到一高表達(dá)基因如LacZ基因的下游，致使各種env基因區(qū)分別以與如LacZ基因嵌合的形式表達(dá)，由于產(chǎn)生了表達(dá)為融合蛋白的Env肽，其中每種融合蛋白均是由各自的Env肽和LacZ蛋白(β-半乳糖苷酶)組成的。然后，使這些表達(dá)產(chǎn)物與大量的取自AIDS病患者、無(wú)癥狀HIV攜帶者(AC)和AIDS病相關(guān)復(fù)征(ARC)患者的血清進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，由此確定Env蛋白的表位區(qū)，表位區(qū)即對(duì)血清表現(xiàn)出強(qiáng)的特異反應(yīng)性的區(qū)域。
程序Ⅱ.大量生產(chǎn)Gag-Env融合蛋白，確定與HIV抗體的反應(yīng)性對(duì)編碼含上述程序Ⅰ所確定的表位區(qū)的部分Env肽的各種env基因片段以及編碼Gag肽的各種gag基因片段來(lái)說(shuō)，進(jìn)行下述方法，以確定就改善產(chǎn)率和抗原性而言是理想的Gag-Env融合蛋白。更詳細(xì)地說(shuō)，關(guān)于env基因片段與gag基因片段的各種組合而言，將env基因片段融合到gag基因片段的下游，在啟動(dòng)子的調(diào)控下，env基因以與gag基因嵌合的形式表達(dá)，由此得到表達(dá)為Gag-Env融合蛋白的Env肽。
對(duì)于大量生產(chǎn)得到的Gag-Env融合蛋白，測(cè)定其與HIV抗體的反應(yīng)性。
程序Ⅲ.驗(yàn)證具有Gag蛋白完整氨基酸序列的Gag蛋白p55的反應(yīng)性與上述程序Ⅱ的方法相同，生產(chǎn)出Gag蛋白p55和Gag肽p17、p24和p15，使它們分別與HIV攜帶者的血清進(jìn)行免疫學(xué)反應(yīng)，并就與血清的反應(yīng)性相互進(jìn)行比較，從而證明p55在反應(yīng)性和HIV檢測(cè)比兩方面活性最高。
下面對(duì)實(shí)施上述程序Ⅰ-Ⅲ的技術(shù)進(jìn)行說(shuō)明。
(1)制備包含gag基因和/或HIV的env基因的cDNA片段可利用gag基因和env基因的各自完整區(qū)域或片段。把完整區(qū)域或片段插入進(jìn)一高表達(dá)媒介中，使得插入的讀碼與媒介讀碼相匹配。由于HIV基因組是由RNA組成的，因此當(dāng)用重組體DNA技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)時(shí)，有必要將上述HIV基因轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)DNA(cDNA)片段。cDNA可由整合到宿主細(xì)胞染色體的前病毒基因組制成或由克隆的外染色體環(huán)形DNA制成。另外，cDNA片段可由cDNA庫(kù)篩選而得，所說(shuō)的cDNA庫(kù)是按常規(guī)方法，利用從HIV病毒顆粒中提取的RNA基因組為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下建立的。但是在上述制備cDNA片段的方法中，必須直接處理高度危險(xiǎn)的HIV。從防止危害生物的觀點(diǎn)看，直接處理HIV是不可取的。因此，為了避免在制備cDNA片段時(shí)由HIV引起的生物危害問(wèn)題，同時(shí)還能節(jié)省人力，推薦利用已知已鑒定的HIV基因的cDNA克隆。關(guān)于HIV基因研究的情況，如基因克隆、制作限制圖譜以及核苷順序的測(cè)定，世界各地的研究者已發(fā)表了許多報(bào)告。為了保證安全和效率，希望能利用這些已公開(kāi)的研究成果。例如，可以利用質(zhì)粒如pNL3-1、pNL3-2和pNL4-3，它們均是HIV-1前病毒基因組克隆，并可由美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)購(gòu)得(關(guān)于pNL3-1和pNL3-2，可參見(jiàn)JournalofVirology，59，p284-291，1986，關(guān)于pNL4-3，請(qǐng)看GenbankdatafileHIVNL43)。另外，如使用pNL4-3，已有培養(yǎng)并保藏的含各種載有HIV-1基因組部分區(qū)域的質(zhì)粒的微生物。更詳細(xì)地說(shuō)，這些保藏的微生物有大腸桿菌(E.coli)JM109/pCV91，其質(zhì)粒pCV91含gag-pol融合基因中心區(qū)域(保藏在日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)FERMBP3195)，E.coliJM109/pNLH122，所含質(zhì)粒pNLH122具有5′1/2gag基因(保藏于日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)FERMBP-3196)，E.coliJM109/pTG581，其質(zhì)粒pTG581含完整gag基因區(qū)(保藏在日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)FERNBP-3927)，E.coliJM109/pNS210，其質(zhì)粒pNS210含完整gag基因(保藏在日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)FERNBP-3920)，E.coliJM109/pTE192，其質(zhì)粒pTE192含有編碼Env蛋白Env(512-611)區(qū)域的cDNA(保藏在日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)FERMBP-3925)，E.coliJM109/pGE33，其質(zhì)粒含負(fù)責(zé)編碼由Gag(308-406)和Env(512-611)構(gòu)成的Gag-Env融合蛋白的cDNA(保藏在日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)FERMBP-3923)?？梢园凑諅鹘y(tǒng)方法用上述克隆制備cDNA片段。例如，用限制酶切割上述克隆，再通過(guò)酚提取、氯仿處理、醇沉淀等技術(shù)提純，從而制得所要求的DNA片段。用于切割DNA的限制酶可以根據(jù)每種克隆的限制圖譜適當(dāng)加以選擇。
(2)gag基因、env基因和gag-env融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)成，插入有這些質(zhì)料的轉(zhuǎn)化體的制備將前述方法制備而成的HIV基因cDNA片段按照傳統(tǒng)方法，如利用T4DNA連接酶融合到一質(zhì)?；蛞幻浇槲锏母弑磉_(dá)基因上，以便直接表達(dá)克隆基因，由此構(gòu)成了HIV基因表達(dá)質(zhì)粒。在本發(fā)明中，使用術(shù)語(yǔ)“質(zhì)粒”是為了說(shuō)明上的方便，實(shí)質(zhì)上，廣義的指表達(dá)HIV基因的復(fù)制子。
因此，為構(gòu)成這些表達(dá)質(zhì)粒，可使用傳統(tǒng)和商購(gòu)的表達(dá)媒介物。適用的媒介物的實(shí)例包括腸細(xì)菌族的質(zhì)粒媒介物pSN508系列(見(jiàn)US4，703，005)，來(lái)源于酵母的質(zhì)粒媒介物pJM105(見(jiàn)日本特許公開(kāi)62-286930說(shuō)明書(shū))，來(lái)源于酵母的質(zhì)粒媒介物pBH103系列(見(jiàn)日本特許公開(kāi)63-22098說(shuō)明書(shū))，稀釋了的水痘病毒媒介物(見(jiàn)日本特許公開(kāi)53-41202)，稀釋了的Marek′s病病毒媒介物(見(jiàn)EP公開(kāi)號(hào)334530)，來(lái)源于大腸埃希桿菌(Escherichiacoli)的質(zhì)粒媒介物，如pUR290系列，包括pUR290、291和292(見(jiàn)EMBOJournal，2，P1791-1794，1983)，pSN5182(見(jiàn)JournalofBacteriology，157，P909-917，1984)，以及pT7系列(見(jiàn)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA，82，P1074-1078，1985)。
在構(gòu)成表達(dá)媒介物時(shí)，重要的是在一強(qiáng)啟動(dòng)子的調(diào)控下插入和連接上述基因，并使該基因大量地與一確能表達(dá)的基因融合。例如，當(dāng)采用上述pUR290系列媒介物時(shí)，最好將上述基因融合到lacZ基因的下游。當(dāng)用pSN5182時(shí)，所說(shuō)的基因最好融合到pstS基因的下游。當(dāng)用上述pT7系列中的pT7-7時(shí)，所說(shuō)的基因最好克隆進(jìn)T7啟動(dòng)子下游的多克隆位點(diǎn)。
pT7-7特別適用于表達(dá)HIVgag基因、env基因和gag-env融合基因，它的T7啟動(dòng)子是一種很強(qiáng)的啟動(dòng)子，因此，本發(fā)明特別優(yōu)選使用pT7-7。
在基因插入和連接過(guò)程中，必需用BAP(細(xì)菌堿性磷酸酶)預(yù)處理經(jīng)限制酶切割的質(zhì)粒以脫去磷酸基，從而防止其自身連接，同時(shí)還必須使質(zhì)粒中基因的讀碼與所插入的基因讀碼彼此匹配以保證有效的翻譯。這就是說(shuō)，按照使HIV基因讀碼與高表達(dá)基因讀碼相匹配的方式把HIV基因插入進(jìn)一高表達(dá)基因，從而保證大量表達(dá)HIV基因。通過(guò)常規(guī)方法，利用酶如限制酶、核酸酶Bal31和mungbeen核酸酶可以實(shí)現(xiàn)上述讀碼匹配。
為了得到轉(zhuǎn)化體，將上述構(gòu)成的表達(dá)媒介物引入一適宜的宿主細(xì)胞，所說(shuō)的宿主細(xì)胞應(yīng)從能將基因復(fù)制和表達(dá)在表達(dá)媒介物上的敏感宿主細(xì)胞中選擇，特別是從容易引入且易于檢測(cè)構(gòu)成的表達(dá)媒介物的細(xì)胞中選擇。例如，當(dāng)利用上述pSN系列媒介物作表達(dá)媒介物時(shí)，大腸埃希桿菌菌株C75(保藏在日本發(fā)酵研究院，保藏號(hào)10191)是優(yōu)選的宿主細(xì)菌，因?yàn)橥ㄟ^(guò)插入上述媒介物獲得的轉(zhuǎn)化體可以以其抗藥性為標(biāo)識(shí)物而加以篩選。當(dāng)用pUR290系列和PT7系列媒介物時(shí)，可采用大腸埃希桿菌菌株UT481(見(jiàn)JournalofBacteriology，163(1)，P376-384，1985)、大腸埃希桿菌菌株BL21(DE3)(見(jiàn)JournalofMolecularBiology，189(1)，P113-130，1986)、大腸埃希桿菌菌株JM109(DE3)(見(jiàn)JournalofMolecularBiology，189(1)，P113-130，1986;Gene，33(1)，P103-119，1985)，以及大腸埃希桿菌菌株JM103(見(jiàn)NucleicAcidsResearch，9，P309-321，1981)。優(yōu)選采用上述菌株的宿主細(xì)胞，因?yàn)橛擅浇轶w引入而得到的轉(zhuǎn)化體可以以抗氨芐青霉素為標(biāo)識(shí)物加以篩選。
可以用常規(guī)方法如氯化鉀法把表達(dá)媒介物引入上述宿主細(xì)胞(見(jiàn)JournalofMolecularBiology，53，P154-162，1970)。從對(duì)上述標(biāo)識(shí)物呈陽(yáng)性的菌落中篩選出含引入gag基因、env基因或gag-env融合基因表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體，然后，從篩選出的轉(zhuǎn)化體菌落中提取出表達(dá)媒介物DNA，用限制酶消化，再做瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)測(cè)定插入的DNA片段尺寸。把經(jīng)證明存在有基因DNA片段的菌落作為轉(zhuǎn)化體克隆來(lái)表達(dá)HIV基因。(3)大量生產(chǎn)LacZ(β-半乳糖苷酶)-Env融合蛋白按照(2)給出的方法可以大量表達(dá)出LacZ-Env融合蛋白。例如，可以通過(guò)把負(fù)責(zé)編碼下(5)所示各種Env肽的env基因片段(見(jiàn)表1)克隆進(jìn)pUR290、pUR291或pUR292來(lái)大量表達(dá)融合蛋白。關(guān)于LacZ-Env融合蛋白，β-半乳糖苷酶有可能與一些無(wú)癥狀HIV攜帶者和末感染人體的血清發(fā)生反應(yīng)，并顯示出假陽(yáng)性。但是，例如如果對(duì)試驗(yàn)血清進(jìn)行預(yù)處理使抗LacZ抗體預(yù)吸附在帶有LacZ蛋白的血清中，或者用抗LacZ抗體掩蔽融合蛋白上的LacZ部分，那么上述假陽(yáng)性反應(yīng)就可能消除，因此，可以用LacZ-Env融合蛋白作為診斷AIDS病的抗原。
(4)驗(yàn)證轉(zhuǎn)化抗體克隆上gag基因，env基因和gag-env融合基因的表達(dá)通過(guò)按常規(guī)方法如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和Western印跡法分析轉(zhuǎn)化體克隆粗提物可以對(duì)上(2)獲得的轉(zhuǎn)化體克隆基因表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。可以按下述方法制備粗提物用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體后，通過(guò)低速離心分離收集細(xì)菌細(xì)胞，用十二烷基硫酸鈉(SDS)和2-巰基乙醇處理，接著高速離心分離，收集上清液。把上清液進(jìn)行SDS-PAGE，使之分成多個(gè)蛋白質(zhì)帶。分開(kāi)的蛋白質(zhì)帶用CBB(考馬斯亮蘭)著色以驗(yàn)證是否已經(jīng)大量表達(dá)。當(dāng)采用Western印跡法時(shí)，可以利用選出的各種不同商購(gòu)材料，按下述常規(guī)方法步驟來(lái)驗(yàn)證是否已大量表達(dá)上述粗提物進(jìn)行DSD-PAGE，將分離開(kāi)的蛋白質(zhì)帶借助轉(zhuǎn)印跡細(xì)胞轉(zhuǎn)移到硝基纖維膜或聚偏二氟乙烯膜上。將所說(shuō)的膜浸漬在明膠溶液或脫脂乳溶液中，阻滯該膜。然后，例如，當(dāng)膜上待檢驗(yàn)的樣品是HIV基因表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，首先讓它們與無(wú)癥狀HIV攜帶者的血清進(jìn)行反應(yīng)，然后洗滌試樣，再讓它們與過(guò)氧化物酶共軛的抗人體IgG抗體進(jìn)行第二次反應(yīng)。之后，再次洗滌試樣，然后用過(guò)氧化氫和著色劑將它們著色，檢測(cè)與HIV攜帶者血清有特異反應(yīng)的蛋白質(zhì)帶，由此驗(yàn)證上述克隆上HIVgag基因、env基因和gag-env融合基因的表達(dá)。
(5)確定包含HIV抗體反應(yīng)表位的局部Env肽區(qū)域例如，可以利用上述(3)所說(shuō)的LacZ-Env融合蛋白反應(yīng)性，通過(guò)上述(4)所說(shuō)的Western印跡法進(jìn)行測(cè)定。按照該方法，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在圖2-(1)至2-(3)所示的Env蛋白完整氨基酸序列上對(duì)HIV抗體反應(yīng)的局部區(qū)域包括下述氨基酸序列區(qū)Env(14-244)，Env(14-437)，Env(14-611)，Env(175-363)，Env(224-510)，Env(244-611)，Env(244-434)，Env(244-437)，Env(244-772)，Env(244-826)，Env(437-510)，Env(437-611)，Env(437-722)，Env(437-826)，Env(512-611)，Env(512-699)，Env(610-722)，Env(610-826)和Env(721-826)。
在上述氨基酸序列中，下述序列對(duì)HIV抗體表現(xiàn)出特別強(qiáng)的反應(yīng)性，并被確認(rèn)為是含表位的Env蛋白Env(14-244)，Env(244-434)，Env(244-510)，Env(512-611)，
Env(512-699)，Env(610-722)和Env(721-826)。
在本發(fā)明中，從作為本發(fā)明HIV抗原要求Gag-Env融合蛋白具有良好的抗原性和產(chǎn)率的角度看，在上述7個(gè)氨基酸序列的表位區(qū)中，由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少一部分，即包含至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)的表位的部分是可利用的。Env肽局部中所含的表位最好是由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
(6)確定用于構(gòu)成Gag-Env融合蛋白的優(yōu)選Gag肽在Gag-Env融合蛋白中，用Gag肽而非LacZ作為有效生產(chǎn)高產(chǎn)率Env肽的載體。因此，對(duì)于Gag肽來(lái)說(shuō)，產(chǎn)率比抗原更重要。為此，在按照如上(2)所述方法構(gòu)成gag基因表達(dá)媒介物后，按與上(4)相同的SDS-PAGE方法來(lái)測(cè)定Gag肽的產(chǎn)率。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)下列氨基酸序列所代表的Gag肽能夠成功地用來(lái)生產(chǎn)高產(chǎn)率Gag-Env融合蛋白Gag(1-119)，Gag(1-132)，Gag(1-154)，Gag(1-210)，Gag(1-309)，Gag(1-405)，Gag(1-406)，Gag(1-437)，Gag(1-500)，Gag(121-405)，Gag(121-406)，Gag(121-437)，Gag(308-405)，Gag(308-406)，Gag(308-435)，Gag(308-436)，Gag(308-437)和Gag(308-500)。
其中，Gag(308-437)是富集在大腸桿菌細(xì)胞中最多的氨基酸序列之一。因而其可用來(lái)確保本發(fā)明的Gag-Env融合蛋白高產(chǎn)。如上所述，在本發(fā)明中，Gag-Env融合蛋白上的Gag肽包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)，優(yōu)選至少30個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)，最優(yōu)選至少70個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。作為Gag-Env融合蛋白上的Gag肽，最優(yōu)選的肽是由Gag(308-406)或Gag(308-437)所代表的氨基酸序列。
(7)Gag-Env融合蛋白的生產(chǎn)優(yōu)選的Gag-Env融合蛋白是由上述(6)中選出的一種Gag肽和上述(5)中選出的一種Env肽組成的。表達(dá)該融合蛋白的質(zhì)粒如可按下述方法構(gòu)成根據(jù)上述(1)和(2)的方法，將負(fù)責(zé)編碼上(5)所述一種Env肽的基因插入一僅表達(dá)Gag肽，即上(6)中所述Gag肽的質(zhì)粒中，或者插入如用gag-pol融合基因制成的含gag基因的質(zhì)粒中。gag基因與env基因的融合是以插入的env基因讀碼與表達(dá)質(zhì)粒中g(shù)ag基因讀碼相匹配的方式進(jìn)行的。可按傳統(tǒng)方法，利用酶，如限制酶、核酸酶Bal31和mungbeen核酸酶實(shí)現(xiàn)上述融合。在操作中，Gag肽和Env肽可以通過(guò)由幾個(gè)氨基酸殘基組成的接合鏈融合在一起。由于這樣操作的結(jié)果，所說(shuō)的接合鏈通常會(huì)連接在融合蛋白中，這是本領(lǐng)域所公知的。但是這并不會(huì)有害于本發(fā)明Gag-Env融合蛋白的抗原性。因此，表達(dá)“由Gag肽和Env肽組成的Gag-Env融合蛋白”和與之類(lèi)似的表達(dá)應(yīng)解釋為包括由Gag肽、Env肽和一接合鏈(如果需要存在的話)組成的Gag-Env融合蛋白?？梢园瓷?4)所述同樣的方法來(lái)驗(yàn)證是否大量表達(dá)。
(8)通過(guò)培養(yǎng)已證明能進(jìn)行g(shù)ag基因或gag-env融合基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化體來(lái)生產(chǎn)Gag蛋白或Gag-Env融合蛋白
例如，可以采用下述步驟為了大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)，應(yīng)制備待培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體種菌，當(dāng)轉(zhuǎn)化體如為大腸桿菌時(shí)，先在LB培養(yǎng)基中于30°-40℃培養(yǎng)12-35小時(shí)直到大腸桿菌的細(xì)胞密度達(dá)到2×109-8×109細(xì)胞/毫升。然后，取1-10升該種菌接種在1000升新鮮的LB培養(yǎng)基中，分兩步培養(yǎng)，即前期培養(yǎng)和后期培養(yǎng)。前期培養(yǎng)的目的是使種菌細(xì)胞增殖和復(fù)制表達(dá)媒介物，該培養(yǎng)在10°-40℃下進(jìn)行1-24小時(shí)，最好在15°-37℃下進(jìn)行2-12小時(shí)。例如，如果是大腸桿菌，當(dāng)其細(xì)胞密度達(dá)到OD600nm為0.1-2.0時(shí)，中斷前期培養(yǎng)。前期培養(yǎng)中止后，將得到的培養(yǎng)物進(jìn)行后期培養(yǎng)。后期培養(yǎng)是在嚴(yán)格控制的條件下進(jìn)行的。所說(shuō)的條件是能夠保證克隆在表達(dá)媒介中的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，同時(shí)還可以避免翻譯所得基因產(chǎn)物受宿主細(xì)胞中蛋白分解酶的作用而無(wú)規(guī)分解和失活。后期培養(yǎng)的溫度最好比前期的低，可在10°-40℃下培養(yǎng)1-40小時(shí)，最好是15°-37℃ 3-35℃。另外，考慮到所用表達(dá)媒介的特性，為了促進(jìn)和誘導(dǎo)表達(dá)，如培養(yǎng)基中磷酸鹽不足時(shí)，可以在后期培養(yǎng)一開(kāi)始就向培養(yǎng)物中添加誘導(dǎo)劑[如IPTG(異丙基β-硫代半乳糖吡喃糖苷)]等。通過(guò)上述兩步培養(yǎng)，Gag蛋白或Gag-Env融合蛋白一般可以以1-50毫克/升培養(yǎng)物的產(chǎn)率生成。在上述Gag肽和Env肽的各種組合中，能以高產(chǎn)率生產(chǎn)并表現(xiàn)出極高抗原性的融合蛋白是分別有下述氨基酸序列的Gag-Env融合蛋白Gag(308-406)-Env(512-611)，Gag(308-437)-Env(512-611)和Gag(308-406)-Env(512-699)。
(9)以高產(chǎn)率生產(chǎn)的Gag蛋白和Gag-Env融合蛋白的提純可以綜合使用常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)提純。例如，通過(guò)適當(dāng)組合下述方法可以提純蛋白質(zhì)(a)利用沉淀劑、離心和過(guò)濾等收集轉(zhuǎn)化細(xì)胞;(b)通過(guò)超聲處理，壓力/真空處理和均質(zhì)器等破碎轉(zhuǎn)化細(xì)胞，制備粗提物，(c)用硅酸或活性碳吸附和解吸，鹽析，用有機(jī)溶劑沉淀等進(jìn)行提純，并且通過(guò)超離心、柱色譜、電泳等分提達(dá)到高純度;和(d)通過(guò)用硅酸或活性碳吸附和解吸及密度梯度離心(見(jiàn)日本特許公開(kāi)63-297說(shuō)明書(shū))分提進(jìn)行提純。
因此，按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)基本純的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原的方法，其中Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽構(gòu)成的，該方法包括(a)將第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列連接到一可復(fù)制的表達(dá)媒介上，得到能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的第一個(gè)重組DNA分子，該分子包括所說(shuō)的表達(dá)媒介物和所說(shuō)的插入在媒介上的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列，第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼包含由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列的Gag肽，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值系圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào);
(b)將第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列連接到第一個(gè)重組DNA分子上的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸的下游，使第二個(gè)序列融合在第一個(gè)序列上，第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼包含至少一部分由Env(512-699)所代表的氨基酸序列的Env肽，該部分包括至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)的表位，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào);
由此獲得了第二個(gè)能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的重組DNA分子，該分子包括表達(dá)媒介，第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列和融合在第一個(gè)序列下游的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列;
(c)用第二個(gè)重組DNA分子將原核細(xì)胞或真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化體;
(d)從未轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中選擇出轉(zhuǎn)化體;
(e)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體使之產(chǎn)生含有Gag-Env融合蛋白的HIV抗原，其中Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽組成的;
(f)從培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體中分離出含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原。
第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列最好負(fù)責(zé)編碼由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
上述第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼包含有由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列的Gag肽。第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼下述Gag肽，即優(yōu)選包含Gag(308-437)所代表氨基酸序列中的至少30個(gè)，更優(yōu)選至少50個(gè)，最優(yōu)選至少70個(gè)相鄰排列的氨基酸序列的Gag肽。最好是，第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含Gag(308-406)或Gag(308-437)代表的氨基酸序列的Gag肽。
從提高Gag-Env融合蛋白抗原性和產(chǎn)率的角度考慮，要求第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含至少一部分Env(512-699)所代表的氨基酸序列的Env肽，所說(shuō)的部分至少包括一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)的表位。第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)，更好是至少10，最好是至少15個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
表達(dá)媒介優(yōu)選pT7系列或pUR290系列媒介，最好是pT7-7。
本發(fā)明方法中所得到的表達(dá)媒介可以以裝在密封小容器如安瓿或小瓶中的形式，或以結(jié)合進(jìn)宿主細(xì)胞的形式提供。
按照本發(fā)明的又一方面，提供了一種能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的重組DNA分子，該分子包含插入了第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列的表達(dá)媒介及融合在第一個(gè)序列下游的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列，第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含有由Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10相鄰排列的氨基酸序列的Gag肽，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均系圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)，第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含有至少一部分由Env(512-699)所代表的氨基酸序列的Env肽，所說(shuō)的部分包括至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)活性的表位，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值系圖2-(1)至2-(3)所示HIV的Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)。
第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列最好負(fù)責(zé)編碼由Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
上述那些與生產(chǎn)本發(fā)明HIV抗原中Gag-Env融合蛋白方法有關(guān)的形式可以作為本發(fā)明重組DNA分子上第一和第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列的最佳形式。
表達(dá)媒介優(yōu)選由pT7系列或pUR290系列媒介衍生而來(lái)的那些媒介。最好的表達(dá)媒介是pT7-7。
可以將用本發(fā)明重組DNA分子大量生產(chǎn)而得的Gag蛋白和Gag-Env融合蛋白以液體或干粉形式，或以吸附在濾紙或膜上的形式裝入并密封在一小容器如安瓿或小瓶中。當(dāng)本發(fā)明的抗原為液體時(shí)，可按預(yù)定的體積取出合理使用;當(dāng)抗原為干物時(shí)，先將抗原溶解于蒸餾水中復(fù)水，使體積達(dá)到干燥前的原體積，然后取出預(yù)定的體積數(shù)使用;當(dāng)抗原吸附在濾紙或膜上時(shí)，用適當(dāng)?shù)娜芤核峡乖笤偈褂谩?br> 本發(fā)明還提供了一種通過(guò)免疫反應(yīng)診斷后天免疫缺陷綜合癥的試劑，該試劑含有免疫學(xué)反應(yīng)有效量的本發(fā)明的含Gag-Env融合蛋白和/或Gag蛋白的HIV抗原。
本發(fā)明還提供了一種后天免疫缺陷綜合癥疫苗，該疫苗包括有效免疫量的本發(fā)明的含Gag-Env融合蛋白和/或Gag蛋白的HIV抗原及至少一種藥學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或賦形劑。
對(duì)成人一次給藥的疫苗劑量一般為0.001-1000微克。
結(jié)合下述實(shí)例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)例不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
實(shí)例1步驟1(能夠表達(dá)LacZ-Env融合蛋白的質(zhì)粒的構(gòu)成)首先用EcoRⅠ和Xhol消化HIV-1前病毒DNA克隆pNL4-3(見(jiàn)JournalofVirology，59，P284-291，1986;GenBankdatafileHIVNL43;克隆pNL4-3購(gòu)于美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生院)，然后做瓊脂糖凝膠電泳，由此得到3.1kbDNA片段[根據(jù)GenBankdatafileHIVNL43，核苷酸編號(hào)5743-8887]。將得到的DNA片段克隆進(jìn)已經(jīng)過(guò)EcoRⅠ和SolⅠ消化及BAP處理的質(zhì)粒pHSG398中，得到質(zhì)粒pNS210。將獲得的質(zhì)粒pNS210用KpnⅠ消化，再做瓊脂糖凝膠電泳，由此得到2.55kbDNA片段。將收集的DNA片段用HaeⅢ消化，然后再做瓊脂糖凝膠電泳，由此得到大約570bHeaⅢDNA片段[根據(jù)GenBankdatafileHIVNL43，核苷酸編號(hào)7834-8400]。將所得DNA片段克隆進(jìn)行已經(jīng)用HincⅡ消化和BAP處理過(guò)的質(zhì)粒pUR9中，得到質(zhì)粒pEH22。將所得質(zhì)粒pEH22用BamHⅠ和PstⅠ消化，得到大約580bDNA片段，再將所得DNA片段克隆進(jìn)已用BamHⅠ和PstⅠ切割過(guò)的質(zhì)粒pUR292中(見(jiàn)EMBOJournal，2，P1791-1794，1983)，由此得到質(zhì)粒pAS182(見(jiàn)表1)。用HindⅢ消化所得質(zhì)粒pAS182，然后使之自身連接在一起，由此得到質(zhì)粒pAS192(見(jiàn)表1)。用所得質(zhì)粒pAS182和pAS192分別表達(dá)LacZ-Env(512-699)和LacZ-Env(512-611)融合蛋白。除了上述質(zhì)粒外，還制成了表達(dá)各種LacZ-Env融合蛋白的其它15種質(zhì)粒(見(jiàn)表1)。
步驟2(大量生產(chǎn)LacZ-Env融合蛋白)將表1給出的包括質(zhì)粒pAS182和pAS192在內(nèi)的17種表達(dá)媒介引入大腸桿菌菌株JM103(見(jiàn)Nucleic Acids Research，9，P309-321，1981)。把所得大腸桿菌轉(zhuǎn)化體分別接種在2毫升含20微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到培養(yǎng)物。取每種培養(yǎng)物0.05-0.1毫升接種到5毫升含20微克/毫升氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃搖振培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到OD600nm0.5時(shí)，把IPTG加到培養(yǎng)物中至最終濃度為1mM，從而誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。該培養(yǎng)物在37℃下?lián)u振培養(yǎng)5小時(shí)，然后，通過(guò)離心從1.5毫升培養(yǎng)物中收獲大腸桿菌細(xì)胞，將收獲的細(xì)胞懸浮在120微升20mM Tris-HCl(PH7.5)中，得到一懸濁液。把60微升SDS-PAGE試樣緩沖劑加到懸濁液中，混合均勻，將混合物在100℃下加熱3分鐘，并以12，000rpm轉(zhuǎn)速離心5分鐘，由此得到上清液。取7.5微升所得上清液加到SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行分離。用CBB將凝膠著色以驗(yàn)證融合蛋白的形成。如此，可以證明大量產(chǎn)生了17種LacZ-Env融合蛋白。
步驟3(通過(guò)HIV攜帶者血清中的Env抗體識(shí)別表位區(qū)，由此鑒定表位區(qū))采用與步驟2基本相同的方法，通過(guò)SDS-PAGE把已經(jīng)大量生成了17種LacZ-Env融合蛋白(見(jiàn)表1)和LacZ蛋白的大腸桿菌中的所有蛋白質(zhì)分離開(kāi)，并電印跡(electroblotted)至一聚偏二氟乙烯膜上，印跡用脫脂乳(由美國(guó)DifcoLaboratories得到)阻滯，并分別與血清A、B和C反應(yīng)，這三個(gè)血清取自三例HIV攜帶者(無(wú)癥狀HIV攜帶者)并用含20mMTris-HCl(PH7.5)、150mMNaCl和0.05%吐溫20的緩沖劑稀釋至100倍。在與血清反應(yīng)前，已確認(rèn)這些血清均不與LacZ反應(yīng)。以過(guò)氧化物酶共軛的山羊抗人體IgG(Bio-RadLaboratories，美國(guó))為第二抗體。通過(guò)分析Western印跡結(jié)果(見(jiàn)表2)，分別確定了由血清A、B和C中所含Env抗體認(rèn)別的2、3和5個(gè)表位區(qū)(見(jiàn)表3)。能與血清A、B和C都發(fā)生反應(yīng)的融合蛋白是含Env(512-611)氨基酸序列和/或Env(721-826)氨基酸序列的LacZ-Env融合蛋白。
步驟4(對(duì)LacZ-Env(512-611)和LacZ-Env(721-826)融合蛋白作為診斷用抗原的評(píng)價(jià))
為了證明LacZ-Env(512-611)和LacZ-Env(721-826)融合蛋白可作為診斷用抗原，采用與步驟3基本相同的方法，用41例HIV攜帶者(具體地，36個(gè)無(wú)癥狀HIV攜帶者，1個(gè)ARC和4個(gè)AIDS病患者)的血清作了Western印跡試驗(yàn)。該試驗(yàn)結(jié)果與步驟3的3個(gè)無(wú)癥狀HIV攜帶者的試驗(yàn)結(jié)果一起列在表4中。LacZ-Env(512-611)與44例HIV攜帶者的血清均發(fā)生反應(yīng)(100%)，而LacZ-Env(721-826)僅與其中35個(gè)有反應(yīng)(79%)。據(jù)此，認(rèn)為Env(512-611)可作為診斷用抗原。Env(721-826)區(qū)不能單獨(dú)用于診斷，可以與其它抗原結(jié)合使用，如與Env(512-611)區(qū)結(jié)合使用。由于39例無(wú)癥狀HIV攜帶者中僅有2例血清與LacZ(β-半乳糖苷酶)發(fā)生微弱反應(yīng)，因此，把LacZ-Env融合蛋白用于診斷目的是不理想的。但是，如果按如上所述的傳統(tǒng)方法將受試血清預(yù)處理，把抗LacZ抗體預(yù)吸附在含LacZ蛋白的血清中，LacZ-Env融合蛋白則可用于診斷目的。
步驟5(在T7啟動(dòng)子控制下構(gòu)成能表達(dá)Env蛋白的質(zhì)粒)將合成的低聚核苷酸5′TATGGCTAAG3′和5′AATTCTTAGCCA3′退火并插入質(zhì)粒pT7-7中，該質(zhì)粒是pT7系列(見(jiàn)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesUSA，82，P1074-1078，1985)中的一種并已用NdeⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ消化過(guò)，由此得到質(zhì)粒pT7-7-1。質(zhì)粒pT7-7-1為這樣一種質(zhì)粒即由于pT7-7上有多克隆位點(diǎn)，在NdeⅠ位點(diǎn)和EcoRⅠ位點(diǎn)之間插入了一腺嘌呤殘基(A)的核苷酸。用BamHⅠ和PstⅠ消化質(zhì)粒pT7-7-1，并將由BamHⅠ和PstⅠ消化質(zhì)粒pEH22(見(jiàn)步驟1)而得到的約580b片段克隆進(jìn)質(zhì)粒pT7-7-1中，由此得到質(zhì)粒pTE182(見(jiàn)表5)。之后，用HindⅢ消化如此得到的質(zhì)粒pTE182，并使之自身連接成為質(zhì)粒pTE192(見(jiàn)表5)。質(zhì)粒pNS210(見(jiàn)步驟1)用NdeⅠ消化，再進(jìn)一步用BglⅡ部分消化，由此得到NdeⅠ-BglⅡ片段(根據(jù)GenBankdatafileHVNL43，核苷酸編號(hào)6399-7611)。將如此所得NdeⅠ-BglⅡ片段克隆進(jìn)已用NdeⅠ和BamHⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pUR292(見(jiàn)步驟1)中，得到質(zhì)粒pNB21。將所得質(zhì)粒pNB21用BglⅡ和ClaⅠ消化得到約0.6kb片段。把該片段克隆進(jìn)已用BamHⅠ和ClaⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pT7-7中，得到質(zhì)粒pTE311(見(jiàn)表5)。用所得質(zhì)粒pTE182、pTE192和pTE311分別表達(dá)Env(512-699)、Env(512-611)和Env(244-437)。在T7啟動(dòng)子控制下能表達(dá)Env蛋白的質(zhì)粒列在表5中。大腸桿菌BL21(DE3)用作表達(dá)宿主。該菌細(xì)胞的培養(yǎng)和蛋白質(zhì)分析方法基本上與步驟2和3所述方法相同。由質(zhì)粒pTE182、pTE192和pTE311所表達(dá)的Env蛋白與總的細(xì)胞蛋白之比值僅為1-2%。這說(shuō)明既使從中選擇一種質(zhì)粒，以可接受的產(chǎn)率表達(dá)Env蛋白也是很困難的。
步驟6(在T7啟動(dòng)子控制下能表達(dá)Gag蛋白的質(zhì)粒的構(gòu)成)用NdeⅠ和BclⅠ消化質(zhì)粒pTG591(見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289說(shuō)明書(shū))得到大約1.6kb片段。將該片段克隆在均已用NdeⅠ和BamHⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pT7-7和pTE-3a(見(jiàn)MethodeinEnzymology，185，P60-89，1990)上，由此獲得質(zhì)粒pTG581和pEG581(見(jiàn)表6)。用這些質(zhì)粒表達(dá)gag基因(p55)。
用ApaⅠ和ClaⅠ分別消化質(zhì)粒pTG210、pTG110和pTG591(見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289說(shuō)明書(shū))，再用T4DNA聚合酶處理，使之自身連接起來(lái)，由此分別獲得質(zhì)粒pTG210-2、pTG110-2和pTG561(見(jiàn)表6)。這些質(zhì)粒能分別表達(dá)Gag(308-405)、Gag(121-405)和Gag(1-405)。在T7啟動(dòng)子控制下能表達(dá)Gag蛋白的質(zhì)粒列在了表6中。大腸桿菌BL21(DE3)用作表達(dá)宿主，其細(xì)胞培養(yǎng)和所得蛋白質(zhì)分析基本按步驟2和3的方法進(jìn)行。
步驟7(在T7啟動(dòng)子控制下能表達(dá)Gag-Env融合蛋白的質(zhì)粒的構(gòu)成)質(zhì)粒pAS192(見(jiàn)步驟1)用BamHⅠ消化，用T4DNA聚合酶處理，再用ClaⅠ消化，隨后做瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠上回收312b片段。將該片段克隆在質(zhì)粒pTG210(見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289)上得到質(zhì)粒pGE33(見(jiàn)表7)，其中質(zhì)粒pTG210是已用ApaⅠ消化，T4DNA聚合酶處理及ClaⅠ消化過(guò)的。把所得質(zhì)粒pGE33用HindⅢ消化，再做瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠中回收約600b片段。該片段克隆在質(zhì)粒pTG110和pTG591(見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289說(shuō)明書(shū))上，其中所說(shuō)的質(zhì)粒均已用HindⅢ消化和BAP處理過(guò)，由此得到質(zhì)粒pGE1133和pGE5633(見(jiàn)表7)。用所得質(zhì)粒pGE33、pGE1133和pGE5633分別表達(dá)融合蛋白Gag(308-406)-Env(512-611)和Gag(121-406)-Env(512-611)和Gag(1-406)-Env(512-611)。
質(zhì)粒pT7-7-1(見(jiàn)步驟5)多克隆位點(diǎn)中的BamHⅠ位和HindⅢ位之間的核苷酸序列用質(zhì)粒pUR292(見(jiàn)步驟1)的序列代替，得到質(zhì)粒pT7-29-1。將所得pT7-29-1用BamHⅠ消化，T4DNA聚合酶處理，并使之自身連接在一起，由此獲得質(zhì)粒pT7-29-14。上述質(zhì)粒pGE33用HindⅢ消化得到0.6kb片段，將此片段克隆在已用HindⅢ消化和BAP處理過(guò)的質(zhì)粒pT7-29-14上，由此得到質(zhì)粒pGE2133。
質(zhì)粒pAS182(見(jiàn)步驟1)用BamHⅠ和ClaⅠ消化，得到大約590b片段。將此片段克隆在均已用BamHⅠ和ClaⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pGE2133和pGE1133上，得到質(zhì)粒pGE218和pGE118(見(jiàn)表7)。質(zhì)粒pGE218和pGE118分別表達(dá)融合蛋白Gag(308-406)-Env(512-699)和Gag(121-406)-Env(512-699)。
質(zhì)粒pT7-7(見(jiàn)步驟5)用BglⅡ消化，T4DNA聚合酶處理，并自身連接，得到質(zhì)粒pT7-7(BglⅡx)。質(zhì)粒pTG210(見(jiàn)日本特許公開(kāi)4-117289說(shuō)明書(shū))用NdeⅠ和ClaⅠ消化得到大約1kb片段。將此片段克隆在已用NdelⅠ和ClaⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pT7-7(BglⅡx)上，由此得到pTG210X。
質(zhì)粒pAS192(見(jiàn)步驟1)用BamHⅠ和ClaⅠ消化，得到310b片段。將此片段克隆在已用BglⅡ和ClaⅠ消化過(guò)的質(zhì)粒pTG210X上，由此得到質(zhì)粒pGE31(見(jiàn)表7)。質(zhì)粒pGE31表達(dá)融合蛋白Gag(308-437)-Env(512-611)。
在T7啟動(dòng)子控制下能表達(dá)Gag-Env融合蛋白的質(zhì)粒列在了表6中。大腸桿菌菌株BL21(DE3)用作表達(dá)宿主。為了大量生產(chǎn)融合蛋白而進(jìn)行的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白質(zhì)分析方法與步驟2和3基本相同。
將已產(chǎn)生了表7所列融合蛋白的大腸桿菌細(xì)胞中的總細(xì)胞蛋白通過(guò)SDS-PAGE分開(kāi)，凝膠用CBB著色。通過(guò)光密度計(jì)掃描凝膠測(cè)出所得融合蛋白與總細(xì)胞蛋白之比值。用質(zhì)粒pGE33、pGE218和pGE31表達(dá)融合蛋白具有最高的比值，約為20%。步驟8(Gag-Env融合蛋白對(duì)HIV抗體反應(yīng)性的構(gòu)成)步驟7所構(gòu)成的質(zhì)粒pGE33、pGE31和pGE218在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中表達(dá)大量的Gag-Env融合蛋白。在這些融合蛋白中，產(chǎn)量特別高的蛋白是由pGE33表達(dá)的Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白。為了證明該融合蛋白作為診斷用抗原的用途，就該融合蛋白與41例HIV攜帶者(36例無(wú)癥狀HIV攜帶者，1例ARC和4例AIDS病患者)血清的反應(yīng)一一作了研究，方法為常規(guī)的Western印跡法，與步驟2和3基本相同(見(jiàn)表8)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在41例攜帶者的血清中均能檢測(cè)到Env抗體，因此保證了該融合蛋白作為診斷用抗原的用途。
步驟9(Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白的提純)把250毫升已大量產(chǎn)生Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白的大腸桿菌菌株BL21(DE3)的培養(yǎng)物在5，000rpm下離心10分鐘，收獲該菌細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞懸浮在10毫升含50mMTris-HCl(pH7.5)和10mM2-巰基乙醇的緩沖液中，對(duì)所得懸濁液作超聲處理以使細(xì)胞破碎。當(dāng)該破碎物以19，000rpm離心30分鐘時(shí)，Gag-Env融合蛋白沉積在沉淀物中。去掉上清液，再將沉淀物懸浮在10毫升含50mMTris-HCl(PH7.5)和10mM2-巰基乙醇的緩沖液中。向該懸濁液中添加5毫升SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)試樣緩沖劑，混合均勻，在100℃下加熱5分鐘。該加熱后的混合物在12，000rpm下離心5分鐘，取2毫升(每批)上清液加到491型PrepCell(由Bio-RedLaboratories得到，美國(guó))的SDS-PAGE凝膠上，在40mA下做電泳。以速度為1毫升/分鐘，分提量為2.5毫升/分提的條件進(jìn)行色譜分離，由此收集含Gag-Env融合蛋白的峰溜分。
將峰溜分濃縮大約20倍，此濃縮物進(jìn)行SDS-PAGE，然后用CBB著色。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白的純度很高，觀察不到其它蛋白質(zhì)帶。
從1升大腸桿菌培養(yǎng)物中能得到大約5毫克純的Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白。
步驟10(純Gag-Env融合蛋白作為診斷用抗原)將步驟9所得純的Gag(308-406)-Env(512-611)融合蛋白制品稀釋?zhuān)汛讼♂屛稂c(diǎn)在聚偏二氟乙烯膜上，使融合蛋白每個(gè)點(diǎn)的量分別為10、20、40、80、160和320ng。用脫脂乳阻滯各點(diǎn)，并與55例HIV攜帶者(具體地，50例無(wú)癥狀HIV攜帶者，1例ARC和4例AIDS病患者)及84例未感染個(gè)體(健康個(gè)體)的每例血清反應(yīng)，血清已先用含20mMTris-HCl(PH7.5)、150mMNaCl和0.05%吐溫20的緩沖液稀釋了100倍。以過(guò)氧化物酶共軛的山羊抗人體IgG(由Bio-RedLaboratories獲得，美國(guó))為第二抗體，用傳統(tǒng)方法進(jìn)行著色反應(yīng)。上述點(diǎn)印跡試驗(yàn)結(jié)果列在表9中。
20ng這樣少量的融合蛋白與全部55例HIV攜帶者的血清發(fā)生了特異性反應(yīng)，甚至5ng融合蛋白與除2例無(wú)癥狀HIV攜帶者外的全部HIV攜帶者的血清發(fā)生了反應(yīng)。而高達(dá)320ng的融合蛋白與84例健康者的血清之間即未發(fā)現(xiàn)特異性反應(yīng)也未觀察到非特異性反應(yīng)。由此結(jié)果可以判斷，純的融合蛋白表現(xiàn)出極高的特異性及與血清的廣譜反應(yīng)性，由此確保了該蛋白質(zhì)作為診斷用抗原的用途。
實(shí)例2步驟1(生產(chǎn)高純度Gag蛋白p55)把已經(jīng)大量生成了Gag蛋白p55的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體BL21(DE3)/pTG581培養(yǎng)物在5，000rpm下離心10分鐘，收獲細(xì)胞。將收獲的細(xì)胞懸浮在含20mM磷酸鈉(PH6.9)和10mM2-巰基乙醇的磷酸鹽緩沖液中，該緩沖液的體積是上述培養(yǎng)物體積的1/50，所得懸濁物進(jìn)行超聲處理以破碎細(xì)胞。所得細(xì)胞破碎物在19，000rpm下離心60分鐘，以獲得含p55的上清液。此上清液用20%飽和硫酸銨處理形成沉淀物。將此沉淀物溶解在如上限定的但含8M尿素的磷酸鹽緩沖液中。讓此溶液流經(jīng)S-Sepharose柱(PharmaciaFineChemicalsAB制造和銷(xiāo)售，瑞典)，該柱用上述同樣的磷酸鹽緩沖液平衡過(guò)。向該柱加含氯化鈉且其濃度梯度為0-1M的緩沖液進(jìn)行洗脫，得到p55洗脫液部分，將這些p55洗脫液部分匯集起來(lái)，匯集部分用如上限定的磷酸鹽緩沖液且含300mM氯化鈉進(jìn)行滲析，隨后在19，000rpm下離心20分鐘。讓所得上清液通過(guò)Heparing-SepharoseCL-6B柱(PharmaciaFineChemicalsAB制造和銷(xiāo)售，瑞典)，該柱已用上述磷酸鹽緩沖液平衡。向該柱加含氯化鈉且其濃度梯度為0-1M的緩沖液進(jìn)行洗脫，由此得到p55洗脫液部分。將所得p55洗脫液部分匯集，然后濃縮。向此濃縮物中添加SDS-PAGE試樣緩沖劑，混合均勻。把混合物加到PrepCell的SDS-PAGE凝膠上。按實(shí)例1步驟9的同樣條件進(jìn)行色譜分離。將所得p55溜分濃縮大約20倍，再將此濃縮物進(jìn)行SDS-PAGE，之后用CBB著色。發(fā)現(xiàn)p55純度很高，未觀察到任何其它蛋白質(zhì)帶。
步驟2(Gag蛋白p17.p24和p15及完整Gag蛋白p55各自與HIV攜帶者血清的反應(yīng)性，Gag蛋白已通過(guò)大腸桿菌大量生產(chǎn)并高度提純)按照與實(shí)例1步驟10基本相同的方法，把高純度HIV-1Gag蛋白p17、p24、p15(見(jiàn)WO91/18990)和p55(見(jiàn)實(shí)例2步驟1)分別點(diǎn)加在聚偏二氟乙烯膜上，并分別與40例HIV攜帶者(具體說(shuō)，35例無(wú)癥狀HIV攜帶者，1例ARC和4例AIDS病患者)和10例未感染者(健康個(gè)體)的血清反應(yīng)。用基本與實(shí)例1步驟10相同的方法進(jìn)行血清反應(yīng)和著色反應(yīng)。研究結(jié)果列在表10中。Gag蛋白p17、p24和p15分別能檢測(cè)出92.5%(37/40)、87.5%(35/40)和85%(34/40)攜帶者中的特異抗體。Gag蛋白p55與全部40例HIV攜帶者的血清發(fā)生特異性反應(yīng)，而且其反應(yīng)比p17、p24和p15要強(qiáng)。尤其是注意到，其中1例無(wú)癥狀攜帶者的血清只與p55有反應(yīng)，而Gag蛋白p17、p24和p15無(wú)一與之反應(yīng)。反應(yīng)性最弱的Gag蛋白是p15。
Gag蛋白p17.p24和p55與ARC和AIDS病患者血清的反應(yīng)性比無(wú)癥狀HIV攜帶者血清的反應(yīng)性要弱。這一現(xiàn)象在p15上未觀察到。對(duì)10例健康者，均未發(fā)生反應(yīng)。
由上述結(jié)果可以看出，Gag蛋白p55是篩選HIV感染最好的Gag抗原。
表1表達(dá)LacZ-Env融合蛋白的質(zhì)粒質(zhì)粒 5'克隆 5'克隆位點(diǎn) 3'克隆位點(diǎn) 3'克隆產(chǎn)物**位點(diǎn)*的核苷酸的核苷酸位點(diǎn)*編號(hào)*編號(hào)*pAS160KpnI63437031BglIILacZ-Env(14-244)pAS210KpnI63437611BglIILacZ-Env(14-437)pAS200KpnI63438131HindIIILacZ-Env(14-611)pAS172Stul68227391ScalLacZ-Env(175-363)pAS220HaeIII69697834HaeIIILacZ-Env(224-510)pAS311BglII70317611BglIILacZ-Env(244-437)pAS331BglII70318131HindIIILacZ-Env(244-611)pAS111BglII70318465BamHILacZ-Env(244-722)pAS131BglII70318887XhoILacZ-Env(244-826)pAS342BglII76118131HindIIILacZ-Env(437-611)pAS122BglII76118465BamHILacZ-Env(437-722)pAS142BglII76118887XhoILacZ-Env(437-826)pAS192HaeIII78348131HindIIILacZ-Env(512-611)pAS182HaeIII78348400HaeIIILacZ-Env(512-699)pAS351HindIII81318465BamHILacZ-Env(610-722)pAS151HindIII81318887XhoILacZ-Env(610-826)pAS451BamHI84658887XhoILacZ-Env(721-826)＊核苷酸序列及其編號(hào)來(lái)自Genbank data file HIVNL43。
＊＊括號(hào)內(nèi)的數(shù)為由Env蛋白(gb160)N-末端計(jì)數(shù)的氨基酸編號(hào)。
表2LacZ-Env融合蛋白與三例HIV攜帶者血清通過(guò)Western印跡試驗(yàn)顯示的反應(yīng)性質(zhì)粒產(chǎn)物血清 A血清 B血清 CpUR290LacZ---pAS160LacZ-Env(14-244)--+pAS210LacZ-Env(14-437)--+pAS200LacZ-Env(14-611)+++pAS172LacZ-Env(175-363)--+pAS220LacZ-Env(224-510)-++pAS311LacZ-Env(244-437)--+pAS331LacZ-Env(244-611)+++pAS111LacZ-Env(244-722)+++pAS131LacZ-Env(244-826)+++pAS342LacZ-Env(437-611)+++pAS122LacZ-Env(437-722)+++pAS142LacZ-Env(437-826)+++pAS192LacZ-Env(512-611)+++pAS182LacZ-Env(512-699)+++pAS351LacZ-Env(610-722)--+pAS351LacZ-Env(610-826)+++pAS451LacZ-Env(721-826)+++
表3確定Env蛋白上的表位區(qū)血清 A血清 B血清 CEnv(14-244)Env(224-510)Env(244-437)確定的表位區(qū)Env(512-611)Env(512-611)Env(512-611)Env(610-722)Env(721-826)Env(721-826)Env(721-826)表4檢測(cè)HIV攜帶者血清中的Env抗體抗原血清+±-總計(jì)AC39--39LacZ-Env(512-611)ARC1--1AIDS4--4AC343239LacZ-Env(721-826)ARC-1-1AIDS13-4
表5表達(dá)HIV-1Env蛋白的質(zhì)粒質(zhì)粒 5'克隆 5'克隆位點(diǎn) 3'克隆位點(diǎn) 3'克隆產(chǎn)物**位點(diǎn)*的核苷酸的核苷酸位點(diǎn)*編號(hào)*編號(hào)*pTE160KpnI63437031BglIIEnv(14-244)pTE210KpnI63437611BglIIEnv(14-437)pTE200KpnI63438131HindIIIEnv(14-611)pTE172Stul68227391ScalEnv(175-363)pTE17-2Stul68227391ScalEnv(175-363)pTE220HaeIII69697834HaeIIIEnv(224-510)pTE311BglII70317611BglIIEnv(244-437)pTE342BglII76118131HindIIIEnv(437-611)pTS23BglII76118887XhoIEnv(437-826)pTE192HaeIII78348132HindIIIEnv(512-611)pTE18-192HaeIII78348131HindIIIEnv(512-611)pTE182HaeIII78348400HaeIIIEnv(512-699)pTE18-182HaeIII78348400HaeIIIEnv(512-699)pTS45BamHI84658887XholEnv(721-826)＊核苷酸序列及其編號(hào)來(lái)自Genbank data file HIVNL43。
＊＊括號(hào)內(nèi)的數(shù)為從Env蛋白(gb160)N-末端計(jì)數(shù)的氨基酸編號(hào)。
既使選擇一種適宜的質(zhì)粒，以可接受的產(chǎn)率單獨(dú)表達(dá)Env蛋白也是困難的。
表6表達(dá)HIV-1Gag蛋白的質(zhì)粒質(zhì)粒 5'克隆 5'克隆位點(diǎn) 3'克隆位點(diǎn) 3'克隆產(chǎn)物***位點(diǎn)*的核苷酸的核苷酸位點(diǎn)*編號(hào)*編號(hào)*pTG581 NdeI**787 2429 BclI Gag(1-500)pTG581 NdeI**787 2429 BclI Gag(1-500)pTG571 NdeI**787 2096 BglII Gag(1-437)pEG571 NdeI**787 2096 BglII Gag(1-437)pTG561 NdeI**787 2006 ApaI Gag(1-405)pTG551 NdeI**787 1712 HindIII Gag(1-309)pTG541 NdeI**787 1415 PstI Gag(1-210)pTG531 NdeI**787 1247 NsiI Gag(1-154)pTG207 NdeI**787 1415 PstI Gag(1-132)****pTG521 NdeI**787 1145 PVuII Gag(1-119)pTG121PvuII11452096BglIIGag(121-437)pTG110-2PvuII11452006ApaIGag(121-405)pTG212HindIII17122429BclIGag(308-500)pTG221HindIII17122096BglIIGag(308K-437)pTG210-2HindIII17122006ApaIGag(308-405)＊核苷酸序列及其編號(hào)來(lái)自Genbank data file HIVNL43。
＊＊通過(guò)試管誘變把NdeⅠ引入在gag基因的起始密碼子上。
＊＊＊括號(hào)內(nèi)的數(shù)為從Gag蛋白(p55)N-末端計(jì)數(shù)的氨基酸編號(hào)。
＊＊＊＊在p24的第一個(gè)密碼子上引入終止密碼子，使之表達(dá)p17。
表7表達(dá)Gag-Env融合蛋白的質(zhì)粒質(zhì)粒產(chǎn)物Gag蛋白質(zhì)區(qū)Env蛋白質(zhì)區(qū)(a.a.)(a.a.)pGE216308-40614-244pGE116121-40614-244pGE221308-40614-437pGE217308-406175-363pGE117121-406175-363pGE231308-406244-437pGE131121-406244-437pGE223308-406437-510pGE123121-406437-510pGE5231-406437-510pGE2134308-406437-611pGE1134121-406437-611pGE56341-406437-611pGE2711-119437-611pGE2112308-406437-722pGE1112121-406437-722pGE56121-406437-722pGE2142308-406437-826pGE1142121-406437-826pGE56421-406437-826pGE30308-436437-826pGE33308-406512-611pGE1133121-406512-611pGE56331-406512-611pGE2811-119512-611pGE31308-437512-611pGE218308-406512-699pGE118121-406512-699pGE2801-119512-699pGE34308-406721-826pGE1145121-406721-826pGE56451-406721-826pGE2901-119721-826pGE32308-435723-826
表8Gag-Env融合蛋白與HIV攜帶者血清的Western印跡試驗(yàn)抗原血清+±-總計(jì)AC36--36Gag(308-406)-Env(512-611)ARC1--1AIDS4--4表9純Gag-Env融合蛋白與HIV-1攜帶者和未感染者血清的反應(yīng)性血清-++++++總計(jì)AC0115355ARC00011AIDS00044未感染個(gè)體8400084(健康個(gè)體)-與320ng純?nèi)诤系鞍撞话l(fā)生反應(yīng)。
+、++、+++與至少20ng、至少10ng和至少5ng發(fā)生反應(yīng)表10Gag蛋白與HIV-1攜帶者血清抗體的反應(yīng)性(A)檢測(cè)HIV攜帶者血清中的抗-p55抗體與至少量反應(yīng)的反應(yīng)的測(cè)試的血清320160804020105(ng)AC323273535ARC111AIDS3144(B)檢測(cè)HIV-1攜帶者血清中的抗-p17抗體與至少量反應(yīng)的反應(yīng)的測(cè)試的血清320160804020105(ng)AC15381153335ARC111AIDS2134
(C)檢測(cè)HIV-1攜帶者血清中的抗-p24抗體與至少量反應(yīng)的反應(yīng)的測(cè)試的血清320160804020105(ng)AC42469333135ARC01AIDS11244(D)檢測(cè)HIV-1攜帶者血清中的抗-p15抗體與至少量反應(yīng)的反應(yīng)的測(cè)試的血清320160804020105(ng)AC1281633035ARC111AIDS123權(quán)利要求
1.一種基本純的HIV抗原，該抗原包含Gag-Env融合蛋白，其中所說(shuō)的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽組成的，所說(shuō)的Gag肽包含Gag(308-437)所代表氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均系圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)，所說(shuō)的Env肽包含至少一部分Env(512-699)所代表的氨基酸序列，所說(shuō)的部分包括至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)的表位，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的HIV抗原，其中在所說(shuō)部分Env肽中包含的表位是Env(512-699)所代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
3.一種HIV抗原，該抗原包括權(quán)利要求1的HIV抗原與含Gag(1-500)所代表的氨基酸序列的Gag蛋白的混合物，所說(shuō)的氨基酸序列為圖1-(1)至1-(2)所示的Gag蛋白的氨基酸序列，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖1-(1)至1-(2)中的氨基酸的位置編號(hào)。
4.一種基本純的HIV抗原，該抗原包括以基本分離形式存在的含Gag(1-500)所代表氨基酸序列的Gag蛋白，所說(shuō)的氨基酸序列為圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白的完整氨基酸序列，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖1-(1)至1-(2)中氨基酸的位置編號(hào)。
5.一種生產(chǎn)基本純的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原的方法，其中所說(shuō)的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag肽組成的，該方法包括(a)將第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列連接到可復(fù)制的表達(dá)媒介上以獲得能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的第一個(gè)重組DNA分子，該分子包含所說(shuō)的表達(dá)媒介和插入在該媒介上的所說(shuō)的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列，所說(shuō)的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含有Gag(308-437)所代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列的Gag肽，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào);(b)把第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列連接到所說(shuō)的第一個(gè)重組DNA分子上的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列的下游，使所說(shuō)的第二個(gè)序列融合到所說(shuō)的第一個(gè)序列上，所說(shuō)的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含有至少一部分Env(512-699)所代表氨基酸序列的Env肽，所說(shuō)的部分包括至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)的表位，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)，由此獲得第二個(gè)能在宿主細(xì)胞中復(fù)制的重組DNA分子，該分子包含所說(shuō)的表達(dá)媒介，所說(shuō)的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列以及融合在該序列下游的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列;(c)用所說(shuō)的第二個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞或真核細(xì)胞以制備成轉(zhuǎn)化體;(d)從未轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞和真核細(xì)胞中選擇出轉(zhuǎn)化體;(e)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以生產(chǎn)含有Gag-Env融合蛋白的HIV抗原，其中所說(shuō)的Gag-Env融合蛋白是由以羧基末端融合在所說(shuō)的Env肽上的Gag肽組成的;(f)從所培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體中分離出所說(shuō)的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說(shuō)的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼Env(512-699)代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所說(shuō)的表達(dá)媒介是由pT7系列或pUR290系列媒介得到的。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說(shuō)的由pT7系列得到的表達(dá)媒介是pT7-7。
9.一種能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制的重組DNA分子，其包含已插入有第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列的可復(fù)制表達(dá)媒介以及融合在所說(shuō)第一個(gè)序列下游的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列，所說(shuō)的第一個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含Gag(308-437)代表的氨基酸序列中的至少10個(gè)相鄰排列的氨基酸序列的Gag肽，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均是圖1-(1)至1-(2)所示Gag蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)，所說(shuō)的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼含有至少一部分Env(512-699)代表的氨基酸序列的Env肽，所說(shuō)的部分包括至少一個(gè)對(duì)HIV抗體有反應(yīng)的表位，其中括號(hào)內(nèi)的每一數(shù)值均為圖2-(1)至2-(3)所示Env蛋白完整氨基酸序列中的氨基酸位置編號(hào)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組DNA分子，其中所說(shuō)的第二個(gè)脫氧核糖核苷酸序列負(fù)責(zé)編碼Env(512-699)代表的氨基酸序列中的至少5個(gè)相鄰排列的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的重組DNA分子，其中所說(shuō)的表達(dá)媒介來(lái)源于pT7系列或pUR290系列媒介。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的重組DNA分子，其中所說(shuō)的來(lái)源于pT7系列的表達(dá)媒介是pT7-7。
13.一種通過(guò)免疫學(xué)反應(yīng)診斷后天免疫缺陷綜合癥用的試劑，其含有免疫學(xué)反應(yīng)有效量的權(quán)利要求1-4任何之一的HIV抗原。
14.一種后天免疫缺陷綜合癥疫苗，其包括有效免疫量的權(quán)利要求1-4任何之一的HIV抗原以及至少一種藥學(xué)可接受的佐劑、稀釋劑或賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種基本純的含Gag-Env融合蛋白的HIV抗原，所說(shuō)融合蛋白是由以羧基末端融合在Env肽上的Gag組成的。本發(fā)明HIV抗原可以很好地用作AIDS病診斷劑、疫苗、抗體制劑和治療劑的活性組分。本發(fā)明還公開(kāi)一種基本純的含由完整gag基因編碼而得Gag蛋白的HIV抗原。
文檔編號(hào)C07K14/16GK1079509SQ9211539
公開(kāi)日1993年12月15日 申請(qǐng)日期1992年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1992年6月4日
發(fā)明者齋藤敦, 品川日出夫, 中田篤男 申請(qǐng)人:阪大微生物病研究會(huì)