專利名稱：抗免疫球蛋白等模式標(biāo)本的重整形單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及直接抗免疫球蛋白E(IgE)的等模式標(biāo)本定子的重整形人的單克隆抗體及所述抗體的衍生物。該抗體及其衍生物對于在體外及體內(nèi)診斷、預(yù)防和治療過敏反應(yīng)是有效的。
過敏反應(yīng)是一種由于對外界動因(過敏原)的過度的免疫響應(yīng)而引起的過敏狀態(tài)。特征為與過敏原一接觸而立即產(chǎn)生過敏反應(yīng)的快速過敏性(I型)是由B細(xì)胞為媒介的，而且是基于抗原-抗體反應(yīng)的，而滯后過敏性是以T細(xì)胞為媒介，而且是基于細(xì)胞免疫力機理的。近年來，術(shù)語過敏(allergy)已日漸成為I型過敏性(Hypersensitivity)的同意詞了。
快速過敏性是基于E類免疫球蛋白抗體(IgE抗體)的產(chǎn)生，這種產(chǎn)生是由于B細(xì)胞對抗過敏原分化入抗體而分泌出漿細(xì)胞。IgE所引起的反應(yīng)是一種發(fā)生在過敏原進(jìn)入人體的位點，即粘膜表面和/或局部淋巴結(jié)處的局部癥狀。局部產(chǎn)生的IgE首先使局部肥大細(xì)胞致敏，即IgE抗體結(jié)合到其恒定區(qū)處于該肥大細(xì)胞表面上的Fce受體上，然后“溢出”IgE進(jìn)行循環(huán)，并結(jié)合到循環(huán)嗜堿的和組織固定的周身的肥大細(xì)胞上的受體上。當(dāng)結(jié)合了的IgE接著與反應(yīng)原接觸時，通過與反應(yīng)原結(jié)合使Fce受體交聯(lián)，而這種結(jié)合是通過細(xì)胞脫去并釋放出一些過敏媒介，如組胺、前列腺素leukotrienes等。正是釋放出的這些物質(zhì)是引起典型的快速過敏性的臨床癥狀的主要原因，這些癥狀如呼吸或腸中平滑肌痙孿，微血管擴張和對水的滲透性和原生蛋白質(zhì)的提高，導(dǎo)致如鼻炎、異位、excema和氣喘的粘液分泌，刺激皮膚中的神經(jīng)末稍而導(dǎo)致的痛和癢。
另外，與該過敏原二次接觸的反應(yīng)增加，這是因為在通過在細(xì)胞表面上表達(dá)的IgE與抗原的第一次接觸后，某些B細(xì)胞形成了表面IgE正B細(xì)胞(SlgE+B細(xì)胞)的“記憶池”。
治療過敏的有發(fā)展前途的思路涉及到應(yīng)用單克隆抗體，該抗體是IgE等模式標(biāo)本-特性的，因而能結(jié)合IgE。這種方法基于通過減弱IgE免疫應(yīng)答來抑制過敏反應(yīng)，這種應(yīng)答是誘發(fā)過敏的最早狀況，而且它使過敏狀況得以保持。當(dāng)其它抗體類的應(yīng)答不受影響時，對過敏癥狀的即刻的和長期的效果就可達(dá)到。另外，適于作抗過敏物的抗體應(yīng)與進(jìn)入產(chǎn)生漿細(xì)胞的IgE的表面IgE正B細(xì)胞反應(yīng)，從而使之可用來在功能上消除這些B細(xì)胞。然而，從原則上來說，抗IgE的抗體還可通過交聯(lián)Fce受體誘發(fā)自IgE致敏的肥大細(xì)胞的介質(zhì)的釋放，從而拮抗了施加在血清IgE和Slg+B細(xì)胞水平上的有益效果。因此，可用于治療過敏的抗體不必能與接合在致敏的肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞上的IgE反應(yīng)，但應(yīng)保持識別Slg+B細(xì)胞的能力。
這類IgE等模式標(biāo)本-特征的抗體已由Chang等人(Biotechnology 8.122-126(1990)在PCT申請No.89/06138和歐洲專利申請No.396505中公開。然而由于這類已公開的抗體不是源于人類的，所以它們不適于用于人身，這是因為作為外源蛋白質(zhì)時的免疫原性，它們相當(dāng)時間地持續(xù)在循環(huán)中，以及可能形成破壞的免疫配合物。這些缺點可通過將例如嚙齒類抗-IgE單克隆抗體轉(zhuǎn)化成將可變的嚙齒類抗體區(qū)域與人抗體的恒定區(qū)相結(jié)合的一種嵌合抗體而有可能地得以減少。這方法保留了嚙齒類親本抗-IgE抗體的抗原結(jié)合位點，同時又賦予了人等模式標(biāo)本和效應(yīng)因子功能。然而，就對用于人身而言，這類嵌合抗體在臨床上可能并不充分地優(yōu)于原生的嚙齒類抗體。
通過將嚙齒類的超可變區(qū)，又術(shù)語為補償性確定區(qū)(CDRs)，嫁接到人的輕鏈的和重鏈可變區(qū)域范圍中的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生重整的人抗體，這樣就可進(jìn)一步降低嵌合抗體免疫原性。這種技術(shù)包括對這些在“種屬”的人重鏈和輕鏈可變范圍內(nèi)現(xiàn)存物的抗原-特定嚙齒類CDR序列的替代或重組嫁接(歐洲專利申請No.239400)。可以推斷這種技術(shù)將能把該抗體結(jié)合位點的決定性的和主要位點傳遞到人的抗原中。
天然的完整的免疫球蛋白或抗體包含一個通常是Y型的，有在每上臂端處的抗原結(jié)合位點的四聚分子?？贵w結(jié)合位點由與輕鏈的可變范圍相關(guān)聯(lián)的重鏈可變范圍構(gòu)成。特別是，一種抗原結(jié)合位點基本上由重鏈可變區(qū)(VH)中的三個CDR和輕鏈可變區(qū)(VL)中的三個CDR構(gòu)成。在VL和VH中CDR可同4個骨架區(qū)域(FRS)交替形成下面通式的多肽鏈，通式為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (1)其中，該多肽是按始于N-末端，終于C-末端而被描述的。VH和VL的CDR還分別命名為H1、H2、H3和L1、L2、L3。談到是什么構(gòu)成FR或CDR，通常是通過比較在相同種類中提高的氨基酸序列抗體數(shù)目和本領(lǐng)域中用于鑒別的通用規(guī)則來確定的(“Sequences of proteins of immunological interest”，Kabat E.A.et al.，US depatement of health and human Service，Public health service，National Institute of Health)。
近來發(fā)現(xiàn)輕鏈可變區(qū)對結(jié)合動力學(xué)的作用與相關(guān)的重鏈可變區(qū)的這一作用相比起來是小的，并發(fā)現(xiàn)隔開了的重鏈可變區(qū)對其本身有抗原結(jié)合活性。這類分子通常稱為單區(qū)域抗體，Ward，E.S.et al.，Nature 341，544-546(1989)。
這些CDR在該區(qū)域中形成與b-層結(jié)構(gòu)相連的環(huán)。一個環(huán)的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列間的關(guān)系可用規(guī)范的結(jié)構(gòu)模型來描述(Chothia et al.，Nature 342，887-883(1989))。根據(jù)這種模型，對每一起可變區(qū)而言，抗體僅有少數(shù)主鏈構(gòu)象或“典型結(jié)構(gòu)”。通過該CDR中特定位點上存在的少數(shù)關(guān)鍵氨基酸殘基，對于某些環(huán)而言是存在于框架區(qū)來確定了其構(gòu)象。在這些位點上，在不同免疫蛋白中有相同構(gòu)象的超可變區(qū)有相同的或非常相似的氨基酸殘基。
對產(chǎn)生具有結(jié)合親和力遠(yuǎn)比嚙齒類CDR-供體抗體的這種親合力低的重整人(或人化的)抗體的幾種嚙齒類單克隆抗體已進(jìn)行了CDR緣接。近來的發(fā)現(xiàn)表明，除CDR傳遞之外，在人的序列框架內(nèi)的改變對于提供CDR-嫁接產(chǎn)物中的令人滿意的抗原結(jié)合活性可能是必要的。
Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA86，10029-10033(1989))已公開來源于鼠抗-Tac單克隆抗體的CDR可被嫁接成人的框架中。選擇人的框架以使與鼠序列的同系性為最大。作者還使用鼠親本抗體的計算機模型來確認(rèn)位于FR內(nèi)的氨基酸殘基，所述的FR是接近得足以與該CDR或抗原料在使用的。這些殘基被突變成成鼠序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。這種人化了的抗Tac抗體的親合力僅為鼠格Tac抗體的這一親合力的1/3左右，而保持這種抗體的人的特征還是成問題的。
令人驚奇的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)有可能生產(chǎn)直接抗人IgE的，有抗原，即IgE結(jié)合力的重整人抗體，所述的親合力大約等于或甚至超過鼠的CDR-供體抗體的這一親合力。
因而，本發(fā)明的目的之一是提供專對IgE的重整的人單克隆抗體，它包含至少一種抗原結(jié)合位點，該位點在順序中包括該超可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3;所述的CDR1的氨基酸序列為Met-Tyr-Trp-Leu-Glu，所述的氨基酸序列為Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala，所述的CDR3的序列是Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr，所述的重整的人抗體的抗原結(jié)合親合力具有至少約等于鼠的CDR一供體抗體的親合力，一種所述重整抗體的直接等同物的或衍生物。在SEQID No1序列中所描繪的氨基酸序列中，CDR1從氨基酸31伸展至35、CDR2從氨基酸50伸展至66，而CDR3從氨基酸99伸展至112。該鼠的CDR-供體抗體是單克隆抗體TES-C21。
本發(fā)明優(yōu)選地涉及一種具有至少一個抗原結(jié)合位點的重整的人抗體，所述位點有a)順次包含超可變區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3的第一區(qū)，所述的CDR1的氨基酸序列為Met-Tyr-Trp-Leu-Glu，所述的氨基酸序列為Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala，所述的CDR3的序列是Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr;以及b)順次包含超可變區(qū)域CDR1、CDR2和CDR3的第二區(qū)，所述的CDR1的氨基酸序列為Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His，所述的CDR2的氨基酸序列為Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser，所述的CDR3的氨基酸序列為Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr，所述的重整的人抗體有一種至少與鼠的CDR-供體抗體相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合親合力，有一種所述重整形抗體的直接等同物或衍生物。第一區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3是一種蛋白質(zhì)的CDR，其序列在SEQID No.1序列中被確認(rèn)出來，在SEQIDNo.3序列中所描繪的氨基酸序列中，第二區(qū)的CDR1、CDR2和CDR3分別從24、50、89伸展到34、56和87。
當(dāng)該抗原結(jié)合位點包含第一區(qū)和第二區(qū)二者時，這些位點可位于相同的多肽鏈上，或者最好是每個區(qū)在不同的鏈上，第一區(qū)是一種免疫球蛋白重鏈，或其片斷的一個部分，第二區(qū)是一種免疫球蛋白輕鏈，或其片斷的一個部分。
按本發(fā)明，重整的人抗體指的是一種特征如下的分子(1)它至少包含一種抗原結(jié)合位點，在其中每條存在的鏈都包含一個人類的結(jié)構(gòu)，以及，(2)任何存在的恒定區(qū)至少與人免疫球蛋白恒定區(qū)同源，最好是與之相同。本文所用的“人一類結(jié)構(gòu)”是一種依次由構(gòu)架區(qū)FR1、FR2和FR3構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，它包含至少約70或更多，最好是至少約75或更多個與一種特殊的人免疫球蛋白序列中的氨基酸相同的氨基酸。因此，除可能的重整的人抗體的CDR外，全部都與一種或多種天然人免疫球蛋白序列的相應(yīng)部分同系的，比如，一種重整的人抗體不具有含有鼠的可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。
一種人-類型的構(gòu)架可與特定的人免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)相同，或最好是與該特定的人結(jié)構(gòu)不同，即，一個有限數(shù)目的氨基酸殘基可插入，去除或被其它的氨基酸殘基替代。這類修飾可被限制在單個的FR1、FR2、FR3或FR4，或包括兩種、三種或全部四種FR。比如，人受體結(jié)構(gòu)中的疏水氨基酸可被另種的氨基酸，最好也是疏水的氨基酸，如同系的氨基酸取代，被兩種氨基酸取代，或被去除。同樣，人結(jié)構(gòu)中的親水氨基酸也可被其它的氨基酸，兩種氨基酸所替代，或被去除，因此，取代的氨基酸最好保持了原結(jié)構(gòu)的氫鍵結(jié)構(gòu)。這種修飾可根據(jù)試錯法的基礎(chǔ)完成，即通過對比所產(chǎn)生和重整人抗體與鼠CDR-供體抗體TES-C21的抗原-結(jié)合親合力來評價其效果。適用于確定抗原結(jié)合親合力的分析將于下文敘述。
特別是，所選的人受體結(jié)構(gòu)中的有限數(shù)目的氨基酸殘基，最好是1-12個殘基被存在于鼠單克隆抗體中的相應(yīng)位置上的氨基酸殘基所取代(人H鼠交換)。特別是被鼠TES-C21，和/或被存在于不同人抗體中的相應(yīng)部位上的氨基酸殘基取代(人H人交換)。這種設(shè)想的氨基酸取代最好是基于先前被確認(rèn)的特殊構(gòu)架殘基，它們被認(rèn)為對抗原結(jié)合和/或VL/VH斂集是潛在關(guān)鍵的。這類關(guān)鍵性的氨基酸包括這樣的構(gòu)架殘基，其由于特殊的性質(zhì)和/或位置-被認(rèn)為是與該抗體的CDR中的氨基酸接觸著的或位于其附近的;
-可能參與該抗原的關(guān)鍵性的相互作用;
-被認(rèn)為是參與保持成對的VH/VL結(jié)構(gòu)的完整性，直接或間接影響VH和VL區(qū)中，或期間的相互作用。
已知的適于鑒別所謂的關(guān)鍵氨基酸的方法包括分子模擬法。比如，一種抗原結(jié)合位點的分子模型可通過采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的和一般可得到的計算機程序在計算機監(jiān)視器上形成和顯示。
特別是，本發(fā)明的重整抗體的設(shè)計可包括以下步驟a)構(gòu)造鼠抗體TES-C21的VL和VH的似乎真實分子模式，例如基于1和3號序列中所描繪的氨基酸序列和相應(yīng)的被確定為高度同源的鼠抗體的已知結(jié)構(gòu)，通過序列搭配來構(gòu)造。該已知的結(jié)構(gòu)來源于同樣的鼠抗體或源于兩種不同的鼠抗體。
b)從已知的人免疫球蛋白序列，即從公眾可得的數(shù)據(jù)庫，如KABAT數(shù)據(jù)庫(“Sequence of proteins of immunological interest”Kabat E.A.et al.，US departmant of health and human service public health service National Institute of Health)中可獲得的序列中選擇適宜的人受體構(gòu)架。適宜的人受體構(gòu)架即是來自特定的免疫球蛋白的構(gòu)架，該球蛋白與數(shù)據(jù)庫中所存的序列相比是與抗體TES-C21的VH和VL區(qū)高度同源，而更好是不尋常地同源的，或最好是來自與抗體TES-C21的VH和VL區(qū)高度同源的很多的人抗體的一致的構(gòu)架。為嫁接所選的重和輕鏈構(gòu)架序列無需自相同的人抗體中衍生，但從不同的人抗體產(chǎn)生則為好。
c)構(gòu)造包含鼠TES-C21的CDR和選自符合式I的人受體構(gòu)架FR的重整的人抗體的VH和VL的分子模型。
d)對比得自步驟a)和c)的分子模型。
在本發(fā)明的重整的人抗體中，經(jīng)鑒別的關(guān)鍵氨基酸殘基中的一個，一些或全部均可被另外的氨基酸殘基，特別是被存在于另一個抗體TES-C21中的特定位置上的氨基酸所取代，最好是在所選的人構(gòu)架中的“原來”的氨基酸是不曾被取代的，前提是，它是假設(shè)的規(guī)范結(jié)構(gòu)中的一個部分，或它對確定超可變化環(huán)的結(jié)構(gòu)是重要的。然而，氨基酸的取代不限于關(guān)鍵的氨基酸。最好是，非關(guān)鍵性影響殘基的轉(zhuǎn)變是人-人型的轉(zhuǎn)變。
在本發(fā)明的重整的人抗體中的氨基酸Cys可處于形成-S-S-橋的氧化態(tài)。
本發(fā)明所提供的重整的人抗體的例子包括單區(qū)抗體，單鏈抗體以及完整的多鏈的，如四聚的包含全長度重鏈和輕鏈和其任何片斷，如Fv、F(ab′)2、Fab′和Fab片斷的抗體。
單區(qū)抗體包括一個含單區(qū)的單抗原結(jié)合位點。
單鏈抗體(術(shù)語也叫SCFv)基本上由重鏈和輕鏈的可變區(qū)構(gòu)成。最好是，這些可變區(qū)通過由含約10-30，特別是15個選自甘氨酸和絲氨酸的氨基酸的短肽鍵共價連接的。優(yōu)選的肽鍵是由三個重復(fù)單元Gly-Gly-Gly-Gly-Ser構(gòu)成的15個氨基酸多肽，單鏈抗體既不包括重鏈的，也不包括輕鏈的恒定部分。
本發(fā)明的重整的人抗體是專門針對IgE的，即，它被用來直接對抗人IgE的等模式標(biāo)本決定簇。因此，本發(fā)明的抗體識別IgE類的免疫球蛋白所共有的重鏈上的抗原決定簇，即，它與不同種類的IgE分子反應(yīng)，但不與其它等模式標(biāo)本的免疫球蛋白或免疫球蛋白輕鏈反應(yīng)。
要求本發(fā)明的重整的抗體具有至少約與鼠抗體TES-C21相等的IgE-結(jié)合親合力。如在此前或此后所用的術(shù)語“至少約相等”意指該重整的人抗體(檢測抗體)的IgE-結(jié)合親合力，在統(tǒng)計的基礎(chǔ)上是參比抗體TES-C21的至少約90%，更好是高于90%特別是在約100%和約250%的范圍內(nèi)。重整的抗體與TES-C21的相應(yīng)結(jié)構(gòu)對比。如，如果該重整的抗體是一單區(qū)抗體，那么，它的親合力應(yīng)與單區(qū)TES-C21相關(guān)。在SEQ ID的1和3號序列所給的信息的基礎(chǔ)上，可很容易地制出鼠單區(qū)抗體。在這段敘述中抗體的親合力(“affinity”)和結(jié)合力(“avidity”)沒有區(qū)別，但術(shù)語親合力“affinity”既指親合力“affinity”又指結(jié)合力“avidity”。
參比的和重整的實驗抗體親合力的確定將以同樣的方法，即以相同的條件在相同的分析中進(jìn)行。相互對比的這些抗體的純度應(yīng)相同，最好是用高純度的抗體。
針對IgE的抗體的結(jié)合親合力被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員基于已知技術(shù)和原則用適當(dāng)?shù)亩糠治龊苋菀椎卮_定。
欲測的適宜的參數(shù)是平衡常數(shù)kaff(親合力常數(shù))。已研究出各種數(shù)學(xué)公式以用于抗體-抗原相互間的親合力常數(shù)的實驗性計算。測量Kaff的適宜的實驗方法可以，如有賴于對游離抗原束縛的比例的測量，如競爭性放射免疫分析(RIA)或競爭性酶-鍵合的免疫吸附劑分析(EIA)，或有賴于總的抗體濃度的測量，如由Beatty等所述的非競爭性固相EIA(J.Immunol.Meth 100，173-179(1987))。
最好是在采用CM5表面嵌片的BIA coreTM體系(Phamacia Biosensor，Uppsela，Sweden)上分析此抗體對此IgE的抗體的實際時間的生物特點的相互作用(Jonsson，V.et al.，Biotechniques 11，620-627(1991)來測定Kaff。該項分析基本上按制造者的說明書進(jìn)行，并包括測定動力學(xué)常數(shù)Kass和Kdiss。適宜的抗體比如是，如由Serotec所供的市售人的IgE(如BP094，Dottikon Switzerland)或是一種有人e恒定區(qū)的嵌合抗體，如SE44(Sun et al.，J.Cell.Biol.109，289a(1989))。特別是這種分析包括一種實驗過程，它包括1)采用化學(xué)方法制動該嵌片表面上的所謂傳染性抗體，即對包含鼠抗體TES-C21的一種抗-鼠抗體，如抗-鼠IgE的測量，或?qū)Π景l(fā)明的重整的人抗體的一種抗-人的抗體，如抗-人IgG。
2)將參比的或?qū)嶒灥目贵w與已制動的傳染性抗體結(jié)合。
3)將已結(jié)合的參比的或?qū)嶒灥目贵w與固定濃度的抗原接觸。
最好用定量的已束縛的抗體和可變濃度(已知的)IgE進(jìn)行數(shù)次，比如四次實驗周期。完成每次實驗后，比如用酸，如HCl恢復(fù)此表面。
設(shè)計本發(fā)明的重整的抗體旨在構(gòu)成一種有高結(jié)合率(Kass)，優(yōu)選為2.5×105M-1S-1或更高，而離解率(Kdiss)低的，優(yōu)選為1.9×10-5S-1或更低的抗體。
如本文所述，本發(fā)明的重整的人抗體的直接等同物是一種順次含有1號序列所示的CDR1、CDR2和CDR3，以及任選的示于3號序列的CDR1、CDR2和CDR3的重整的人抗體，其中，在一個可變區(qū)內(nèi)，該CDR中最多有4個氨基酸殘基，即在該CDR中的1、2、3或4個氨基可被其它的氨基酸取代。因此術(shù)語“其直接等同物既指一種單區(qū)重整的人抗體(蛋白質(zhì)Y)(1)其中，超可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3作為一個整體被認(rèn)為是至少90%與SEQ ID的1號序列中所示的CDR同源的，以及(2)它所具有的對IgE的親合力至少約與本發(fā)明的參比蛋白的親合力相等，所述的參比蛋白的FR與蛋白Y的相同，而且其有與SEQ ID1號序列中的CDR相同的CDR;又指每個結(jié)合位點有兩個區(qū)的重整的抗體(蛋白Y′)(1)其中該超可變區(qū)CDR1H、CDR2H、CDR3H和CDR1L、CDR2L和CDR3L作為一整體認(rèn)為至少80%，最好是90%與1和3號序列中所示的CDR同源，而且(2)它的對IgE的親合力至少約與本發(fā)明參比蛋白的親合力相等，所述的參比蛋白FR和恒定部分與蛋白Y′的相同，但它具有與1和3號序列中的等同的超可變區(qū)CDR1H、CDR2H、CDRH和CDR1L、CDR2L、和CDR3L。
后一指標(biāo)可通過測定Kaff，如按上述方法測定來檢測。
鼠單克隆抗體TES-C21顯示(在其它抗體之中)以下特征，此特征也為本發(fā)明的重整的人抗體所共有-它抑制了IgE與帶有Fce受體Ⅰ或Ⅱ的細(xì)胞的結(jié)合;
-專與人-IgE分泌細(xì)胞結(jié)合;
-不識別和不結(jié)合已結(jié)合在帶有Fce受體Ⅰ或Ⅱ的細(xì)胞，如已致敏的肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞，表面上的IgE;
-不觸發(fā)介質(zhì)(如組胺)釋放;
-抑制IgE在免疫應(yīng)答中的形成。
這些有特征性的能力可用本技術(shù)領(lǐng)域中的已知方法，如公開在歐洲申請No.396505中的方法測定，該申請經(jīng)參閱已引入本文。
本發(fā)明較佳的重整的抗體或其衍生物至少含有a)一種免疫球蛋白重鏈或其斷片，它含有順次包含超可變區(qū)CDR1H、CDR2H和CDR3H的可變區(qū)域，以及人重鏈的恒定部分或其斷片，所述的CDR1H的氨基酸序列有Met-Tyr-Trp-Leu-Glu，所述的CDR2H的氨基酸序列有Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala，所述的CDR3H的氨基酸的序列是Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr;和b)一種免疫球蛋白輕鏈或其斷片，它包含一個輕鏈可變區(qū)和一個輕鏈的恒定部分或其斷片，所述可變區(qū)順次包含超可變區(qū)CDR1LCDR2L和CDR3L，所述的CDR1L的氨基酸序列為Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His，所述的CDR2L的氨基酸序列為Tyr-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser，所述的CDR3L的氨基酸序列為Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr。
免疫球蛋白的重鏈或輕鏈斷片是一種重鏈或輕鏈，它不是全長度鏈，但包含一可變區(qū)和任選地包含該鏈恒定區(qū)的部分。
更為優(yōu)選的重整的人抗體或其衍生物至少包含a)有一個可變區(qū)的重鏈，而該可變區(qū)的氨基酸序列基本上與11號序列中所示的相同，該序列起始于1位上的氨基酸而終止于123位上的氨基酸，該可變區(qū)還具有人重鏈的恒定部分;以及b)在一個可變區(qū)的輕鏈，該可變區(qū)的氨基酸序列基本上與5號序列中所示的相同，該序列起始于1位上的氨基酸序列而終止于107位上的氨基酸，該可變區(qū)還具有人輕鏈的恒定部分;
重整的人抗體或其衍生物是特別優(yōu)選的，其至少包含a)有一個可變區(qū)的重鏈，該可變區(qū)的氨基酸序列基本上與13號序列中所示的相同，該序列起始于1位上的氨基酸而終止于123位上的氨基酸，該可變區(qū)還具有人重鏈的恒定部分;以及b)有一可變區(qū)的輕鏈，該可變區(qū)的氨基酸序列與5號序列中所示的基本相同，該序列始于1位氨基酸而終于107位氨基酸，該可變區(qū)還具有人輕鏈的恒定部分;
本申請中的殘基符號與氨基酸殘基的直線編碼相對應(yīng)。
人的重鏈的恒定部分可選自等模式標(biāo)本(a)、(b)、(g)或(μ)中的任幾種，各種次級重鏈，如IgG1-4次級都可用。人gl鏈的恒定部分是優(yōu)選的。重鏈中的不同級和次級參與不同的效應(yīng)子功能。因此，通過挑選重鏈恒定區(qū)的類型，就可產(chǎn)生出有所需效應(yīng)子功能的重鏈抗體。輕鏈恒定區(qū)是(1)鏈，優(yōu)選的是(k)鏈。
由細(xì)胞系EH31.8所產(chǎn)生，編號為H3L1的重整的人抗體是最好的。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的重整的人抗體的衍生物。重整的人抗體的一種衍生物具有所述抗體的抗原特性。根據(jù)本發(fā)明，衍生物指的是任意可通過修飾本發(fā)明的抗體而獲得的分子，所述的修飾比如是吸附或化學(xué)改性。比如，按衍生物的目的用途，可通過與蛋白質(zhì)的，或非蛋白質(zhì)的分子的共價的或非共價的聯(lián)接而衍生出本發(fā)明的抗體。比如用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的偶合技術(shù)就可得到共價結(jié)合而產(chǎn)生的抗體軛合物。在類軛合物中抗體直接與共軛配偶體結(jié)合，或以隔離物或直線基團的方式結(jié)合。衍生物的例子是本發(fā)明的放射性標(biāo)記的重整的人抗體和重整的人抗體的軛合物，如帶有酶的，一種熒光的或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，一種適宜的細(xì)胞溶解或抑制細(xì)胞的物質(zhì)，一種金屬螯合物，一種非酶的蛋白，如抗生物素蛋白，或帶有非-蛋白質(zhì)的分子，如生物素的重整的人抗體和其軛合物。
用于本發(fā)明抗體軛合物的酶比如是辣根過氧化酶、堿性磷酸鹽酶、b-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、堿性磷酸鹽酶、碳酸酐酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶或葡糖-6-磷酸酯脫氫酶。
熒光標(biāo)記物包括熒光素;熒光染料、若丹明等類似物。
化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物是魯米諾的2，3-喹啉二羧酸鎓(acridinium)酯。
金屬螯合物的例子是乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DPIA)、1，4，8，11-四吖十四烷、1，4，8，11-四吖十四烷-1，4，8，11-四乙酸、1-噁-4，7，12，15-四吖十七烷-4，7，12，15-四乙酸等。
本發(fā)明的放射性標(biāo)記抗體或其斷片含有如放射性碘(123I、125I、131I)，氚(3H)、碳(14C)、硫(35S)、釔(90Y)锝(99mTC)等。
本發(fā)明還涉及制備本發(fā)明的抗IgE重整的人抗體，其直接等同物和衍生物的方法。
本發(fā)明的重整的人抗體，其直接等同物或衍生物用其本身是已知的方法制備，該方法的特征是下文將進(jìn)一步定義的產(chǎn)生本發(fā)明蛋白的寄主細(xì)胞在體內(nèi)或體外增殖，若需要，將所需的蛋白分離出來，并任選地將其轉(zhuǎn)化成其衍生物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)用一種方法制備，該方法包括在可表達(dá)所述蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)任何適宜的可轉(zhuǎn)化的寄主，分離所述蛋白并任選地通過蛋白水解分裂將分離出的蛋白轉(zhuǎn)變成本發(fā)明的另種蛋白，或比如將另一種化合物，如上述的蛋白或一種非蛋白質(zhì)的分子按上述的方法進(jìn)行連接而轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的衍生物。
在本發(fā)明的一較佳實施例中提供了一種產(chǎn)生多鏈抗-IgE重整的人抗體的方法，該方法包括(1)用下文將定義的本發(fā)明的第一和第二DNA構(gòu)成物培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的適宜的寄主細(xì)胞，及(2)從該培養(yǎng)物中恢復(fù)活性的抗IgE重整的人抗體。在本文的上下文中，活性抗體是一種專與IgE結(jié)合的抗體。多鏈抗體是一種至少包含具有一個重鏈和一輕鏈可變區(qū)的至少一個抗原結(jié)合位點的抗體。
可以選擇的是，可將重鏈和輕鏈分別恢復(fù)并在體外折疊后重新構(gòu)成一種活性抗體。適宜的重構(gòu)方法是為本技術(shù)領(lǐng)域中普通技術(shù)人員熟知的。因此，產(chǎn)生本發(fā)明的多鏈抗體的方法還包括(1)以本發(fā)明的第一DNA構(gòu)成物培養(yǎng)已轉(zhuǎn)變的第一寄主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中恢復(fù)所述的重鏈或其斷片，及(2)以本發(fā)明的第二DNA構(gòu)成物培養(yǎng)已轉(zhuǎn)變的第二寄主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)基中恢復(fù)所述的輕鏈或其斷片，以及(3)以得于(1)的重鏈或其斷片和得于(2)中的輕鏈及其斷片在體內(nèi)重構(gòu)活性的抗-IgE重整的抗體。
還以類似的方式提供了產(chǎn)生本發(fā)明單鏈或單區(qū)的重整的人抗體的方法。該法包括(1)以分別對本發(fā)明的單鏈或單區(qū)重整的人抗體編碼的DNA構(gòu)成培養(yǎng)一種已轉(zhuǎn)變的寄主細(xì)胞，及(2)從培養(yǎng)基中恢復(fù)所述的多肽。
該重整的人抗體的斷片，如Fab、Fab′或F(ab′)2斷片可用上述的重組DNA技術(shù)制成，或用上文已提及的實際上已知的方法，如通過用酶，如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化和/或用化學(xué)反應(yīng)分裂二硫化物鍵從如上述的已制得的無損傷的多鏈重整白人抗體制成。
適宜的寄主細(xì)胞包括真核細(xì)胞，如動物細(xì)胞、植物細(xì)胞和真菌，和原核細(xì)胞，如革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，如E.coli。較佳的真核寄主細(xì)胞是哺乳動物源的細(xì)胞和酵母細(xì)胞。
在上下文所用的體外(in vitro)意指非體內(nèi)(ex vivo)，因此這就包括如細(xì)胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)條件。
比如，在適宜的培養(yǎng)基中于體外增殖哺乳動物細(xì)胞，該培養(yǎng)基是慣例的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，如Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM)或RPMI1640介質(zhì)，任選地補充了哺乳動物血清，如胎牛血清，或痕量元素和生長持久補充劑，如諸如通常的鼠腹膜滲出物細(xì)胞、脾細(xì)胞、骨髓巨噬細(xì)胞之類的喂養(yǎng)細(xì)胞、2-氨基乙醇、胰島素、鐵傳遞蛋白、低密度脂蛋白、油酸等。
體外產(chǎn)生提供了相當(dāng)純的抗體制品，并使之傳遞增以得到大量的所期望的抗體。培養(yǎng)細(xì)菌細(xì)胞、酵母和哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，而且包括均勻懸浮液培養(yǎng)，如在空氣提升反應(yīng)器或在連續(xù)攪拌反應(yīng)器中培養(yǎng)，或制動或捕捉細(xì)胞培養(yǎng)物，如在中空纖維中，在微囊中，在瓊脂糖微珠上或陶瓷盒中進(jìn)行的培養(yǎng)。
也可通過體內(nèi)繁殖哺乳動物細(xì)胞來獲取大量的本發(fā)明的所期望的重整的人抗體。為此，將產(chǎn)生所需抗體的雜交細(xì)胞注入組織適宜的哺乳動物中，以引發(fā)產(chǎn)生腫瘤抗體的生長。任選地，在注射前，用碳?xì)浠?，特別是礦物油，如姥鮫烷(四甲基十五烷)使此動物作好準(zhǔn)備。1-3周后，從這些哺乳動物的體液中分離出抗體。比如，將產(chǎn)自雜交細(xì)胞系Sp2/0的，產(chǎn)生所需抗體的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以腹膜注射注入最好用姥鮫烷預(yù)處理過的Balb/c鼠中，1-2周后從該動物中提取腹水流體。
為得到所需的重整的人抗體篩選該細(xì)胞培養(yǎng)上清液，優(yōu)選采用酶免疫分析法，如多層分析或點分析，或用人IgE作抗原的放射免疫分析。如，可用多層酶分析來確定是否在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中存在正確組合的免疫球蛋白，借此使用直接對著該輕鏈人恒定區(qū)K或I(當(dāng)適合時)的抗體和直接鄰對該重鏈人恒定區(qū)的另一抗體，如所需次級的抗體，其中之一被復(fù)蓋到一固體支撐物上，而另一被共軛到可用適宜的酶基質(zhì)監(jiān)測的酶上。這類免疫分析比如是一種酶鍵合的免疫吸附分析(ELISA)，其中一適宜的載體，如塑性微滴定板覆以免疫球蛋白E，然后用待測的培養(yǎng)上清液進(jìn)行培養(yǎng)。通過在該上清液中用酶標(biāo)記的，識別抗-IgE抗體的抗體的培養(yǎng)，然后接著添加適宜的酶培養(yǎng)基溶液來檢測已結(jié)合的單克隆抗體。該酶培養(yǎng)基反應(yīng)比如導(dǎo)致可用肉眼觀察到的或用光學(xué)測量裝置觀察到的顏色變化。
為分離此重整的人抗體，則可將該培養(yǎng)物上清液中的，或該腹水流體中的免疫球蛋白濃縮，如通過用硫酸銨沉淀，抗吸濕材料如PEG滲析用選擇性膜過濾等方法濃縮。如果需要和/或必要，用慣用的色譜法，如凝膠過濾、離子交換色譜法、疏水相互反應(yīng)色譜法或親合性色譜法，如免疫親合性色譜法提純該抗體。最好是，將該重整的人抗體與含它們的細(xì)胞上清液中分離，所用的方法包括一種色譜提純步驟，如親合性色譜法，比如采用Protein A(如果本發(fā)明的抗體含有-Fc部分)的親合性色譜法、離子交換色譜法和/或凝膠過濾法。
用本身為已知的方法，如通過將本發(fā)明的重整人抗體吸附于另一種化合物，或通過偶合提供化學(xué)結(jié)合的軛合物來制備本發(fā)明的重整人抗體衍生物。含蛋白，如一種酶的本發(fā)明抗體的軛合物，比如是通過使按上述方法制得的抗體與該蛋白在有偶合劑存在時進(jìn)行反應(yīng)，偶合劑如，戊二醛、高碘酸酯、N-N′-O-亞苯基二馬來酰亞胺、N-(m-馬來酰亞胺基苯甲酸基)-琥珀酰亞胺、N-(3-[2′-吡啶基二硫基]-丙?；?-琥珀酰亞胺、N-乙基-N-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺等。含生物素的軛合物，比如是通過使抗體與一種生物素的活化的酯，如生物素羥基-琥珀酰亞胺酯反應(yīng)而制成。含熒光的或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的軛合物是在有如上在所列的偶合劑存在時，或通過與一種異硫氰酸鹽，優(yōu)選是熒光素-異硫氰酸鹽反應(yīng)而制得。
用碘(123I、125I、131I)的放射性標(biāo)記的重整的抗體是通過根據(jù)本身已知的方法碘化而從本發(fā)明的抗體中獲得的，該碘化比如用放射活性鈉或鉀的碘化物和一種化學(xué)氧化劑，如次氯酸鈉、氯胺T或類似物，或一種酶氧化劑，如乳過氧化酶;或葡糖氧化酶和葡萄糖進(jìn)行的。本發(fā)明的抗體或斷片，比如通過二亞乙基三胺五乙酸-螯合作用而與釔90Y偶合。锝-99m標(biāo)記的抗體或斷片通過脂交換方法，如通過用亞錫離子溶液還原锝酸鹽(TcO4-)，將還原的锝螯合到Sephadex柱上再將該抗體施于該柱而制得，或用直接標(biāo)記技術(shù)用如高锝鹽，一種還原劑，如SnCl2，一種緩沖溶液，如鈉-鉀的磷酸鹽和本發(fā)明的抗體培養(yǎng)制得。
也可直接用重組DNA技術(shù)，如下面將述及的技術(shù)制成與蛋白結(jié)合的本發(fā)明抗體的軛合物。
制備本發(fā)明的一種重整的人抗體，或其一種直接等同物或衍生物的方法應(yīng)產(chǎn)生其量足供親合力和特性測定的所需的蛋白。
本發(fā)明還涉及對本發(fā)明的重整的人抗體及其直接等同物編碼的重組體DNA。以一種非常通用的方式提供了將本發(fā)明的單區(qū)重整的人抗體、單鏈重整的人抗體，本發(fā)明的重整的人抗體的重鏈或輕鏈或其斷片編碼的DNA分子。經(jīng)確定，這類DNA包括編碼單線DNA，由所述編碼DNA此外和補償DNA，或這些補償DNA(單線的)本身構(gòu)成的雙線DNA。特別是本發(fā)明涉及下述的第一和第二DNA構(gòu)成物。
第一DNA構(gòu)成物將一重鏈或其斷片編碼，而且包括a)對任選地包含F(xiàn)R和CDR的可變區(qū)編碼的第一部分，所述的CDR按順序是CDR1H、CDR2H、CDR3H，它們在1號序列中的氨基酸序列分別從31、50和99位伸展至35、66和112位;第一部分起始于將該可變區(qū)的第一個氨基酸編碼的密碼子，而終止于將可變區(qū)最后一個氨基酸編碼的密碼子，而且還任選地含b)對-人重鏈恒定區(qū)部分或其斷片編碼的第二部分，它始于將該重鏈的恒定部分的第一氨基酸編碼的密碼子，而終于將其恒定部分或其斷片的最后一個氨基酸編碼的密碼子，接著的是一個無意義的密碼子。較好是，這第一部分編碼-可變區(qū)，其氨基酸序列基本上與13號序列中所描述的氨基酸相同，其序列始于1位氨基酸終于123位氨基酸。更好是此第一部分有一示于13號序列的核苷酸序列，它始于79位上的核苷酸而終于447位上的核苷酸。這第二部分可以是基因源的DNA斷片(包括基因內(nèi)區(qū))，或一種cDNA斷片(不含基因內(nèi)區(qū))。如果存在，將gl鏈恒定部分編碼的第二部分是優(yōu)選的。
該第二DNA構(gòu)成物將一輕鏈及其斷片編碼并含有a)一個對任選地含有FR和CDR的可變區(qū)編碼的第一部分，所述CDR依次是CDR1L、CDR2L和CDR3L，它們在3號序列中的氨基酸序列中自24、50和89位分別伸展至34、56、97位;這第一部分始于將該可變區(qū)的第一氨基酸編碼的密碼子，而終于將該可變區(qū)的最后一個氨基酸編碼的密碼子，及，任選地含有b)將一人輕鏈恒定部分或其斷片編碼的第二部分，它始于對此輕鏈的恒定部分的第一氨基酸編碼的密碼子，而終于對該恒定部分或其斷片的最后一個氨基酸編碼的密碼子，接著是一個無義密碼子。較佳的是，這第一部分對具有氨基酸序列基本與5號序列中所描繪的氨基酸序相同的可變區(qū)編碼，該序列始于1位上的氨基酸而終于107位的氨基酸。更佳的是，這第一部分有如5號序列所示的核苷酸序列，它始于82位上的核苷酸而終于403位上的核苷酸。這第二部分可以是基因源的一個DNA斷片(包含基因內(nèi)區(qū))或是-cDNA斷片(無基因內(nèi)區(qū))。如果存在，將此K鏈的恒定部分編碼的第二部分是優(yōu)選的。
含有此第二和第二部分的第一和第二DNA構(gòu)成物是優(yōu)選的。在這種情況下，第一和第二部分通過基因內(nèi)區(qū)序列分隔開。
有益的是，這第一和第二DNA構(gòu)成物含有一第三部分，它位于該第一部分的上游，而且它將一引導(dǎo)肽(leader peptide)編碼;這第三部分始于將該引導(dǎo)肽的第一氨基酸編碼的密碼子而終于將該引導(dǎo)肽的最后氨基酸編碼的密碼子。一種適宜的引導(dǎo)肽是被該寄主有機體要求分泌出鏈的肽，其中，鏈被表達(dá)，而且接著被該寄主排除。較佳的是，第一和第二DNA構(gòu)成物的第三部分將一免疫球蛋白的基因的引導(dǎo)肽編碼。最佳的是，該第一DNA構(gòu)成物的第三部分對具有氨基酸序列基本上與13號序列中所示的序列相同的引導(dǎo)肽編碼，13號序列始于在-19位的氨基酸而終于-1位的氨基酸。最佳的還有，第二DNA構(gòu)成物的第三部分對具有氨基酸序列基本上同于5號序列中所示的氨基酸序列的引導(dǎo)肽編碼，0號其序列始于-20位上的氨基酸而終于-1位上的氨基酸。
本發(fā)明還涉及為本發(fā)明重整的人抗體的直接等同物編碼的重組體DNA和為本發(fā)明抗體的與一蛋白偶合的軛合物編碼的重組體DNA。
本技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)現(xiàn)狀是這樣的本技術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員得到本文所提供的信息，即CDR的氨基酸序列和對其編碼的DNA序列(1和3號序列)就能夠合成本發(fā)明的DNA分子。獲得將本發(fā)明重整的人抗體可變區(qū)編碼的DNA構(gòu)成物的方法包括合成一些低核苷酸，用PCR法使其增殖以及為得到所需的DNA序列使它們連接。為構(gòu)成一可變區(qū)基因的可供選擇的方法是-克隆一對有任意物特性的人單克隆編碼的基因，-確定將FR和CDR編碼的該DNA的片段，-去除CDR編碼的DNA片段，以使對此FR編碼的DNA片段與適宜的限制位點在結(jié)合處融合在一起，-根據(jù)上面鑒定的1和3號序列中的序列制備雙線合成CDR盒，所述盒有粘性末端，-將此盒綁扎在此FR結(jié)點處(歐洲專利申請No239400)。
如果愿意，可用各種已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，如用誘發(fā)隨機突變或位點定向的誘變法使該DNA構(gòu)成物發(fā)生突變。在為本發(fā)明的重整的人抗體編碼的DNA構(gòu)成物中，誘變不會導(dǎo)致CDR內(nèi)的任何氨基酸的改變。在對為本發(fā)明重整的人抗體的直接等同物編碼的DNA構(gòu)成物中，用另一核苷酸替代-核苷酸有可能改變一個或多個CDR中的氨基酸序列。
為本發(fā)明的重整的人抗體的直接等同物編碼的DNA可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法，如隨機突變或位點定向誘導(dǎo)對本發(fā)明的重整的人抗體編碼的DNA來制備。不是不活動突變而是導(dǎo)致位于CDR內(nèi)的至少一個氨基酸殘基取代的這種突變會產(chǎn)生為本發(fā)明的重整的人抗體的直接等同物編碼的DNA，前提是如果這樣產(chǎn)生的蛋白滿足上述規(guī)定。
如在本說明書以下部位所用的，本發(fā)明的重整的人抗體意味著包括其直接等同物。
此外，本發(fā)明還涉及一種重組體DNA，它是一種雜交的載體，它包括至少一種上述的DNA構(gòu)成物，如為一輕鏈可變區(qū)和/或一重鏈可變區(qū)編碼的插入物，所述載體是可在一原核的和/或真核的寄主中復(fù)制的。
本發(fā)明優(yōu)選的雜交載體包含一種為本文前述的輕鏈編碼的插入物和/或為本文前述重鏈編碼的插入物。
本發(fā)明的雜交載體包括一復(fù)制源或一自發(fā)復(fù)制序列，一個或多個主要標(biāo)志序列和，任選地，表達(dá)控制序列，信號序列和附加的限制位點。
較佳的是，本發(fā)明的雜交載體包括一上述的可行地鍵聯(lián)于一表達(dá)控制序列上的插入物，這些在下文將專門描述。
載體一般與可相容的寄主細(xì)胞協(xié)同完成兩個功能。一個是促使將該免疫球蛋白鏈編碼的核酸的克隆，即產(chǎn)生可用量的核酸(克隆載體)。另一功能是在適宜的寄主中提供基因構(gòu)成物的復(fù)制和表達(dá)，方法或是保持作為染色體外元素，或是合并到寄主染色體中(表達(dá)載體)。一個克隆載體包含上述的基因構(gòu)成物，一個復(fù)制源或一自發(fā)復(fù)制序列，可選擇的標(biāo)志序列和，任選地，包括信號序列和附助的限制位點。一表達(dá)載體還另外包含表達(dá)控制序列，它主要用于基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的。
一種復(fù)制源或一種自發(fā)復(fù)制序列或由包括外生源，如產(chǎn)自Simina病毒40(SV40)或其它病毒源的載體結(jié)構(gòu)，或由該寄主細(xì)胞的染色體機構(gòu)提供。
該標(biāo)志可允許選擇含該載體的寄主細(xì)胞。選擇標(biāo)志包括提供抗重金屬如對銅的抗性，或提供對抗體，如四環(huán)素，氨芐青霉素geneticin(G-418)、新霉素、卡納霉素、潮霉素抗性的基因，或補償該寄主細(xì)胞基因損傷，如缺乏胸腺激酶，次黃嘌呤磷酰轉(zhuǎn)移酶、二氯葉酸還原酶等的基因。
信號序列比如可以是對引導(dǎo)抗體分泌的引導(dǎo)肽編碼的前序列或分泌引導(dǎo)、并合信號等。
作為表達(dá)控制序列，該載體DNA包括一啟動子，為起始和終止轉(zhuǎn)錄和為穩(wěn)定mRNA所必須的序列，以及，任選地包括強化因子和其它的調(diào)節(jié)序列。按該寄主細(xì)胞的特性可采用多種起動序列。很強的、同時也很易調(diào)節(jié)的啟動子是最有用的。起始轉(zhuǎn)錄的序列比如是Shine-Dalgano序列。為起始和終止轉(zhuǎn)錄及為穩(wěn)定該mRNA所必需的序列通?？煞謩e得自病毒的或真核的cDNA，如得自表達(dá)寄主，的不編碼的5′-區(qū)和3′-區(qū)。強化因子是基因或病毒源的轉(zhuǎn)錄-刺激DNA序列，如產(chǎn)生于Simima病毒、多形瘤病毒、牛乳頭瘤病毒、Moloney肉瘤病毒，或特別是產(chǎn)生于人涎脘病毒的病毒源。
該載體DNA的各種DNA片段可被鍵合，即它們彼此接合并處于功能上的互相關(guān)系。
適于在一種E.Coli菌株中復(fù)制和表達(dá)的載體的例子是噬菌體，如λ噬菌體的衍生物，或質(zhì)粒。適宜的載體包括一完整的復(fù)制子，一種標(biāo)志基因、限制核酸內(nèi)切酶的識別序列，從而使外來DNA，以及，如果適合，該表達(dá)控制序列可被嵌在這些位點上，以及信號序列和強化因子上。本發(fā)明的表達(dá)載體包含一含有定義如上的含有適宜的啟動子和DNA結(jié)構(gòu)成物的表達(dá)盒，該DNA是為所述啟動子所控制。
微生物啟動子比如是噬菌體λ的強向左的啟動子PL，它受溫度敏感阻遏物控制。E.Coli啟動子，如被乳糖阻遏物調(diào)節(jié)的和被異丙基-β-D-硫代半乳糖苷引發(fā)的乳糖啟動子，被色氨酸阻遏物調(diào)節(jié)的，和被如色氨酸缺乏而誘發(fā)的，以及被乳糖阻遏物調(diào)節(jié)的雜文色氨酸一乳糖啟動子調(diào)節(jié)的乳糖啟動子也是適宜的。
適于在酵母中復(fù)制和表達(dá)的載體含有對酵母的復(fù)制起始和可選擇的基因標(biāo)志。這類載體中的一組包括作為復(fù)制源的稱之為ars序列(自發(fā)復(fù)制序列)。這些載體在轉(zhuǎn)化和自發(fā)復(fù)制后被滯留在染色體外的酵母細(xì)胞內(nèi)。此外含全部或部分得自Saccharomyces cerevisise的2μ(2微克)質(zhì)粒DNA也可用，這類載體將通過重組入已存在于該細(xì)胞中的2μ質(zhì)粒，而得以完整，或自發(fā)復(fù)制。當(dāng)要達(dá)到高轉(zhuǎn)化頻率和高復(fù)制數(shù)時，2μ序列是尤為適宜的。
適于在酵母表達(dá)中的表達(dá)控制序列比如是被高度表達(dá)的酵母基因序列。因而，對TRPI基因，ADHⅠ基因或ADHⅡ基因，酸性磷酸酶(PHO3或PHO5)基因，異細(xì)胞色素基因的啟動子或與糖酵解途徑有關(guān)的啟動子。如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸鹽激酶(PGK)、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸蘋果糖激酶、葡糖-6-磷酸鹽異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶基因的啟動子是可用的。
適用于哺乳動物寄主細(xì)胞的啟動子可從人的免疫蛋白基因中獲得或從諸如Simiana病毒40(SV40)，Rous sarcoma病毒adeno病毒(RSV)、adeno病毒2，bovine papilloma病毒(BPV)，papova病毒BK突變體(BKV)，或鼠或人的細(xì)胞肥大病毒(CMV)中來獲得。人的CMV啟動子是較佳的。任選地，該載體可含有得自哺乳動物表達(dá)產(chǎn)物的啟動子，如肌動蛋白、膠原蛋白、肌球蛋白等的啟動子，或天然啟動子和通常與該免疫球蛋白基因序列有關(guān)的控制序列。
該載體可適用于原核的和真核的寄主。本發(fā)明的DNA分子一旦制成，則可將其很方便地轉(zhuǎn)錄到適宜的表達(dá)載體中。包括適宜的啟動子和將重和輕鏈恒定部分編碼的基因的表達(dá)載體是公眾可得的。
用于該輕鏈和該重鏈的基因構(gòu)成物借助兩種載體順次地或同時地轉(zhuǎn)移到該寄主細(xì)胞。任選地，將重鏈和輕鏈二者克隆入同一雜交載體，并以一步工藝按單一構(gòu)成物并入該寄主細(xì)胞中。一種第三選擇方法利用共轉(zhuǎn)染沒鍵合的DNA斷片。
所需的重整的人抗體編碼的重組體DNA，比如可通過培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞而制得。
特別是，這類DNA可用包括下述步驟的方法制備。
a)制備了專對IgE的重整的人抗體的可變重鏈和/或輕鏈可變區(qū)編碼的DNA;
b)制備為一種人抗體的重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)編碼的DNA，如通過將DNA從基因庫分離及用DNA探針選擇所需的為抗體所述恒定區(qū)編碼的DNA;
c)將步驟a)或a)和b)的DNA并入到適宜的雜交載體中;
d)將所得的雜交載體轉(zhuǎn)移到受體寄主細(xì)胞或恢復(fù)為此所需基因編碼的DNA，再將此未鍵合的DNA轉(zhuǎn)入適宜的受體寄主細(xì)胞中;
e)選擇和培養(yǎng)此已轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞，并任選地;
f)分離所需的DNA。
將上述方法b)的基因組人的DNA自適宜的人組織。最好是從人胎盤或人的胎肝細(xì)胞中，以本技術(shù)領(lǐng)域的已知方法分離出來。根據(jù)已確定的步驟通過用適當(dāng)?shù)?，限制性?nèi)切酶限制消化由此構(gòu)成一遺傳DNA庫。復(fù)制此基因組的DNA庫，如在消化纖維膜上復(fù)制，然后用DNA探針篩選感興趣的此DNA序列。該所需的DNA可用PCR技術(shù)放大。
下文將述及轉(zhuǎn)移該重組體，如轉(zhuǎn)移雜交載體，以及選擇已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
此外，本發(fā)明還涉及一種以上述重組體DNA轉(zhuǎn)變的適宜的寄主細(xì)胞。即稱之為以對該輕鏈編碼的DNA和/或?qū)λＭ谋景l(fā)明的重整的人抗體的重鏈編碼的DNA轉(zhuǎn)變的寄主細(xì)胞。對每個細(xì)胞含大量該載體復(fù)制的寄主細(xì)胞是優(yōu)選的。
本發(fā)明的寄主細(xì)胞必須能在體外培養(yǎng)。適宜的寄主細(xì)胞是原核源或真核源的寄主細(xì)胞，而且包括細(xì)菌細(xì)胞，特別是E.Coli.酵母，如Saccharomyces啤酒酵母細(xì)胞，或哺乳動物細(xì)胞。為提供適于功能四聚抗體產(chǎn)生的環(huán)境，真核的，特別是哺乳動物或酵母源的寄主細(xì)胞是優(yōu)選的，因為功能的四聚物抗體分子的生物合成需要正確的新生的多肽鏈疊合和組合。原核細(xì)胞，尤其是E.Coli.可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體斷片。如Fab及Fv斷片。
適宜的寄主的例子是缺乏或沒有限制性或修飾性的酶的微生物，如細(xì)菌，特別是Escherichia coli菌株，以及酵母，比如，Saccharomyces啤酒酵母。
本發(fā)明優(yōu)選的寄主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，如COS-7細(xì)胞、Bowes黑素瘤細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、胎肺細(xì)胞L-132及淋巴結(jié)源的哺乳動物細(xì)胞，如淋巴瘤、骨髓瘤、雜交瘤(hybridoma)trioma或quadroma細(xì)胞。鼠的骨髓瘤NSO細(xì)胞是最好的。
這些寄主細(xì)胞單獨用輕(L-)鏈-基因構(gòu)成物，單獨用重(H-)鏈-基因構(gòu)成物，或以二者，或依次地或同時地借助兩個分別的載體，或以一個一步驟程序，通過采用前文確定的雙-構(gòu)成物(L-鏈/H-鏈)載體轉(zhuǎn)染。在這種可選擇方案中，未連接的基因結(jié)構(gòu)可順次地或同時地轉(zhuǎn)染到該寄主細(xì)胞中。
以優(yōu)選的是上文所述的兩種基因構(gòu)成物轉(zhuǎn)染分泌重整的人抗體的寄主細(xì)胞，特別是細(xì)胞系EH31.8是優(yōu)選的。本發(fā)明寄主細(xì)胞的其它例子是以類似的重組體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其含H-和L-鏈基因構(gòu)成物的可選的取向，將另外的DNA成份合并以利于高度表達(dá)本發(fā)明的抗體。
本發(fā)明的寄主細(xì)胞是遺傳穩(wěn)定的，產(chǎn)生和最好是分泌恒定特性的本發(fā)明的重整的人抗體，并且可通過解凍和再克隆從深冷培養(yǎng)物中活化。
該已轉(zhuǎn)變的寄主細(xì)胞可用本技術(shù)領(lǐng)域中的已知方法在一液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，此培養(yǎng)基含有可吸收的碳源，如葡萄糖或乳糖之類的碳水化合物、氮，如氨基酸、肽或它們的降解產(chǎn)物，如胨、銨鹽等以及無機鹽，如鈉、鉀、鎂和鈣的硫酸鹽、磷酸鹽和/或碳酸鹽。該培養(yǎng)基比如還含促進(jìn)生長的物質(zhì)，如痕量元素，如鐵、鋅、錳等。
為了對選擇壓力和防止尚未轉(zhuǎn)變的，或已失去雜交載體的細(xì)胞生長，最好挑選此培養(yǎng)基。因此，比如如果該雜交載體含作為標(biāo)志的一種抗生素阻抗基因，則將一種抗生素加入該培養(yǎng)基中，比如使用一種寄主細(xì)胞，它在基本氨基酸中屬營養(yǎng)缺乏型，而雜交載體含一對補償此寄主缺陷的酶編碼的基因，則所述氨基酸的最小培養(yǎng)基缺陷則被用來培養(yǎng)此轉(zhuǎn)變的細(xì)胞。
培養(yǎng)是以本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法完成，要挑選培養(yǎng)條件如溫度、培養(yǎng)基的pH值和終止時間以便獲得本發(fā)明的該多肽或衍生物的最大滴定值。因此，最好在需氧條件下，通過拌隨震動或攪拌的浸漬培養(yǎng)，在約20℃-40℃。最好是在約30℃的溫度下，以4-8，最好是7的pH值一種E.Coli或酵母菌系培養(yǎng)約4-30小時，最好是直到獲本發(fā)明的多肽或衍生物的最大產(chǎn)率時為止。
當(dāng)此細(xì)胞密度達(dá)到一充分值時，阻斷此培養(yǎng)并可分離此多肽或衍生物。如果此雜交載體含適當(dāng)?shù)姆置谛盘栃蛄?，則將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)入此培養(yǎng)基的細(xì)胞就分泌此多肽或衍生物。否則，該細(xì)胞必須破壞，如用洗滌劑，如SDS、NP-40TMTritonTM或脫氧膽酸處理，用溶菌酶或類似的活性酶溶解或用滲透震動或超聲波破壞。如果信號序列直接分泌所需蛋白到此細(xì)胞周質(zhì)中，則也將需要破壞此細(xì)胞。如果用酵母作寄主微生物，則通過葡糖苷酶的酶消化去除細(xì)胞壁。任選地或附加地，可用機械力，如剪切力(如French壓力機、Pyno碾壓機或類似機械)或玻璃珠或鋁氧化物的搖動，或轉(zhuǎn)化冷凍，如在液氮中冷凍，和解凍如在30℃-40℃解凍，以及超聲波來打破此細(xì)胞。
將分裂細(xì)胞后所得的混合物離心分離后所獲的細(xì)胞上清液或溶液-它含有蛋白、核酸和其它的細(xì)胞成分-以本領(lǐng)域已知的方式，在包括本發(fā)明的多肽在內(nèi)的蛋白中富集。因此，比如用聚乙烯亞胺處理去除大部分非蛋白質(zhì)組分。而包括本發(fā)明多肽和衍生物的蛋白則，如用上述方法分離。
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化寄主細(xì)胞的制備方法，其特征是，用符合本發(fā)明的一種或兩種載體將前文所述的適宜的受體寄主細(xì)胞轉(zhuǎn)化。然后選擇此已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
衍生物轉(zhuǎn)化按文獻(xiàn)，比如針對S.cerevisiae(A.Hinnen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA751929，1978)及對E.coli(M.Mandel et al.，J.Mol.Biol.53159，1970)的文獻(xiàn)進(jìn)行。
因此，E.Coli細(xì)胞的轉(zhuǎn)化步驟包括如對Ca2+細(xì)胞的預(yù)處理以使DNA被攝取，以及用雜交載體培養(yǎng)。已轉(zhuǎn)化細(xì)胞的后續(xù)選擇可以進(jìn)行，比如可通過將該細(xì)胞轉(zhuǎn)移到可使已轉(zhuǎn)化細(xì)胞按該載體DNA的標(biāo)志序列特性與親本細(xì)胞分離的選擇性生長培養(yǎng)基而完成。較佳的是，使用不使不含該載體的細(xì)胞生長的生長培養(yǎng)基。酵母的轉(zhuǎn)化，比如包括借助葡糖苷的酶去除酵母細(xì)胞壁，用該載體在有聚乙二醇和Ca2+離子存在時處理所得的原生質(zhì)球以及通過將該原生質(zhì)球埋入瓊脂來再生此細(xì)胞的步驟。較佳的是，用一種上述的可同時再生和選擇已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的方法制備此再生瓊脂。
較高的真核源的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，如哺乳動物細(xì)胞系的細(xì)胞轉(zhuǎn)化最好通過轉(zhuǎn)染完成。用常規(guī)技術(shù)完成轉(zhuǎn)染，如磷酸鈣沉淀、微注射入細(xì)胞核、原生質(zhì)體融合、電穿孔(electroporation)，即用短電脈沖引入DNA(它瞬間提高細(xì)胞膜穿透性)等進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染可在輔助化合物，如二乙氨基葡聚糖、二甲亞砜、甘油、聚乙二醇等存在時進(jìn)行，或以載體DNA和磷酸鈣的共沉淀進(jìn)行。
轉(zhuǎn)染程序之后，借助與用于轉(zhuǎn)染的DNA的選擇標(biāo)志匹配的選擇程序鑒定和選擇已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。選擇標(biāo)志包括提供對重金屬，如銅、或?qū)股?。如G-418(遺傳霉素，一種新霉素的衍生物)或潮霉素抗性的基因，或補償寄主細(xì)胞基因缺乏的基因，如缺乏胸腺苷激酶、次黃嘌呤磷酰轉(zhuǎn)移酶、二氨葉酸還原酶等的基因。比如，如果用于轉(zhuǎn)染的DNA包括一種遺傳霉素抗性標(biāo)志，則通過有抗生素遺傳霉素存在時的培養(yǎng)物來確認(rèn)已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并將之與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離。
本發(fā)明的重整的人抗體或其衍生物用于定性和定量的測定IgE，特別是在體液中，如在血清中的體內(nèi)和體外。
比如，該重整的人抗體或其衍生物可用于任何取決于IgE的抗原定子和所述抗體的抗體結(jié)合部之間的聯(lián)接間的相互作用的已知免疫分析中，這類分析的例子是放射性免疫分析(RIA)、酶、免疫熒光、化學(xué)發(fā)光、免疫沉淀、乳液凝集或血細(xì)胞凝集免疫分析。
本發(fā)明的重整的人抗體可以就這樣地或以放射性示蹤衍生物的形式用于放射免疫分析中(RIA)。RIA的任何已知的修飾都是可用的。如可溶相(均質(zhì)的)RIA、固相、(非均質(zhì)的)RIA、單RIA或雙(分層的)RIA以直接的或間接的(競爭性的)IgE定子的方式使用。
這類放射免疫分析的例子是分層RIA，在其中適宜的載體，如微空板或試管的塑性表面，如聚苯乙烯、聚丙烯或聚氯乙烯的塑性表面、玻璃或塑性珠、濾紙、葡聚糖等，乙酸纖維素或硝基纖維素片、磁性顆粒等，最好是在激活此載體后以簡單的吸附方法覆蓋這些表面以本發(fā)明的抗體。然后添加測試溶液，它含IgE及最后還含也與該抗原反應(yīng)并作放射性示蹤，如用125I示蹤的重整的人抗體。測試溶液中的IgE的量與結(jié)合的重整的人抗體的量成正比，并且通過對結(jié)合到該載體上的放射性來確定。
本發(fā)明的重整的人抗體可以就這樣或以一種結(jié)合酶衍生物的形式用于酶免疫分析中，如上對放射性免疫分析所述，酶免疫分析的任何已知的改變形式都可使用。
以類似上述放射免疫分析的方式，用一種酶標(biāo)記替代放射性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行此測試。與存在于該測試溶液中的IgE量相對應(yīng)的已形成的免疫復(fù)合體的量通過添加酶物溶液來測定。此酶作用物反應(yīng)，比如產(chǎn)生可被肉眼或用光學(xué)測量裝置觀察到的顏色的變化。
本發(fā)明的重整的人抗體可以就這樣使用或以與同化學(xué)發(fā)光標(biāo)記結(jié)合的衍生物的形式用于化學(xué)發(fā)光分析。如上對于放射免疫分析所述化學(xué)發(fā)光分析的任何已知變化形式都可用。
以類似于上述放射免疫分析的方式，用化學(xué)發(fā)光標(biāo)記代替放射性標(biāo)記來進(jìn)行此測試。與存在于該測試溶液中的IgE的量相對應(yīng)的已形成的免疫復(fù)合體的量是通過添加引起發(fā)光的化合物，如H2O2和NaOH，再用光學(xué)測量儀器測量光的發(fā)射來測定的。
上述的本發(fā)明的重整的人抗體或其衍生物對測定IgE的應(yīng)用還包括其它的本質(zhì)上是已知的免疫分析，如免疫熒光分析，用抗體覆蓋或抗原覆蓋的膠乳顆粒進(jìn)行的膠乳凝集，用抗體涂覆或抗原涂復(fù)的紅血細(xì)胞進(jìn)行的血球凝集作用，用涂以抗體光纖和其它的將結(jié)合情況轉(zhuǎn)化為電的或光信號等的直接作用的免疫傳感器進(jìn)行的瞬時光分析。
本發(fā)明的重整的人抗體或其衍生物對測定產(chǎn)生IgE的細(xì)胞是有用的，它被優(yōu)選地用于噬菌斑形成細(xì)胞分析(PFC)。
本發(fā)明的噬菌斑形成分析基于固相免疫分析的原理。任何固相免疫分析的已知變形都可采用，如，放射免疫分析，一種酶、免疫熒光或化學(xué)發(fā)光免疫分析等。
這類噬菌斑形成細(xì)胞分析的例子是基于酶鍵合免疫吸著劑分析(ELISA)。為測定產(chǎn)生IgE細(xì)胞的總量，將一種上述用于多層RIA的適宜的載體涂以本發(fā)明的抗體。添加產(chǎn)生IgE的細(xì)胞的懸浮液，該細(xì)胞得含這種細(xì)胞的體液，這是通過離心分離，過濾等得到的。所述體液還含專對IgE的第二種多克隆或單克隆抗體，如本發(fā)明的抗體識別IgE的不同抗原決定基不同于第一抗體，它與一種酶，如堿性磷酸酶軛合。在此測試懸浮液中的產(chǎn)生IgE細(xì)胞的量與已結(jié)合的第二抗體的量成正比，且通過添加合適的酶作用物溶液而確定的，這產(chǎn)生了有色反應(yīng)產(chǎn)物，然后計算著色點(噬菌斑)。為測定產(chǎn)生用來抗特定過敏原而產(chǎn)生IgE細(xì)胞的量，在添加上述的細(xì)胞懸浮液之前首先將載體涂以該過敏原或其可吸收的軛合物。直接抗該過敏原的測試懸浮液中的IgE的份額與表面結(jié)合的過敏相結(jié)合，IgE測定是通過加入本發(fā)明的抗體，所述抗體是與一種酶和導(dǎo)致著色反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)生的適合的酶作用物溶液相結(jié)合的，然后計算著色點(噬菌斑)。
此外，本發(fā)明還涉及一種用于IgE和產(chǎn)生IgE細(xì)胞的定性和定量測定的測試儀器，該細(xì)胞包括本發(fā)明的單克隆抗體和/或其衍生物，任選地還包括其它單克隆或多克隆抗體和/或附屬物。
本發(fā)明的用于放射免疫分析的測試儀比如含有一適宜的載體，一種或多種單克隆抗體的任選地經(jīng)冷凍干燥或濃縮的溶液，放射性示蹤的單克隆抗體的溶液或放射性示蹤的IgE溶液。IgE的標(biāo)準(zhǔn)溶液緩沖液及，任選地，防止非特性吸附和凝聚形成的清潔劑、吸管、反應(yīng)容器、校準(zhǔn)曲線等。該測試儀中的一種或多種單克隆抗體是本發(fā)明的單克隆抗體，測定產(chǎn)生用以直接抗特定過敏原的IgE的產(chǎn)生出IgE細(xì)胞的測試儀另外還包含該抗原的溶液或該過敏原的一種可吸附的軛合物。
用于酶免疫分析的本發(fā)明的測試儀比如含有一適宜的載體，一種或多種單克隆抗體的任選地經(jīng)冷凍干燥或濃縮溶液，任選地經(jīng)冷凍干燥或濃縮的酶標(biāo)記單克隆抗體的溶液、酶標(biāo)記的IgE溶液，多克隆抗-IgE血清和/或酶標(biāo)記的識別和結(jié)合該抗-IgE抗體的單克隆或多克隆抗體的溶液，固態(tài)或溶解態(tài)的酶作用物、IgE的標(biāo)準(zhǔn)溶液、緩沖液、清潔劑、吸管、反應(yīng)容器、校準(zhǔn)曲線、色標(biāo)表等。該測試儀中的一種或多種單克隆抗體是本發(fā)明的單克隆抗體，用于測定產(chǎn)生用以抗特定過敏原的IgE的產(chǎn)生IgE細(xì)胞的測試儀還另外包括該過敏原的溶液及其可吸附的軛合物。
此外，通過任何已知的常規(guī)著色法技術(shù)，如通過流動血細(xì)胞計數(shù)分析可將本發(fā)明的重整形人抗體及其衍生物用于定量和定性測定表面IgE陽性(sIgE+)B細(xì)胞。
此外，本發(fā)明的單克隆抗體和/或其衍生物對于治療和/或預(yù)防過敏是有用的。
通過使IgE免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)下降而達(dá)到此療效，這是由于本發(fā)明的重整人抗體和其衍生物的專門特征＊它們通過結(jié)合游離IgE和抑制IgE與生成Fce受體Ⅰ或Ⅱ的細(xì)胞，特別是肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的結(jié)合而能中和已形成的IgE。
＊它們的識別和結(jié)合表達(dá)在表面IgE陽性B細(xì)胞(sIgE+B)細(xì)胞，表面上的IgE，因此它們對減少這樣一類細(xì)胞的種群是有用的它們形一種“記憶池”在第二次暴露于該過敏原之后則導(dǎo)致IgE的產(chǎn)生。產(chǎn)生經(jīng)選擇的免疫球蛋白類(次級)的重整的人抗體可能性使得寄主免疫體系的細(xì)胞機制得以激活，導(dǎo)致專門扼殺sIgE+B細(xì)胞。這也可通過將本發(fā)明的單克隆抗體與細(xì)胞毒素藥物的軛合物而達(dá)到，所述軛合物將把這類藥物輸送至靶細(xì)胞。
＊由于本發(fā)明的重整的人抗體及其衍生物不識別在產(chǎn)生Fce受體Ⅰ或Ⅱ的細(xì)胞，如肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞上的嗜細(xì)胞IgE，它們不因為這些細(xì)胞而誘發(fā)媒介物釋放。
＊本發(fā)明單克隆抗體及其衍生物還具有長的療效，因為它們對免疫應(yīng)答中IgE形成有明顯的抑制作用。
結(jié)果，本發(fā)明的重整的人抗體及其衍生物就提供了一種治療，它不治療癥狀，確切地說是影響潛在的致敏原因，比如，通過去除IgE抗體和表面IgE陽性B細(xì)胞，從而消除了過敏應(yīng)答的可能因素并抑制了IgE的形成。特別有益的是，這種治療無需進(jìn)行重復(fù)用藥，及本發(fā)明的重整的人抗體及其衍生物可通過在確定任何過敏癥之前給藥而用于預(yù)防性治療。
由于它們是弱致免疫性或非致免疫性的，那么當(dāng)施藥于人時，本發(fā)明的重整的人抗體及其衍生物對體內(nèi)的診斷治療應(yīng)用及預(yù)防是尤為有效的。較佳的是，當(dāng)以治療目的而施用時，該重整的人抗體作為自身蛋白為人有機體所耐受的。
對于哺乳動物的治療日劑量為0.1mg和10mg公斤體重，這取決于病人的狀態(tài)及施用的方式。
本發(fā)明還涉及藥物制品，它們包括本發(fā)明的重整的人抗體及其衍生物。該藥物制品含，比如，治療上有效量的該重整的人抗體和/或其衍生物，它們本身合在一起，或與有機或無機的，固態(tài)或液態(tài)的藥用載體混合。
腸胃外施用或吸入的制劑是等滲水溶液或懸浮液，任選地就在剛使用前從冷凍干燥的或濃縮的制劑中制備。此藥用制劑可經(jīng)消毒并含比如用來保存、穩(wěn)定增濕、乳化或增溶這些成分，調(diào)節(jié)滲透壓的鹽，緩沖劑和/或調(diào)節(jié)粘度的化合物，如羧基纖維素鈉、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或明膠的助劑。用本技術(shù)領(lǐng)域中已知的方法，如用常規(guī)的混合、溶解或冷凍干燥來制備它們，它們含有約0.01%-約50%的活性成分。用于注射的此制劑經(jīng)處理，裝入安瓿、小瓶或不回收的注射器，然后在本領(lǐng)域所知的無菌條件下密封。
本發(fā)明的藥用制劑可用于預(yù)防和治療人身中的過敏反應(yīng)，特別是那些一般與快速型過敏性有關(guān)的反應(yīng)，如過敏性氣喘、過敏性鼻炎、特異反應(yīng)性氣喘。
對下圖的簡要說明

圖1HCWV-用于產(chǎn)生與人k輕鏈恒定區(qū)融合的C21-Ll和與人γl重鏈恒定區(qū)融合的C21-Hl的哺乳動物表達(dá)載體。
如在實施例中所述，本發(fā)明特別是涉及重整的人抗體、重組體DNA、經(jīng)轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞以及制備它們的方法。以下實施例解釋本發(fā)明但不將其限于任何程度。
縮略符號VL＝輕鏈可變區(qū);VH＝重鏈可變區(qū);CDR＝補充性確定區(qū);FR＝構(gòu)架區(qū);HCWV＝人細(xì)胞肥大病毒。
原料從人質(zhì)粒中提純的帶有k輕鏈的人IgG均購自Sigma，Buchs.Switkzerland(IgGl∶1-3889，IgG2∶1-4139，IgG3∶1-4389及IgG∶1-4639)。來自人骨髓瘤血清的人IgM(Cat，No.PHP003)及人IgD(Cat.No.PHP005)得自Serotec.來自人質(zhì)粒的IgA(IgAl∶400105;IgA2∶400108)得自Calbiochem，Laufelfingen，Switzerland。
實施例1mAbC21VL和VH的分子模型建立識別人Ig的鼠單克隆抗體C21的VL(1號序列)和VH(3號序列)區(qū)的分子模型被建立，對VL按高度同源鼠抗-溶菌酶抗體HyHEL-10(Padlan，E.A.Silverton，E.W.Sheriff，S.，Cohen，G.H.，Smith-Gill and Davies，D.R.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，865938;在Brookhavin數(shù)據(jù)庫稱之為序列3號HFM，Bernstein et al.，J.Mol.Biol 112，535-542(1977)的溶解結(jié)構(gòu)建立;對VH按鼠抗溶菌酶抗體HyHEL-5(Sherff，S.，Silverton，E.W.Padlan，E.A.，Cohen，G.H.，Smith-Gill，S.J.，Binzel，B.C.and Pivies，D.R.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，848075;在Brookhaven數(shù)據(jù)庫中稱之為2號序列HFL，Supra結(jié)構(gòu)而建立。mAbC21和HyHEKL-10或HyHEL-5的重鏈和輕鏈的可變區(qū)分別有91%和90%的氨基酸同一性。該模型建立在按UNIX操作系統(tǒng)下運行的Silicon Graphics IRLS4D工作站，并采用分子模型化組件QUANTA(Polygen Corp USA)。在該構(gòu)架中相同的殘基被保留;不相同的殘基用最大重疊程序(Snow，M.E.and Amzel，L.M.，1986，Proteins 1∶267)取代，所述程序已納入QUANTA的蛋白模型建立的設(shè)備。
確定得自鼠C21抗體的VL區(qū)的CDR1(L1)、CDR2(L2)和CDR3(L3)及VH的CDR1(H1)、CDR2(H2)與預(yù)先設(shè)定的典型規(guī)范的互補性(Chothia，C.，Lesk，A.M.，Tramontano，A.，Leviett，M.，Smith-Gill，S.T.Air.G.，Sherrif，S.，Padlan E.A.，Davies，D.，Tulip，W.R.，Colman，P.M.，Spinelli，S.，Alzari，P.M.，and Poljak，R.J.，1989，Nature 342∶877)。這些環(huán)的主鏈扭角象原抗體結(jié)構(gòu)一樣保持(HyKEL-10對于L1-L3，和HyHEL-5對于H1和H2)。對于VH區(qū)的CDR3(H3)而言沒有規(guī)范的結(jié)構(gòu)，因此難以為其建立模型。用已公開的方法(Jones，T.A.，and Thurup，S.，1986，EMBO J.，5819-822)(該法已在QUANTA中用過)從91個高溶解性的蛋白結(jié)構(gòu)中抽取30個選擇的環(huán)，而最好的模型用肉眼挑選。這種環(huán)固定在H3CDR值一側(cè)的三個構(gòu)架的殘基上。VH區(qū)的H3的模型就建在殘基87-106的區(qū)中的Bence-Jones蛋白RHE上(Furey，W.，Wang，B，C.，Yoo C.S.;and San;M.;1983，J.Mol，Biol.，167661-692)。其大致對應(yīng)著CDR3(L3)。
為了解脫不希望的原子接觸，優(yōu)化范德華力和靜電力的相互反應(yīng)，用在QUANTA中用過的CHATM的勢能(Brooks，B.R.，Bruccoleri，R.E.，Olafson，B.D.，States，D.S.，Swaminathan，S.and Karplus，M.，1983，J.Comp;Chem.，4∶187)使該模型經(jīng)一急劇下降和使軛合梯度能夠減至最小。
實施例2重整形人C21VL和VH區(qū)設(shè)計重整的C21VL和VH區(qū)的設(shè)計主要基于VL和VH區(qū)的一致序列(模型C21-L1，C21-L2，C21-L3，C21-H1，和C21-H3，其在KABST數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)的(Kabat.，E.A.，Wu，T.T.，Reid-Miller，M.，Perry，H.M.and Gottsman，K.S.，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Edition，U.S.Department of Heafth and Human Services，V.S.Government Printing Office)。此外兩個更重整的人C21VH區(qū)(C21-Hay1及C21-Hay3)基于一個單獨的人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)。
為設(shè)計在一致基礎(chǔ)上的重整的人C21可變區(qū)，將來自鼠C21抗體的VL和VH區(qū)的氨基酸序列與得自KABAT數(shù)據(jù)庫的人抗體VL和VH區(qū)的一致序列對比。這些分析說明鼠C21VL區(qū)和鼠C21VH區(qū)分別與人kVL次組Ⅲ一致序列，和人的VH次組I一致序列極為相似，其中分別有77%氨基酸和71%氨基酸相同。這些人的一致序列被用于設(shè)計含鼠C21CDR和人的相應(yīng)的一致序列的FR的重整的人C21輕和重鏈可變區(qū)C21-LO和C21-HO。鼠C21可變區(qū)的分子模型(實施例1)被用于鑒別構(gòu)架殘基，所述殘基對于得到好的抗原的結(jié)合是很可能重要的，而且對VL/VH的斂集可能是關(guān)鍵性的，作為這圖解分析的結(jié)果，該FR中的被標(biāo)出的某些人的一致氨基酸與它們的相應(yīng)的鼠C21殘基互相交換。如果它們不落入以下范疇，這類變化只在人構(gòu)架區(qū)中考慮[1]人的一致序列(人亞組1;HSG1)顯示出在此位置沒有任何的主要的氨基酸選擇，但如在原鼠C21序列中發(fā)現(xiàn)的該氨基酸存在于相關(guān)的人免疫球蛋白可變區(qū)亞組的至少一個單獨的序列中。比如，HSG1被認(rèn)為是在氨基酸殘基19上(Kaba+等，見上文)沒有任何一致序列，雖然在此位置上一些人抗體有賴氨酸殘基。由于賴氨酸還出現(xiàn)在C21序列中，所以被保留在此重整的單克隆抗體中。[2]在構(gòu)架位置上的氨基酸是假設(shè)的規(guī)范結(jié)構(gòu)的一部分，這對確定CDR或超可變環(huán)的結(jié)構(gòu)是重要的，因而被期望對保持該抗原結(jié)合位點的形狀和完整性是不可缺少的(Chothia，C and Lesk，A.M.，1987，J.Mol.Biol.，196∶901;Chothia，C.et al.，1989，supra)。
按照這些規(guī)定，當(dāng)與人的一致序列比較時，在該重整的人輕和重鏈可變區(qū)C21-LO和C21-HO中的4個和6個氨基酸被交換，結(jié)果形成了類型C21-L1′和C21-H1。被更換的氨基酸位置是C21-L1′和其后鑒定的修飾后的類型C21-L1(5號序列)中的1、3、49位。在C21-H1(11號序列)這些被交換的氨基酸的位置是38、40、67、68、70和87。重整的人C21HV區(qū)的76位是上述規(guī)定的例外，在此我們?yōu)榇宋恢锰暨x了如在人VH一致序列中發(fā)現(xiàn)的最常出現(xiàn)的人氨基酸(蘇氨酸)。
進(jìn)而，VL和VH的新類型含有如下變形(與C21-L1和C21-H1分別相比)C21-L1(7號序列)天冬氨酸(替代絲氨酸)在60位;
C21-L3(9號序列)谷氨酸(替代天冬氨酸)在1位;纈氨酸(替代亮氨酸)在3位;
C21-H3(13號序列)精氨酸(替代賴氨酸)在38位;丙氨酸(替代精氨酸)在40位;精氨酸(替代賴氨酸)在67位;精氨酸(替代蘇氨酸)在87位。
用C21-L1′和C21-H1的數(shù)據(jù)庫檢索重整的人C21VL模型C21-L1′與人k輕鏈可變區(qū)HVMIG KAF(DMBL數(shù)據(jù)庫，Heidelberg，Germany，Newkirk，M.M.，Gram，H.，Heinrich，G.F.，Oeseberg，L.，Capra，J.D.，and Isserman，R.L.，1988，J.Clin.Invest.，811511-1518)最相似(91%序列相同)，而重整的人抗體C21-VH模型C21-H1與人重鏈可變區(qū)HVMIG HAY(EMBL數(shù)據(jù)庫，Supra，Dersimonian，H.，Schwartz，R.S.，Barrrett，K.J.and Stellar，B.D.，1987，J.Immunol.，1392496-2501)最相似(78%序列相同)。這些序列以下分別被稱為KAF和HAY。KAF的FR與人kVL亞組Ⅲ一致序列僅在49和85位不同。在49號位置上相應(yīng)的鼠C21氨基酸(賴氨酸)被保持，這是因為其推斷的抗原結(jié)合，而在85位，人VLⅣ一致氨基酸纈氨酸如在KAF所發(fā)現(xiàn)的那樣被轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸。因此，改型的C21-L1′，符號為C21-L1(5號序列)是基于單獨的人輕鏈可變區(qū)KAF(Newkirk，m.m.，et al.，1988，Supra的。它與第一型C21-L1′的不同處在于在85位甲硫氨酸代替了纈氨酸。重整類型C21-L2(7號序列)和C21-L3(9號序列)在89位也有甲硫氨酸。
相反，人重鏈可變區(qū)的FR和人VH亞組I的一致序列在數(shù)個位置上不同。為構(gòu)成與這獨特的人抗體高度相似的重整人C21VH區(qū)，基于得自人重鏈可變區(qū)HAY的該重鏈可變區(qū)的FR用來設(shè)計重整的人C21VH區(qū)的兩種以上的類型?；贖AY的重整的人C21VH類型的構(gòu)成必需要在重整的人C21模型C21-H1及C21-H3的FR2和FR3中分別于43、44、48、76及77位作5種變化。這些以HAY為基礎(chǔ)的模型被分別稱為C21-Hay1(15號序列)和C21-Hay3(17號序列)。HAY的FR和人VH亞組I一致序列之間在30和72位的兩種另外的區(qū)別仍象在鼠C21VH中一樣被保存下來，而且不被認(rèn)為是變化了，因為它們是確定CDR結(jié)構(gòu)的規(guī)定的殘基(Chothia，C.et al.，1989，Supra)。
實施例3設(shè)計的和構(gòu)成人化的抗體基因為設(shè)計人化的抗體基因盒，將有效表達(dá)和克隆所必需的輔助序列加在所得的編碼區(qū)的5′-和3′-端。為有效表達(dá)重整的人C21抗體的真核引導(dǎo)序列加于構(gòu)架中到已指定為人化可變區(qū)。對該重整的人C21VL區(qū)的引導(dǎo)序列自發(fā)現(xiàn)于人抗體KAF的K輕鏈中的引導(dǎo)序列產(chǎn)生(Newkirk，M.M.，et al.，1988，Supra)由此該可變區(qū)被用于C21VL區(qū)的重整。用于重整的人C21VH區(qū)的引導(dǎo)序列自發(fā)現(xiàn)于人抗體HG3(Rechavi，G.，Ram，D.，Glazer，L.，Zakut，R.and Givol，D.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80855-859)的重鏈中的引導(dǎo)序列和人VH亞組I的成員(Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Reid-Miller，M.Perry，H.M.and Gottesman，K.S.，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，4th Edition，U.S.Department of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office)產(chǎn)生。所得的重整的人C21VL/VH區(qū)的蛋白序列然后被所轉(zhuǎn)譯成DNA序列，所用的是鼠序列的密碼子使用表(Codon Usage Table)，該表可在the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wiseonsin，USA，找到。對于此已設(shè)計成的DNA構(gòu)架，還在5′端位上加入真核轉(zhuǎn)譯信號(Kozak，M.，1987，J，Mol.Biol.，196947-950)，在3′端加入供體并合位點(Breathnach，R.，Benoist，C.，O′Hare，K.，Gannon，F(xiàn)，and Chambon，P.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，754853-4857)及將HindⅢ(5′端)和Bam H1及Xba(3′端)DNA限制位點，以便于亞克進(jìn)入到指定的哺乳動物表達(dá)載體中。
對該重整的人C21VL和VH區(qū)C21-L1和C21-H1編碼的已設(shè)計成的人化抗體基因盒用合成DNA聚核苷酸通過基因合成法而構(gòu)成。整個DNA構(gòu)被再分成六個用20個核苷酸相互交錯的區(qū)。對于每個重整的人C21可變區(qū)基因盒而言，被標(biāo)為C21-LA(19號序列)、C21-LB(20號序列)、C21-LC(21號序列)、C21-LD(22號序列)、C21-LE(23號序列)、C21-LF(24號序列)、C21-HA(25號序列)、C21-HB(26號序列)、C21-HC(27號序列)、C21-HD(28號序列)、C21-HE(29號序列)、至HF(30號序列)的六種5′磷酸化的和PAGE-提純的聚核苷酸均購自Genosys Biotechnologies，Houston，Texas，USA。它們在一基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的基因合成中進(jìn)行重組。5pmol的每種聚核苷酸(即LA至LF)首先被逐漸冷卻，然后在一含WmM Tris-HCl pH8.3、1.5mM MgCl2、50mM KCl，10mM β-巰基乙醇，0.05%(重量/體積)Tween-20，0.05%NP-40(Merck Zurich 20μm dNTPs(N＝G.A.T或C)及5V VentTM DNA聚合酶(New England Biolabs)的100μl反應(yīng)物中伸展。溫度步驟是95℃/分，50℃/2分及72℃/4分，用的是Techne PHC-2溫度循環(huán)控制器。第一循環(huán)后，添加在所需的全長度DNA斷片的5′端和3′雜交的50pmol的低核苷酸引物C21-5′(31號序列)和C21-L3′(33號序列)或C21-H3′(32號序列)，然后在一約20個循環(huán)的PCR的反應(yīng)中加入大此全長度DNA斷片，所用的是以下的循環(huán)參數(shù)95℃/1分、60℃/2分、72℃/2分。然后用1份體積的氯仿將此PCR混合物萃取一次，并通過添加1/10體積8M LiCl條3體積乙醇使此DNA沉淀。沉淀的DNA被重溶于H2O，再用HindⅢ和Bam H1限制核內(nèi)切酶在供應(yīng)商(Boehringer，Mannhein，Germany)建議的條件下消化。尺寸大小合適的DNA斷片(C21-L1＝416bp和C21 H1＝459bp)在1%瓊脂糖/TBE中經(jīng)電泳提純?nèi)缓髲拇四z上切斷，將此膠狀片切成較小的段，在液氮中冷凍5分鐘，再經(jīng)玻璃纖維在一微型離心機中經(jīng)離心分離而洗脫(30分鐘，136000×g)室溫下的酚-氯仿萃取及Licl/乙醇沉淀后，將提純的Hind Ⅳ-Bam H1限制斷片亞克隆入pBluescript K S ⅡMB+(層基因(Stratagene))再轉(zhuǎn)染入勝任的E.Coli細(xì)胞中(得自GIBCO-BRL的HB101菌株)。含尺寸正確的DNA插入物的KS+C21/L1或KS+C21/H1的多質(zhì)?？寺∮肧equenase(VSB)序化。在該DNA序列中的點突變和/或缺失按已公開的程序通過交換不同的克隆和/或?qū)е翽CR誘變的低核苷酸之間的DNA限制酶斷片來校正(Kammann，M.，Lauts，J.，Schell J.and Groneneborn B.，1989，Nucl.Acid.Res.，17∶5404)。顯示出能校正DNA序列的HindⅢ-Bam H1斷片則被亞克隆入輕或重鏈表達(dá)載體中以產(chǎn)生質(zhì)粒HCMV C21/L1和HCMV-rl-C21/H1(描繪于圖1)，其中這Hind Ⅲ-Bam H1斷片(它將該重整的人輕或重鏈可變區(qū)編碼)分別與為人k和rl恒定區(qū)編碼的DNA進(jìn)行結(jié)合。兩種質(zhì)粒含Simith Virus 40(SV40)源，HCMV加強因子區(qū)，HCMV啟動子，氨芐青霉素可選擇的基因(Keffleborough et al.，1991，Supra)。
重整的人C21VL區(qū)模型C21-L2和C21-L3通過低核苷酸引發(fā)的誘變，利用發(fā)生在PCR反應(yīng)期間重組情況而產(chǎn)生(Mullis，K.，F(xiàn)aloona，F(xiàn).，Sharf，S.，Saiki，R.，Horn，Gand Ehrlich，H.，1986，Cold Spring Harbour Symp.，51∶263 and Yolov，A.A.and Shabarovam，Z.A.，1990，Nucl.Acids.Res.，18∶3983)。為了通過PCR放大而產(chǎn)生兩個DNA斷片則對應(yīng)兩個輕鏈V-區(qū)型中的每一個部分合成低核苷酸引物C21-5′(31號序列)、L/D60SL(35號序列)、L/D60S-SL(36號序列)(對于C21-L2)、RSP(34號序列)、L/EID-V3L(37號序列)、L/EID-V3L-SL(38號序列)(對C21-L3)及C21-L3′(33號序列)(對C21-L2和-L3)。除末端低核苷酸引物C21-5′，RSP及C21-L3′)外，低核苷酸都納入所期望的密碼子變化的所需的序列。除引物對RSP和L/EID-V3L外，約50pmol的適宜引物對的每一種都與Ca·10ng得自KS+C1/L1的XhoⅠ-NotⅠ斷片，3單位的VEntTM DNA聚合酶結(jié)合及25PCR放大循環(huán)被采用(60℃/25秒，72℃/40秒及93℃/25秒)。對于引物對RSP和L/EID V3L而言，Ca.150ng的KS+C21/L1質(zhì)粒DNA被用作樣板，而所需的DNA斷片用35個循環(huán)(40℃/30秒、72℃/1分，及93℃/30秒)進(jìn)行PCR放大。這些用瓊脂糖凝膠電泳提純的反應(yīng)產(chǎn)物首先結(jié)合，而Ca5-30ng的每個DNA斷片用5個單位的VentTM DNA聚合酶擴展(95℃/1分、50℃/2分及72℃/4分)。然后加入末端低核苷酸引物C21-5′和C21-L3′和已結(jié)合的，用25個循環(huán)(95℃/1分、50℃/2分及72℃/2分)PCR放大的全長度DNA斷片。對C21-L2和C21-L3的PCR放大的DNA在用DNA限制核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Bam Hl消化后被亞克隆入pBluescript KSⅡM13+(層基因)，然后序化。正確的序列再轉(zhuǎn)移到上述的HCMV-rl-表達(dá)載體中。
重整人21Vh區(qū)模型C21-H3、C21-Hayl及C21-Hay3以類似于產(chǎn)生C21-L1和C21-L2的方式產(chǎn)生。為得到這些C21Hv區(qū)模型，低核苷酸引物C21-51、H/R38K-A40R-L(39號序列)、H/R38K-40R-SL(40號序列)、H/R67K-L(41號序列)、H/R67K-SL(42號序列)、H/R87T-L(43號序列)、H/R87T-S(44號序列)、HayFR2(45號序列)、HayFR2-S(47號序列)、HayFR3(48號序列)、HayFR3S(49號序列)及C21-H31被用于PCR放大，所用DNA模板是C21-H1(用于C21-H3和C21-Hay1)或C221-H3(用于C21-Hay3)，含所需密碼子的雙線DNA斷片改變了不同的重整形人C21Vh型。相應(yīng)地，瓊脂糖凝膠提純的斷片則通過PCR重組而產(chǎn)生上述的全長度DNA斷片，如上述在經(jīng)DNA限制性核酸內(nèi)切酶Hind Ⅲ和Bam H1消化，接著克隆入pBluescript KSⅡM13+(層基因)后，檢查質(zhì)?？寺∫员阍诒豢寺∪際CMV-rl-表達(dá)載體之前校正序列。
實施例4重組質(zhì)粒在COS細(xì)胞中的瞬時表達(dá)用帶有對該重整人C21重和輕鏈編碼的基因的HCMV表達(dá)載體10μg使COS細(xì)胞電穿孔(electroporated)。將10μgH-和L-鏈表達(dá)質(zhì)粒加至0.8ml的COS細(xì)胞在PBS/O(PBS缺乏由GIBCO-BRL.Basel，Switzerland提供的Ca2+和Mg2+，cat.no.041-0419m)中的1×107細(xì)胞/ml的懸浮液中。然后將-Bio-Rad Gene脈沖器用來在25μF電容下將1900V脈沖送入此懸浮的細(xì)胞中，在深入到10ml含5%(體積/體積)游離γ球蛋白和熱失活胎牛血清的(GIBCO-BRL，Basel，Switzerland;cat，no.063-06510H)的DMEM之前，讓此細(xì)胞恢復(fù)10分鐘。經(jīng)7小時培育后，收集此培養(yǎng)基，離心分離以去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。用0.45μm的膜過濾COS細(xì)胞上清液，然后以ELISH分析人rl/k等模式標(biāo)本的組合抗體的存在。再用蛋白A親合色譜法進(jìn)一步提純此人化的抗體。
實施例5人IgG/k產(chǎn)生的ELISA分析在96-＃微滴定板上(Nunc Maxisorb，Cat.No.439454)涂以50μl的山羊抗人IgG(Fespecific;Dianova，＃109-005-098)在PBS/O，pH7.2中的1∶1000稀釋液過一整夜。這一及后續(xù)的全部步驟之后，用200μl PBST(PBS/OpH7.2含0.05%Tween-20)將樣板洗三次。來結(jié)合位點用100μl RIA-緩沖液(1%的在PBST中的牛血清白蛋白)在37℃時阻斷1小時。添加50μl的試樣及其在RIA-緩沖液中的稀釋液。再將此混合物于37°培養(yǎng)1小時。以高純重組人抗體F5-444(人rl/k等模式標(biāo)本，歐洲申請No.497767)作為標(biāo)準(zhǔn)。然后施用50μl與在RIA-緩沖液辣根過氧化酶軛合的親合純化的山羊抗人k-輕鏈抗血清的1∶1000的稀釋液(Sigma，Buchs，Switzerland;Cat.no.A-7164)，接著于37℃培養(yǎng)1小時。100μl ABTS(2，2′-連氮基-雙(3-乙基苯-噻唑啉-6-磺酸))培養(yǎng)溶液(BioRad，Glattbrugg，Switzeland;＃172-1064)被用于發(fā)育。經(jīng)一般適宜的培養(yǎng)時間之后，用等體積(100μl)的2%(重量/體積)草酸阻止此酶反應(yīng)。以415nm的吸收用于定量分析結(jié)合的和已完整組合的人抗體。
實施例6自COS細(xì)胞和人化抗體的蛋白A提純通過親合色譜法，在被填入到HR5/5FPLC柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)中的1ml Prosep A柱(Bioprocessing Ltd，Durham，England)中提純暫時被表達(dá)的人化抗體。該柱以2ml/分的恒定流速在FPLC系統(tǒng)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上運行，從柱上洗下的蛋白洗脫物在流動池中用U.V-以280nm吸收測定。該柱的制備是這樣的，用10個柱體積的PBS/O pH8.0(20mM·磷酸鈉，150mM NaCl)洗滌，用10個柱體積的100mM檸檬酸鈉緩沖液pH3.0預(yù)洗脫及用10個體積的PBS/O pH8.0再平衡。經(jīng)0.5μm膜過濾而澄清的COS細(xì)胞上清液(20-50ml)用壓縮泵直接裝入到該柱上。然后該柱用PBS/O pH8.0洗脫直到此u.v-吸收率回到基準(zhǔn)線為止。洗脫的牛IgG用100mM檸檬酸鈉緩沖液pH5.0洗滌直到基線回到0。最后用100mM檸檬酸鈉緩沖液pH3.0洗脫此人化的抗體，然后立即將洗脫物用1M Trizma-Base(Sigma，Buchs，Switzerland)調(diào)節(jié)至pH7.0。用Coomassie蘭著斑法(Laemmli U.K.1970。Nature 227680-685)通過SDS-Poly-arylamide凝膠電泳分析此人化抗體的純度。對于生物傳感器分析，則將此中和的蛋白A洗脫液在-Centricon-10型微濃縮器(Amicon)中濃縮，<p>
流量5μl/分; HBS(10mM Hepes，3.4mM EDTA，150mM NaCl，0.05%BIA表面活性劑，pH7.4)為用作運行緩沖液; 測試抗體(在PBS/O pH7.2)在HBS中稀釋至最終濃度為5-10μg/ml，然后與此俘獲抗體結(jié)合以獲得1300-2200RV(1.3-2.2ng/mm2)的已結(jié)合的測試抗體; 將人單克隆IgE(SE44)在此結(jié)合抗體上通過9分鐘; 4μl的40mM HCl用于去除抗體-抗原配合物并為下一周期準(zhǔn)備表面; 分析溫度25℃。
用在BiocoreTM系統(tǒng)中所用的計算機程序計算抗體-抗原相互作用的結(jié)合常數(shù)。
為測定離解率常數(shù)，除包括離解相外，采用類似的方法。分析條件如上述。首先通過制動傳染性抗體而將測試抗體來得到傳感器表面。在高濃度的(25nM)IgE(SE44)與該抗體結(jié)合。接著結(jié)合HBS緩沖液以5μl/分的恒流速在該傳感10表面上經(jīng)過，然后以15-25分的期間監(jiān)測共振信號的減少。通過用4μl的40mM HCl洗滌使該傳感器片最終恢復(fù)。由于抗體IgE配合物的離解是一級的反應(yīng)，所以取傳感器程序的線性部份及使用BIACORETM系統(tǒng)中所用的計算機程序來計算此離解率常數(shù)。
重整的人C21抗體的動力學(xué)常數(shù)Kass(抗體-抗原結(jié)合的速度常數(shù))及Kdiss(抗體-抗原配合物離解的速度常數(shù))以及親合力(由平衡常數(shù)Kaff表示)被歸納于表1。
表1重整的人C21抗體的動力學(xué)常數(shù)和親合力。對Kass所作的獨立實驗次數(shù)列在括弧中;每個Kdiss是用兩次獨立實驗測定的抗體 kass×105M-1S-1kdiss×10-5S-1Kaff×1010M-1TES-C21 2.4±0.3(3) 2.6±0.0 0.92±0.12C21-HI/L1 2.6±0.1(3) 3.0±1.1 0.87±0.32C21-HI/L2 2.8±0.1(3) 5.7±0.2 0.49±0.02C21-HI/L3 2.9±0.4(3) 6.2±1.0 0.47±0.10C21-H3/L1 2.5±0.3(3) 1.9±0.6 1.32±0.44C21-H3/L2 2.5±0.3(4) 4.4±0.7 0.57±0.11C21-H3/L3 2.6±0.5(3) 3.5±0.2 0.74±0.15C21-Hay3/L1 2.5±0.3(3) 4.1±0.6 0.61±0.12C21-Hay3/L2 2.5±0.3(3) 3.1±0.6 0.81±0.18C21-Hay3/L3 2.6±0.3(3) 15.9±1.8 0.16±0.03所有這些重整的人C21抗體都有相當(dāng)相似的結(jié)合率。結(jié)合親合力的下降主要是由較高的離解率所引起的。由于氨基末端1和3位的重要性，分析重整的人C21輕鏈的不同的類型。當(dāng)這些位置上的氨基酸與存在于C21輕鏈上的氨基酸相同時就得到了與抗原的良好結(jié)合。使用完整的人KAF FRI就降低了與配偶體無關(guān)結(jié)合。
通過生物性相互作用分析來檢測該重整人G21抗體對人免疫球蛋白的所有等模式標(biāo)本的結(jié)合。首先，使測試抗體分別結(jié)合到在前述傳感器片上的被制動的俘獲抗體上。在5μg/ml的所有等模式標(biāo)本的人免疫球蛋白IgM、IgD、IgA1、IgA2、IgG4、IgG3、IgG2、IgG1及IgE(SE44)依次在此預(yù)處理過的表面上通過5分鐘之前，用嵌合抗CEA抗體10μg/mlRek41阻斷這些被制動的兔抗-人IgG和兔抗-鼠IgGl抗體的高反應(yīng)性5分鐘(人rl/k，歐洲專利申請No.323806)。最后該表面用4mM HCl恢復(fù)。流量，溫度和其它條件與前述的相同。用BIAcoreTM體系記錄傳感器程序。該重整形人C21抗體是專對人IgE等模式標(biāo)本的。
實施例8制造永久細(xì)胞系通過按氯化銫梯度離心分離到平衡將用于轉(zhuǎn)染的重整TESC-21人CMVH-和-L-鏈表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA，提純兩次。通過用基因脈沖儀(Gene Pulser)儀(BioRad，Richmond CA)用電穿孔將該重組體免疫球蛋白基因引入到鼠骨髓瘤NSO細(xì)胞。NSO細(xì)胞(2-3×107)用磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)洗滌，然后再懸浮于0.8ml PBS中，它含有BspCl-線性化的H-和L-鏈質(zhì)粒DNA，每種10μg。電穿孔是在210V的電場和960μFD的電容下進(jìn)行的?；厥盏募?xì)胞在含2%FBS(胎牛血清)的Protein-Free Hybridoma Medium(PFHM，Gibco)中稀釋，然后以每＃104個細(xì)胞的量涂在96＃的微滴定板中。經(jīng)48小時培養(yǎng)后，在含0.7mg/ml G418(Gibco)和2%FCS(胎牛犢血清)的PFHM中選擇轉(zhuǎn)集物，2周后，含抗藥集群的＃用ELISA篩選以便產(chǎn)生人IgG。為定量表面在該培養(yǎng)物上清液中的重組人IgG Kappa抗體使ELISA發(fā)育。Immulon 2(Dynatech Labs)96＃板用100μl的在PBS中的0.5μg/ml山羊抗-人Kappa抗體(Souther Biotech)于室溫下涂復(fù)過夜。用Blotto(5%在PBS中的干奶粉)將＃阻斷1小時，然后用含0.05%Tween-20的PBS(PBST)洗滌。將培養(yǎng)物上清液(50μl)加于該被涂過的＃上，然后培養(yǎng)1小時在用PBST洗滌之后，將在Blotto中以1/50000稀釋的100μl與辣根過氧化酶軛合的山羊抗-人IgG(FC)抗體(Jackson Immuno Reseach Lad)加到每一＃中，然后將該板培養(yǎng)1小時。含0.1%的3′、3″、5′、5″-四甲基聯(lián)苯胺(Sigma)和0.003%的過氧化氫(Sigma)的過氧化酶培養(yǎng)基溶液以每＃100μl的量加入，再于室溫下培養(yǎng)0.5小時。通過添加50μl的2M硫酸阻止此反應(yīng)，然后用Dynatech M R5000平板閱讀器在450nm讀出每＃中的反應(yīng)混合物的O.D.。重整的TESC-21人CMV表達(dá)質(zhì)粒H1、H3、L1和L3以四種組合方式，H3L1、H3L3、H1L1和H1L3被用于轉(zhuǎn)染NSO細(xì)胞。H3L1、H3L3、H1L1和H1L3的142、122、68和64全部＃以低于0.01的背景讀數(shù)分別都得到大于0.05的O.D讀數(shù)。對每種組合而言，基于IgG分泌水平選擇一種細(xì)胞系EH31.8分泌H3L1抗體;EH33.16分泌H3L3抗體;EH11.13，分泌H1L1抗體;而EH13.5，分泌H1L3抗體。
寄存數(shù)據(jù)下列細(xì)胞系已按American Type Culture Collection(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852，USA于1992年9月23日寄存。登記號列于括弧中。
產(chǎn)生重整人抗體H3L1的細(xì)胞系EH31.8(HB11130)產(chǎn)生重整人抗體H1L1的細(xì)胞系EH11.13(HB11132)產(chǎn)生重整鼠單克隆抗體TES-C21的細(xì)胞系TES-C21(HB11133)產(chǎn)生重整人抗體H3L3的細(xì)胞系EH33.6(HB11131)產(chǎn)生重整人抗體H1L3的細(xì)胞系EH13.5(HB11134)。
序列表(1)總的情況(i)申請人(A)姓名:CIBA-GEIGY AG(B)街道:Klybeckstr.141(C)城市:Basle(E)國家:Switzerland(F)郵編:4002(G)電話:+41 61 69 11 11(H)電傳:+41 61 696 79 76(I)傳真:962 991(A)姓名:TANOX BIOSYSTEMS,INC(B)街道:10301 Stella Link(C)城市:Houston(D)州名:Texas(E)國家:United States of America(F)郵政編碼::77025(ii)發(fā)明名稱:抗免疫球蛋白等模式標(biāo)本的重整的單克隆抗體(iii)序列數(shù):49(iv)計算機可閱讀的形式:
(A)存貯媒體類型:Floppy盤(B)計算機:IBM PC 可兼容的(C)操作系統(tǒng):PC-POS/MS-DOS(D)軟件:PatentIn Release #1.0,Verston#1.25(EPO)(2)序列標(biāo)號1的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:370堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:1..369(D)其它信息:產(chǎn)物="抗體TES-21重鏈可變區(qū)"(xi)序列描述:1號序列

(2)2號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:123氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性
(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:2號序列

(2)3號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:322堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙
(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:1..321(D)其它信息:產(chǎn)物="鼠抗體TES-C21輕鏈可變區(qū)"(xi)序列描述:3號序列

ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAG ATA AAA C 322Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)4號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:107氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:4號序列


(2)5號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:424堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(xii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..402(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:82..402(D)其它信息:/產(chǎn)物="輕鏈可變區(qū)C21-L1"(xi)序列描述:5號序列

(2)6號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:127氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:6號序列

(2)7號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:424堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..402(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:82..402(D)其它信息:/產(chǎn)物="輕鏈可變區(qū)C21-L2"(xi)序列描述:7號序列

(2)8號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:127氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:8號序列

(2)9號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:424堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..402(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:82..402(D)其它信息:/產(chǎn)物="輕鏈可變區(qū)C21-L3"(xi)序列描述:9號序列


(2)10號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:127氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性
(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:10號序列

(2)11號序列的信息:
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(A)長度:468堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙
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(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..447(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:79..447(D)其它信息:/產(chǎn)物="重鏈可變區(qū)C21-H1"(xi)序列描述:11號序列


(2)12號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:142氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:12號序列


(2)13號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:468堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..447
(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:79..447(D)其它信息:/產(chǎn)物="重鏈可變區(qū)C21-H3"(xi)序列描述:13號序列


(2)14號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:142氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:14號序列


(2)15號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:467堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..447(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:79..447(D)其它信息:/產(chǎn)物="重鏈可變區(qū)C21-Hay 1"(xi)序列描述:15號序列


(2)16號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:142氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:16號序列


(2)17號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:467堿基對(B)類型:核酸(C)束型:雙(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:CDS(B)位置:22..447(ix)特征:
(A)名稱/關(guān)鍵詞:mat-peptide(B)位置:79..447(D)其它信息:/產(chǎn)物="重鏈可變區(qū)C21-Hay 3"(xi)序列描述:17號序列


(2)18號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:142氨基酸(B)類型:氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:蛋白質(zhì)(xi)序列描述:18號序列


(2)19號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:105堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(xi)序列描述:19號序列

(2)20號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:95堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:20號序列

(2)21號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:75堿基對
(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:21號序列

(2)22號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:87堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:22號序列

(2)23號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:84堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:23號序列

(2)24號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:82堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(xi)序列描述:24號序列

(2)25號序列的信息:
(i)序列特征:
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(2)26號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:103堿基對
(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:26號序列

(2)27號序列的信息:
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(A)長度:105堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:27號序列

(2)28號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:107堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:28號序列

(2)29號序列的信息:
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(A)長度:83堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(xi)序列描述:29號序列

(2)30號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:83堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:30號序列

(2)31號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:21堿基對
(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:31號序列TGAAGAAAGC TTGCCGCCAC C 21(2)32號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:23堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:32號序列TTTGGATCCT TCTAGAACTC ACC 23
(2)33號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:24堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:33號序列TTTGGATCCT TCTAGAATAC TCAC 24(2)34號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:16堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(xi)序列描述:34號序列AACAGCTATG ACCATG 16(2)35號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:30堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:35號序列CTGAACCTGT CGGGGATGCC GCTGATGCTC 30(2)36號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:25堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單
(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:36號序列CCCGACAGGT TCAGCGGCAG CGGCA 25(2)37號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:22堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:37號序列GGTCAGCACG ATCTCGCCGG TG 22(2)38號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:27堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:38號序列GAGATCGTGC TGACCCAGAG CCCCGGC 27(2)39號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:28堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:39號序列CCGGGGGCCT GCCTCACCCA CTCCAGCC 28
(2)40號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:29堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:40號序列GAGGCAGGCC CCCGGCCACG GCCTGGAGT 29(2)41號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:34堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(xi)序列描述:41號序列GAAGGTGGCC CTGGCCTTGA ACTTCTCGTT GTAG 34(2)42號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:28堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:42號序列CAAGGCCAGG GCCACCTTCA CCGCCGAC 28(2)43號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:31堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單
(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:43號序列GTCCTCGCTC CTCAGGCTGC TCAGCTCCAT G 31(2)44號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:21堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:44號序列CAGCCTGAGG AGCGAGGACA C 21(2)45號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:27堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:45號序列CCATCCACTC CAGCCTCTGG CCGGGCC 27(2)46號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:33堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:46號序列CCATCCACTC CAGCCTCTGG CCGGGGGCCT GCC 33
(2)47號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:27堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:47號序列CAGAGGCTGG AGTGGATGGG CGAGATC 27(2)48號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:20堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)
(xi)序列描述:48號序列GTGCTGGCGC TGGTGTCGGC 20(2)49號序列的信息:
(i)序列特征:
(A)長度:21堿基對(B)類型:核酸(C)束型:單(D)拓?fù)鋵W(xué):線性(ii)分子類型:DNA(基因組)(xi)序列描述:49號序列ACCAGCGCCA GCACCGCCTA C 2權(quán)利要求
1.一種專對重整的人單克隆抗體，它包括一種抗原結(jié)合位點，所述位點依次包括多可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3；所述所述的CDR1的氨基酸序列為Met-Tyr-Trp-Leu-Glu，所述CDR2的氨基酸序列為Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala，所述的CDR3的該序列是Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr，所述的重整的人抗體具有的抗原結(jié)合親合力至少與鼠CDR一供體抗體TES-C21的抗原結(jié)合力相等，及一種所述抗體的直接等同物的或衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的重整的人抗體，它含一抗原結(jié)合位點，該位點含a)一個第一區(qū)，它依次包含多可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3，所述的CDR1的氨基酸序列為Met-Tyr-Trp-Leu-Glu，所述CDR2的氨基酸序列為Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala，所述的CDR3氨基酸的序列為Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr，和b)第二區(qū)，它依次包含多可變區(qū)CDR1、CDR2和CDR3所述的CDR1的氨基酸序列為Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His，所述的CDR2的氨基酸序列為Tyr-Ala-Ser-Glu-Ser-Ile-Ser，所述的CDR3的氨基酸序列為Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr，所述重整的人抗體具有的抗原結(jié)合親合力至少與鼠CDR一供體抗體TES-C21的相等，以及一種所述重整的抗體直接等同物的或衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重整的人抗體，它包括a)一種免疫球蛋白重鏈或其斷片，它具有依次包含多可變區(qū)CDR1H、CDR2H和CDR3H的可變區(qū)域，以及人重鏈的恒定部分或其斷片，所述的CDR1H的氨基酸序列有Met-Tyr-Trp-Leu-Glu，所述的CDR2H的氨基酸序列有Glu-Ile-Ser-Pro-Gly-Thr-Phe-Thr-Thr-Asn-Tyr-Asn-Glu-Lys-Phe-Lys-Ala，所述的CDR3H的氨基酸的序列是Phe-Ser-His-Phe-Ser-Gly-Ser-Asn-Tyr-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr-Phe-Asp-Tyr;和b)一種免疫球蛋白輕鏈或其斷片，它具有一個依次包含多可變區(qū)CDR1L、CDR2L和CDR3L的輕鏈可變區(qū)和人輕鏈恒定部分或其斷片，所述的CDR1L的氨基酸序列為Arg-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Gly-Thr-Asn-Ile-His，所述的CDR2L的氨基酸序列為Tyr-Ala-Ser-Gln-Ser-Ile-Ser，所述的CDR3L的氨基酸序列為Gln-Gln-Ser-Asp-Ser-Trp-Pro-Thr-Thr，一種所述重整的抗體的直接等同物或衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的重整的人抗體或其衍生物，它們含a)一重鏈，它包含具有基本上與11號序列所示的氨基酸序列實際上相同的氨基酸序列的可變區(qū)和人重鏈的恒定部分，所述的氨基酸序列始于1位氨基酸而終于123位氨基酸;和b)一輕鏈，它包含具有基本上與5號序列所示的氨基酸序列實際上相同的氨基酸序列的可變區(qū)和人輕鏈的恒定部分，所述的氨基酸序列始于1位氨基酸而終于107位氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的重整的人抗體或其衍生物，它們包括a)一包含一可變區(qū)和人重鏈的恒定部分的重鏈，該可變區(qū)的氨基酸序列與13號序列所示的序列實際上相同，它始于1位氨基酸而終于123位氨基酸;和b)一包含一可變區(qū)和人輕鏈的恒定部分的輕鏈，該可變區(qū)的氨基酸序列與5號序列中所示的序列實際上相同。它始于1位氨基酸而終于107位氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項的重整的人抗體，它包括該重鏈人恒定區(qū)rl的重鏈及其一種衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一項的重整的人抗體，其中該重鏈包括重鏈人恒定區(qū)rl，而該輕鏈包括輕鏈人恒定區(qū)k，以包括它們的衍生物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5的被命名為H3Ll的由細(xì)胞系EH31.8產(chǎn)生的重整的人抗體或其衍生物。
9.根據(jù)權(quán)利要求4的被命名為HlLl的由細(xì)胞系EH11.13產(chǎn)生的重整的人抗體或其衍生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的重整的人抗體的衍生物。
11.制備根據(jù)權(quán)利要求1的重整的人抗體，其直接等同物或衍生物的方法，它包括培養(yǎng)一產(chǎn)生本發(fā)明蛋白的適宜寄主，若需要則分離所述蛋白并任選地將其轉(zhuǎn)化成一種衍生物。
12.將一重鏈或其斷片編碼的DNA構(gòu)成物，它包含a)將可選擇地含有FR和CDR的可變區(qū)編碼的第一部分，所述CDR依次是CDR1H、CDR2H和CDR3H，它們的氨基酸序列與權(quán)利要求3中的該序列相同，和任選地含b)將人重鏈恒定區(qū)或其斷片編碼的第二部分。
13.將一輕鏈或其斷片編碼的DNA構(gòu)成物，它包含a)將可選擇地含有FR和CDR的可變區(qū)編碼的第一部分，所述CDR依次是CDR1L、CDR2L和CDR3L，它們的氨基酸序列與權(quán)利要求3中的該序列相同，和任選地含b)將人輕鏈恒定區(qū)或其斷片編碼的第二部分。
14.含根據(jù)權(quán)利要求12和/或根據(jù)權(quán)利要求13的DNA構(gòu)成物的雜交載體。
15.用根據(jù)權(quán)利要求14的雜交載體轉(zhuǎn)化的寄主細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的寄主細(xì)胞，它是細(xì)胞系EH11.13。
17.根據(jù)權(quán)利要求15的寄主細(xì)胞，它是細(xì)胞系EH31.8。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的，用于預(yù)防和/或治療人體中的過敏反應(yīng)的重整的人抗體，其直接等同物和/或其衍生物。
19.含根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其直接等同物和/或其衍生物的藥物組合物及藥學(xué)上可接受的載體。
20.將根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其直接等同物和/或衍生物用于對1gE定量或定性測定。
21.用于定量或定性測量含權(quán)利要求1的抗體，其直接等同物和/或衍生物的1gE的測試儀。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用以抗免疫球蛋白E(lgE)的等模式標(biāo)本定子的重整的人單克隆抗體、所述抗體的直接等同物和衍生物。本發(fā)明的分子對于診斷、預(yù)防和治療過敏是有用的。
文檔編號C07K16/00GK1088986SQ9311984
公開日1994年7月6日 申請日期1993年9月24日 優(yōu)先權(quán)日1992年9月24日
發(fā)明者N·哈德曼, F·科爾賓格, J·薩爾丹 申請人:希巴-蓋吉股份公司