專利名稱：抗血栓劑及其制造方法
技術領域：
本發(fā)明涉及抗血栓劑、血栓形成抑制劑或血栓形成因素抑制劑。
更詳細地說，是通過新的或具有創(chuàng)造性的改良的制法得到具有優(yōu)良的抑制血栓形成因素作用和穩(wěn)定性，以藥理上可允許的綠茶葉提取物的粉末為有效成分的抗血栓劑、血栓形成抑制劑或血栓形成因素抑制劑。(以下，將抗血栓劑、血栓形成抑制劑及血栓形成因素抑制劑統(tǒng)稱為“抗血栓劑”。)綠茶，在以中國、日本等為中心的遠東地區(qū)作為日常的嗜好品是占據一定位置的飲料，據說對于健康也很有益處。
在綠茶的葉中含有綠茶丹寧類、咖啡因、抗壞血酸、維生素E類、黃酮醇類、多糖類及β-胡蘿卜素等成分。其中抗壞血酸及綠茶丹寧類等是主要構成成分。其中咖啡因及抗壞血酸在來自其他植物的茶中也含有，但以兒茶素類為代表的綠茶丹寧類只是綠茶中才能得到的固有成分，已知作為主成分有表兒茶素(epicatechin)、表兒茶素棓酸鹽(epicatechingallate)、表棓兒茶素(epigallocatechin)、表棓鹽兒茶素棓酸鹽(epigallicatechingallate)四種。另外還含有氟、鋅、鈣鹽的無機物等。
業(yè)已知道綠茶兒茶素類的主要功能是具有抑制脂質過氧化作用，此外認為對與各種疾病有關的活性氧作用的抑制、致癌物質變異原性的抑制、膽固醇再吸收抑制作用、抗菌抗病毒抑制作用、蟲牙的預防及消臭作用等的多種效果。特別是進入1990年代，多方面公開了這些成分中的表棓兒茶素棓酸鹽對于致癌物質的引發(fā)(initiation)過程及致癌促進劑(promotor)的抑制作用，并作了肯定的結論，所以從綠茶兒茶素開發(fā)抗癌制劑受到有力的重視。
本發(fā)明者，就綠茶成分藥理學的作用進行了長時間的研究，其結果驚奇地發(fā)現綠茶成分具有卓越的抗血栓效果，從而完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是在于提供含有以綠茶提取物為有效成分，并含有通常的賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑及其他藥學制劑中通常使用的輔助劑的抗血栓劑。
本發(fā)明的另一個目的在于提供含有以綠茶提取物為有效成分，并含有通常的賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑及其他藥學制劑中通常使用的輔助劑的抗血栓劑的制造方法。
綠茶兒茶素類的分離過程可以分為1)提取過程、2)除去過程及3)精制過程三個階段。按以往報告中的提取過程是利用熱水、冷水、戊醇或乙醇及其適當的混合物進行提取。從提取液除去有效成分以外的其他成分的過程，主要是用與水不混合的有機溶劑來達到最大的除去效果，主要使用極性大的氯仿、乙酸乙酯或二乙酯等。最終的精制過程主要是利用有機溶劑間互相不同的極性差異的分配提取法，目前使用了柱色譜法或高速液相色譜法進行精制。用分配提取法的精制過程，提取操作時需要很多時間，并且要大量使用氯仿、甲基異丁基酮等有機溶劑，所以在分離操作時，其經濟性及穩(wěn)定性上存在問題。用色譜進行精制的方法要使用通過交聯葡聚糖凝膠或聚合物樹脂的精制方法，溶劑的洗脫條件不是單一的、需要一定的洗脫時間及很多的人力，在這些方面應加以改善。另一方面，用高速液相色譜法雖然可以迅速高效率地進行純度極好的精制，但是也存在著購買測定裝置及洗脫溶劑的價格昂貴以及分離柱的老化等問題。
本發(fā)明者為了解決這些問題進行了廣泛的研究，用離心分離法能一次完全除去熱水提取液中的殘余物。使用柱色譜用交聯葡聚糖凝膠(Sephadex)LH-20，純化分離溶劑，通過用15%-丙酮或二烷混合溶液一次洗凈，不僅可除去水溶性的咖啡因、游離氨基酸類及糖類，而且還可以完全洗掉萜類化合物類及著色成分。所以，不需要像已知方法那樣有一個另外的去咖啡因操作，可以防止使用氯仿、甲基異丁基酮等有機溶劑，在最終產品中混入有機溶劑或來自有機溶劑的污染物質。其結果只是紅黃色部分存在于柱的頂端，這用肉眼能容易地觀察出來。另一方面，對于殘留的紅黃色部分用60%水-丙酮或二烷混合溶劑能一次溶解離析出來，因此可以最大的收率得到活性成分，所以用本發(fā)明的方法可以完全克服公知方法存在的缺點。以這種發(fā)現為基礎反復進行廣泛研究的結果，完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明中，初階段用熱水提取綠茶后，在提取液濃縮過程考慮到有效成分的抗氧化效果，必須加入1/4左右提取液的正丁醇，提取液在濃縮時，正丁醇暴露在上部空氣中，為了不產生氧化變化要在經常保持正丁醇的體積下進行濃縮。另一方面要用冷凍干燥方式進行最終提取出的有效成分的濃縮操作。這樣不僅可以完全除去水分，而且濃縮液的組成和冷凍干燥后有效成分的組成比幾乎沒有變化。
干燥了的有效成分粉末是黃褐色，易溶于水，即使保管6個月以上也沒有吸收性，是很穩(wěn)定的。因此，干燥了的粉末易于制成藥學制劑。
反復實施上述方法的結果，各批(batch)中含有活性成分的制品的各組成成分幾乎是一致的。
調查此活性成分組成的結果，確認了含有30%的聚戊醇(ポリペノ )類、60%的表棓兒茶素棓酸鹽和表兒茶素的混合物、6%以下的表棓兒茶素。
本發(fā)明中的綠茶提取物的一般提取方法通過下述各方法進行說明。
提取方法將作為原料物質的干燥綠茶葉直接地或者將烘干茶葉，用70-90℃的熱水提取10分鐘以上。最好一邊攪拌生成的混合物，一邊在不沸騰的狀態(tài)下完成提取。用加壓過濾、吸濾或離心分離過濾等公知方法過濾出提取液中的不溶性物質，并收集過濾液。
用于提取的熱水相當綠茶重量的5-100倍，優(yōu)選的是10-30倍。熱水提取溶劑中也可以混合5-50%左右的醇性溶劑后使用。提取時間依提取溫度而不同。一般30秒至1小時，優(yōu)選的是5-20分鐘。
減壓下的濃縮方法使用熱水作為提取溶劑時，在得到的熱水提取物中要加入10-50%(V/V)，最好為20%左右的正丁醇，直至在減壓下濃縮操作完全終止之前都要保持此比例，這樣做一方面防止提取物沸騰，另一方面由于存在于熱水提取物的上層，可防止提取物內的有效成分直接與空氣接觸，從而防止成分組成的變化。
在約50-70℃下邊加熱，邊在減壓下如10-70mmHg下進行濃縮，制造出粘性提取物[水含量約10-30%(w/w)]。
減壓下濃縮所需要的時間依減壓的程度有所不同，但約為30分鐘-2小時。在減壓下的濃縮方法中，為了防止提取物中的成分損失或受到破壞，溫度不要升到90℃以上。
冷凍干燥方法用減壓下濃縮方法，在不加熱的常溫下濃縮從柱中得到的精制液后，急速地使之冷凍并保存。冷凍干燥方法是利用-100℃以下的致冷劑形成極低溫狀態(tài)，將試樣置于真空狀態(tài)中，這樣可以完全除去具有升華性的物質和殘留的水分。干燥時間取決于試樣的量、表面的致冷劑溫度及真空泵的容量，但一般在約12-24小時以內可以得到完全干燥品。
在用上述工序得到的干燥粉末中或綠茶中所含有的有效成分之一如下述通式， 式中的表棓兒茶素酸鹽(EGCG)是以在提取物中含有量約50-70%(w/w)的比例殘留在本發(fā)明的生成物中。
由于用這樣方法得到的干燥粉末無吸濕性，而且是比容積小的粉末，所以適合于用公知方法來制造像粉末、微細顆粒、顆粒或片劑那樣的藥學制劑。
另外，這樣得到的干燥粉末毒性小，可以經口給藥。干燥了的粉末可以通過與藥學上允許的賦形劑(例如，谷物粉末、乳糖、碳酸鈣、磷酸鈣等)、結合劑(如，谷物粉末、阿拉伯膠、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、結晶纖維素等)、潤滑劑(如，硬脂酸鎂、滑石等)及崩解劑(羧甲基纖維素、鈣、滑石、合成鋁、硅酸鹽等)、稀釋劑(水、植物類等)的混合制造出膠囊、粉末、顆粒、微細顆?；蚱瑒?、軟膠囊及液劑等藥學的制劑。
在下述實施例中進一步詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些限制。
實施例1將綠茶葉的干燥物、烘干綠茶或者市售綠茶200g用4000ml的70-90℃熱水提取20分鐘。得到的提取液進行一次過濾除去不溶物后，再以2000rpm將濾液離心分離10分鐘，除去沉淀下的殘渣。收集上層濾液(約3500ml)，用真空旋轉蒸發(fā)器，在70℃下減壓濃縮到約400ml。用400ml氯仿提取，完全除去非極性化合物。上述的提取進行三次以上。接著，用400ml乙酸乙酯三次反復提取水層后，將得到的約1200ml有機溶劑層，用真空旋轉蒸發(fā)器在50℃下濃縮至50ml。濃縮液中加入丙酮或二烷200ml后，再次濃縮到20ml。20ml濃縮液加到交聯葡聚糖凝膠LH-20柱的上部(內徑35mm，長度550mm，交聯葡聚糖凝膠重量200g)。首先用水-丙酮或水-二烷(84∶15，體積比)的溶液3000ml充分洗滌后，當判斷出在柱內完全洗脫出綠黃色及褐色層后，用水-丙酮或水-二烷(40∶60體積比)溶液開始洗脫當吸附在柱上層部分的黃褐色乃至黃色帶(band)開始在柱的頂端洗脫時，接受此時的餾分。而后用真空蒸發(fā)干燥器在70℃下濃縮到50ml。濃縮液在-20℃以下保存1日后，在冷凍干燥器中每次少量地使之完全干固，得到8.6g干燥粉末(EGCG殘留比∶70%)。
干燥粉末中的EGCG的殘留比可用以下方程式計算。
EGCG的殘留比(%)＝相當EGCG峰面積/全體峰面積×100。
精確地稱取用上述方法得到的干燥粉末5.0mg，并溶解在5.0ml甲醇中，將其中的5μl加在高速液相色譜上測定EGCG的含量。
高速液相色譜的測定條件測定儀器高速液相色譜儀(P-6300，日本日立工業(yè)社)洗脫條件乙腈-乙酸乙酯-0.05%磷酸(12∶2∶86，V/V)混合溶劑分離柱Cosmosil5C18(4.6mmi.d.x15mmL)(日本NakalaiTesque社)柱溫度40℃測定波長280nm在這樣的條件下，EGCG的殘留時間是6.9分鐘。
上述試驗的結果表明，EGCG的殘留比是70%。
實施例2-6中得到的干燥粉末的EGCG的殘留比也用與上述同樣方法測定。
實施例2將綠茶葉干燥物、烘干綠茶或市售的綠1.5Kg用20.0升的70℃的水-乙醇(90∶10，體積比)混合液提取20分鐘。得到的提取液用濾紙進行一次過濾除去不溶物。收集濾液(約19.0升)，用真空旋轉蒸發(fā)器，在70℃下減壓濃縮，得到粘性提取物。將粘性提取物再次溶解至2升溫水中后，每500ml用500ml的氯仿-正已烷混合溶劑(80∶20，體積比)提取，完全除去非極性化合物等。上述的提取除去操作進行三次以上。接著用500ml的乙酸乙酯反復三次提取水層，用真空旋轉蒸發(fā)器，在50℃下將得到的約1500ml有機層完全干燥。干燥物中加入500ml丙酮中，再次濃縮到50ml。將50ml濃縮液加入到交聯葡聚糖凝膠LH-20柱的上部(內徑20mm×長500mm，交聯葡聚糖凝膠純重400g)。首先用4.0升水除去水溶性物質后，用水-丙酮(70∶30，體積比)的溶液3.0升充分洗滌，判斷出柱內的綠黃色及褐色層完全被洗脫出后，開始用水-丙酮(40∶60，體積比)溶液洗脫，當吸附在柱上層部的黃褐色乃至黃色帶開始在柱的頂端洗脫時，接受此時的餾分，并將該餾分用真空蒸發(fā)干燥器在70℃下濃縮到100ml。濃縮液在-20℃以下保存1日后，保存1日后，每次少量地在冷凍干燥器中完全干燥，得到43.8g的干燥粉末(EGCG殘留比54%)。
實施例3將綠茶葉干燥物、烘干綠茶或市售的綠茶200g用4000ml70-90℃的熱水提取20分鐘。得到的提取液進行一次過濾除去不溶物后，再次以2000rpm離心分離濾液10分鐘，除去沉淀下來的殘渣。收集上層濾液(約3500ml)，用真空旋轉蒸發(fā)器，在70℃下減壓濃縮至約400ml。接著，水層用400ml乙酸乙酯反復提取三次，將得到的有機溶劑層約1200ml，用真空旋轉蒸發(fā)器，在50℃下濃縮到50ml。濃縮液中加入200ml異丙醇，再次濃縮至20ml。將20ml濃縮液加入到交聯葡聚糖凝膠LH-20柱的上部(內徑35mm×長550mm，交聯葡聚糖凝膠凈重量200g)。首先用水-丙酮(85∶15，體積比)的溶液3000ml充分洗滌，當判斷出柱內的綠黃色及褐色層完全洗脫出后，開始用水-丙酮(55∶45，體積比)溶液5.0升洗脫，當吸附在柱上層部的黃褐色乃至黃色帶開始在柱的頂部洗脫時，接受此時的餾分，將該餾分用真空蒸發(fā)干燥器，在70℃下濃縮到50ml。用2.0升丙酮將殘留在LH-20柱內的非極性物質洗脫出后，交聯葡聚糖凝膠LH-20柱還可再使用。濃縮液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷凍干燥器內使其完全干固后，可得到14.7g干燥粉末(EGCG殘留比62%)。
實施例4將綠茶葉干燥物、烘干綠茶或市售綠茶100g用1升的70-90℃的熱水提取10分鐘。得到的提取液進行一次過濾降去不溶物后，再次以2000rpm離心分離濾液10分鐘，除去沉淀的殘渣。收集上層濾液(約0.8升)，用真空旋轉蒸發(fā)器，在70℃下減壓濃縮到約100ml。接著，用100ml乙酸乙酯反復3次提取水層后，將得到的有機溶劑層約280ml用真空蒸發(fā)器，在50℃下濃縮至粘稠狀態(tài)。向濃縮液中加入150ml甲醇，再次濃縮至15ml。將15ml濃縮液加入的交聯葡聚糖凝膠LH-20柱的上部(內徑35mm×長550mm，交聯葡聚糖凝膠凈重200g)。首先用水-甲醇(85∶15，體積比)的溶液4.0升充分洗滌，判斷出柱內的綠黃色及褐色層完全洗脫出后，開始用水-甲醇(30∶70，體積比)溶液洗脫，當吸附在柱上部的黃褐色乃至黃色帶開始在柱的頂部洗脫時，接受此餾分，用真空蒸發(fā)干燥器，在70℃下濃縮到30ml。濃縮液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷凍干燥器中使之完全凍結干固，得到5.5g干燥粉末(EGCG殘留比58%)。
實施例5將綠茶葉干燥物、烘干綠茶或市售的綠茶200g用4000ml70-90℃的熱水提取20分鐘。得到的提取液進行一次過濾除去不溶物后，再次以2000rpm離心分離濾液10分鐘，除去沉淀下來的殘渣。收集上層濾液(約3500ml)用真空旋轉干燥器在70℃下減壓濃縮到約400ml。接著，用400ml乙酸乙酯反復三次提取水層，將得到的有機溶劑層約1200ml用真空旋轉蒸發(fā)器在50℃下濃縮到50ml。向濃縮液中加入200ml異丙醇，再次濃縮到20ml。將濃縮液20ml注入到交聯葡聚糖凝膠LH-20柱的上部(內徑35mm×長550mm，交聯葡聚糖凝膠凈重200g)。首先用水-異丙醇(90∶10，體積比)的溶液2.5升充分洗滌，判斷出柱內的綠黃色及褐色層完全被洗脫出后，開始用水-異丙醇(50∶50，體積比)溶液洗脫，當吸附在柱上層部的黃褐色乃至黃色帶開始在柱的頂端洗脫時，接受此時的餾分，用真空蒸發(fā)干燥器，在70℃下濃縮到40ml。濃縮液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷凍干燥器使之完全干固，得到10.2g的干燥粉末(EGCG殘留比70%)。
實施例6將綠茶葉干燥物、烘干綠茶或市售的綠茶200g用4.0ml40-65℃的水-甲醇(50∶50，體積比)提取60分鐘。得到的提取液進行一次過濾除去不溶物后，再次以2000rpm離心分離濾液10分鐘，除去沉淀下的殘渣。收集上層濾液(約3.0升)用真空旋轉干燥器在70℃下充分減壓受縮。在邊加溫下將濃縮干燥物溶解在水-甲醇(80∶20，體積比)的混合溶液500ml中，用乙酸乙酯400ml反復提取3次，將得到的有機溶劑層約1200ml用真空旋轉蒸發(fā)器，在50℃下濃縮到50ml。向濃縮液中加入200ml二烷，再次濃縮到20ml。將濃縮液20ml注入到交聯葡聚糖凝膠LH-20柱(內徑35mm×長550mm，交聯葡聚糖凝膠凈重200g)的上部。首先用水-二烷(85∶15，體積比)的溶液3000ml充分洗滌，判斷出柱內的綠黃色及褐色層完全被洗脫出后，開始用水-二噁烷(40∶60，體積比)溶液洗脫，當吸附在柱上部的黃褐色乃至黃色帶開始在柱的頂端開始洗脫時，接受此時的餾分，并用真空蒸發(fā)干燥器，在70℃下濃縮到50ml。濃縮液在-20℃以下保存1日后，每次少量地在冷凍干燥器使之完全干固，得到7.8g的干燥粉末(EGCG殘留比)。
以這種成分測定血小板凝集抑制能的活性。血液的凝固現象大致區(qū)分為作為血中有效成分的血小板起作用的一次止血和除去有形成分的所謂與血漿成分相關的二次止血。其中對于抑制血栓形成及為了防止血液凝固來說，一次止血的阻斷劑的開發(fā)，可以說具有根本治療制劑的價值。
在本發(fā)明說明書中，所謂烘干綠茶是指綠茶葉干燥物切細后，在制造綠茶前的半加工品。
對一次止血的效果1.抑制血小板凝集試驗使用凝集記錄計IIPa-3220(京都第一化學株式會社)按照Born的濁度計測定方法(Turbidimetric method)測定抗血小板凝集效果。檢查原理是制作血小板富集現象(platelets rich plasma;PRP)，使血小板數達到200，000-400，000/mm3左右，而后向其中加入促凝物質(ADP，腎上腺素(Epinephrine)、膠原(collagen)、瑞斯托菌素(Ristocetin)，使之邊凝集，邊記錄由于凝集而引起的吸光度(OD)變化。檢查方法是從血小板機能正常的健康人體中，用抗凝固劑在3.8%檸檬酸鈉(Sod.citrate)的管中以1∶9的比例采血。為了得到PRP用160G(1000rpm)離心分離10分鐘后，調節(jié)此時的血小板數為200，000-400，000/mm3。為了得到血小板欠缺現象(plateletspoorplasma;PPP)，用2000G(3400rpm)進一步離心分離10分鐘。使用凝集記錄計IIPA-3220進行試驗。溫度為37℃、轉速固定在1000rpm，用血小板欠缺血漿補償。將血小板欠缺血漿和試料移到測定設備上后，預先放置3-5分鐘左右。而且加入血小板促凝物質后，測定10分鐘后的凝聚程度。血小板促凝物質使用ADP、腎上腺素、膠原、瑞斯托菌素。
實驗結果，綠茶提取物以1mg/ml量時顯示了強烈地抑制由促凝進物質而引起的血小板凝集。對于ADP顯示60%的抑制效果，對腎上腺素顯示96.5%的抑制效果，對膠原顯示35.3%的抑制效果，對瑞斯托菌素顯示36.5%的抑制效果。相反，作為對照藥物的阿斯匹林(Aspirin)(0.1mM)，對ADP顯示13.5%的抑制效果，對腎上腺素顯示79.5%抑制效果，對膠原顯示72.6%的抑制效果，而對于瑞斯托菌素完全未看出有抑制效果。


圖1表示給與凝集促進劑ADP和本發(fā)明的抗血栓劑時的抑制凝集效果圖。
圖2表示給與凝集促進劑腎上腺素和本發(fā)明的抗血栓劑時的抑制凝集效果圖。
圖3表示給與凝集促進劑膠原和本發(fā)明的抗血栓劑時的抑制凝聚效果圖。
圖4表示給與凝集促進劑瑞斯托菌素和本發(fā)明的抗血栓劑時的抑制凝集效果圖。
從本實驗結果可以明顯地看出本發(fā)明的抗血栓劑具有卓越的抑制血小板凝集效果。
2.抗血栓作用的測定實驗的血栓誘發(fā)是按吉米諾(Dimino)的實驗方法實施血。此時使用的大鼠是體重20-30g左右的雄性ICR大鼠，血栓的誘發(fā)是通過將血小板凝集促進物(腎上腺素、膠原)注射到大鼠的尾靜脈中，使之急速地分布于微小血管內而完成的。所使用的凝集促進物是將15μg的膠原和400μM濃度的腎上腺素調制在100μl生理鹽水中，每20g大鼠的體重以100μl的容量注射到尾靜脈中。為了測定綠茶提取物的抗血栓效果，在實驗開始2小時前按大鼠的體重每Kg各投與100mg和10mg的試料，此時投藥的全體容量是0.4ml以下。綠茶提取物的抗血栓效果可用從由于給與血小板凝集促進物質而沒有發(fā)生大鼠后肢麻痹和死亡的被保護的實驗動物數的百分數進行計算，這里麻痹的標準是指15分鐘以上后肢喪失機能或者有持續(xù)的振顫狀態(tài)。
在確認腎上腺素和膠原的合適血栓誘發(fā)體積試驗中，把15μg的膠原和400μM的腎上腺素溶解在100μl的生理食鹽水中后，進行靜脈內注射，結果可以誘發(fā)95%的血栓。血栓生成與否是以投與血小板凝集促進物后，是否致死和后肢麻痹持續(xù)15分鐘以上的情況來判定，后肢麻痹是以拖著后肢爬行或者伴有振顫現象的狀態(tài)作為判斷基準。每Kg體重向腹腔內投入100mg綠茶提取物時，可看到66%的預防效果，腹腔內投入10mg時，可以看到44%的預防效果。另一方面，對于作為對照藥物的阿斯匹林(100mg/Kg)則看到45%的預防效果。
圖5表示投與凝集促進劑腎上腺素及膠原和本發(fā)明的抗血栓劑時的血栓抑制效果圖。
按照本試驗，可從確認本發(fā)明的抗血栓劑具有卓越的抗血栓效果，此效果表明以阿斯匹林的約1/10容量就具有與阿斯匹林同等的效果。
3.血液凝固試驗(1)出血時間(BleedingTime)的測定。
對于體重180-200g的雄性Sprague-Dawley白鼠，每日一次連續(xù)10日投與試料。向白鼠腹腔內注入戊巴比妥鈉(Sodiumpentobarbital∶400mg/Kg)進行麻醉，從距尾部頂端5mm處切掉尾尖，而后將尾巴浸入到37.5℃的鹽水(Saline)溶液中直至距尾根部5cm處，測定止血時間。
試驗結果，對照群的出血時間是65.0±12.9秒，而試料投與群，當10mg/Kg時是113.2±19.6秒，當100mg/Kg時是250.7±117.3秒，當300mg/Kg時是509.8±71.6秒，從此可看出出血時間是依試料容量的增加而延長。相反作為對照藥物的阿斯匹林(100mg/Kg)是165.1±34.3，比對照藥物顯示了優(yōu)良的作用。其結果表示在圖6中。圖6表示投與本發(fā)明的抗血栓劑和作為對照藥物的阿斯匹林時的出血時間圖。
(2)全血凝固時間(wholebloodclottingtime)的測定測定出血時間，將經過1日后的白鼠用乙醚麻醉，再用預先裝有3.13%檸檬酸鈉溶液0.5ml的塑料注射器從心臟采集血液5ml。慢慢地混合采集的血液后，集中在注射器中，將1ml血液加入到玻璃試管內，再加入1.7%CaCl2·2H2O200μl，在室溫下緩慢振蕩，并測定血凝塊產生的時間。
試驗結果，對照群的全血凝固時間是109.4±14.0秒，而試料投與群，當10mg/Kg時是130.1±20.5秒、當100mg/Kg時是140.9±14.2秒，當300mg/Kg時是150.6±17.6秒，可看出隨容量增加而有若干增加。相反對于作為對照藥物的阿斯匹林(100mg/Kg)，其全血凝固時間是137.2±19.4秒。其結果示于圖7中。圖7是投與本發(fā)明的藥物和阿斯匹林時的全血凝固時間的比較圖。
(3)血漿凝固時間(plasmaclottingtime)的測定將以上得到血液的一部分以25000rpm離心分離后，得到血漿，將血漿100μl、鹽水100μl及50nMCaCl250μl加到玻璃試管中，在37℃下邊緩慢振蕩，邊測定至產生塊(clot)的時間。
試驗的結果，對照群的血漿凝固時間是146.2±26.5秒，而對于試料投與群，當10mg/Kg時是177.5±37.6秒，當100mg/Kg時是219.8±57.9秒，當300mg/Kg時是233.1±83.2秒，可看出依投入容量而增加。相反，作為對照物的阿斯匹林(100mg/Kg)表現出的時間是222.5±40.2秒。其結果示于圖8中。圖8表示投與本發(fā)明的藥物和阿斯匹林時的血漿凝固時間。
4.對血小板內的脂質過氧化及酶的抑制作用a)抑制丙二醛[malondialdehyde(MDA)]生成效果的測定將血小板浮游液1ml在37℃加到綠茶提取物的等滲透溶液中(最終濃度1mg/ml)，再加入Ca++及膠原。加入TBA試劑2ml，在90℃下加溫20分鐘后，在室溫下冷卻，以3000rpm離心分離10分鐘。以535nm測定沉淀的血小板上部的紅色溶液的吸光度，以1.56×105計算MDA-TRA包合體的摩爾吸光系數，通過MDA的生成量比較對于綠茶提取物的脂質過氧化抑制活性。
MDA生成量在與脂質過氧化過程中的第二次生成物的反應中，可以作為總脂質過氧化標準使用。綠茶提取物與抑制磷脂酶A2抑制劑的伯氨喹(primaquine)、阿的平(quinacrine)、氧酶(oxygenase)性的阿斯匹林(Aspirin)比較，對于脂質過氧化的抑制效果顯示出同等程度的水平(level)。
b)測定花生四烯酸放出活性在37℃下，邊培養(yǎng)(incubate)血小板浮游液1ml，邊加入綠茶提取物(最終濃度1mg/ml)，再加入Ca++和膠原。30分鐘后用薄膜過濾器迅速地除去血小板，使濾液呈pH3以下的酸性。用2ml的提取溶劑(氯仿∶甲醇＝1∶1，v/v)提取二次后，進行離心分離，將下部的氯仿層移到其他試管中后，用氮氣干燥。將此干燥物溶解在50μl的二甲基甲酰胺(DMF)中，加入12nM單丹酰尸胺(monodancylcadaverine)的DMF溶液50μl及二乙基磷氰化物(diethilphosphorocyanidate)2μl，在常溫下放置15分鐘后，用螢光標識花生四烯酸。
用螢光標識了的花生四烯酸用逆相色譜柱，按50%甲醇∶乙腈的線性梯度溶離進行洗脫，以激發(fā)波長340nM、螢光波長520nM檢測。
觀察花生四烯酸量的變化結果，從依賴于綠茶提取物的花生四烯酸的變化少于伯胺喹及阿的平的變化可以推斷出綠茶提取物在血小板內的作用部位與其說抑制磷脂酶A2倒不如說是通過抑制環(huán)氧合酶(cylooxygenase)或脂氧合酶(lipoxygenase)來達到脂質過氧化及血小板凝集的抑制效果。
6.高脂血癥的治療效果-抗過氧化作用(invitro)向小鼠(Rat)的肝微粒體(microsome)成分(1.5mgprotein/ml)中加入提取物，加入半膀氨酸(cystein)(最終濃度500μM、硫酸亞鐵(最終濃度5μM)，在37℃培養(yǎng)(incubation)30分鐘。加入10%的三氯乙酸3ml，離心分離后取上層液2ml。向其中加入0.67%TBA溶液，在沸水中反應15分鐘后，冷卻，測定吸光度。
7.對生物體機能性的研究-抗高血壓效果(invitro)。
對血管緊漲素變化酶(Angiotensinconvertingenzyme;ACE)的抑制效果。
血管緊張素變化酶(ACE)是作用在擔當生物體內血壓及體液、電解質重要調節(jié)作用的腎素-血管緊張素(reninangiotensin)系統(tǒng)上的酶。該酶(ACE)可以在從腎素(renin)產生出的血管緊張素變化酶Ⅰ(ANGⅠ)的C末端游離出二肽(dipeptide)(His-Leu)，并轉化成具有活性形式的血管緊張素變化酶Ⅱ(ANGⅡ)。此酶在生產出增高血壓系(hypertensivesystem)的ANGⅡ的同時，還使得降壓系(hypotensivesystem)的舒緩激肽(bradykinnin)惰性化，所以對調節(jié)生物體循環(huán)起著重要作用。
因此，根據綠茶提取物對于此酶的抑制效果的研究，可認為可以起到血壓上升抑制劑作用。
阿斯匹林是抗血壓凝固作用極為卓越的藥物?？墒前⑺蛊チ謱τ谖改c有很大的傷害，所以連續(xù)地服用是不可能的。相反，業(yè)已證實本發(fā)明的抗血栓劑不僅對胃腸沒有傷害，而且在效果上是具有與阿斯匹林同等以上的卓越效果的藥物。
像由以上試驗確認的那樣，本發(fā)明的綠茶提取物具有極其卓越的抗血栓效果。
因而，本發(fā)明的綠茶提取物可以作為抗血栓劑、血栓形成抑制劑或血栓形成因素抑制劑使用。
實驗例1急性毒性實驗從1CR系大鼠的靜脈及口分別投入綠茶提取物的生理鹽水溶液，通過72小時后的生死判斷計算出LD50。計算時使用up and down方法(1969年日本南山堂發(fā)行、高木、小澤共編“藥物學實驗”第204-205頁)。其結果如下投與物質投與方法動物數 LD50mg/Kg綠茶提取物靜脈內投與10500經口投與101000像由以上實驗確認的那樣，本發(fā)明的抗血栓劑的急性毒性是極其小的。
本發(fā)明的綠茶提取物依患者或應給藥人的年齡、性別或癥狀或預防的目的來給藥，按每Kg體重1日1次乃至數次服用1.00-2000.00mg。
本發(fā)明的綠茶提取物可與通常的賦形劑、結合劑、潤滑劑、崩解劑、稀釋劑等輔助劑混合，制成藥學制劑。
例舉出以下制劑實施例制劑實施例1片劑的制造綠茶提取物10mg乳糖20mg淀粉20mg硬脂酸鎂適量將上述成分按通常的片劑制法，壓成50mg的片劑而制造出片劑。
制劑實施例2膠囊劑的制造綠茶提取物10mg乳糖20mg淀粉19mg滑石1mg硬脂酸鎂適量將上述成分按通常的膠囊劑的制法，充填到50mg容量的膠囊中。
制劑實施例3液劑的制造綠茶提取物100mg異性化糖10g蜂蜜500mg尼古酰胺(藥典)20mg無水咖啡因(藥典)30mg苯甲酸鈉70mg將上述成分按通常的液劑制造方法制造，充填到100ml容量的褐色瓶中，用塞蓋好后進行低溫殺菌處理。
制劑實施例4注射劑的制造綠茶提取物5mg減菌蒸餾水適量將上述成分按通常注射劑制法制造，充填到2ml的安瓿中，密封后殺菌。
制劑實施例6軟質膠囊劑的制造1)充填組成物綠茶提取物10mg聚乙二醇230mg丙三醇13mg2)干燥外皮組成物(重量%)明膠52%丙三醇32%ANIDRISORB35/7012%水5%將上述組成物按通常的軟質膠囊制法，制造軟質膠囊。
制劑實施例7顆粒劑的制造綠茶提取物10mg
乳糖25mg將上述成分用通常的擠壓組合機進行擠出，制造成顆粒劑。
本發(fā)明的抗血栓綠茶提取物也可以作為與具有其他藥效的藥理物質混合的組合物使用。這樣的組合物當然也屬于本發(fā)明的范圍。
4.圖的簡單說明圖1至圖4是一邊用凝集促進物ADP、腎上腺素、膠原以及瑞斯托菌素進行凝集，一邊加入本發(fā)明的抗血栓劑，從而比較抗血栓效果的圖。
圖5是合并投與腎上腺素和膠原，測定投入本發(fā)明抗血栓劑的抗血栓效果圖。
圖6是表示投與本發(fā)明的抗血栓劑和作為對照物的阿斯匹林時的出血時間的圖。
圖7是比較投入本發(fā)明抗血栓劑和阿斯匹林時的栓血凝固時間圖。
圖8是表示投入本發(fā)明的抗血栓劑和阿斯匹林時的血漿凝固時間圖。
權利要求
1.一種抗血栓劑，其中含有以綠茶提取物作為有效成分，與通常藥劑學上使用的輔助劑一起用通常方法制成通常的劑形。
2.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是散劑。
3.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是片劑。
4.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是膠囊劑。
5.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是液劑。
6.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是軟膠囊劑。
7.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是注射劑。
8.權利要求1的抗栓劑，其中通常的制劑是顆粒劑。
9.一種抗血栓劑的制造方法，其中是以綠茶提取物為有效成分，與通常藥劑學上使用的輔助劑一起用通常方法制成通常的劑形。
10.綠茶提取物的制造方法，其中是用水或水和低級醇的混合物熱水提取綠茶葉干燥物、烘干綠茶或市售的綠茶，除去不溶物質的溶液濃縮后，再次溶解在水中，用有機溶劑提取，除去非極性化合物后，濃縮水層，用色譜柱濃縮分離出的液體而得到綠茶提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗血栓劑、血栓形成抑制劑或血栓形成因素抑制劑。更詳細地說是涉及通過新穎的又有創(chuàng)造性的改良方法，制造出具有優(yōu)良的阻斷血栓形成因素作用和穩(wěn)定性的，以藥理上可允許的綠茶提取物的粉末為有效成分的抗血栓劑、血栓形成抑制劑或血栓形成因素抑制劑。本發(fā)明提供了含有以綠茶的提取物為有效成分并含有通常的賦形劑、稀釋劑、抗氧化劑、以及其他藥學的制劑的制造中通常使用的輔助劑的抗血栓劑及其制造方法。
文檔編號C07D311/62GK1107355SQ9411529
公開日1995年8月30日 申請日期1994年9月13日 優(yōu)先權日1993年9月13日
發(fā)明者尹汝杓, 文東轍, 李镕文, 李世昌, 樸鐘凡 申請人:許桂成