專利名稱：N-苯硫脲衍生物及其藥物用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及N-苯硫脲衍生物以及它們的藥物用途。
它涉及式Ⅰ化合物
其中R1為丙基，異丙基或2-甲基丙基;
R2為原子序數(shù)為9到35的囟素，而且，R3為碳原子數(shù)為1至4的烷基。
R1最好是丙基或2-甲基丙基。R2最好是氯。R3最好是甲基、乙基、異丙基或叔丁基，優(yōu)選的是甲基、乙基或異丙基，特別是甲基。
在一類式Ⅰ化合物中，R1為丙基，或2-甲基丙基以及R3為碳原子數(shù)為1至3的烷基;更加優(yōu)選的，R1為丙基，R2為氟或氯，R3為甲基或乙基;尤其優(yōu)選的是，R3為甲基，R1為2-甲基乙基。
一些式Ⅰ化合物可以有一不對稱中心。因此，一個這樣的化合物有兩個對映體。所有可能的同分異構體及外消旋體都在本發(fā)明的范圍中。這些化合物最好沒有任何不對稱中心。
碳原子數(shù)為1至4的烷基優(yōu)選的為甲基或乙基，特別是乙基。囟素優(yōu)選的為氯。
一類式Ⅰ化合物中(化合物Ⅰp)R3不是4個碳原子的烷基。
在還有一類式Ⅰ化合物中，R3不是多于一個碳原子的烷基。
另一類式Ⅰ化合物可經(jīng)如下方法獲得。它包括將式Ⅱ對應的化合物
其中，R2與R3同前定義，與式Ⅲ對應的化合物
其中R1同前定義，發(fā)生反應。
上述式Ⅰ化合物的制備方法可以按傳統(tǒng)方法進行。
它是一個異硫氰酸酯與胺的反應。反應溫度優(yōu)選地為約10°至約40℃，優(yōu)選地為約20°至約30℃。常使用無水惰性有機溶劑，如囟化低級烷烴，即二氯甲烷或是C1-3烷基(C2-3)烷酮鹽，即乙酸乙酯。
式Ⅰ的化合物可用傳統(tǒng)方法從反應混合物中分離，若需要，可提純。
有不對稱中心的化合物可用任意純度的原料得到不同純度的產(chǎn)物。
原料的制備方法不在此處描述，作為原料的化合物是周知的，或可從已知化合物用已知方法制得，即如描述于實施例中的那樣。
以下用實施例來說明本發(fā)明。所有溫度均為攝氏溫度。MP即熔點。
實施例一N-(5-氯-2-甲基苯基)-N′-丙硫脲。
(R1為正丙基;R2為氯;R3為甲基)163克正丙胺(式Ⅲ化合物)在40分鐘內滴加到溶于700毫升乙酸乙酯中的390克5-氯-2-甲苯基異硫氰酸(式Ⅱ化合物)中，在氮氣氛下，于15℃攪拌，控制其滴加速度使溫度保持在25°～30℃。滴加完畢后，反應混合物在25～30℃下攪拌5分鐘，加入2.1升正庚烷，然后混合物在20分鐘內冷卻至0℃。所得白色懸浮液于0℃攪拌1小時，真空過濾收集固體，用冷的(5℃)正庚烷洗滌兩次，每次250毫升，并在25毫米汞柱1240℃時干燥約18個小時至恒重。便獲得標題化合物(白色固體，MP為97-98℃)。
實施例二N-(5-氯-2-甲苯基)-N′-2-甲基丙硫脲。
(R1為2-甲基丙基;R2為氯;R3為甲基)將25.0克 5-氯-2-甲苯基異硫氰酸酯溶于25毫升二氯甲烷所得的溶液，一滴滴加入到克溶于150毫升二氯甲烷的10.0克異丁胺(式Ⅲ化合物)溶液中，于20～25℃下攪拌，反應混合物于20～25℃攪拌2個小時。蒸餾二氯甲烷，而且，在蒸餾的同時慢慢加入甲基叔丁基醚。所得的甲基叔丁基醚溶液可冷卻至20～25℃，經(jīng)過濾收集所得固體，用甲基叔丁基醚洗滌并真空干燥至恒重。即獲標題化合物(MP 為114～116℃)。
用類似實施例一和二的方法可獲得如下式Ⅰ化合物實施例 R1R2R3MPNo.
3 -CH(CH3)2-Cl -CH3126°-128°4 -CH2CH2CH3-Cl -CH2CH379°-81°5 -CH2CH2CH3-F -CH368°-71°6 -CH2CH2CH3-Br -CH3109°-112°式Ⅰ化合物有著有趣的藥理學活性。它們可用作藥物。
特別地，它們提高了血清中高密度脂蛋白(HDL;HDL-膽固醇)及阿樸脂蛋的A-I(脫輔基A-I)含量?；衔镏写蠖鄶?shù)有著降低血清中甘油三酯含量的功效。
這種功效可通過傳統(tǒng)鑒定方法來得到證實，即，如下述a)試驗A柱身HDL-膽固醇試驗雄性Sprague-Dawley鼠，體重200～225克，每籠兩只，喂食Purina Rodent Chow Special Mix 5001-S加上0.25%膽酸和0.75%膽固醇及Purina和水隨意達7或8天。然后每種試驗物在增加的食譜上用于6只鼠一組達8或21天。在服食食物、試驗物及試驗結束時記錄體重及食物消耗情況。一般說試驗物的劑量為4～200毫克/千克/天。
實驗結束時，麻醉所有的試驗用鼠，放血，收集其血液，凝結時保持冰點溫度，分離，然后血清即被分離出來，用氯化鈉溶液調整一等分試樣密度為1.06克/毫升，然后冰凍貯存過夜。其它殘余血清等分試樣則冰凍貯存。
HDL通過微超速離心法(mUC)或快速蛋白液層析法(FPLC)技術得到離析。mUC方法如下所述175微升的密度調整為1.06克/毫升的血清試樣于20℃在Beckmann 42.2Ti旋機上以4200轉/分離心2.5小時。95微升從頂部分出，而80微升則在下面。FPLC分離方法是采用Kieftet al.J.Lipid Res.32(1991年，第859～866頁)上的方法，通過France et al.，Latoratory Robotics and Automation 2(1990年，第155～173頁)上所述的改良技術，用Superose 6(有著干緣直徑為20～40微米的高度交聯(lián)凸緣瓊脂糖)凍膠溶透層析法來進行。所用柱緩沖劑為Tris緩沖塊溶液(即，0.05摩爾濃度Tris(2-氨基-2-羥基甲基-1，3-丙二醇)及0.15摩爾濃度的含0.01%疊氮化鈉，溶于蒸餾的去離子水(ddHO)的氯化鈉溶液。注入200微升血清，40份0.5毫升分級試樣則收存起來。
用Sigma鑒定儀來分析總體，42.2Ti旋轉機底部及FPLC分級試樣的膽固醇，以鑒定膽固醇的酶分析，方法第352號，改為使用96凹陷式微向型滴定盤。在PH＝6.5的緩沖液中，再生試劑(加了水以后)含300U/l膽固醇氧化酶，100/外膽固醇酯酶，1000U/l過氧化物酶(辣根)，0.3毫摩爾/升4-氨基安替比林及30.0毫摩爾/升對羥基苯磺酸鹽。這種方法用膽固醇酯酶來水解膽固醇酯以游離出膽固醇。氧化游離態(tài)的膽固醇以產(chǎn)生過氧化氫用來形成醌亞胺染料。因為該反應定量地進行，染料的濃度，通過比色可測得，直接與樣品中膽固醇含量成比例。校準液，校準液及樣品可用鹽水稀釋，若膽固醇濃度使得讀數(shù)在線性范圍之外的話。
20微升校準液，校準液或試樣與200微升等分試劑于96凹陷式微滴定盤內混合。每一混合物在20～25℃恒溫25分鐘，然后用一比色微滴定盤讀數(shù)器在490492或500nm處讀取吸光度。
位于上部的膽固醇(即，LDL-膽固醇)可通過減法得出。微超速離心法的定性分離可用科爾寧(Corning)大眾瓊脂糖凍膠電流與Fat紅色7B著色劑來分析。
FPLC分級試樣阿樸A-I含量可根據(jù)France et al.，I.Lipid Res 30(1989年，第1997～2004頁)上的非減量SDS-PAGE方法來分析。通過鑒定含阿樸A-I及不含免疫反應的阿樸B蛋白分級試樣膽固醇含量來定量分析HDL-膽固醇。
血清中總甘油三酯可用Mannheim診斷Reagentset甘油三酯-GB儀(Cat第877557號)，經(jīng)如下方法改良微滴定盤鑒定法來測量根據(jù)前述方法制備試劑。100微升工作溶液及20微升稀釋血清[1∶1血清∶鹽水(鹽水為0.15摩爾濃度的溶于ddH O的氯化鈉溶液]分別加到兩個96凹陷式微滴定盤，混合并在20～25℃時恒溫至少5分鐘。100微升工作溶液2加到每個盤中，然后混合并于20～25℃時恒溫至少5分鐘。100微升工作溶液2加到每個盤中，然后混合并于20～25℃時恒溫至少5分鐘，然后在490，492或500nm處讀數(shù)。血清中甘油三酯總含量(mg/dl)通過對比已知樣品的吸光度來計算得出。
可用其它傳統(tǒng)方法來鑒定血清樣品中HDL-膽固醇及甘油三酯總含量。
b)試驗B阿樸A-I試驗通過如下鼠阿樸A-I酶交聯(lián)免疫吸附劑鑒定法(ELISA)來分析試驗A中試驗動物的阿樸A-I血清含量1.兔子防鼠疫阿樸A-I抗體的產(chǎn)生與提純通過連續(xù)的超速離心法及鼠高密度脂蛋白(HDL)的分離從沉淀的鼠血清中提純鼠可樸A-I。尾隨著脫酯質酶，通過凍膠過濾層析法，阿樸A-I從其它HDL-蛋白中解析出來。從傳統(tǒng)的免疫原始記錄中，通過連續(xù)皮下注射提純了的鼠阿樸A-I，在三種兔子(Pocono兔子場，Candensis，PA)產(chǎn)生了血清抗體。經(jīng)過一年的重復放血，血清抗體沉淀，等分及于-20℃冰凍。原血清抗體除去泡沫，加入到活化的溴化氰Sepharose Cl-4B(有著干緣直徑為60～140微米的凸緣瓊脂糖)柱，它與提純了的人類HDL共價鍵接，用鹽水洗滌柱，提純的抗體用1M PH＝3的甘氨酸溶液洗脫。用Tris緩沖鹽溶液通過透析來除去甘氨酸以獲得提純了的兔子防鼠疫阿樸A-I抗體的濃縮液。
2.緩沖液，試劑及標準液-碳酸鈉吸附緩沖液2.25克碳酸鈉，4.40克碳酸氫鈉及0.15克疊氮化鈉溶于1.4升ddH2O中，用氫氧化鈉調整PH值為9.6，緩沖液用ddH O衡釋至總體積為1.5升;
-PH＝8，0.5M Tris溶液60.55克Tris.HCl(2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇.鹽酸鹽)溶于1.0升ddH2O溶液，用10N氫氧化鈉溶液調PH值至8.0;
-次抗體緩沖液200毫升PH＝8的0.5MTris溶液加到溶于1.8升ddH2O含40克中血清蛋白(BSA)Cohn級數(shù)五的溶液中，加入0.2克疊氮化鈉及18.0克氯化鈉;
-底物緩沖液0.1克疊氮化鈉攪拌加入到105.1克二乙醇胺及500毫升ddH2O中，加入10毫升0.5M六水氯化鎂溶液，用12N鹽酸調PH為9.8，然后用ddH2O稀釋至總體積為1升;
-30X ELISA洗滌緩沖液525.96克氯化鈉，76.68克Tris，6克疊氮化鈉和30毫升Tween 20[聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸酯]混合，用12N鹽酸調PH值至7.3，然后用ddH2O稀釋至總體積為2升;
-1X ELISA洗滌緩沖液由一體積30 X ELISA洗滌緩沖液與29體積ddH2O稀釋而成;
-樣品稀釋緩沖液886.34毫升次抗體緩沖液與113.66毫升Tween 20充分混合獲得11.366%(體積比)Tween 20溶液;
-標準稀釋緩沖液(A)780毫升次抗體緩沖液與220毫升Tween 20充分混合獲得22%(體積比)Tween 20溶液。(B)890毫升次抗體緩沖液及110毫升Tween 20充分混合獲得11%(體積比)的Tween 20溶液;
-鼠血清沉淀A用這種鼠血清來繪制每次鑒定中的標準曲線。用以校準提純化的阿樸A-Ⅰ和含有45±2.7毫克阿樸A-Ⅰ/dl血清;
-鼠血清沉淀B在每次鑒定中用作低內標以監(jiān)測漂移及含40毫克阿樸A-Ⅰ/dl血清;
-鼠血清沉淀C來自用所提化合物(二甲苯氧庚酸)處理過的老鼠，用作監(jiān)測鑒定漂移得含70毫克阿樸A-Ⅰ/dl血清的高內標。
3.試驗程序含942微克/毫升的冰凍提純了的鼠阿樸A-I用碳酸鈉吸附緩沖液稀釋至最終濃度為3.7微克/毫升。向7個Nunc聚苯乙烯96凹陷式微滴定盤的每個中加入100微升這種溶液。阿樸A-I在4℃，48個小時內吸附到盤內，滴定盤用1X ELISA洗滌緩沖液洗滌，盤中的非特異點用同樣在冰冷狀態(tài)下恒溫過夜的次抗體緩沖液(200微升/孔)來填充。所有鑒定盤以這種方式貯存直至使用(三個星期之久)。
鑒定時，ELISA Platees(2個盤，每盤有36種鼠血清樣)用1X ELISA洗滌緩沖液刷洗4次。在試樣加入前每個盤為有100微升1X ELISA洗滌緩沖液，10微升欲分析的每種鼠血清樣品與290微升樣品稀釋緩沖液混合獲得最終1∶30稀釋液及11%的最終Tween 20濃度。作為內標鼠血清沉淀B和C的復制成6份樣之一試樣以同樣的方式處理。
2.0毫升鼠血清沉淀A與等體積的標準稀釋緩沖液A混合獲得1∶2的稀釋液及濃度為11%的Tween 20。然后該樣品連續(xù)用標準稀釋緩沖液B稀釋以獲得1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，和1∶128的稀釋液。
非ELISA微滴定盤中的稀釋后的標準液及試樣量于加熱至52℃的恒溫稍2小時。與冷卻至20～25℃后，洗滌緩沖液從ELISA試驗盤中移去，換上75微升標準液及試樣。75微升提純過的防鼠疫阿樸A-I抗體溶液用次抗體緩沖液稀釋至1∶75，然后加到每個試驗盤。輕搖每個盤使抗體與試樣混合，密封后在20～25℃恒溫18個小時。恒溫后每個盤用1X ELISA洗滌緩沖液洗4次。然后往每個盤加入100微升堿性磷酸酯酶共軛山羊防兔疫IGG抗體，用次抗體緩沖液稀釋成1∶1000。并在20～25℃相互反應3個小時。然后重洗每個盤并抽氣干燥，向每個盤加含1毫克/毫升硝基苯磷酸酯二鈉的底物緩沖液，它是一種色原的底物，其色域與樣品中阿樸A-I數(shù)量成反比每個盤在ELISA分光光度計監(jiān)測(至3小時)。當所有沒有阿樸A-I(最大色)的盤在405納米處達到任意密度為1.0時，用ELISA讀數(shù)器讀取每個盤的讀數(shù)。
標準曲線繪制成任意密度對濃度的對數(shù)的函數(shù)形式。未知數(shù)與該曲線相關，且阿樸A-I含量表示為毫克/dl。
上述試驗A與B結果表明，上述化合物的劑量在約10毫克/千克。天至約200毫克/千克。天時是有效的。
因此上述化合物可用于提高血清高密度脂蛋白(HDL;HDL即為膽固醇與阿樸脂蛋白A-I)含量，其中許多也可用于降低血清甘油之酯總含量因而可用于治療動脈粥樣硬化。
使用的準確劑量取決于幾個因素，包括宿主、特性及治療的劇烈情況，施用的方式及特別功效物質。然而，總的來說，實驗表明滿意的結果是每天劑量為約400毫克至約200毫克，一般是每天分成2至4次使用。
化合物可經(jīng)各種途徑服用，較多地是通過腸內，優(yōu)選地是口服，即以片劑或膠囊的形式，或不經(jīng)腸內，即以無菌可注射的溶液或懸浮液的形式。
實施例1，2和3的化合物是優(yōu)選的，特別是實施例1和2的化合物，尤其是實施例2的化合物。
因而下述活性已被測定
上述結果表明，當作為所述藥物用途時，實施例1和2的化合物所需的劑量要比相似服用方法采用常用的二甲苯氧庚酸所需的劑量要低，即口服約400～1000毫克/天。
含有式Ⅰ的化合物以單一形式或藥理學上可接受的鹽的形式以及與至少一種藥理學上可接受的載體或稀釋劑共同存在的藥物可用一般方法制得。它們可以是，如單位劑量形式，含有如約100毫克至約500毫克的有效組合物。
本發(fā)明也涉及一種藥物，它包含式Ⅰ化合物以及至少一種藥理學上可接受的載體或稀釋劑。
它還包含式Ⅰ化合物的藥物用途特別是用于動脈粥樣硬化的預防或有療效治療。
它還涉及一種藥物的制備方法，該藥物包含式Ⅰ化合物與至少一種藥理學上可接受的載體或稀釋劑的混合。
它還包含式Ⅰ化合物用于生產(chǎn)一種治療動脈粥樣硬化的藥物。
權利要求
1.式Ⅰ化合物
其中R1為丙基，異丙基或2-甲丙基；R2為原子序數(shù)為9到35的囟素；且R3為碳原子數(shù)為1至4的烷基。
2.權利要求1的化合物，其中R3為4個碳原子的烷基。
3.權利要求1的化合物，其中R1為正丙基，R2為氯和R3為甲基。
4.權利要求1的化合物，其中R1為2-甲丙基，R2為氯和R3為甲基。
5.權利要求1的化合物，其中R1，R2和R3分別是-CH(CH3)2，-Cl， -CH3，或-CH2CH2CH3，-Cl， -CH2CH3，或-CH2CH2CH3，-F， -CH3，或-CH2CH2CH3，-Br， -CH3.
6.權利要求1的化合物的制備方法，其中包含將式Ⅱ對應的化合物
其中R2與R3如權利要求1所定義的那樣，與式Ⅲ對應的化合物其中R1為權利要求1所定義的那樣，發(fā)生反應。
7.一種藥物，它包含權利要求1的化合物以及至少一種藥理學上可接受的載體或稀釋劑。
8.權利要求1的化合物用作藥物。
9.一種藥物的制備方法，它包含將式Ⅰ化合物與至少一種藥理學上可接受的載體或稀釋劑混合。
10.權利要求1的化合物，用于生產(chǎn)治療動脈粥樣理化的藥物。
全文摘要
本發(fā)明涉及式I的化合物，它們可用于治療動脈粥樣硬化。本發(fā)明也涉及含有式I化合物的藥物。式I的化合物可經(jīng)一般方法制備，如將異硫氰酸酯與胺反應而得到。
文檔編號C07C335/16GK1089257SQ93100330
公開日1994年7月13日 申請日期1993年1月1日 優(yōu)先權日1993年1月1日
發(fā)明者G·M·科波拉, R·E·達蒙 申請人:山道士有限公司