專利名稱：修飾的血小板因子-4的制作方法
技術領域：
本發(fā)明基于發(fā)現(xiàn)人血小板因子-4的一種新的N-末端區(qū)域的加工形式，即下文的修飾的血小板因子-4(MPF-4)。本發(fā)明也包括一種經(jīng)蛋白質(zhì)水解裂解、非還原形式的血小板因子-4，即下文的裂解血小板因子-4(CPF-4)。從脂多糖刺激的外周血白細胞耗盡的培養(yǎng)基中可分離到MPF-4和CPF-4。
經(jīng)氨基酸測序揭示了MPF-4與以Ser-17開始的血小板因子-4(PF-4)同源，因而推斷MPF-4是PF-4的一種自然發(fā)生的裂解產(chǎn)物。CPF-4具有與PF-4相同的氨酸酸順序，但因在16與17殘基間的肽鍵不存在而不同。然而，產(chǎn)生的兩個肽仍通過二硫橋鍵合。最有意義地是，本發(fā)明的化合物是內(nèi)皮細胞增殖的有效抑制因子，并且無論怎樣都比天然的PF-4活性高出10-100倍，這有賴于PF-4來源及報道的實驗室。
PF-4是正在擴大的小的可誘導蛋白質(zhì)組成的家族的一個原型成員，當用有絲分裂原或細胞因子刺激后可從各種各樣的細胞型中釋放出來。這個蛋白質(zhì)家族，被認為是“intercrines”，發(fā)現(xiàn)它調(diào)節(jié)各種生物過程，例如血管生成、細胞增殖、凝結、炎癥和組織修復。參見Oppenheim等，《新的前炎癥超基團“intercrine”胞質(zhì)族的性質(zhì)》，Ann.Rev.Immunol.9617-648，1991;Taylar等，《精氨酸為血管生成的抑制劑》，Nature 297307-312，1982;以及Maione等，《由重組人血小板因子-4和相關肽抑制血管生成》，Science 24777-79，1990)。
intercrine家族的其它成員包含白細胞介素-8(IL-8)、黑素細胞生長刺激活性(hGro/MGSA)、β-血栓球蛋白(β-TG)、中性白細胞激活蛋白(NAP-2)、IP-10和巨噬細胞炎性蛋白(MIP-2)。參見Lindley等，《基團編碼的單核細胞衍生的中性白細胞激活因子在大腸桿菌中的合成和表達天然的和重組的中性白細胞激活因子之間的生物等價性》，Proc.Natl.Acad.Sci.859199-9203，1988;Walz等，《在受刺激的單核細胞培養(yǎng)物中形成的β-血栓珠蛋白的新的裂解產(chǎn)物激活人中性白細胞》，Biochem.Biophys.Res.Commun.159969-975，1989;Luster等，《γ-干擾素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)含同源性的基因?qū)ρ“宓鞍踪|(zhì)的早期反應》，Nature315672-676，1985;以及Wolpe等，《巨噬細胞炎性蛋白質(zhì)2的識別和表征》，Proc.Natl.Acad.Sci.86612-616，1989)。
PF-4完整的一級結構在本領域是熟知的(Poncz等，《由人紅白血病細胞系衍生的血小板因子-4 cDNA的克隆和表征》，Blood69219-223，1987)。PF-4的類似物和片段也是熟知的，并在美國專利4，545，828和4，737，580中稱作“制瘤素-A”，在此引用作為參考。研究顯示了intercrine蛋白家族在N-末端區(qū)域含有特征的半胱氨酰-X-半胱氨酸(CXC)基元。CXC基元通過與Cys-36和Cys-51殘基形成分子內(nèi)二硫鍵參與產(chǎn)生天然PF-4的二級及三級結構(St.Charles等，《牛血小板因子-4的三維結構在3.0-A的分辨》，J.Biol.chem.2642092-2098，1989)。
再者，基于公布的牛PF-4三維結構，確定了N-末端Gln-9到Val-19殘基形成一個巨大的開環(huán)，Thr-16與Cys-51以氫鍵締合。這些N-末端結構已表明對PF-4的免疫調(diào)節(jié)活性是重要的。(Katz等，《血小板因子-4的蛋白酶誘導的免疫調(diào)節(jié)活性》，Proc.Natl.Acad.Sci.833491-3495，1986)。
雖然PF-4主要在血小板的α-粒中發(fā)現(xiàn)，但是基因組克隆揭示了這樣一個事實，即產(chǎn)生不同形式的PF-4(即PF-4 varI和PF-4alt)的人PF-4基團的復制(Doi等，《大白鼠血小板因子-4基因結構巨核型分辨標記》，Mol.Cell Biol.7898-912，1987)。變異體的推斷氨基酸序列顯示在N-末端先導序列和C-末端富賴氨酸結構域存在重要差別(Green等，《人血小板因子-4的基因變異體，PF4var 1的識別和表征》，Mol.Cell.Biol.91445-1451，1989;Eisman等，《人血小板因子4和PF4alt的基因結構和功能比較》，Blood 76336-344，1990)。先導序列的變化提示其分泌方式和表達的組織類型所在有區(qū)別。因此，PF-4的替代品形式也可能是由細胞產(chǎn)生的而非血小板。
人們也公認PF-4富含賴氨酸的C-末端區(qū)域與肝素和有關的氨基葡聚糖牢固結合(Rucinski等《人血小板因子4及其C-末端肽肝素結合和從循環(huán)中清除》，Thrombos.Haemostas.63493-498，1990)。
PF-4的突變形式已被公開作為利用突變體來治療血管形成的疾病。見美國專利5，086，164和5，112，946，在此引用作為參考。這些專利揭示PF-4 C-末端區(qū)域的修飾而產(chǎn)生的類似物再也沒有結合肝素的能力。本發(fā)明公開PF-4的加工后形式MPF-4及CPF-4。
本發(fā)明包含MPF-4成份和CPF-4成份，MPF-4實質(zhì)上由具有序列SEQ.ID.No1氨基酸順序的一種蛋白質(zhì)組成，CPF-4實質(zhì)上由具有序列SEQ ID No1的氨基酸順序的蛋白質(zhì)與具有序列SEQ.ID.No2的氨基酸順序的蛋白質(zhì)以二硫鍵鍵合的蛋白質(zhì)組成。CPF-4的兩條蛋白質(zhì)鏈是由SEQ.ID.No1的Cys-20與SEQ.ID.No2的Cys-10以及SEQ.ID.No1的Cys-36與SEQ.ID.No2的Cys-12以二硫鍵連接。本發(fā)明還包含純化MPF-4及CPF-4的方法，包括反相色譜法→肝素親合層析色譜法→反相色譜法。此外，服用抑制劑量的MPF-4及CPF-4以阻止血管形成的方法也是權利要求的。編碼MPF-4和CPF-4的最終重組DNA化合物也包含在本發(fā)明中，它們是包含這些重組DNA化合物的載體和宿主細胞。


圖1是一個濃度效應曲線，表示MPF-4、CPF-4及PF-4對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。
MPF-4是一個由54個氨基酸殘基組成的自然存在的蛋白質(zhì)，由SDS-PAGE測得其分子量約為七千道爾頓。MPF-4與PF-4C-端的54個殘基100%同源，因而被認為是PF-4的一種加工形式。在SEQ.ID.No1中陳述了MPF-4的氨基酸順序。
CPF-4是一個天然存在的蛋白質(zhì)，由一條含16個氨基酸鏈(SEQ.ID.No2)和一條MPF-4的54個氨基酸鏈(SEQ.ID.No1)組成。CPF-4由SDS-PAGE測得分子量約為7.8-8.0千道爾頓。CPF-4的兩條蛋白鏈在SEQ.ID.No1的Cys-20和SEQ.ID No2的Cys-10間二硫鍵合，另一個二硫鍵橋在SEQ.ID.No1的Cys-36和SEQ.ID.No2的Cys-12之間。
普通的熟練技術人員會明白對這些序列作一些保守氨基酸的替換而不會對本發(fā)明造成有害的影響。保守氨基酸替換包括Gly和Ala間、Asp和Glu間、Asu和Glu間、Phe和Tyr間和Lys和Arg間的替換。
與親本蛋白相似，MPF-4與CPF-4都與肝素結合并抑制內(nèi)皮細胞的生長，這使它們成為用于治療血管形成的及細胞增殖的疾病的有吸引力的候選者。肝素結合區(qū)域認為是SEQ.ID.No1的Lys-45到Lys-50。
給予在此公布的序列資料和固相蛋白質(zhì)合成的技術陳述，可通過化學合成獲得基本純的MPF-4和CPF-4。多肽的固相化學合成原理在技術上是已知的，并且可在此領域的一般教科書中找到，如Dugas，H.和Penney，C.，Bioorganic Chemistry(1981)Springer-Verlag，New York，54-92頁。
例如，肽或蛋白質(zhì)如MPF-4可通過固相方法利用Applied Biosystems 430A肽合成儀(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln center Drive，F(xiàn)oster City，CA94404)以及Applied Biosystems提供的合成循環(huán)合成。Boc氨基酸及其它試劑可從Applied Biosystems以及其它的化學供應商店買到。將利用雙連結法的有順序的Boc化學過程應用于開始的對-甲基二苯甲基胺樹脂以產(chǎn)生C-末端甲酰胺(carboxamides)。用相應的PAM樹脂生成C-末端酸。用預先形成的羥基苯并三唑酯將天冬酰胺、谷氨酰胺及精氨酸連接起來。可使用下列側鏈保護基團Arg，甲苯磺?；鵄sp，環(huán)己基
Glu，環(huán)己基Ser，芐基Thr，芐基Tyr，4-溴芐酯基Boc脫保護可在二氯甲烷中用三氟醋酸完成。合成完成后，肽可在含10%間甲苯酚的無水氟化氫(HF)中脫保護并從樹脂上裂解下來。側鍵保護基的裂解以及肽從樹脂上的裂解可在攝氏零度甚至更低的條件下進行，優(yōu)選在-20℃進行30分鐘再在0℃進行20分鐘。除去HF后，肽/樹脂用乙醚洗滌，肽用冰乙酸提取出來并冷凍干燥。
同樣，分子生物學上的技術陳述給普通的熟練技術人員提供了另一種可獲得基本純的MPF-4和CPF-4的方法。雖然這兩種分子都可用固相肽合成法、從耗盡的培養(yǎng)基中分離或者重組的方法來生產(chǎn)，但是如果想要一個高產(chǎn)量，重組方法是優(yōu)選的。重組生產(chǎn)MPF-4或CPF-4的基本步驟包括a)編碼MPF-4的天然DNA序列的分離或者構建合成或半合成DNA編碼序列，b)將編碼序列放入一個表達載體中，使其能以適當?shù)姆绞絾为毐磉_此蛋白質(zhì)或表達一個融合蛋白質(zhì)，c)用表達載體轉(zhuǎn)化一種合適的真核或原核宿主細胞，d)在允許表達MPF-4或CPF-4的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
e)回收并純化重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，(如果必要)使蛋白質(zhì)再折迭到其天然構象。
正如前面敘述的那樣，兩蛋白質(zhì)的編碼序列可全合成或可對更大的、天然PF-4編碼為DNA修飾后得到。編碼天然PF-4的DNA序列在美國專利No.5，086，164上有描述，并且它可作為重組產(chǎn)生MPF-4的起始原料，或者通過改變天然序列得到前體蛋白質(zhì)以獲得預期結果。
合成的基因，在體內(nèi)或體外經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后將產(chǎn)生MPF-4或CPF-4，這些基因可由已知的技術構建。由于基因密碼天然的簡并性，技術人員會認出一個相當大的編碼MPF-4或CPF-4的確定數(shù)目的DNA序列。
合成基因的構建方法學在技術上是已知的。參見Brown等，(1979)Methods in Enzymology，Academic Press，N.Y.，68卷，109-151頁。編碼MPF-4或CPF-4的DNA序列可根據(jù)在此公布的氨基酸順序和公布的PF-4順序來設計。一旦設計好后，序列本身可利用常規(guī)DNA合成儀器如Applied Biosystems Model 380A或380B DNA合成儀(Applied Biosystems，Inc.，850 Lincoln Center Drive，F(xiàn)oster City，CA94404)來產(chǎn)生。
為了實現(xiàn)MPF-4或CPF-4的表達，人們通過利用合適的核酸限制性內(nèi)切酶，將設計合成的DNA序列插入到許多合適的重組DNA表達載體的任何一種中。通常參見Maniatis等(1989)Molecular Cloning;A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory Press，N.Y.，1-3卷。核酸限制性內(nèi)切酶裂解位點被設計在MPF-4編碼DNA的任何一端以利于整合到已知的擴增和表達載體中以及從中分離出來。使用的特殊核酸內(nèi)切酶是由使用的親本表達載體的核酸限制性內(nèi)切酶裂解圖譜來確定的。限制性位點的選擇是為了以控制調(diào)節(jié)使編碼序列正確定向以獲得正確的框架閱讀以及目的蛋白質(zhì)的表達。編碼序列必須與啟動子和表達載體的核糖體結合部位放在正確的閱讀框架中，在表達此蛋白質(zhì)的宿主細胞中后兩者都是起作用的。
為了獲得合成基因的高效轉(zhuǎn)錄，所述基因必須與一個啟動子-操縱子區(qū)域相聯(lián)接。因此，合成基因的啟動子-操縱子區(qū)域要位于相對于合成基因的ATG起始密碼子順序相同的方向。
用于轉(zhuǎn)化原核和真核細胞的各種表達載體在技術中是已知的。參見The Promega Biological Research Products Catalogue(1992)(Promega Corp.，2800 Woods Hollow Road，Madison WI，53711-5399);和The Stratagene cloning Systems Catalogue(1992)(Stratagene Corp.，11011 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA，92037。而且，美國專利No.4，710，473描述了環(huán)狀DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體，用于大腸桿菌中高水平表達外源基因。這些質(zhì)粒用作重組DNA過程中的轉(zhuǎn)化載體和a)授與質(zhì)粒在宿主細胞中自主復制的能力;
b)涉及維持宿主細胞培養(yǎng)的溫度，調(diào)節(jié)質(zhì)粒自主復制;
c)在宿主細胞群中穩(wěn)定質(zhì)粒的生長;
d)在宿主細胞群中指示質(zhì)粒生長的一種蛋白質(zhì)的直接合成;
e)提供只對質(zhì)粒的幾組核酸限制性內(nèi)切酶識別位點;
f)終止mRNA轉(zhuǎn)錄這些環(huán)狀DNA質(zhì)粒在重組DNA過程可作為有用的載體以獲得外源基因的高水平表達。
構建好表達載體后，下一步是將載體放入一種合適的細胞中，從而構建了一個在目的基因表達中有用的重組宿主細胞。用重組DNA載體轉(zhuǎn)化細胞的技術在技術中是已知的，并可在如Maniatis等(見上)類似的一般參考文獻中找到。宿主細胞可由真核或原核細胞構建。真核宿主細胞能進行表達蛋白質(zhì)的翻譯后糖基化，有一些還能將目的蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中。
原核宿主細胞通常以高速度生產(chǎn)蛋白質(zhì)，它們?nèi)菀着囵B(yǎng)但不能對最終蛋白質(zhì)進行糖基化。在高水平細菌表達系統(tǒng)中表達的蛋白特征地聚集為顆?；虬w，其中含有高水平的過度表達蛋白。一般用已知的技術將這種蛋白質(zhì)聚集體溶解、變性和再折迭，參見Kreuger等，(1990)Protein folding，Gierasch和King出版，136-142頁，American Association for the Advancement of Science Publication No.89-18S，Washington，D.C.;以及美國專利No.4932967。
MPF-4和CPF-4還能從有絲分裂原刺激的PBL制品或產(chǎn)生它們的任何細胞株的耗盡培養(yǎng)基中分離得到。在人PBLs情形中，用技術上已知的任何一種方法將PBLs從全血的血沉棕黃層中分離得到。已發(fā)表的許多制備人PBLs方法中的一個例子是Singh等，《人單核細胞衍生的生長因子的純化和生化性質(zhì)》，Proc.Natl.Acad.Sci.856374-6378，1985。一旦分離后，PBL制品在平衡的鹽溶液中充分漂洗以除去任何非細胞物質(zhì)。
然后將PBL制品接種到含有有絲分裂原的規(guī)定的無血清生長培養(yǎng)基中。普通的技術人員會容易地意識到各種發(fā)表并可買到的適用于培養(yǎng)PBL制品的生長介質(zhì)。類似地，許多能刺激PBL活性的有絲分裂原在技術中上也是已知的。下面是與主題發(fā)明一致的有絲分裂原的實例，它們只用來解釋而不是限定脂多糖(LPS)、植物血凝素(PHA)、伴刀豆蛋白A(ConA)、酵母多糖和一些有絲分裂原決定簇的直接抗體。
PBL制品然后在合適的條件下培養(yǎng)一段時間以生成MPF-4和CPF-4，通常培養(yǎng)一至數(shù)天，這取決于接種的初始濃度。耗盡的培養(yǎng)基再收集起來并通過過濾、離心或其它方法與細胞分開。
不管用什么方法生產(chǎn)MPF-4或CPF-4，都需要純化。許多種蛋白質(zhì)純化技術在技術上均是已知的，其中很多對一般熟練的技術人員來說，按照這里公布的新教導明顯是合適和容易的。一本敘述蛋白質(zhì)純化技術的基本教材是Janson和Ryden的Protein purification，VCH Publishers Inc.，New York，1989。
我們發(fā)現(xiàn)了一種非常有用的純化方法，它包括先將耗盡的培養(yǎng)基加到一種反相純化柱上。這種柱在技術中是已知的，并可從許多賣方買到，包括Pharmacia、Biorad和Amicon。在目的蛋白質(zhì)與柱相互作用時，用逐漸線性增加的一種有機溶劑在三氟乙酸(TFA)中的溶液進行梯度洗脫。優(yōu)選的有機溶劑是乙腈，含有MPF-4和CPF-4的組份在30-50%的乙腈梯度部分發(fā)現(xiàn)。更優(yōu)選的梯度部分是33-39%的區(qū)域。
洗脫下的蛋白質(zhì)然后與肝素親合樹脂接觸。一般熟練的技術人員會容易地意識到這一步最好在柱上以色譜方式進行。肝素親合柱可從上面提到的一些賣方中買到。在這一步，目的分子MPF-4或CPF-4與肝素柱結合并用逐漸線性增加的鹽梯度溶液洗脫。NaCl是優(yōu)選的鹽，優(yōu)選收集的梯度部分是0.1～2.0M部分。收集的更優(yōu)選的梯度部分是0.7～2.0M部分。
最后一步是將0.7～2.0M部分洗脫液上到第二根反相柱并用溶于TFA的乙腈線性梯度洗脫。優(yōu)選梯度是25-75%乙腈，而27-67%更好。柱中流出物用220nm處的吸收度監(jiān)測。峰蛋白質(zhì)部分進行細胞抗增殖活性(生物活性)檢驗。較早顯示生活性的洗脫峰是CPF-4，后面的活性洗脫峰是MPF-4。
下面的實施例對指導純化過程及理解本發(fā)明是有用的。這些實施例僅是為了說明的目的，絕不想以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1從州際血庫購買健康供血者的血液制備得血沉棕黃層。PBL細胞制品是通過histopaqueTM(Sigma chemical Co.，St.Louis，Mo 63178)在4℃進行梯度離心，從匯集的血沉棕黃層中分離得到的。PBL制品用Hank′s平衡鹽溶液(GIBCO;Grand Island，N.Y.)洗滌，以密度為3×106細胞/毫升(總體積為4升)接種到無血清最小基本培養(yǎng)基(GIBCO;Grand Island，N.Y.)中，并補充2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、0.8mM D-葡萄糖、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和20μg/ml的脂多糖(Sigma Chemical Co.;St.Louis，MO 63178)。PBL制品在37℃含5%CO2和95%空氣中培養(yǎng)30小時。收集耗盡培養(yǎng)基，PBLs用0.2μm濾器過濾除去。
實施例24升無細胞耗盡培養(yǎng)基加入0.1%(V/V)三氟乙酸(TFA)酸化，然后以約為15ml/min的流速直接上到反相C4-RP-304TM(250×21.5mm)半制備柱(BioRad，Richmond，CA 94804)上。柱子用在0.1%TFA中的0-50%乙腈線性梯度洗脫約40分鐘，然后用含有50%乙腈的0.1%TFA洗脫10分鐘。流速為15ml/min。大約50分鐘可收集15ml組分。洗脫過程在220nm處監(jiān)測，收集并匯集用33-39%乙腈洗脫的組份(C4-池)。
實施例3C4-池進一步在Econo-pacTM5ml肝素-瓊脂糖cartridge(BioRad，Richmond，CA 94804)上通過肝素親合色譜進行分級。結合的蛋白質(zhì)以流速為2.0ml/min通過含有0-2.0M NaCl的磷酸鹽緩沖液(PBS)線性梯度洗脫。從柱上洗脫的蛋白質(zhì)匯集為3個部分(1)不與肝素結合部分(流過)(2)與肝素低親合性結合部分(0-0.7M NaCl)和(3)與肝素高親合性結合(0.7M-2.0M NaCl)部分。
實施例4將與肝素高親合性結合部分(3)(0.7M-2.0M NaCl)上到預先用含27%乙腈的0.1%TFA平衡的VydacTM0.46×10cm C-4高壓液相柱(The Marshall Co.;Worthington，OH 43085)。該柱用0.1%TFA中線性梯度為27%-67%的乙腈洗脫約40分鐘。監(jiān)測220nm處吸收度并人工收集峰蛋白質(zhì)組分，然后再依實施例5的方法進行生物活性檢測。兩個峰說明了抑制細胞增殖的能力。根據(jù)常規(guī)氨基酸順列分析，發(fā)現(xiàn)較早洗脫下的生物活性峰為CPF-4，后面洗脫下的生物活性峰是MPF-4。
實施例5實際按Buzney等，《視網(wǎng)膜脈管內(nèi)皮細胞和周細胞體外的不同生長特點》，Invest.Ophthalmol.Visual Sci.24470-483(1983)敘述的方法制備原代視網(wǎng)膜毛細管內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物，并按Voyta等，《基于其增加攝取低乙?；芏戎鞍椎膬?nèi)皮細胞的識別和分離》，J.Cell.Biol.992034-2040(1981)敘述的方法分離污染的細胞。
也可以制備牛心臟內(nèi)皮細胞(American Type CultureCollection;Rockville MD 20852)用作檢測。無論哪種來源，內(nèi)皮細胞都接種到24孔組織培養(yǎng)板中，細胞密度為10000細胞/孔，用Dulbecco′s Modified Eagle培養(yǎng)基(GIBCO;Grand Island，N.Y.)，補充了5%牛血清白蛋白、1%青霉素-鏈霉素、1%L-谷氨酰胺和20ng/ml成纖維生長因子。接種細胞后，立即將各種量的PF-4(Sigma Chemical Co.;St.Louis，MO 63178)、MPF-4或CPF-4(按上述實施例中的方法分離得到)加到各個培養(yǎng)孔中。MPF-4和CPF-4試驗終濃度從0.001至1μg/ml。天然PF-4作為對照，試驗濃度為0.001至3μg/ml，并且從只補充培養(yǎng)基作為陰性對照。內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物可在含5%CO2的37℃潮濕組織培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。然后培養(yǎng)物分別用胰酶消化收集，并用Zm-Coulter計數(shù)器(Coulter Electronics.Inc.;Opa Locka FL 33054)計數(shù)。
結果繪制在圖1中，圖中每一點代表四個數(shù)據(jù)點的平均值，也就是每個培養(yǎng)孔是一個數(shù)據(jù)點。結果表明PF-4抑制內(nèi)皮細胞的增殖，半數(shù)有效抑制濃度(IC50)約為800-1000ng/ml(大約130nM)。這些結果與最近發(fā)表的關于重組PF-4抗增殖活性的研究(Science，24777-79(1990)有很好的相關性。數(shù)據(jù)還表明在相同的條件下，MPF-4和CPF-4都是內(nèi)皮細胞增殖更有效的抑制劑。證明MPF-4的半數(shù)抑制濃度為30-50ng/ml(約7nm)，CPF-4的半數(shù)抑制濃度約為150ng/ml(20nm)。MPF-4的抑制濃度與人血漿中PF-4的生理范圍接近(同上)。
序列目錄SEQ ID No1數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長度54個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No1
SEQ ID No2數(shù)據(jù)(ⅰ)序列特征(A)長度16個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No權利要求
1.氨基酸順序為NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH的修飾的血小板因子-4(MPF-4)。
2.氨基酸順序為NH2-Ser-Gln-Val-Arg-Pro-Arg-His-Ile-Thr-Ser-Leu-Glu-Val-Ile-Lys-Ala-Gly-Pro-His-Cys-Pro-Thr-Ala-Gln-Leu-Ile-Ala-Thr-Leu-Lys-Asn-Gly-Arg-Lys-Ile-Cys-Leu-Asp-Leu-Gln-Ala-Pro-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Lys-Leu-Leu-Glu-Ser-COOH.的裂解的血小板因子-4(CPF-4)，它以二硫鍵與氨基酸順序為NH2-Glu-Ala-Glu-Glu-Asp-Gly-Asp-Leu-Gln-Cys-Leu-Cys-Val-Lys-Thr-Thr-COOH的第二個蛋白連接，即MPF-4的Cys-20與第二個蛋白的Cys-10和MPF-4的Cys-36與第二個蛋白的Cys-12以二硫鍵合。
3.含有如權利要求1和2中任何一項所述的一個活性組份MPF-4或CPF-4的藥物制劑，該制劑還含有一個或多個藥學適用的載體、賦形劑或稀釋劑。
4.如權利要求1和2中任何一項所述的用于血管形成抑制劑的MPF-4或CPF-4。
5.如權利要求1和2中任何一項所述的MPF-4或CPF-4的制備方法，包括a)提供含有MPF-4或CPF-4的液體混合物;b)將混合物上到反相純化柱上并收集用30-50%乙腈洗脫下的第一部分洗脫液;c)將從b)中收集的洗脫液與肝素親合樹脂接觸，使MPF-4或CPF-4與肝素親合樹脂結合并從收集的洗脫液中除去與MPF-4或CPF-4結合的樹脂;d)用0.7M到2.0M NaCl從肝素親合樹脂中將第二部分洗脫液洗脫下來;e)將由d)中得到的第二部分洗脫液上樣到第二根反相分析高壓液相色譜柱，同時在200nm波長下監(jiān)測;f)根據(jù)生物活性和220nm波長處的吸收，收集含有MPF-4或CPF-4的級分。
6.權利要求5的方法，其中含有MPF-4或CPF-4的液體混合物是利用權利要求1和2中任何一項的編碼MPF-4或CPF-4的重組DNA化合物產(chǎn)生的。
7.權利要求6的重組DNA化合物。
8.含有權利要求7的一個DNA化合物的重組DNA載體，當轉(zhuǎn)化入一種合適的宿主細胞后，該載體能夠驅(qū)使表達權利要求7的DNA化合物。
9.用權利要求8的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
全文摘要
本發(fā)明基于人血小板因子-4兩種修飾形式的發(fā)現(xiàn)，在此叫做MPF-4或CPF-4，它們是從脂多糖刺激的外周血白細胞的無血清培養(yǎng)基中分離得到的。氨基酸順序測定顯示MPF-4與血小板因子-4自N-末端第17個殘基起同源。CPF-4由MPF-4與血小板因子-4的N-末端16個殘基以二硫鍵合構成。MPF-4和CPF-4都是內(nèi)皮細胞增殖的有效抑制劑，比天然的或重組血小板因子-4效力高約10—100倍，這使它們在治療血管發(fā)生的疾病上有用。
文檔編號C07K14/52GK1088216SQ9311729
公開日1994年6月22日 申請日期1993年9月24日 優(yōu)先權日1992年9月25日
發(fā)明者S·K·古塔, J·P·星 申請人:伊萊利利公司