專(zhuān)利名稱(chēng)：與主要組織相容復(fù)合物分子的hla-c-克隆10能形成復(fù)合物的分離的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷和治療疾病的多肽，特別是它涉及被加工成一個(gè)由MHC分子的HLA-C-克隆10提呈(presented)的肽分子的多肽，以及該被提呈的肽。這些多肽被用于診斷和治療。
哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)識(shí)別和與外源物質(zhì)反應(yīng)的過(guò)程是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。該系統(tǒng)一個(gè)很主要方面是T細(xì)胞應(yīng)答。這種應(yīng)答要求T細(xì)胞識(shí)別并與稱(chēng)為人白細(xì)胞抗原(“HLA”)，或主要組織相容復(fù)合物(“MHCs”)的肽類(lèi)細(xì)胞表面分子進(jìn)行相互作用的復(fù)合物。這些多肽來(lái)源于參與提呈HLA/MHC分子之細(xì)胞加工的更大分子。這方面參見(jiàn)Male et al.，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1987，特別其第六至十章。T細(xì)胞和HLA/肽的復(fù)合物的相互作用是受限制的，這要求對(duì)一種HLA分子和一種肽特定結(jié)合狀態(tài)具有特異性的一種T細(xì)胞。假如不存在特異性T細(xì)胞，盡管存在其配對(duì)結(jié)合的復(fù)合物，也沒(méi)有T細(xì)胞應(yīng)答。同樣，假如無(wú)特異的復(fù)合物，盡管T細(xì)胞存在也無(wú)應(yīng)答。這種機(jī)理涉及自身免疫病免疫系統(tǒng)對(duì)外源物質(zhì)的應(yīng)答，以及對(duì)細(xì)胞異常性的應(yīng)答。人們將大量工作的重點(diǎn)放在這一機(jī)理的研究上，經(jīng)過(guò)這種機(jī)理可將蛋白加工成HLA結(jié)合多肽。參見(jiàn)Barinage，Science257880(1992);Fremont etal.，Science 257919(1992);Matsumura et al.，Science 257927(1992);Latron et al.，Science 257964(1992)。
癌癥也已暗示存在有T細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞異常性的機(jī)制。例如，在PCT申請(qǐng)專(zhuān)利中的PCT/US92/04354(申請(qǐng)日1992年5月22日，
公開(kāi)日1992年11月26)，其中所揭示的一族基因，它們被加工成能在細(xì)胞表面表達(dá)的多肽，這可引起由特異的CTLs對(duì)腫瘤細(xì)胞溶解的作用。所述的這類(lèi)基團(tuán)編碼著“腫瘤排斥抗原前體”(“tumor rejection antigen precursors”)或“TRAP”分子，源自其中的多肽稱(chēng)之為“腫瘤排斥抗原”或“TRAs”。參見(jiàn)Traversari et al.，Immunogenetics 35145(1992);van der Bruggen et al.，Science 2541643(1991)，關(guān)于該族基因的進(jìn)一步資訊也可參見(jiàn)1991年12月12日申請(qǐng)的USSN807，043。
在USSN938，334專(zhuān)利申請(qǐng)中揭示了由HLA-A1分子提呈的九肽。該文獻(xiàn)披露假如給出對(duì)特定的HLA分子特定的多肽已知的特異性，人們希望一特定的肽結(jié)合一個(gè)HLA分子，而不結(jié)合其他的分子。這一點(diǎn)很重要，因?yàn)椴煌膫€(gè)體具有不同HLA表型。結(jié)果，當(dāng)一特定的肽被鑒定作為一特異的HLA分子的配對(duì)結(jié)合物的過(guò)程具有診斷和治療意義時(shí)，這僅與具有特定HLA表型的個(gè)體相關(guān)。該領(lǐng)域仍需要進(jìn)一步研究，因?yàn)榧?xì)胞異常性并不限于一種特定的HLA表型，而定向或靶位療法需要有關(guān)異常細(xì)胞表型的某些知識(shí)。
在USSN008，446中(1993年1月22日申請(qǐng)的)，披露MAGE-1表達(dá)產(chǎn)物被加工成一個(gè)次級(jí)TRA。這種次級(jí)TRA由HLA-C-克隆10分子提呈。該文獻(xiàn)指出一個(gè)已知的TRAP可以產(chǎn)生大量的TRAs。
1992年12月22日申請(qǐng)的USSN994，928中描述酪氨酸酶是一種腫瘤排斥抗原前體。該文獻(xiàn)披露由某些正常細(xì)胞(如黑色素細(xì)胞)產(chǎn)生的分子在腫瘤細(xì)胞中可被加工生成由HLA-A2分子提呈的腫瘤排斥抗原。
1993年3月18日提交的USSN08/032，978中公開(kāi)一種由HLA-A2分子提呈的次級(jí)TRA，它不是源于酪氨酸酶。所述的TRA來(lái)自TRAP，但是，它是由一非MAGE基團(tuán)編碼的。該文獻(xiàn)指出一個(gè)特定的HLA分子可以提呈不同來(lái)源的TRAs。
1993年6月17日申請(qǐng)的USSN08/079，110，為本申請(qǐng)的母申請(qǐng)，它披露一族基因，本文中稱(chēng)之為BAGE族。經(jīng)觀察得出這些基因也編碼腫瘤排斥抗原前體。在那件申請(qǐng)中可見(jiàn)稱(chēng)做HLA-C-克隆10的MHC分子提呈來(lái)自BAGE腫瘤排斥抗原前體的腫瘤排斥抗原;然而，并沒(méi)有披露所述的腫瘤排斥抗原。本申請(qǐng)涉及這種肽，本文中稱(chēng)之為SEQ ID NO∶10，同時(shí)也討論鑒別這一肽的其他方面。
以下將進(jìn)一步描述本發(fā)明。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1所示采用CTL克隆82/82針對(duì)各種細(xì)胞系所做的鉻釋放分析測(cè)定的結(jié)果。
圖2所示為CTL克隆82/82用來(lái)與一組不同的細(xì)胞系對(duì)比，其TNF釋放分析的結(jié)果。
圖3為用轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞進(jìn)行TNF釋放分析的結(jié)果。
圖4表示用CTL克隆株82/82對(duì)各種轉(zhuǎn)染子細(xì)胞進(jìn)行的試驗(yàn)的結(jié)果和測(cè)定TNF釋放量。
圖5為用SEQ ID NO∶10的肽刺激溶細(xì)胞性T細(xì)胞克隆CTL82/82后測(cè)定細(xì)胞數(shù)最大溶解(half maximal lysis of cell)的研究所得到的結(jié)果。
實(shí)施例1采用標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)，用采自患者的MZ2的黑色素瘤細(xì)胞建立一個(gè)黑色素瘤細(xì)胞系，MZ2-MEL。該細(xì)胞系參見(jiàn)PCT/US92/04354，申請(qǐng)日為1992年5月22日，
公開(kāi)日為1993年11月26日。一旦細(xì)胞系建立之后，輻照其樣品，使得其變?yōu)榉窃鲋车?。然后使用這種輻照后的細(xì)胞分離對(duì)其特異的溶細(xì)胞性T細(xì)胞克隆株(“CTLs”)。
從患者M(jìn)Z2身上采集外周血單核細(xì)胞(“PBMCs”)的樣品，并將其與輻照后的黑色素瘤細(xì)胞接觸。觀察混合物中黑色素瘤細(xì)胞溶解情況，該結(jié)果顯示針對(duì)由黑色素瘤細(xì)胞提呈的肽和HLA分子復(fù)合物的特異性CTLs存在于樣品中。
所用的細(xì)胞溶解分析試驗(yàn)是按Herin等人報(bào)道的鉻釋放分析方法進(jìn)行的，參見(jiàn)Herin et al.，Int.J.Cancer 39390-396(1987)。然而本文也描述這一試驗(yàn)。在體外培養(yǎng)出靶黑色素瘤細(xì)胞，然后在DMEM中以107細(xì)胞/ml重新懸浮，并補(bǔ)加10mM HEPES和30%FCS，以200μCi/ml的Na(5Cr)O4，37℃孵育45分鐘。用加有10mM Hepes的DMEM洗滌標(biāo)記細(xì)胞三次。在含有10mM Hepes和10%FCS的DMEM中懸浮之，隨后將等份量含有103細(xì)胞的100μl加入96孔微培養(yǎng)板。在相同培養(yǎng)基中的PBLs也被加入每孔之中、每孔100μl。重復(fù)兩次該試驗(yàn)。100g離心培養(yǎng)板4分鐘，在8%CO2條件下37℃孵育4小時(shí)。
重新離心培養(yǎng)板，收集和計(jì)數(shù)100μl份量的上清。并按以下公式計(jì)算51Cr釋放51Cr釋放%＝ ((ER-SR))/((MR-SR)) ×100其中ER是實(shí)驗(yàn)得到的51Cr釋放量，SR為僅在200μl培養(yǎng)基中孵育103標(biāo)記細(xì)胞所測(cè)的自發(fā)釋放量(Spontaneous release)而MR為向靶細(xì)胞中加入100μl0.3%Triton X-100而得到的最大釋放量。
那些示出具有高CTL活性的單核血樣經(jīng)有限稀釋法被擴(kuò)大和克隆，再用相同方法進(jìn)行篩選，從而分離出CTL克隆MZ2-CTL82/82。該克隆下文中稱(chēng)做“82/82”。
用相同的方法去檢測(cè)K562靶細(xì)胞，以及一個(gè)黑色素瘤細(xì)胞系。在圖1A中的那些結(jié)果顯示出這種CTL克隆識(shí)別和溶解黑色素瘤細(xì)胞系，但不溶解K562。然后按前述相同的方式針對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系檢測(cè)CTL克隆株82/82。圖1所示，當(dāng)MZ2-MEL.43被CTL克隆82/82溶解時(shí)，MZ2-MEL2.2.5細(xì)胞系，它是一個(gè)缺失表達(dá)HLA-A29，HLA-B44和HLA-C克隆10的變體并不被其溶解，提示TRA是由這些HLA分子中的一種提呈的。當(dāng)采用已知技術(shù)用編碼HLA-C克隆10的DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系MZ2-MEL2.2.5時(shí)，該細(xì)胞對(duì)CTL克隆82/82的溶解變得敏感了，因此顯示HLA-C克隆10提呈由CTL克隆82/82識(shí)別的抗原。
實(shí)施例2進(jìn)一步進(jìn)行的研究確定當(dāng)82/82與靶細(xì)胞接觸時(shí)是否也產(chǎn)生腫瘤壞死因子(TNF)。采用的方法參見(jiàn)Traversari et al.，Immunogenetics 35145-152(1992)。簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng)基中，CTL細(xì)胞系樣品與目標(biāo)靶細(xì)胞的樣品結(jié)合。24小時(shí)后，從培養(yǎng)物中除去上清，然后在TNF敏感的WEHI細(xì)胞上進(jìn)行測(cè)試。如圖2所示，測(cè)試了14個(gè)不同的細(xì)胞系。
圖2中表示的結(jié)果以接觸上清而死亡的WEHI細(xì)胞的百分率表示。該結(jié)果表明三個(gè)黑色素瘤細(xì)胞系提呈這種抗原。由于MZ2.MEL43的強(qiáng)烈的應(yīng)答結(jié)果，它被用于下面的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例3實(shí)施例2的結(jié)果顯示MZ2·MEL.43提呈目的靶抗原。這樣它可做為制備cDNA文庫(kù)的總mRNA的來(lái)源。
從該細(xì)胞系中分離總RNA。再用寡-dT結(jié)合試劑盒按已熟知的技術(shù)分離出mRNA。一旦獲得mRNA后，用標(biāo)準(zhǔn)方法將其轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后將cDNA與EcoRI接頭連接，并按使用說(shuō)明克隆到質(zhì)粒pcD-SRα的EcoRI位點(diǎn)。將重組質(zhì)粒經(jīng)電穿孔進(jìn)入JM101大腸桿菌(電穿孔條件25μfarads 1個(gè)脈沖，2500V)。
用氨芐青霉素(50μg/ml)選擇出轉(zhuǎn)染的細(xì)菌，將其分成87庫(kù)，每庫(kù)400個(gè)細(xì)菌，和297庫(kù)，每庫(kù)為200個(gè)細(xì)菌。每個(gè)庫(kù)分別代表約280cDNAs，或者約140cDNAs，經(jīng)分析顯示約70%的質(zhì)粒含有插入片段。擴(kuò)增每個(gè)庫(kù)至飽合，經(jīng)堿溶解，不用酚提而用醋酸鉀沉淀，分離出質(zhì)粒DNA，該方法參見(jiàn)Maniatis et alMolecular CloningA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor，N.Y.1982)。
實(shí)施例4在制備如實(shí)施例3中描述的文庫(kù)之后，將所述的cDNA轉(zhuǎn)染到真核細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染重復(fù)兩次進(jìn)行。將COS-7細(xì)胞樣品接種到組織培養(yǎng)平底微孔中，接種量為每孔15000個(gè)細(xì)胞，該微孔中含有加入10%FCS的Dulbeco＇s Modified Eagles Medium(DMEM)。37℃過(guò)夜孵育該細(xì)胞，移去培養(yǎng)基，然后換入每孔50μl的含有10%Nu血清，400μg/ml DEAE-葡聚糖和100μM氯喹，以及100mg質(zhì)粒的DMEM培養(yǎng)基。這些質(zhì)粒是前述各個(gè)庫(kù)中的質(zhì)粒，100ng質(zhì)粒含有在質(zhì)粒pcD-SRα中編碼HLA-C克隆10的質(zhì)粒。37℃4小時(shí)孵育后，移去培養(yǎng)基，再換入50μl的含10%DMSO的PBS。2分鐘后除去這一培養(yǎng)基，再換入200μl的含10%FCS的DMEM。
變換培養(yǎng)基之后，37℃孵育COS細(xì)胞24-48小時(shí)。然后棄培養(yǎng)基，將1500個(gè)CTL克隆株82/82的細(xì)胞加入100μl含有10%庫(kù)后人血清和20U/ml IL-2的Iscove培養(yǎng)基中。24小時(shí)后移去上清液，按Traversari等人的方法，進(jìn)行WEHI細(xì)胞試驗(yàn)測(cè)定出TNF含量，參見(jiàn)Traversari et al.，Immunol genetics 35145-152(1992)。
在受試的384庫(kù)中，99%刺激TNF，濃度低于5pg/ml時(shí)。有兩個(gè)庫(kù)濃度為40pg/ml以上，并有兩個(gè)孔顯示相同的結(jié)果。參見(jiàn)圖3。篩選這些庫(kù)中的細(xì)菌，即庫(kù)19，作時(shí)一步試驗(yàn)。
實(shí)施例5克隆庫(kù)19的細(xì)菌，并對(duì)800個(gè)細(xì)菌進(jìn)行了測(cè)試。從中提取質(zhì)粒DNA，并按前述相同的方法將其轉(zhuǎn)染入一新COS細(xì)胞樣品中，再測(cè)試細(xì)胞對(duì)CTL克隆82/82的刺激作用。發(fā)現(xiàn)了12個(gè)陽(yáng)性克隆。其中對(duì)一個(gè)作進(jìn)一步測(cè)試，該克隆被稱(chēng)之為cDNA克隆AD5。在一個(gè)比較試驗(yàn)中，用cDNA克隆AD5和HLA-C克隆10轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，或HLA-C克隆10和MAGE-1，或AD5本身，或者HLA-C克隆10本身轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。MZ2-MEL2.2.5和MZ2-MEL.43為對(duì)照細(xì)胞系。按前述方法在WEHI細(xì)胞上測(cè)試CTL上清液中TNF釋放。殘存WEHI細(xì)胞的光密度用MTT測(cè)定。圖4顯示只有用HLA-C克隆10和cDNA-AD5轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞，以及原MZ2-MEL43細(xì)胞系可刺激CTL克隆82/82釋放TNF。
實(shí)施例6按公知的技術(shù)對(duì)cDNA AD5測(cè)序。序列檢索表明質(zhì)粒中插入片段沒(méi)有與公知的基因或蛋白具有同源性。序列鑒定號(hào)(SEQ ID NO∶1)表示用于鑒定過(guò)的該基因的cDNA核苷酸信息，下文中稱(chēng)“BAGE-1”。推定的開(kāi)放讀框(ORF)位于該分子的第201-332堿基處。
實(shí)施例7cDNA序列測(cè)定之后，如實(shí)施例6，進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定正常組織細(xì)胞是否表達(dá)該基因。為了確定這一點(diǎn)，反轉(zhuǎn)錄從正常組織中分離出的RNA，并以寡-dT做為引物。然后擴(kuò)增得到的cDNA，采用的引物5'-CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3'
(SEQ ID NO∶2)以及5'-GAG CGG TTT TTC TGG CAT TG-3'(SEQ ID NO∶3)并采用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法進(jìn)行。加入放射活性的核苷酸，經(jīng)磷顯影測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
以從MZ2-MEL3.0細(xì)胞系中獲得的產(chǎn)物百分率表示產(chǎn)品的數(shù)量，它表示表達(dá)的基因。其結(jié)果如下MZ2-MEL3.0 100%肺 ＜0.5%乳腺 ＂胃 ＂皮膚 ＂腦 ＂前列腺 ＂腎 ＂睪丸 8%在本文中另一未顯出的實(shí)驗(yàn)中，用EcoRI消化MZ2-MEL細(xì)胞系的DNA，然后用對(duì)應(yīng)于本文中cDNA的前300個(gè)核苷酸的PCR探針進(jìn)行雜交。按標(biāo)準(zhǔn)的Southern印跡法，在對(duì)應(yīng)于約5.8，7.5，8.5和11千堿基處鑒定出4條帶，提示有Bage基因族的存在。
實(shí)施例8也鑒定出腫瘤樣品和腫瘤細(xì)胞系的該基因有表達(dá)作用。正好按實(shí)施例4獲得cDNA，然后，采用套入引物(nested primer)方法擴(kuò)增相關(guān)序列。首先采用下述引物進(jìn)行20個(gè)周期的擴(kuò)增5'-CGG CTT AGA GGA CCA GGA GAA-3'(SEQ ID NO∶4)和5'-CAG AAG ATG AAG CAC AGA G-3'(SEQ ID NO∶5)隨后再采用下述引物為進(jìn)行另外20個(gè)周期的擴(kuò)增5'-GGC TCC AAC CTC CAG CTC AC-3'(SEQ ID NO∶6)和5'-TTA GAG GAC CAG GAG AAG G-3'(SEQ ID NO∶7)結(jié)果如下分子數(shù)字為陽(yáng)性樣品數(shù);分母為受試樣品的全部數(shù)目。
黑色素瘤 12/20乳腺癌 2/5小細(xì)胞肺癌 2/8非小細(xì)胞肺癌 2/5肉瘤 1/4頭頸部腫瘤 1/6結(jié)腸癌 0/4腎癌 0/5白血病/淋巴瘤 0/3
實(shí)施例9前述的實(shí)驗(yàn)顯示溶細(xì)胞性T細(xì)胞克隆CTL82/82識(shí)別由BAGE基因編碼的并由HLA-C-克隆10提呈的抗原。本實(shí)施例中描述的工作詳細(xì)地記載了如何鑒定被提呈抗原的氨基酸序列。
與編碼BAGE相同的cDNA克隆，即AD5，用來(lái)生產(chǎn)大量的不完全cDNA分子。將cDNA克隆插入表達(dá)載體pcDNAI/Amp，并用NotI和SphI限制性?xún)?nèi)切酶消化之。隨后按使用說(shuō)明用核酸外切酶Ⅲ處理。通過(guò)使用外切酶Ⅲ的時(shí)間長(zhǎng)短，獲得在AD5 3'端逐漸缺失片段。將截短的不同片段重新聯(lián)接到pcDNAI/Amp，電穿孔進(jìn)入大腸桿菌DH5 αF'IQ菌株，用氨芐青霉素(50μg/ml)選擇之。以這種方式獲得400個(gè)克隆。
從這400個(gè)克隆中獲得質(zhì)粒DNA，再將其與HLA-C-克隆10編碼cDNA一起轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞中。然后以前述的TNF釋放試驗(yàn)測(cè)試轉(zhuǎn)染子。陽(yáng)性克隆為刺激CTL82/82的TNF釋放的克隆。
一旦細(xì)胞被分成陽(yáng)性和陰性轉(zhuǎn)染子，確定出10個(gè)陽(yáng)性和10陰性轉(zhuǎn)染子的質(zhì)粒DNA序列。陽(yáng)性克隆-克隆株19C2含有前述的BAGE基因的部分開(kāi)放讀框，它位于第1位核苷酸至第67位核苷酸處。相反，克隆17G12，為一種陰性轉(zhuǎn)染子，它含有所述基因中的1-6位核苷酸。
通過(guò)對(duì)比陽(yáng)性和陰性克隆的插入片段，鑒別出一個(gè)22氨基酸區(qū)可能含有提呈肽的序列，即Met Ala Ala Arg Ala
Val Phe Leu Ala LeuSer Ala Gln Leu LeuGln Ala Arg Leu MetLys Glu(SEQ ID NO∶8)。
按該序列制備合成肽，并測(cè)試它們能否使用HLA-C-克隆10轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞的具有刺激TNF釋放的能力。第一個(gè)陽(yáng)性肽是一個(gè)16-聚體(16-mer)Met Ala Ala Arg AlaVal Phe Leu Ala LeuSer Ala Gln Leu LeuGln(SEQ ID NO∶9)。
對(duì)更小的肽的測(cè)試導(dǎo)致鑒定出下列九肽Ala Ala Arg Ala ValPhe Leu Ala Leu(SEQ ID NO∶10)。
當(dāng)半數(shù)最大溶解在上述肽濃度逐漸達(dá)到80nM時(shí)，如圖5所示，該肽可有效地刺激CTL82/82。
前述的實(shí)施例表明了編碼腫瘤排斥抗原前體的核酸分子的分離。然而，這種“TRAP”編碼分子與任何一種前述的MAGE編碼序列都無(wú)同源性。因此，本發(fā)明一方面是為一種分離出的核酸分子，它包括如SEQ ID NO 1所述的核苷酸序列。該序列不是MAGE編碼序列，這可參閱前述文獻(xiàn)中所述的任何一種MAGE基因序列并與其對(duì)比可見(jiàn)這一結(jié)果。本發(fā)明的又一部分是編碼非MAGE腫瘤排斥抗原前體的那些核酸序列，但這些序列在嚴(yán)格的條件下可雜交到含前述核苷酸序列的核酸分子。本文中采用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格的條件”其參數(shù)是本領(lǐng)域所熟知的。更具體講，本文采用的嚴(yán)格條件為在3.5×SSC，1×Denhardt溶液，25mM磷酸鈉緩沖液(pH，7.0)，0.5%SDS，和2mM EDTA中65℃雜交18小時(shí)。隨后，65℃用2×SSC，0.1%SDS四次洗滌該濾膜20分鐘，再在0.3×SSC，0.1%SDS中洗20分鐘。也可采用其它的條件，試劑等等，其嚴(yán)格程度相同。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知這些條件，本文此處勿需贅言。
從實(shí)施例中可以看出本發(fā)明包括在表達(dá)載體中使用這些序列，以及將其轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞和細(xì)胞系，這些細(xì)胞為原核細(xì)胞(如大腸桿菌)，或者為真核細(xì)胞(如CHO或COS細(xì)胞)。表達(dá)載體要求在操作上能將前述的相關(guān)序列連接到一個(gè)啟動(dòng)子上。因?yàn)橐寻l(fā)現(xiàn)人白細(xì)胞抗原HLA-C克隆10提呈來(lái)自這些基因的腫瘤排斥抗原，所以表達(dá)載體也可包括編碼HLA-C克隆10的核酸序列。當(dāng)載體包含這兩種編碼序列時(shí)，該載體可被用來(lái)轉(zhuǎn)染正常時(shí)不表達(dá)其中任何一種序列的細(xì)胞。當(dāng)宿主細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)HLA-C克隆10時(shí)，腫瘤排斥抗原前體編碼序列可以單獨(dú)使用。當(dāng)然對(duì)可以采用的特定的宿主細(xì)胞沒(méi)有限制。由于需要，將含有兩種編碼序列的載體可被用在提呈HLA-C克隆10的細(xì)胞上，所以腫瘤排斥抗原前體基因能被用于不表達(dá)HLA-C克隆10的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明也包括所謂的表達(dá)試劑盒，這使得技術(shù)人員制備出一種所需的表達(dá)載體或多種載體。這種表達(dá)試劑盒包括至少每種前述的編碼序列的各自部分。如需要也可以加入其他的組份，只要是前述的序列如需要都包括在其中。
為從前述的MAGE族中區(qū)別出本發(fā)明之核酸分子和TRAPs，本發(fā)明將簡(jiǎn)稱(chēng)為BAGE基因族以及TRAPs。因此，本文中使用“BAGE”時(shí)，它是指前述序列編碼的腫瘤排斥抗原前體。“BAGE編碼分子”以及相似的術(shù)語(yǔ)被用來(lái)描述核酸分子的本身。
本發(fā)明中的一部分為實(shí)施例9中列出的多肽SEQ ID NO∶8，9和10。這些多肽可被用于鑒定那些提呈MHC分子HLA-C-克隆10的細(xì)胞。通過(guò)鑒定該肽已經(jīng)結(jié)合的細(xì)胞再供給攜帶可檢測(cè)信號(hào)的多肽，這是一條用于鑒定細(xì)胞的辦法，就好象使用固相結(jié)合肽，HLA-C-克隆10提呈細(xì)胞所結(jié)合的那樣，因而可從將要被檢樣品中移出它們。另外，本發(fā)明允許技術(shù)人員診斷以TRAP的表達(dá)為特征的疾病。這種方法涉及確定TRAP基因的表達(dá)，和/或源自其中的TRAs，如由HLA-C-克隆10提呈的TRA。在前一種情況中，通過(guò)任何標(biāo)準(zhǔn)核酸測(cè)定方法能進(jìn)行這種確定，包括聚合酶鏈反應(yīng)，或標(biāo)記雜交探針?lè)治觥Ｔ诤笠环N情況中，優(yōu)選分析TRA和HLA復(fù)合物的配對(duì)結(jié)合體的方法，如抗體，另一種替代測(cè)定方法是前述的那種類(lèi)型的TNF釋放分析測(cè)定。
分離TRAP基因也使分離TRAP分子本身成為可能，特別是含有由SEQ ID NO∶1編碼的氨基酸序列的TRAP分子。當(dāng)如前所示的TRA，或TRA和HLA的復(fù)合物，如HLA-C克隆10時(shí)，這些分離出的分子可與如佐劑物質(zhì)結(jié)合，制成疫苗，用于治療以表達(dá)TRAP分子為特征的疾病。另外，也可以從在其表面提呈TRA/HLA復(fù)合物的細(xì)胞中制備疫苗，例如非增殖性癌細(xì)胞，非增殖的轉(zhuǎn)染子等等。在所有把細(xì)胞用做疫苗的例子中，它們可以是用有必要證明參與CTL應(yīng)答的一種或兩種組份的編碼序列轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，或者是表達(dá)兩種分子而非轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。采用現(xiàn)有技術(shù)中公知的標(biāo)準(zhǔn)方法可以用TRAP分子，其相關(guān)TRAs，以及TRA和HLA復(fù)合物制備抗體。
本文中所用的“疾病”(disorder)是指任何一種表達(dá)腫瘤排斥抗原的病理狀態(tài)。這種病的一個(gè)特別例子是惡性黑色素瘤。
基于現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的治療方法，為一種患者免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)，這將導(dǎo)致TRA提呈細(xì)胞，如HLA-C克隆10細(xì)胞的溶解。還有一種這樣的治療方法是向所涉及的表型異常細(xì)胞的患者使用對(duì)復(fù)合物特異性的CTLs。本領(lǐng)域技術(shù)人員能在體外開(kāi)發(fā)出這種CTLs。特別是，例如血細(xì)胞等細(xì)胞樣品，與提呈該復(fù)合物的細(xì)胞接觸，能激發(fā)特異性的CTL增殖。靶細(xì)胞可以是轉(zhuǎn)染子，例如上述類(lèi)型的COS細(xì)胞。這些轉(zhuǎn)染子在其表面上提呈所需的復(fù)合物，而且當(dāng)與目標(biāo)CTL結(jié)合時(shí)，就可刺激其增殖。如其他合適的宿主細(xì)胞一樣，本文中使用了COS細(xì)胞可從很多渠道得到。
為了詳細(xì)了解治療方法學(xué)，參見(jiàn)過(guò)繼性轉(zhuǎn)移(adoptive transfer)(Greenberg，J.Immunol，136(5)1917(1986);Reddel et al.，Science 257238(7-10-92);Lynch et al.，Eur.J.Immunol.211403-1410(1991);Kastet al.，Cell 59603-614(11-17-89))，提呈所需復(fù)合物的細(xì)胞與CTLs結(jié)合，這將引起對(duì)其特異性的CTLs增殖。然后，給細(xì)胞異常性的患者增殖后的CTLs，所說(shuō)的異常性的特征在于某些異常細(xì)胞提呈那種特定復(fù)合物。然后，CTLs溶解異常細(xì)胞，借此達(dá)到理想的治療目的。
先前的治療保證至少部分患者異常細(xì)胞提呈相關(guān)的HLA/TRA復(fù)合物。這一點(diǎn)很容易確定，因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)非常熟悉鑒定提呈一特定HLA分子細(xì)胞的方法，以及如何鑒定表達(dá)相應(yīng)序列DNA(本例中指BAGE序列)的細(xì)胞。一旦提呈相關(guān)復(fù)合物的細(xì)胞經(jīng)過(guò)前述的篩選方法鑒定出來(lái)，它們就能與患者的樣品結(jié)合，其樣品中含有CTLs。假如復(fù)合物提呈細(xì)胞可被混合的CTL樣品溶解，這樣則能斷定來(lái)源BAGE的腫瘤排斥抗原即被提呈，這樣患者是前述治療方法適應(yīng)者。
過(guò)繼性轉(zhuǎn)移不是用于本發(fā)明唯一的治療方法。采用許多方法也能在體內(nèi)激活CTLs。其中一個(gè)方法，即采用前述的表達(dá)復(fù)合物的非增殖細(xì)胞也能完成。用于這種方法的細(xì)胞可以是正常表達(dá)該復(fù)合物的細(xì)胞，例如輻照的黑色素瘤細(xì)胞，或用需提呈該復(fù)合物的一個(gè)或兩個(gè)基因轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞。Chen等人(Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88110-114(January，1991))示出這一方法，他們?cè)谥委煼桨钢胁捎帽磉_(dá)HPVE7多肽的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。也可以用各種細(xì)胞類(lèi)型。同樣，也可以使用攜帶其中一個(gè)或兩個(gè)目的基因的載體。特別優(yōu)選的是病毒或細(xì)菌載體。在這些載體體系中，用如痘苗病毒或者細(xì)菌BCG為載體操作目的基因，實(shí)際上用這些材料“感染”宿主細(xì)胞。提呈目的復(fù)合物的細(xì)胞可被自體CTLs識(shí)別，然后細(xì)胞開(kāi)始增殖。腫瘤排斥抗原或前體與佐劑結(jié)合可獲得相似的效應(yīng)即其促進(jìn)摻合到提呈目的HLA分子的HLA-C克隆10提呈細(xì)胞，這樣，TRAP經(jīng)加工生成HLA分子的肽配對(duì)結(jié)合物，而無(wú)需進(jìn)一步加工后提呈TRA。
本發(fā)明的其他方面對(duì)于普通技術(shù)人員很清楚，此處不必重復(fù)。
已使用過(guò)的術(shù)語(yǔ)和表達(dá)方式被用做描述說(shuō)明性術(shù)語(yǔ)。而并非起限定作用，使用這些術(shù)語(yǔ)和表達(dá)并不排除其所表示和描述的特征之任何等同物，這可說(shuō)明在本發(fā)明的范圍內(nèi)可做各種修改。
SEQ ID NO∶1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1032個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列SEQ ID NO∶1 SEQ ID NO∶2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列表示SEQ ID NO∶2CAGAAGATGA AGCACAGAG
SEQ ID NO∶3的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列表示SEQ ID NO∶3;
GAGCGGTTTT TCTGGCATTGSEQ ID NO∶4的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列表示SEQ ID NO∶4CGGCTTAGAG GACCAGGAGA ASEQ ID NO∶5的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列SEQ ID NO∶5CAGAAGATGA AGCACAGAGSEQ ID NO∶6的信息
(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列表示SEQ ID NO∶6GGCTCCAACC TCCAGCTCACSEQ ID NO∶7的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度19個(gè)堿基對(duì)(B)類(lèi)型核酸(C)股數(shù)單股(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列SEQ ID NO∶7TTAGAGGACC AGGAGAAGGSEQ ID NO∶8的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)氨基酸殘基(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列SEQ ID NO∶8Met Ala Ala Arg Ala5Val Phe Leu Ala Leu10Ser Ala Gln Leu Leu
15Gln Ala Arg Leu Met20Lys GlnSEQ ID NO∶9的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度16個(gè)氨基酸殘基(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列SEQ ID NO∶9Met Ala Ala Arg Ala5Val Phe Leu Ala Leu10Ser Ala Gln Leu Leu15GlnSEQ ID NO∶10的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度9個(gè)氨基酸殘基(B)類(lèi)型氨基酸(D)拓?fù)渚€(xiàn)性(xi)序列SEQ ID NO∶10Ala Ala Arg Ala Val5Phe Leu Ala Leu
權(quán)利要求
1.一種分離出的包括SEQ ID NO∶1所示的核苷酸序列的核酸分子。
2.一種分離出的核酸分子，在嚴(yán)格的條件下，它可與SEQ ID NO∶1所示的核酸序列雜交，并編碼腫瘤排斥抗原前體，其附加條件為所述分離出的核酸分子不編碼MAGE腫瘤排斥抗原前體。
3.一種分離出的與權(quán)利要求1所述的核酸分子互補(bǔ)的mRNA分子。
4.一種用權(quán)利要求1所述的核酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
5.一種用權(quán)利要求2所述的核酸分子轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
6.一種包括將權(quán)利要求1所述的分離出的核酸分子經(jīng)操作連接于啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
7.一種包括將權(quán)利要求2所述的分離出的核酸分子經(jīng)操作連接于啟動(dòng)子的表達(dá)載體。
8.如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是表達(dá)HLA-C克隆10的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中所述的宿主細(xì)胞是表達(dá)HLA-C克隆10的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
10.如權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，還包括編碼HLA-C克隆10的核酸分子。
11.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，還包括編碼HLA-C克隆10的核酸分子。
12.表達(dá)試劑盒，包括如下每一種獨(dú)立的部分(ⅰ)權(quán)利要求1所述的分離出的核酸分子和(ⅱ)編碼HLA-C克隆10的核酸分子。
13.表達(dá)試劑盒，包括如下每一種獨(dú)立的部分(ⅰ)權(quán)利要求2所述的分離出的核酸分子和(ⅱ)編碼HLA-C克隆10的核酸分子。
14.由權(quán)利要求1所述的核酸分子編碼的分離出的腫瘤排斥抗原前體。
15.對(duì)患有以表達(dá)BAGE腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的患者的治療方法，該前體被加工成由HLA-C克隆10分子提呈的腫瘤排斥抗原，包括向所說(shuō)的患者供給足夠量的溶細(xì)胞性T細(xì)胞以緩解所述的疾病，所述的溶細(xì)胞性T細(xì)胞對(duì)所述的BAGE源的腫瘤排斥抗原和HLA-C克隆的分子的復(fù)合物特異，并溶解提呈所述復(fù)合物的細(xì)胞。
16.治療患有以表達(dá)由一核酸分子編碼的和包含SEQ ID NO∶1核苷酸序列的腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的患者的方法，包括，向患者供給足夠量的溶細(xì)胞性T細(xì)胞，以緩解所述的疾病，該溶細(xì)胞性T細(xì)胞對(duì)HLA分子和源于所述腫瘤排斥抗原前體的腫瘤排斥抗原的復(fù)合物特異。
17.對(duì)患有以表達(dá)BAGE腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的患者的治療方法，所述的前體被加工成由HLA-C克隆10分子提呈的腫瘤排斥抗原，包括給所述患者使用足夠量的能引起對(duì)BAGE源的腫瘤排斥抗原和HLA-C克隆10分子的復(fù)合物的免疫應(yīng)答的制劑，以使所述的應(yīng)答抵抗提呈所述復(fù)合物的細(xì)胞。
18.對(duì)患有以表達(dá)由一核酸分子包括SEQ ID NO∶1核苷酸序列編碼的腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的患者的治療方法，包括給患者使用足夠量的能引起對(duì)HLA分子和腫瘤排斥抗原前體復(fù)合物的免疫應(yīng)答的制劑，使所述的免疫應(yīng)答抵抗提呈所述復(fù)合物的細(xì)胞。
19.以BAGE腫瘤排斥抗原前體的表達(dá)為特征的疾病的診斷方法，該前體被加工成與HLA-C克隆10分子形成復(fù)合物的BAGE源的腫瘤排斥抗原，包括將取自患者的樣品與對(duì)所述的復(fù)合物特異的制劑(agent)接觸，測(cè)定所述復(fù)合物和所述制劑的相互作用以診斷所述的疾病。
20.以表達(dá)由具有SEQ ID NO∶1序列所示的核酸分子編碼腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的診斷方法，包括將取自患者的樣品與對(duì)所述序列或其表達(dá)產(chǎn)物特異的抗原接觸，測(cè)定所述抗原與所述序列或所述表達(dá)產(chǎn)物之間的作用，以診斷所述的疾病。
21.由SEQ ID NO∶8，SEQ ID NO∶9，和SEQ ID NO∶10中選出的分離的肽。
22.引發(fā)溶細(xì)胞性T細(xì)胞應(yīng)答的方法，包括將HLA-C克隆10提呈細(xì)胞，在溶細(xì)胞性T細(xì)胞存在下，與權(quán)利要求21所述的分離出的肽接觸，以足夠量來(lái)引發(fā)對(duì)HLA-C-克隆10和SEQ ID NO∶10復(fù)合物特異的溶細(xì)胞性T細(xì)胞增殖。
23.對(duì)患者以表達(dá)BAGE腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的患者的治療方法，該前體被加工成由HLA-C克隆10分子提呈的SEQ ID NO∶10的氨基酸序列組成的腫瘤排斥抗原，包括給患者使用足夠量的對(duì)所述BAGE源的腫瘤排斥抗原和HLA-C克隆10分子復(fù)合物特異的溶細(xì)胞性T細(xì)胞以緩解所述的疾病，所述的溶細(xì)胞性T細(xì)胞溶解提呈所述復(fù)合物的細(xì)胞。
24.對(duì)患有的表達(dá)由一核酸分子和包含SEQ ID NO∶1的核苷酸序列編碼的腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病患者的治療方法，包括給患者使用足夠量的對(duì)HLA分子和由SEQ ID NO∶10氨基酸序列組成的腫瘤排斥抗原的復(fù)合物特異的溶細(xì)胞性T細(xì)胞，以緩解所述的疾病。
25.對(duì)患有以表達(dá)BAGE腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的患者的治療方法，該前體被加工成由HLA-C克隆10分子提呈的SEQ ID NO∶10的氨基酸序列組成的腫瘤排斥抗原，包括給患者使用足夠量的能引發(fā)對(duì)所述BAGE源的腫瘤排斥抗原和HLA-C克隆10分子復(fù)合物的免疫應(yīng)答的制劑，使所述的應(yīng)答抵抗提呈所述復(fù)合物的細(xì)胞。
26.對(duì)患有以表達(dá)由包含SEQ ID NO∶1核苷酸序列的核酸分子編碼的腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的治療方法，包括給患者使用足夠量的能引發(fā)對(duì)HLA-C克隆與由SEQ ID NO∶10的氨基酸序列組成的肽的復(fù)合物的免疫應(yīng)答的制劑，以使該應(yīng)答抵抗提呈該復(fù)合物的細(xì)胞。
27.以表達(dá)BAGE腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的診斷方法，該前體被加工成與HLA-C克隆10分子形成復(fù)合物的SEQ ID NO∶10氨基酸序列組成的BAGE源的腫瘤排斥抗原，包括，將取自患者的樣品與所述復(fù)合物特異的制劑接觸，測(cè)定所述復(fù)合物與所述藥物之間的相互作用以診斷所述的疾病。
28.以表達(dá)由具有SEQ ID NO∶1所示序列的核酸分子編碼的腫瘤排斥抗原前體為特征的疾病的診斷方法，包括將取自患者的樣品與來(lái)源于所述前體以及由SEQ ID NO∶10氨基酸序列組成的腫瘤排斥抗原特異的制劑接觸，測(cè)定所述制劑與所述序列或所述表達(dá)產(chǎn)物的相互作用，以診斷所述的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及一新族腫瘤排斥抗原前體，以及編碼它們的核酸分子。這些所述腫瘤排斥抗原前體被稱(chēng)作BAGE腫瘤排斥抗原前體，編碼它們的核酸分子被稱(chēng)作BAGE編碼分子。本發(fā)明描述了該編碼序列和該腫瘤排斥抗原前體分子的各種診斷和治療用途。
文檔編號(hào)C07K7/08GK1102213SQ9410722
公開(kāi)日1995年5月3日 申請(qǐng)日期1994年6月17日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月17日
發(fā)明者皮埃爾·范德布魯根, 蒂爾瑞·布恩·法勒爾, 皮埃爾·庫(kù)里, 瓊·克里斯多弗·雷納德 申請(qǐng)人:路德維格癌癥研究所