專利名稱：大環(huán)雙官能螯合劑及其配合物和抗體共軛物的制備方法
已知官能化的螯合劑，或雙官能配位體能夠共價連接到對癌或腫瘤細胞的抗原決定基或抗原具有特性的抗體上。這種抗體/螯合劑共軛物的放射性核素配合物，可用于診斷和/或治療，作為運送放射性核素到癌或腫瘤細胞的一個方法。請參見，例如，Moares等人，Anal.Biochem.142，68-78，(1984);和Krejcarek等人，Biochem.和Biophys.Res.Comm.77，581～585(1977)。
氨基羧酸螯合劑已被認識和研究多年了。典型的氨基羧酸是次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、反式-1，2-二氨基環(huán)己烷四乙酸(CDTA)和1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸(DOTA)。許多以氨基羧酸為基礎的雙官能螯合劑已被提出和制備。例如DTPA的環(huán)二酐〔Hnatowich等人，Science220，613-615，(1983);美國專利4，479，930〕和DTPA的混合的羧基碳酸酐〔Gansow，美國專利4，454，106和4，472，509;Krejcarek等人，Biochem.和Biophys.Res.Comm.77，581-585，(1977)〕已被報導過。當這些酐與蛋白質偶聯(lián)時，偶聯(lián)是通過酰胺鍵的形成進行的，這樣在二亞乙基三胺(DETA)的主鏈上原來五個羧基甲基基團留下了四個〔Hnatowich等人，Int.J.Appl.Isot.33，327-332，(1982)〕。此外，美國專利4，432，907和4，352，751公開了雙官能螯合劑用于將金屬離子連接到“有機類如有機靶分子或抗體上”。如上所述，偶聯(lián)通過利用二氨基四乙酸二酐經(jīng)過一個酰胺基而獲得。酸酐的實例包括EDTA、CDTA、丙二胺四乙酸和苯-1，2-二胺四乙酸的二酸酐。一份最近的美國專利4，647，447公開了幾種由配位酸的陰離子形成的配合物鹽，可用于各種診斷技術。通過一個配位酸的羧酸基進行共軛作用已有過論述，該作用通過酰胺鍵生成鍵合。
在J.of Radioanalytical Chemistry 57(12)，553-564(1980)中，Paik等人公開了P-硝基芐基溴在與封閉的二亞乙基三胺，即雙-(2-苯二(甲)酰亞氨基乙基)胺的反應中的使用，該反應隨后是解封閉步驟，并用氯代乙酸進行羧基甲基化作用，生成N′-P-硝基芐基二亞乙基三胺N，N，N″，N″-四乙酸。另一方面，由于連接是通過氮原子進行的，所以會得到四乙酸的衍生物。還討論了雙官能螯合劑的共軛作用和與銦的螯合。Eckelman等人，在J.of pharm.Sci.64(4)，704-706(1975)中講述了氮原子上的取代作用，在羧基甲基化作用前，使胺，如1，2-乙二胺或二亞乙基三胺，與適當?shù)耐榛寤镞M行反應。這些化合物被提出來作為可能的放射藥學上的成像劑。
另一類以氨基羧酸官能度為基礎的雙官能螯合劑，在文獻中也有很清楚的記載。例如，Sundberg，Meares等人在J.of Med.Chem.17(12)，1304(1974)中，公開了EDTA的雙官能類似物。這些化合物的代表是1-(P-氨基苯基)-1，2-乙二胺四乙酸和1-(P-苯-重氮化)-1，2-乙二胺四乙酸。討論了通過對位取代基向蛋白質的偶聯(lián)和放射性金屬離子向螯合基團上的結合。在Biochemical and Biophysical Research Communications 75(1)，149(1977)和美國專利3，994，966和4，043，998中也公開了這些化合物。有一點很重要值得注意，即向EDTA結構上連接芳香基團是通過1，2-乙二胺主鏈上的一個碳原子。在美國專利4，622，420中公開了基于EDTA、HEDTA和DTPA的旋光活性的雙官能螯合劑。在這些化合物中，亞烷基團將芳族基團(其上含有為連接到蛋白質上所需要的官能度)連接到多胺的碳原子上，多胺中含有螯合官能度。這類化合物的其它參考文獻包括Brechbiel等人，Inorg.Chem.25，2772-2781(1986)，美國專利4，647，447和國際專利公開號WO86/06384。
更為最近的，某些大環(huán)雙官能螯合劑和它們的銅螯合共軛物在診斷或治療上的應用，已在美國專利4，678，667中，并被Moi等人，Inorg.Chem.26，3458-3463(1987)公開。氨基羧酸官能度向雙官能螯合分子的其余部分的連結，是通過環(huán)多胺主鏈的一個環(huán)碳進行的。例如，一個連接基團，其一端與環(huán)多胺的一個環(huán)碳相連著，其另一端也可連接一個能夠與蛋白質進行反應的官能基團。
同時值得注意的另一類雙官能螯合劑，包括這些化合物，其中這個分子的螯合部分，即氨基羧酸，是通過一個氮原子連接到一分子的其中含有能夠與蛋白質反應部分的官能基團上。例如，Mikola等人在專利申請(國際公開號WO84/03698，
公開日期9/27/1984)中公開了一種雙官能螯合劑，該螯合劑是通過P-硝基芐基溴與DETA反應，接著與溴代乙酸反應生成氨基羧酸而制備的。其硝基被還原成相應的胺基，然后再與二氯硫化碳反應，轉化成異硫氰酸根合基團。這些化合物是能夠螯合鑭系元素的雙官能螯合劑，鑭系元素可以共軛到生物有機分子上而用作診斷劑。由于這個分子連接部分的連接，是通過氨基羧酸的多個氮中的一個氮原子進行的，那么對于螯合作用就失去了一個可能的氨基羧酸基團。因此制備的是含四個酸(不是五個酸)基團的DETA-基礎上的雙官能螯合劑。在這一方面，這類雙官能螯合劑相似于那些通過酰胺基團與蛋白質相連而失去一個羧基螯合基團的螯合劑。
最近，Carney、Rogers和Johnson公開了(關于單克隆抗體治癌的第三屆國際會議;San Diego，California-2/4～6/88)題為“體內較高級組織不吸收銦-111標記的抗體在裸露鼠樣品中共同施用銦-111和碘-125標記的B72.3”和“在裸露鼠內，螯合劑Denticity對銦-111標記的B72.3免疫共軛生物分布的影響”的摘要。公開了與EDTA和DTPA雙官能螯合劑配合的銦-111的生物分布。芳香環(huán)向EDTA/DTPA部分的連接是通過乙酸酯的亞甲基進行的。在最近的一次會議上，D.K.Johnson等人〔Florida Conf.on Chem.in Biotechnology，April26～29(1988)，Palm Coast，F(xiàn)L〕公開了EDTA和DTPA的雙官能衍生物，其中的P-異硫代氰酸根合芐基部分連在多個羧基甲基基團之一的亞甲基碳上。以前，Hunt等人在美國專利4，088，747和4，091，088(1978)中，公開了以1，2-乙二胺二乙酸(EDDA)為基礎的螯合劑，其中，芳族環(huán)向EDDA部分的連接是通過亞烷基或乙酸酯的亞甲基進行的。這些化合物已被論述可用作螯合劑，用來研究肝膽管的功能。優(yōu)選的金屬是锝-99m。銦-111和銦-113m也被認為是有用的放射性核素，用于成像。
因而，提供一種不易離解，能迅速從整個身體內，除了所需的組織處外排除的，并與抗體共軛產(chǎn)生所需的結果的配合物將是很有利的。


圖1-7和15-21說明了153Sm的生物分布，其施用方式是本發(fā)明的含153Sm的共軛物，抗體CC49-IgG用在本發(fā)明的共軛體中。在帶有LS174-T腫瘤的裸露鼠體上測定其生物分布。
圖8-14和22-28說明了153Sm的生物分布，其施用方式是本發(fā)明的含153Sm的共軛物。本發(fā)明的共軛體用CC49-F(ab′)2作為抗體片段。在帶有LS174-T腫瘤的裸露鼠中測定其生物分布。
圖29-34說明了以含177Lu(PA-DOTMA)的共軛物形式的177Lu的生物分布。該共軛物用CC49-IgG作抗體。在帶有LS174-T腫瘤的裸露鼠中測定其生物分布。
令人驚奇的是，本發(fā)明的配合物和/或共軛物比較穩(wěn)定(即不容易離解)，并且顯示了能從整個身體內，除了所需組織處，被快速地排除。
本發(fā)明包括新的雙官能螯合劑的設計和合成，每種螯合劑含一個螯合官能度和一個以共價鍵結合于生物分子的化學活性基團。本發(fā)明的組成部分還包括制備各種雙官能配位體(BFC)-金屬配合物的方法，以及將配合物連接到抗體上以制備適于診斷和/或治療應用的放射性核素(如釤-153、镥-177和釔-90)標記的抗體和/或片段的方法。
本發(fā)明直接公開了新型的雙官能螯合劑與金屬離子，尤其是具有稀土類化學性質的“放射活性”金屬離子形成配合物。優(yōu)選的稀土類金屬離子包括La，Ce，Pr，Nd，Pm，Sm，Eu，Gd，Tb，Dy，Ho，Er，Tm，Yb，Lu，Y和Sc。優(yōu)選的放射性稀土類金屬離子包括153Sm，166Ho，90Y，149Pm，159Gd，140La，177Lu，175Yb，47Sc和142Pr。其它可令人感興趣的放射性金屬離子是47Sc，99mTc，186Re，188Re，97Ru，105Rh，109Pd，197Pt，67Cu，198Au，199Au，67Ga，68Ga，111In，113mIn，115mIn，117mSn和212Pb/212Bi。如此形成的配合物，可以連結(共價鍵合)到抗體或其片段上，用于治療和/或診斷的目的。該配合物和/或共軛物可被配制以供體內或體外使用。配制的共軛物的優(yōu)選應用是治療動物體，尤其是人體內的癌。
使用本發(fā)明的其中包括一個非放射性金屬的配合物和/或共軛物，診斷和/或治療病癥，如癌，也是可能的。這種使用是已知的，對于非放射性的金屬，用射頻可引起高溫(Jpn.KoKai ToKKyo Koho Jp 61，158，931)和熒光-免疫導向的治療(FIGS)〔K.Pettersson等人，Clinical Chemistry29，(1)，60-64(1983)和C.Meares等人，Acc.Chem.Res.17，202-209(1984)〕。
更具體地說，本發(fā)明公開了式(Ⅰ)的化合物 其中每個Q分別是氫或(CHR5)pCO2R;
Q1是氫或(CHR5)wCO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是Q和Q1的總和中至少兩個不是氫;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
X和Y各自分別是氫或者可以與相鄰的X和Y生成另外的碳-碳鍵;
n是0或1;
m是包括0到10的整數(shù);
p＝1或2;
r＝0或1;
w＝0或1;
條件是當X和/或Y生成另外的碳-碳鍵時，n僅是1，并且r和w的總和是0或1;
L是以共價鍵鍵合的連接基/間隔基，取代了與其相連的碳原子之一上的一個氫原子，該連接基/間隔基用下式表示
其中s是0或1的整數(shù);
t是包括0到10的整數(shù);
R1是一個親電或親核部分，其允許共價鍵合到抗體或其片段上，或者R1是一個合成的連接基，其可以連接到抗體或其片段上，或者R1是其前體;以及Cyc表示一個環(huán)脂族部分、芳族部分、脂雜環(huán)部分、或芳雜環(huán)部分，每個所說的部分可任意地被一個或多個基團取代，這些基團不會干擾向抗體或抗體片段的連接。條件是當s，t，m，r和n是0時，R1不是羧基;
或其藥學上可接受的鹽。
式(Ⅰ)化合物優(yōu)選的部分是R是氫;R5是氫或甲基;n是0;m是0到5;r是0;L是式(A)的化合物 其中R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰氨基和馬來酰亞胺組成的基團;
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H、羥基和氫組成的基團;
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基，硫代脲氨基、羧基、溴乙酰氨基和馬來酰亞胺基組成的基團;
條件是R2和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中的一個必須是氫;
或其藥學上可接受的鹽。
當本發(fā)明的共軛物是所需要的時，R2和R4必須不是硝基。當R2或R4是硝基時，那么就要存在一個連接基部分(L)的前體。這個前體部分可以是任一部分，其為制備式(Ⅰ)化合物中R2或R4部分而形成，并且不連到抗體或抗體片段上。
本發(fā)明也公開了稀土類金屬離子配合物，特別是放射性中性的或帶電荷的稀土類金屬離子配合物，而且還公開了與上述的配合物和抗體或抗體片段所形成的共軛物。另外本發(fā)明也包括由本發(fā)明共軛物和藥學上可接受的載體組成的制劑，特別是藥學上可接受載體為液體的制劑。本發(fā)明也包括診斷或治療哺乳動物體內病癥特別是癌的方法。其方法包括將有效量的制劑施用于哺乳動物體內。
正如本文使用的，下面被說明的術語具有這些含意對于R1，R2或R4的定義來說，親電部分包括異硫氰酸根合、溴乙酰胺基、馬來酰亞胺基、亞氨酸酯、硫代鄰苯二甲酰亞胺、N-羥基琥珀酸酯、吡啶基二硫化物和苯基疊氮化物，但不只限于此;合適的親核部分包括羧基、氨基、酰(基)肼、脲氨基和硫代脲氨基，但不限于此;“合成的連接基”包括任一合成的有機或無機連接基，它們能共價鍵合到抗體或抗體片段上。優(yōu)選的合成連接基是可生物降解的合成連接基，其在病人血清中是穩(wěn)定的，但有可能在排除的器官內裂解放射性同位素，例如可生物降解的肽或帶基團的肽。親電部分的異硫氰酸鹽是優(yōu)選的，親核部分的氨基、脲氨基和硫代脲氨基是優(yōu)選的。有一點要合乎需要，即R1的性質和/或位置要明顯地不干擾螯合反應。
式(Ⅰ)中，術語“x-c-y”表示在相鄰碳原子之間任意存在有雙鍵和三鍵。不飽和鍵可以分別存在于包括0到10個碳原子的，如在式(Ⅰ)中用“m”術語所定義的鍵長中。
正如本文所使用的，術語“哺乳動物”指的是用乳腺的奶養(yǎng)育它們幼子的動物，優(yōu)選的是溫血動物，更優(yōu)選的是人?！翱贵w”指的是任何多克隆的、單克隆的、嵌合抗體或雜抗體，優(yōu)選的是單克隆抗體;“抗體片段”包括Fab片段和F(ab′)2片段，以及具有朝著一個目的抗原決定基或多個抗原決定基特性的抗體的任何一個部分。當用術語“金屬螯合物/抗體共軛物”或“共軛物”時，“抗體”部分意思是包括整個抗體和/或抗體片段，包括其半合成或遺傳工程變異體。
正如本文所使用的，“配合物”指的是本發(fā)明如式(Ⅰ)化合物與稀土類金屬離子，特別是放射性的稀土類金屬離子的配合物，其中至少一個金屬原子是螯合的或(多價)螯合的;“放射性金屬離子螯合物/抗體共軛物”或“放射性金屬離子共軛物”指的是以共價鍵連接到抗體或抗體片段上的放射性金屬離子共軛物;當“放射性”與“金屬離子”聯(lián)合使用時，指的是能放射粒子和/或光子的稀土類元素的一個或多個同位素，如153Sm，166Ho，90Y，149Pm，159Gd，140La，177Lu，175Yb，47Sc和142Pr;術語“雙官能配位體”、“雙官能螯合劑”和“官能化螯合”是可互換的，指的是具有能夠螯合金屬離子的螯合部分和以共價鍵連接于螯合部分的連接基/間隔基部分的化合物，該化合物可用來以共價鍵連接于抗體或抗體片段上。
正如本文所使用的，“藥學上可接受的鹽意思是無毒的，足以用于哺乳動物的治療或診斷的式(Ⅰ)化合物的任何一種鹽。因此，根據(jù)本發(fā)明，這些鹽是有用的，即通過標準反應，從有機的或無機酸制成的鹽。這些酸包括如硫酸，鹽酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、乳酸、馬來酸、富馬酸、棕櫚酸、膽酸、棕櫚油酸、粘酸、谷氨酸、d-樟腦酸、戊二酸、乙醇酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、硬脂酸、水楊酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、安息香酸、肉桂酸和其它合適的酸。也包括通過標準反應，從有機堿或無機堿，如銨、堿金屬離子、堿土金屬離子和其它類似離子制得的鹽。特別優(yōu)選的是式(Ⅰ)化合物的鉀、鈉、銨或其混合物的鹽。
當然，式(Ⅰ)化合物的游離酸也可以使用，也可以是質子化形式的化合物，如當羧酸鹽被質子化時，和/或氮原子即當形成HCl鹽時。
優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括那些其中Q1是氫，L用A式表示的化合物，如下式所示
其中每個Q分別是H或CHR5CO2R;
每個R分別是H、芐基或C1～C4烷基;條件是至少兩個Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來酰亞胺基組成的基團;
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H，羥基和氫組成的基團;
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來酰亞胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
條件是R2和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中的一個必須是氫;
或其藥學上可接受的鹽。
在式(Ⅱ)中，當R3和R4兩者都是氫時，化合物用下式表示 其中每個Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少兩個Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來酰亞胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
或其藥學上可接受的鹽。
在式(Ⅱ)中，當R2是氫時，化合物用下式表示 其中每個Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少兩個Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H或羥基組成的基團;
R4選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來酰亞胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
或其藥學上可接受的鹽。
另外優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括那些其中至少一個Q是氫的化合物，用下式表示 其中每個Q分別是氫或CHR5CO2R;
Q1是氫或(CHR5)wCO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是Q和Q1的總和中至少兩個必須不是氫，而Q中之一是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
w是0或1;
R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團;
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H、羥基和氫組成的基團;
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來酰胺基和溴乙酰胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
條件是R1和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中的一個必須是氫;
或其藥學上可接受的鹽。
其它優(yōu)選的式(Ⅰ)化合物包括那些其中Q1是CO2R(W＝0)的化合物，用下式表示 其中每個Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少一個Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合，脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團;
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H、羥基和氫組成的基團;
R4選自由氫、硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
條件是R2和R4不能兩者都是氫，但R2和R4中之一必須是氫;
或其藥學上可接受的鹽。
一些優(yōu)選的式(Ⅵ)化合物是那些其中R3和R4兩者都是氫的化合物，用下式表示 其中每個Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是;至少一個Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R2選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、溴乙酰胺基和馬來酰亞胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
或是藥學上可接受的鹽。
其它優(yōu)選的式(Ⅵ)化合物是那些其中R2是氫的化合物，用下式表示
其中每個Q分別是氫或CHR5CO2R;
每個R分別是氫、芐基或C1～C4烷基;
條件是至少一個Q必須不是氫;
m是包括0到5的整數(shù);
R3選自由C1～C4烷氧基、-OCH2CO2H和羥基組成的基團;
R4選自由硝基、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、羧基、馬來酰亞胺基和溴乙酰胺基組成的基團;
每個R5分別是氫或C1～C4烷基;
或其藥學上可接受的鹽。
本文描述的雙官能螯合劑〔用式(Ⅰ)-(Ⅷ)中任何一個表示的〕可用于螯合或(多價)螯合稀土類金屬離子，特別是放射性的稀土類金屬離子，以生成金屬離子螯合物(這里也可稱為“配合物”)。由于可官能化部分的存在〔在式(Ⅰ)中用R1表示的〕，配合物可以連到官能化的載體，如官能化的聚合載體上，或優(yōu)選地，當式(Ⅰ)的配合物，其中的L表示式A，R2和R4必須不是硝基時，配合物可以共價連接到蛋白質或比較特殊的抗體或抗體片段上。因此，這里所描述的配合物(用式(Ⅰ)-(Ⅷ)中任一個表示的化合物與稀土類金屬離子，特別是放射性稀土類金屬離子進行配合的產(chǎn)物)可以共價連接到一個抗體或抗體片段上，在此稱為“共軛物”。
本文中所描述的共軛物中可使用的抗體或抗體片段能夠用已知技術制備。高特異的單克隆抗體可以用已知的雜交技術制備，參見，例如，Kohler和Milstein〔Nature256，4.95-497(1975);和Eur.J.Immunol.6511-519(1976)〕。通常這樣的抗體有高特異的反應活性。在放射性金屬離子共軛物中，可以使用直接抗任何目的抗原或半抗原的抗體。在放射性金屬離子共軛物中所用的優(yōu)選抗體是單克隆抗體，或其對目的抗原決定基有高特異性的片段。本發(fā)明中所用的抗體可以直接抗如腫瘤、細菌、真菌、病毒、寄生物、支原菌屬、分化和其它細菌膜抗原、病原體表面抗原、毒素、酶、變應原、藥物和任何生物學活性分子。某些抗體或抗體片段的實例是CC-11，CC-46，CC-49，CC-49F(ab′)2，CC-83，CC-83F(ab′)2和B72.3〔對于CC-49，CC-83和B72.3抗體請參見D.Colcher等人，Cancer Res.48，4597-4603(Aug.15，1988)〕。雜種細胞線B72.3存放在美國類型培養(yǎng)標本(ATCC)中，登記號為HB8108。在美國專利申請7-073，685中，(1987.7.15申請)公開了各種CC抗體，它們可以通過NTIS獲得。其它鼠的單克隆抗體粘在TAG-72，一種連在抗原上的腫瘤，的抗原決定基上。比較全面的抗原目錄表可在美國專利4，193，983中找到，該專利在此列為參考文獻。本發(fā)明的放射性金屬離子共軛物對于診斷或治療各種癌癥是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明優(yōu)選的稀土類(鑭系元素或假鑭系元素)配合物用下式表示C〔Ln(BFC)〕(Ⅸ)其中Ln是稀土金屬(鑭系元素)離子，如Ce3+，Pr3+，Nd3+，Pm3+，Sm3+，Eu3+，Gd3+，Tb3+，Dy3+，Ho3+，Er3+，Tm3+，Yb3+和Lu3+，或假鑭系元素金屬離子如Sc3+，Y3+，和La3+，BFC表示雙官能螯合劑;C表示藥學上可接受的離子或為保證整個配合物呈中性而帶有足夠電荷的離子的基團。如果BFC含有四個或更多陰電荷部分，那么C是陽離子或陽離子基團，如H+，Li+，Na+，K+，Rb+，Cs+，Mg2+，Ca2+，Sr2+，Ba2+，NH+4，N(CH3)+4，N(C2H5)+4，N(C3H7)+4，N(C4H9)+4，As(C6H5)+4，〔(C6H5)3P＝〕2N+和其它質子化的胺。如果BFC含有三個陰電荷部分，則C是不需要的。如果BFC含有兩個陰電荷部分，則C是陰離子，如F-，Cl-，Br-，I-，ClO-4，BF-4，H2PO-4，HCO-3，HCO-2，CH3SO-3H3C-C6H4-SO-3，PF-6，CH3CO-2和B(C6H5)-4本發(fā)明的共軛物，以及在某些情況下本發(fā)明的配合物，可以用來做制劑。制劑由式(Ⅰ)化合物與抗體和/或金屬離子和生理學上可接受的載體、賦形劑或媒介物所組成。例如，制劑可由生理學上可接受的載體和配合物(金屬離子+配位體)，共軛物(金屬離子+配位體+抗體)或(配位體+抗體)組成。制備這種制劑的方法是已知的。制劑可以是懸浮液、注射液或其它合適的制劑形式?？梢允褂蒙韺W上可接受的懸浮介質，加或不加輔助劑。
本發(fā)明的制劑是含有與配位體配合的活性放射性核素的固體或液體形式。這些制劑可以是配套形式，在使用前適當?shù)臅r間里，將兩個成分(即配位體和金屬、配合物和抗體，或配位體/抗體和金屬)進行混合。無論是予混合形式還是配套形式，制劑通常需要藥學上可接受的載體。
本發(fā)明的可注射組合物可以是懸浮液形式或溶液形式。在制備合適的制劑時，一般將會看到鹽的水溶解性大于酸的形式。在溶液形式時，配合物(或是所需的單獨成分)被溶于生理學上可接受的載體中。這些載體包括合適的溶劑、防腐劑如芐醇，如果需要，還包括緩沖劑。有用的溶劑包括如水、含水酒精、1，2-乙二醇和膦酸脂或碳酸酯。這種含水溶液含有不大于50%(體積比)的有機溶劑。
注射懸浮液是本發(fā)明的組合物，其需要-液態(tài)懸浮介質作為載體，可加或不加輔助劑。懸浮介質可以是如含水聚乙烯吡咯烷酮、惰性油如植物油或高精細礦物油、或含水的羧甲基纖維素。如果必須保持配合物為懸浮液形式，則可以從增稠劑如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽中選擇合適的生理學可接受的輔助劑。很多表面活性劑可用作懸浮劑，如卵磷脂、烷基酚、聚環(huán)氧乙烷加合物、萘磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯。
在個別情況下，許多影響液體懸浮介質的親水性、密度和表面張力的物質會有助于注射懸浮液的制備，例如(聚)硅氧烷消泡劑、山梨糖醇和糖都是有用的懸浮劑。
“有效量”的制劑被用于治療。劑量將根據(jù)被治療的疾病而改變。雖然可用本發(fā)明制劑進行體外診斷，但也期望著用本發(fā)明制劑進行體內診斷。本發(fā)明的共軛物和制劑也可以用于放射免疫導向外科(RIGS);然而，能用于此目的的其它金屬也包括99mTc，111In，113mIn，67Ga和68Ga。
本發(fā)明的一些螯合劑的其它應用，可包括磁共振成像，例如，式(Ⅰ)的配合物，特別是式(Ⅵ)的配合物，與Gd+3一起為各種目的，如作為診斷試劑，連到聚合物載體上，然后通過選擇性提取方式除去鑭系元素金屬或假鑭系元素金屬離子。
本發(fā)明提供了螯合劑、配合物和抗體共軛物，與已知技術相比，其中一些具有較好的穩(wěn)定性、和/或改善了的生物分布、和/或能更迅速地從體內排除。
一種合理的、一般的合成式(Ⅰ)所示的本發(fā)明近似12大環(huán)的雙官能螯合劑的方法，包括用一適當?shù)挠H電試劑(例如任何適當取代的α-鹵代羧酸酯)使大環(huán)游離堿(例如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷)僅在一個氮原子上進行單官能化反應。這個親電試劑必須具有適當?shù)倪B接基部分或被適當保護的連接基部分，該部分要允許雙官能配位體共價連接到蛋白質、抗體或抗體片段上。
從現(xiàn)有技術中已認識到用來制備單一N-官能的多氮雜大環(huán)的烷基化技術，會導致產(chǎn)品難以分離的混合物〔T.Kaden，Top.Curr.Chem.121，157-75(1984)〕。這個問題通過已報導的方法，即使用大量過量的大環(huán)堿(相當于親電試劑的5～10當量)已被克服。過量的大環(huán)堿有助于單烷基化加合物的生成〔M.Studer和T.A.Kaden，Helv.Chim.Acta69，2081-86(1986);E.Kimura等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun 1158-59(1986)〕。
生成單一N-官能的多氮雜大環(huán)的其它路線包括過長的保護、官能化作用和脫保護步驟〔P.S.Pallavicini等人，J.Amer.Chem.Soc.109，5139-44(1987);M.F.Tweedle等人，Eur.Pub.Pat.Appln.No.0232-751〕。一個關于取代的苯基丙酮酸和胺的還原胺化作用的最近的報導，已由Abbott Labs發(fā)表，是最近的一次會議的摘要(D.K.Johnson等人，F(xiàn)lorida Conf.on Chem.in Biotechnology，April 26-29(1988)，Palm Coast，F(xiàn)L)。一種制備單一N-烷基化的多氮雜大環(huán)的方法被公開在序號為289，163，由W.J.Kr per，于1988，12，22申請的美國專利申請中。該方法是通過使用一種親電試劑與大約1至5當量之間的適當?shù)拇蟓h(huán)在一溶劑中進行反應，該溶劑將不促進質子的轉移。該公開內容特提出作為參考文獻。
本發(fā)明螯合物的一般合成路線已公開在后面的合成路線Ⅰ-Ⅳ中，包括適當?shù)挠H電試劑與多氮雜大環(huán)在適當?shù)挠袡C溶劑中的反應。適當?shù)挠袡C溶劑的例子是任何有助于溶解性的碳氫化合物，如乙腈、異丙醇、二氯甲烷、甲苯、氯仿、n-丁醇、四氯化碳、四氫呋喃、5%乙醇氯仿溶液，其中最好的是氯仿、二氯甲烷、n-丁醇、1，4-二惡烷和乙腈。各種化學計量的反應物、溫度和濃度都可以使用?？梢允褂没瘜W計量差不多的大環(huán)和親電試劑，并以一步反應生成相應的單-N-烷基化產(chǎn)物。反應的溫度范圍從大約0℃到大約回流溫度，最好從0℃到25℃。反應的時間是直到徹底完成大約1到24小時。
為了合成路線Ⅱ到Ⅳ的總的活力，一般需要利用取代的α-鹵酸酯。一個合適的途徑包括發(fā)生在酰鹵位上的溴化作用或氯化作用，例如，D.N.Harpp等人，J.Org.Chem.40，3420-27(1975)。這個途徑考慮到了鏈烷酸的全部α鹵化作用，甚至這個酸含有反應活性的芐基基團。對于取代的?；u的一般方法，包括了有機酸與亞硫酰氯或硫酰氯的反應，例如，E.Schwenk等人，J.Amer.Chem.Soc.70，3626-27(1944)。兩個方法都使用游離羧酸，它們?？蓮纳痰曩I到。
多氮雜大環(huán)，如1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷，可以用文獻中的方法制得，如T.J.Atkins等人，J.Amer.Chem.Soc.96，2268-70(1974)和T.J.Richman等人，Org.Synthesis 58，86-98(1978)。
單-N-官能的大環(huán)的羧甲基化作用，可以用溴乙酸衍生物和適當?shù)膲A通過Desreux方法進行〔J.F.Desreux，Inorg.Chem.19，1319-24(1980)〕。
所有制備本發(fā)明化合物所需要的起始原料，或者從商店中購買，或是從已知文獻敘述的方法制得。
在下面的路線Ⅰ中，制備了Q1是氫的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說明了一個化合物，但式(Ⅰ)中Q1是氫，r＝0或1，n＝0或1，及m＝0到10的其它類似部分也可以用這種方法制得。

在下述路線Ⅱ中，制備了Q1是氫的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說明了一個化合物，但式(Ⅰ)中Q1是氫、r＝0或1，n＝0或1，及m＝0到10的其它類似部分也可以用這種方法制得。
路線Ⅱ
在下面的路線Ⅲ中，制備了Q1是CO2R的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說明了一個化合物，但式(Ⅰ)中Q1是CO2R，包括m＝0到10，n＝0或1，及r＝0的其它類似部分也可以用這個方法制得。
路線Ⅲ
在下面的路線Ⅳ中，制備了Q1是(CHR5)wCO2R的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說明了一個化合物，但式(Ⅰ)中，Q1是(CHR5)wCO2R，包括m＝0到10，n＝0或1，及r＝0的其它類似部分也可以用這個方法制得。
使用一種旋光活性的烷基化試劑能使非對映體減至最小，并簡化了合成步驟。為了放射螯合作用及抗體共軛作用，需要分離出單一的能生成單一的、易純化的鑭系元素配合物的非對映體。
路線Ⅳ
在下面的路線Ⅴ中，制備了Q1是氫或(CHR5)wCO2R和R2是氫的式(Ⅰ)化合物。雖然圖示僅說明了兩個化合物，但式(Ⅰ)中Q1是氫或(CHR5)wCO2R，Q是氫或(CHR5)pCO2R，r＝0或1，n＝0或1，w＝0或1，m＝0到10，p＝1或2，L表示式A，其中R3定義如前，R2和R4選自由氫、氨基、硝基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來酰亞胺基、溴乙酰胺基和羧基組成的基團的其它類似部分也可以用這個方法制得。
路線Ⅴ
親電試劑部分(式中的“R1”)也可以用現(xiàn)有技術中已知方法加以制備。這種方法可以在Acc.Chem.Res.17，202-209(1984)中找到。能夠制備其中R1是異硫氰酸根合部分(當L＝式A時，R2或R4是異硫氰酸根合)的式(Ⅰ)化合物的方法，包括氨基螯合物(當L＝式A時，R2或R4是氨基)與硫光氣反應，該方法公開在序號為289，172，由M.J.Fazio等人于1988，12，23申請的美國專利申請中。該公開內容特引為參考文獻。
放射性核素可以用幾種方法制備，在一核反應器中，用中子轟擊一核素得到一放射性核素，例如Sm-152+中子→Sm-153+γ獲得放射性核素的另一個方法，是在一線性加速器或回旋加速器中，用粒子轟擊核素。此外還有另一種方法是從裂變產(chǎn)物的混合物中離析出放射性核素。獲得本發(fā)明中所用的核素的方法不是很嚴格的。
制備本發(fā)明的共軛物的方法是，首先形成配合物，然后與抗體或抗體片段連接。這樣，該方法包括制備或獲得配位體、形成與金屬的配合物，然后加到抗體上。另一方面，制備標記的抗體共軛物的方法包括，首先將BFC共軛到抗體上，然后螯合，生成放射性核素-BFC標記的Ab。生成本發(fā)明共軛形式的任何適當方法，是在本發(fā)明的范圍之內。
在下列實施例中，使用下列術語和條件，除非另有說明。
一般實驗質鐠是用Finnigan TSQ質鐠儀(Q′MS型)或VGEAB-MS高分辯質鐠儀(用氙做快速原子轟擊，使用3∶1二硫蘇糖醇∶二硫赤蘚糖醇)做的。
1H和13C NMR譜圖是用Varian VXR-300，Bruker APC300，IBM/BruKer NR-80或JeolFx400分光計做的。所用譜圖均在30℃下做的，除非另有說明。1H NMR是在300MHz，80MHz或400MHz(分別對應于上面所列儀器)下做的。13C NMR是在75MHz，20MHz或100MHz(分別對應于上面所列儀器)下做的。NMR的值為δ，此值相對于TMS(四甲基硅)或當D2O為溶劑時相對于DSS(2，2-二甲基-2-硅雜戊烷-5-磺酸，鈉鹽)。
紅外光譜(IR)是用Nicolet 5SX FT/IR儀做的。
用于色譜法的大多數(shù)溶劑為Fisher HPLC級原料。乙酸銨是從Aldrich購買的。用Barnstead NANO PureTM水過濾裝置提純水。有機化合物的制備色譜法既可通過使用標準方法的標準重力色譜法，也可通過由C.W.Still等，J.org.Chem.43，2923-24(1978)所描述的閃色譜法來完成。使用下列溶劑體系溶劑體系組分1 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH2:2:1V:V:V2 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH12:4:1V:V:V.
3 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH16:4:1V:V:V4 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH4:2:1V:V:V5 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH3:2:1V:V:V6 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH7:3:1V:V:V7鹽水(0.85%的NaCl蒸餾水溶液):濃縮的NH4OH4:1V:V8 CHCl3:CH3OH:濃縮的NH4OH4:4:1V:V:V業(yè)已報導，使用這些溶劑體系的Rf值和工業(yè)上另得的、正相、二氧化硅TLC板〔GHLF250微米，Analtech Inc.或Merck Kiesel凝膠60F254〕。使用Merck級60，即60 硅膠做制備柱色譜。
所有百分比均為重量百分比，除非另有說明。
用旋轉式蒸發(fā)器(Buchi 461)和/或真空干燥箱在溫度大約為55-60℃下將一些固體干燥幾小時。此外，用Virtis型10-010自動冷凍干燥機或Speed Vac TM濃縮機去溶劑。
釤-153和镥-177由Research Reactor，Missouri大學(Columbia，MO)生產(chǎn)。鐿-90從OaK Ridgo National Laboratory購買。
通過改進M.W.Brechbiel等，Inog.Chem.25，2772-2781(1986)的方法制備1-(4-異硫氰酸根合芐基)二亞乙基三胺-五乙酸(ScN-Bz-DTPA)，并在陰離子交換HPLC(Q-SepharoseTM)提純得到單一物種。所使用的一些化學物質從指定的來源得到從Behring Diagnostics(La Jolla CA)購買N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)，游離酸和鈉鹽;從Fisher Scientfic購買檸檬酸鈉(經(jīng)檢定);從Aldrich Chemicals購買硫光氣;從Sigma Diagnostics購買乙酸銨，乙酸鈉，乙二胺四乙酸(EDTA)和緩沖鹽水的磷酸鹽(PBS)。
所使用的HPLC柱為Hand-Packed Q-SepharoseTM(Pharmacia)1.5cm×25cm或2.5cm×25cm;從Du Pont Instruments購買的ZorbaxTMBIO Series GF-250(9.4mm×25cm);從Separation Group(Hesperia，CA)購買的VydacTM(Separations Group，Hesperia，CA的商標)蛋白質C-4(4.6mm×25cm);從Pharmacia購買的Mono-QTM和SP-SephadexTM(Pharmacia Biotechnology Products的商品名)。從Waters Associates(Milford，MA)購買Sep-PakTM(Waters Associates的商品名)C-18過濾器從Isolab Inc.(AKron，OH)購買SephadexTMG-25易處理的(2.2mt)從Amicon購買CentriconTM-30(Amicon Division，W.R.Grace & Co.，Danrers，MA的商品名)微型濃縮機。
五個HPLC裝置用于分析和試樣的分離裝置Ⅰ由LKB2150泵，2152控制器，UV檢測器-LKB2238UV電線(Cord)，Berthold LB506A HPLC放射監(jiān)測器(International Berthold Group的產(chǎn)品)和Gilson餾分收集器201-202(Gilson International，Middleton，WI)所組成。
裝置Ⅱ裝備有自動取樣器。WISP710B，兩個泵(510型)，自動梯度控制器(Water Associates的產(chǎn)品)，Perkin-Elmer LC-75分光光度檢測器，Beckman型170放射性同位素檢測器和餾分收集器(Pharmacia的Frac100);
裝置Ⅲ由有一個Water660溶劑程序器的兩個Water M-6000A泵，Waters型481可變波長檢測器和Waters數(shù)據(jù)模件所組成，也可使用準備的ISCO餾分收集器;
裝置Ⅳ為裝備有可變波長UV檢測器的Dionex BioLCTM裝置;和裝置Ⅴ帶有ISCO型2360梯度程序器的Water型590泵和Dionex可變波長檢測器。
Sorvall RT6000B(Du Pont的致冷式離心機)用于離心分離和濃縮，Speed Vac濃縮機(Savant Instruments Inc.，Hicksville，N.Y)用于除去揮發(fā)性溶劑。用CapintecTM放射性同位素校準器(Capintec Inc.的商標)CRC-12，或通過Beckman Ls 9800(Beckman Instrument，Inc.，Irvine，CA)的液體閃爍，或用接觸面有3英寸厚的鉈漂移的碘化鈉完好晶體的(Canberra 35+)多通道分析儀進行放射性測量。
在涉及配合物形式的實施例中，通過下面所指定的一般方法確定配合物的百分比。
通過陽離子交換確定配合物的百分比用在水中溶脹的SP-SephadexTMC-25樹脂1至2ml裝填在10ml塑料柱。通過在柱頂部施加壓力除去過量的水。將試驗溶液(15μl)加至樹脂頂部，然后用2ml4∶1(V∶V)等滲鹽水濃縮的NH4OH作為洗脫液。將洗脫液收集至計數(shù)管中。使用另外2ml洗脫液。在洗脫液收集至第二計數(shù)管后，在樹脂頂部施加空氣壓力使其干燥。將干燥過的樹脂轉至第三個計數(shù)管。用連接在Canberra多通道分析儀上的完好的NaⅠ計數(shù)器測量每個計數(shù)管的活性。作為配合物的金屬量用作在洗脫液中發(fā)現(xiàn)的總活性的百分率，在自由未配合狀態(tài)下的金屬量用作保留在樹脂中的總金屬的百分率。
通過離子交換除去未配合的金屬用0.5ml在水中溶脹的SP-SephadexTMC-25樹脂裝填在10ml塑料柱。將該柱在3，000rpm下離心4分鐘除去過量的水。將200-500μl體積的配合物溶液置于樹脂頂部，再將該管子在3，000rpm下離心4分鐘。未配合的金屬殘留在柱中，配合的金屬用溶劑洗脫。
釔配合物的制備通過制備3×10-4M釔水溶液(YCl3·6H2O，303.26g/mole;或Y(OAC)3，12.1%H2O)來制備配合物。加入放射性Y3+溶液(Oakridge National Laboratories)獲得所需的放射性水平。將10μl配位體溶液(為0.03M)加到990μl Y3+溶液中，得到配位體金屬的摩爾比為1∶1。為使配位體與金屬之比為10∶1，需使用10倍的配位體溶液的量。用幾微升的HCl或NaOH調節(jié)PH至7.4。然后用上面所給的陽離子交換方法測驗溶液的配合釔的量。
釤配合物的制備除了通過將Sm2O3(348.7g/mol溶于0.1M HCl中制備3×10-4M釤外，用上述釔配合物的制備方法制備釤配合物。以大約3×10-4M的0.1M HCl溶液的放射性Sm-153是從Missouri大學，Research Reactor，Columbia，Missouri得到的。
用于全文的一些術語定義如下。
術語匯編Conc.為濃縮的;
-OAC為乙酸根部分，-OCOCH3TLC為薄層色譜;
DIH2O為去離子NANO PureTM水;
NANO PureTM水為由Barnstead NANO PureTM水過濾裝置得到的純凈水;
環(huán)境溫度為室溫或大約20至大約25℃;
過夜為大約9至18小時;
LC為液相色譜;
NBS為N-溴丁二酰亞胺;
MES為2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸;
HPLC為高性能液相色譜;
PBS為從Sigma購買的用鹽水緩沖的磷酸鹽，含有120mM NaCl，2.7mM KCl和10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4;
SP-SephadexTMC-25樹脂為有磺酸官能度的陽離子交換樹脂，由Pharmacia.Inc.出售;
rpm＝每分鐘轉數(shù)PD為氫氘化的PH;
DOTA＝1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
HEPES＝N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸;
BFC＝雙官能螯合劑;
CyCLen＝1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷;
PA-DOTA＝α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
PA-DOTMA＝α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸-4，7，10-三(甲基乙酸)BA-DOTA＝α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
OMe-BA-DOTA＝α-(5-氨基-2-甲氧苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸;
EA-DO3A＝1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸;
DTPA＝二亞乙基三胺五乙酸;
SCN-Bz-DTPA＝1-(4-異硫氰酸根合芐基)二亞乙基三胺五乙酸;
EDTA＝乙二胺四乙酸;
螯合劑相當于配位體;
配合物相當于螯合物，例如;螯合劑連在合適的金屬離子上。
共軛意為螯合劑或配合物共價地連接在抗體或抗體的片段上;和抗體為CC-49，CC-83和B72.3和它們的片段如Fab和F(ab′)2。在上文中已給出了其它抗體。hybridom 細胞系B72.3保藏于American Type Culture Collection，入藏號為ATCC HB8108，其它稱為鼠科無性系的抗體結合在TAG-72抗原決定部位，與抗原有關腫瘤上。
通過下列大量實施例，進一步闡明本發(fā)明，這些實施例僅為使用本發(fā)明的典型例子。
起始原料的制備實施例Ad，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)-丁酸，甲酯的制備通氮氣下將10.46g(0.05mol)的4-(4-硝基苯基)丁酸加到5ml四氯化碳和15ml(0.2mol)亞硫酰氯的溶液中。將溶液回流1小時開始有氯化氫氣體和二氧化硫氣體釋出。將溶于25ml四氯化碳和三滴48%溴化氫水溶液催化劑中的11.0g(0.06mol)N-溴丁二酰亞胺加到熱溶液中，注意溴氣的釋出，將深紅色溶液回流35分鐘，冷卻溶液，然后在攪拌下將溶液倒入100ml甲醇中。TLC分析(60∶40乙酸乙酯∶己烷V∶V)表明為新產(chǎn)物(Rf＝0.69，二氧化硅板)。用旋轉式蒸發(fā)器除去過量的溶劑，用二氯甲烷作洗脫劑通過閃硅膠墊板(1英吋×5英吋)過濾深紅色油液。蒸發(fā)溶劑得到清亮的油液，產(chǎn)量為15.43g，它為標題產(chǎn)物∶起始丁酸衍生物的甲酯為85∶15的混合物。標題產(chǎn)物的結構特征為1H NMR(CDCl3)8.16(d)，7.38(d)，4.20(dd)，3.79(S)，2.88(m)，2.38(m);
13C NMR(CDCl3，75MHz)169.6，147.5，129.3，123.7，53.0，44.4，35.5，33.0。
實施例Bα-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-乙酸，1-甲酯的制備在通氮氣并攪拌下，在五分鐘內將2.07g(5.82mmol)d，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)丁酸，甲酯(由實施例A的方法制備)加到攪拌的1.72g(10.0mmol)的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的17ml用氯仿穩(wěn)定的戊烯溶液中。在大約25℃下將反應混合物攪拌48小時。TLC(使用溶劑體系2，在Analtech硅膠板上)表明形成了標題產(chǎn)物(Rf＝0.73)。將黃色氯仿溶液加至1英吋×16英吋閃色譜硅膠柱(用5%甲醇的氯仿溶液預洗脫)中，用250ml5%甲醇的氯仿溶液洗脫，接著用溶劑體系2洗脫。合并含有純標題產(chǎn)物的餾分，蒸發(fā)得到2.15g(5.46mmol，94%)標題產(chǎn)物，為淡黃色玻璃狀。用乙醚研制這種玻璃狀物的氯仿溶液得到分析純的白色粉末沉淀(mp＝156-159℃)，其結構特征為1H NMR(CDCl3)δ.14(d)，7.39(d)，3.71(s)，3.39(dd)，2.5-3.0(m)，2.08(m)，2.01(m);
13C NMR(CDCl3，75MHz)172.7，149.3，146.4，129.2，123.6，62.3，51.2，48.9，47.2，45.8，45.4，32.8，30.9。
實施例C2-溴-2-(4-硝基苯基)乙酸，甲酯的制備在通氮氣下將對硝基苯乙酸(25.0g，0.14mol)和溶于無水苯(100ml)的亞硫酰氯(15.1ml，0.21mol)的混合物回流攪拌三小時。然后在真空下將混合物蒸發(fā)干燥。將殘余物溶于四氯化碳中并通氮氣回流攪拌。在三天時間內分小批加入溴(7.2ml，0.14mol)并回流混合物。冷卻反應混合物并用甲醇(50ml，慢慢加入)驟冷酰基氯。通過用玻璃單環(huán)的六英吋柱減壓(BP＝168℃，在1.1mm下)蒸餾回收所得到的溴酯(27g，71%)，為黃色油狀物。標題產(chǎn)物的結構由下列數(shù)據(jù)所證實1H NMR(COCl3)8.25(d)，7.81(d)，5.51(s)，3.86(s)。
實施例Dα-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯的制備將含有能形成完全溶液的剛好足量的甲醇的354mg(2.068mmol)的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的20ml乙腈溶液，一起加到529mg(2.068mmol)2-溴-2-(4-硝基苯基)乙酸，甲酯(由實施例C的方法制備)的20ml乙腈溶液中。將所得的粉紅色溶液攪拌1.5小時，然后在真空下于35℃將溶液濃縮至少體積。用硅膠色譜以20%(wt/v)NH4OAC/CH3OH洗脫純化粗的單酯四胺。純化過的單酯四胺以三乙酸鹽離析出來，然后轉化為自由胺。270mg的3ml水溶液在0℃用K2CO3水溶液(10%wt/wt)調PH為11。然后以10ml×5氯仿萃取該堿性溶液，合并氯仿層，然后用硫酸鈉干燥，濃縮得到160mg(產(chǎn)率42%)所要的單酯四胺，其結構特征由NMR和快速原子轟擊質譜(〔M+H〕+＝366)確證，和結構特征是1H NMR(CDCl3)8.12(d)，7.44(d)，4.75(s)，3.76(s)，2.67-2.44(M);
13CNMR(CDCl3)171.5，147.6，144.0，130.0，124.0，67.0，49.8，47.9，46.0，46.9。
實施例EN-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將含有2.1克2-甲氧基-5-硝基芐基溴(8.5mmol)的氯仿溶液(20ml)一次加到攪拌的含有2.9克1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(16.8mmol)的氯仿溶液(20ml)中。室溫攪拌3小時后過濾反應混合物，真空濃縮濾液，得到的殘余物進行色譜分離(硅膠，溶劑體系3)。分離得到單烷基化產(chǎn)物，產(chǎn)率為79%(MP＝154-156℃)，和其結構特征為13C NMR(CDCl3)162.47，140.63，127.92，125.49，124.53，109.91，55.88，53.25，50.90，47.18，45.45，45.29。
實施例FN-(2-羥基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將2-羥基-5-硝基芐基溴(1.2g，7mmol)的二惡烷溶液(15ml)在連續(xù)攪拌下一次加到1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(2.3g，14mmol)的1，4-二惡烷溶液(20ml)中。在幾分鐘后，加入K2CO3(1g)并在室溫下連續(xù)攪拌1小時。然后過濾反應混合物，真空濃縮濾液，得到的黃色半固體進行硅膠柱色譜分離，用溶劑體系5洗脫。從也含有未反應胺的僅余最后1/3亮黃色洗脫液中分離出所要的單烷基化產(chǎn)物。液縮后，用CHCl3(100ml)研制黃色油液，過濾除去起始原料CHCl3可溶性胺。然后分離出純的最終產(chǎn)物，為黃色固體(1.2g，55%);(MP＝142-145℃)，其進一步的結構特征為13C NMR(D2O)25.04，25.28，26.83，31.80，36.54，101.88，107.22，110.92，111.80，115.26，159.99。
實施例G1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將4.00g(17.4mmol)1-(2-溴乙基)-4-硝基苯在通氮氣劇烈攪拌下于5分鐘內滴加到攪拌的3.50克(20.3mmol)1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的50ml用穩(wěn)定氯仿的戊烯溶液中。
在室溫下(大約25℃)繼續(xù)攪拌大約18小時，從溶液中沉淀出溴氫化胺晶體。將全部的反應混合物加至閃色譜硅膠柱(1英吋×18英吋)中，用5%甲醇的氯仿溶液預洗脫;用200ml該溶液洗脫，接著用溶劑體系3洗脫。從所要的產(chǎn)物中分離出1.45g(9.7mmol)對硝基苯乙烯(Rf＝0.98;溶劑體系1)。然后分離出所要的單官能標題產(chǎn)物(2.27g，7.06mmol，40.6%)，為橙黃色油液，存放則凝固(Rf＝0.73，溶劑體系1)。
從CHCl3/環(huán)己烷中再結晶標題產(chǎn)物的試樣，表明其結構特征如下MP＝146.5-148.5℃;
1H NMR(CDCl3)8.135(d，m)，7.395(d，m)，2.91(t)，2.77(t)，2.72(t)，2.50(t)，2.60(s);
13C NMR (CDCl3，75MHz)148.5，146.7，129.6，123.4，55.5，51.4，46.9，45.9，45.1，33.7。
實施例H1-(4-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將3.5克(20.3mmol)1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷和1.7g(7.87mmol)對硝基芐基溴加到50ml氯仿中，在25℃下通氮氣攪拌混合物24小時。然后將溴氫化物的鹽的氯仿淤漿加至1英吋×17英吋的閃色譜硅膠柱中(溶劑體系3)。分離得到2.13g(6.93mmol)的標題產(chǎn)物，為分析純的淡黃色固體，產(chǎn)率為88%(Rf＝0.58，溶劑體系3)，
MP＝128-129℃，其進一步的結構特征為1H NMR(CDCl3)8.19(d)，7.49(d)，3.69(s)，2.82(t)，2.70(t)，2.59(m);
13C NMR(CDCl3，73MHz)147.2，128.4，123.8，58.8，51.7，47.1，46.3，45.1。
(為了避免與后面的生物實施例號混淆，沒有實施例Ⅰ)實施例J1-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷的制備將690mg(2.25mmol)的1-(4-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(由實施例H的方法制備)溶于10ml甲醇中。在該溶液中加入350mg10%鈀的碳催化劑。在25℃下用過量的氫氣吹洗該溶液。在45分鐘內TLC表明已制備了標題產(chǎn)物(Rf＝0.33，溶劑體系3)。用1英吋×16英吋閃色譜硅膠柱(溶劑體系3)進行形成的標題產(chǎn)物的色譜純化，得到480mg(77%)的標題產(chǎn)物，為淡黃色清亮油液。
用無水氯化氫鼓泡通入游離堿的乙醇溶液從而將標題產(chǎn)物的游離堿(103mg，0.37mmol)轉化為鹽酸化物鹽，所得的標題產(chǎn)物的四鹽酸化物鹽，在用冷的乙醇洗滌和真空干燥后，得到產(chǎn)量為147mg(0.347mmol)，MP＝255-260℃(del)，其結構特征為1H(D2O，PD＝1.9)
7.56(d)，7.47(d)，3.95(s)，3.28(t)，3.23(t)，3.09(t)，2.96(t);
13C NMR(D2O，PD＝1.9，75MHz)138.3，134.2，132.2，126.0，58.5，50.3，46.7，44.6，44.3。
實施例K2-甲氧基-5-硝基芐基腈的制備將2-甲氧基-5-硝基芐基溴(25g，101.6mmol)的乙醇(15ml)熱溶液在攪拌下分小批于70℃下加到氰化鈉(6g，121.9mmol)水溶液(5.3ml)中。然后將反應混合物回流1.5小時，冷卻并過濾。濾餅用乙腈洗滌，真空蒸發(fā)濾液得2-甲氧基-5-硝基芐基腈(19.5g，100%)，為棕黃色固體。產(chǎn)物的結構特征為13C NMR(CDCl3)161.4，141.0，125.7，124.6，119.8，116.5，110.2，56.3，18.8。
實施例L2-甲氧基-5-硝基苯乙酸的制備將2-甲氧基-5-硝基芐基腈(19.5g)(由實施例K的方法制備)的濃鹽酸(20ml)的漿液回流3小時。冷卻后，過濾得到粗產(chǎn)物并用水洗滌。將固體溶于熱氫氧化鈉水溶液中并趁熱過濾。將此橙紅溶液冷卻并用鹽酸酸化。過濾沉淀，并用水洗，干燥得到2-甲氧基-5-硝基苯乙酸，為白色固體(15g，70%)。產(chǎn)物的結構特征為
13C NMR(CDCl3-CD3OD)172.8，162.5，140.7，126.2，124.7，124.1，109.7，55.8，35.0。
實施例Mα-溴-(2-甲氧基-5-硝基苯基)乙酸，甲酯的制備將亞硫酰氯(4.0ml，54.8mmol)加到2-甲氧基-5-硝基苯乙酸(2.266g，10.74mmol)(按實施例L的方法制備)的無水苯(50ml)漿液中。在燒瓶上裝置干燥管和冷凝器，將混合物回流2小時。將得到的黃色溶液真空濃縮至小體積，然后溶于無水四氯化碳中。加入溴(0.6ml，11.6mmol)，溶液在隔絕空氣濕度的條件下回流二天。反應混合物濃縮至小體積，加入(50ml)甲醇。真空蒸發(fā)過量甲醇后得到的油滴用色譜法提純(硅膠，二氯甲烷-己烷4∶1)。得到標題產(chǎn)物(2.339g，74%)，為黃色油液。產(chǎn)物結構特征為1H NMR(CDCl3)8.45(dd)，8.15(dd)，6.95(d)，5.75(s)，3.99(s)，3.78(s)。
實施例Nα-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷，1-乙酸，甲酯將α-溴(2-甲氧基-5-硝基苯基)-乙酸(2.399g，7.89mmol)(按實施例M的方法制備)的氯仿(10ml)溶液加到攪拌的1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(2.72g，15.79mmol)的氯仿(50ml)溶液中。室溫下攪拌混合物2小時。然后將混濁的混合物在室溫下真空濃縮至小體積。通過色譜法(硅膠，溶劑體系3)提純粗產(chǎn)物，得到標題化合物，為黃色固體(2.60g，83%)。其結構特征為13C NMR(CDCl3)170.7，161.6，139.9，125.0，124.5，124.2，110.2，59.5，55.5，50.5，48.0，47.3，45.6，44.3，43.5實施例Od，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)-丁酸異丙酯的制備使用Harpp等，J.Org.Chem 40，3420-27(1975)的方法，通氮氣將4-(4-硝基苯基)丁酸(21.0g，0.10mol)加到四氯化碳(10ml)和亞硫酰氯(30ml，0.4mol)的溶液中。將溶液回流1小時開始有氯化氫和二氧化硫迅速釋出。此時，加入N-溴丁二酰亞胺(22.0g，0.12mol)的四氯化碳(50ml)溶液，并將8滴48%溴化氫水溶液催化劑加到熱溶液中，注意溴的釋出，將此深紅色溶液再回流35分鐘。將溶液冷卻并在攪拌下倒至異丙醇(400ml)中。TLC分析(二氯甲烷，硅膠板)表明為新產(chǎn)物(Rf＝0.73)。除去過量溶劑，使用二氯甲烷作洗脫液用閃色譜硅膠墊板(3英吋×6英吋)過濾深紅色油液。真空下除去溶劑，將淡黃色液加至快速硅膠柱(3英吋×18英吋)中，用二氯甲烷洗脫得到25.0g(0.076mol)所題的溴酯產(chǎn)物，為清亮油液，產(chǎn)率為75%，異丙醇溶劑化物中含有少于5%的未溴化的酯，產(chǎn)物的結構特征為1H NMR(CDCl3)8.16(d，2H)，7.38(d，2H)，5.05(t重峰，1H)，4.14(dd，1H)，2.88(m，4H)，2.39(m，4H)，1.29(d，6H);
13C NMR(CDCl3)168.7，147.7，129.3，123.8，69.9，45.1，35.6，33.0，21.5，21.2實施例Pα-〔3-(4-硝基苯基)丙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯的制備將4.81g(換算成14.6mmol)的d，1-2-溴-4-(4-硝基苯基)-丁酸異丙酯(按實施例O的方法制備)在通氮氣并攪拌下于5分鐘內加入3.137g(18.2mmol)Cyclen游離堿的30ml用氯仿穩(wěn)定的戊烯溶液中。在室溫下攪拌反應溶液24小時。TLC分析(溶液體系2)表明已轉化為標題所稱的單烷基化產(chǎn)物(Rf＝0.78，用水合茚三酮，碘和UV活性測定)。將黃色氯仿溶液加至1英吋×17英吋閃色譜硅膠柱中，用5%甲醇的氯仿溶液預洗脫，再用300ml此溶劑體系洗脫，接著用溶劑體系2洗脫得到含純標題產(chǎn)物的餾分，合并這些餾分并蒸發(fā)得到4.85g(5.46mmol)標題產(chǎn)物的游離堿，為淡色油液，產(chǎn)率為79%，其進一步的結構特征為1H NMR(CDCl3)8.15(d，2H)，7.40(d，2H)，5.07(P，1H)，3.35(dd，1H)，2.65-3.0(m，13H)，2.5-2.64(m，4H)，2.14(m，1H)，2.00(m，1H)，1.28(dd，6H);
13C NMR(CDCl3)171.6，149.5，146.5，129.2，123.6，68.1，62.7，49.2，47.5，45.9，45.7，32.9，31.0，22.1，22.0;
IR(CDCl3)cm-13231(N-H)，2978，2933，1721(酯羰基)，1601，1512，1458，1345，1107;
快速原子轟擊質譜m/e422(M+H)+，408，392。
最終產(chǎn)物-配位體的制備實施例1α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，-甲酯，三乙酯的制備將700mg(1.91mmol)的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯(按實施例D的方法制備)溶于含有4.6g(33.3mmol)新鮮粉狀無水碳酸鉀的46ml乙腈中。將1.022g(6.12mmol)溴乙酸乙酯一次加到此懸浮液中，在室溫下攪拌四小時后，真空過濾懸浮液，用15ml乙腈再次洗滌濾餅，在38℃下真空蒸發(fā)濾液得到粗的標題所稱的四酯，為紫色固體。然后用硅膠色譜法提純四酯，用5%C2H5OH/CHCL3洗脫，然后用溶劑體系3洗脫得到620mg(0.988mmol，52%)的所要產(chǎn)物。產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質譜(〔M+H〕+＝624)證實，并通過下列數(shù)據(jù)進一步確證其結構特征1H HMR(CDCl3)8.24(d)，7.45(d)，4.94(s)，4.35-4.10(m)，3.79(s)，3.75-1.84(m)，1.34-1.22(m)，13C NMR(CDCl3)174.3，173.8，173.6，171.5，147.6，138.9，131.5，123.4，64.8，61.5，61.4，60.2，55.4，55.0，53.1，52.9，52.7，52.4，51.9，51.7，48.8，48.3，44.9，19.1，14.1。
實施例2α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的制備將300mg(0.478mmol)的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，-甲基，三乙酯(按實施1的方法制備)溶于30ml6N HCl中，將混和物回流加熱過夜。在回流的終點，將溶液在70℃下真空濃縮得到黃色固體。將此固體溶于3ml水中，過濾，蒸發(fā)濾液得到253mg(0.378mmol，79%)的粗產(chǎn)物。用制備性TLC〔硅膠，在20%NH40AC/CH3OH(wt/v)中展開〕提純該產(chǎn)物，產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質譜(〔M+H〕+＝526)證實，并通過下列數(shù)據(jù)進一步確證其結構特征
1H NMR(D2O)8.21(d)，7.42(d)，4.83(s)，3.83-2.19(m)，1.92(s);
13C NMR(D2O)175.0，173.6，171.8，167.0，166.3，146.9，138.3，130.1，123.0，62.2，54.0，53.0，52.2，50.4，97.3，46.8，44.8，42.8，20.0。
實施例3α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(BA-DOTA)的制備方法A用Adams催化劑(PtO2)和基本定量的氫氣進行四酸(按實施例2的方法制備)的硝基的催化氫化得到標題產(chǎn)物。產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質譜(〔M+H〕+＝496)和陰離子交換HPLC(在Q-SepharoseTM)證實，并通過下列數(shù)據(jù)進一步確證其結構特征1H NMR(D2O)8.12(d)，7.86(d)，5.66(s)，4.73-4.57(m)，4.27-3.78(m)，3.39-2.91(m);
13C NMR(D2O)176.54，176.52，176.46，141.1，128.9，120.9，112.5，65.0，55.9，55.7，53.6，49.7，49.5，49.3，45.7，45.4，44.9，44.6，41.4。
方法B此化合物合成的另一方法，是將實施例D的單酯四胺化合物轉化為-酸四胺化合物(6N HCl，回流過夜)，接著用溴乙酸含水的烷基化，然后將硝基還原成氨基(PtO2催化劑)得到上述等同的產(chǎn)物。
實施例4α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，-三乙酸的制備將2.0g(5.48mmol)的單酯三胺化合物(按實施例D的方法制備)溶于60ml的6NHCl中。將混合物加熱至95℃過夜(大約10小時)，在75℃下真空濃縮混合物得到2.53g(5.11mmol，96%)的一酸四胺四鹽酸化物，為黃色固體。
將上述的-酸四胺四鹽酸化物(0.5g，1.0mmol，溶于15ml水中，用NaOH調PH為9。另外制備溴乙酸溶液(0.71g，5.13mmol)并將它加到-酸四胺水溶液中。再調溶液的PH至9，在反應過程中通過加入少量1.0N NaOH保持溶液的PH為9。一邊反應中進行攪拌，一邊在不同的時間除去等份試樣，用陰離子交換HPLC監(jiān)測烷基化的進程。當二烷基化產(chǎn)物的量(出現(xiàn)的三乙酸鹽的基總量)達到最大值時，將全部反應混合物冷凍干燥得到黑色固體。用硅膠色譜法(用溶劑體系1)純化這個烷基化產(chǎn)品的混合物，接著用制備型陰離子交換色譜法(用0-100%的1M NH4OA(梯度洗脫)，然后用制備型TLC板(用溶劑體系4展開)，最后用硅膠色譜法(用溶劑體系4洗脫)提純烷基化產(chǎn)物的粗混合物。用這種徹底的純化方法得到30mg(0.06mmol，6.0%)的標題產(chǎn)物，為黃色固體。產(chǎn)物的特征可由快速原子轟擊質譜(〔M+H〕+＝468)和陰離子交換HPLC證實，并通過下列數(shù)據(jù)進一步確證其結構特征1H NMR(D2O)8.12(bs)，7.35(bs)，4.76(s)，3.57-3.44(M)，2.97-1.83(m)，1.80(s)。
13C NMR(D2O)181.75，180.68，179.00，175.37，147.70，141.22，133.08，123.53，68.44，59.72，56.00，52.80，49.96，49.29，47.86，45.36，44.26，42.78，42.25，23.72。
實施例5α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸五鹽酸化物和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-三乙酸五鹽酸化物的制備。
按照實施例4所述方法制備烷基化產(chǎn)物的粗混合物。用硅膠柱以20%NH4OAC/CH3OH(wt∶v)洗脫進行色譜分離粗混合物。合并由柱中得到的適宜餾分，蒸發(fā)至干燥。將含有大量NH4OAC的粗產(chǎn)物溶于80ml的NANO PureTM水中，冷凍干燥得到淺棕色固體。將該固體溶于20ml NANO PureTM水中，用PtO2作催化劑通H2，振蕩直到停止吸收氫氣。真空過濾分離催化劑，冷凍干燥濾液得到黃色固體。將該固體溶于3ml溶劑體系4，用溶劑體系4在硅膠上進行色譜分離。匯集起來的餾分真空汽提，冷凍干燥得到779.6mg淺黃色固體。13C NMR和質子NMR表明該產(chǎn)物內兩種可能的幾何異構體50/50的混合物。這種異構體混合物與過量HCl接觸并冷凍干燥得到548，4mg(61%產(chǎn)率)的標題產(chǎn)物。M.P.＞270℃。陰離子交換色譜(HPLC體系Ⅲ)顯示一大峰(＞94%純度);快速原子轟擊質譜表明幾何異構體的〔M+H〕+＝438。
實施例6α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，1，4，7，10-四甲酯的制備將1.71g(12.34mmol)無水碳酸鉀在劇烈攪拌下加到1.43g(3.63mol)的α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯(按實施例B的方法制備)的40ml氬吹洗的乙腈溶液中。將1.78g(11.61mmol)的溴乙酸甲酯加到反應混合物中，然后將反應混合物在大約25℃下攪拌48小時。TLC分析表明形成了新產(chǎn)物(Rf-0.62，溶劑體系2)。將6.0g閃硅膠加到漿液中，用旋轉式蒸發(fā)器除去乙腈。將得到的產(chǎn)物加至1英吋×16英吋硅膠柱中，用5%甲醇的氯仿溶液予洗脫，用大約400ml的所制備的溶液洗脫一些非極性雜質和未反應的烷基化劑。然后使用溶劑體系2，收集，合并，蒸發(fā)含產(chǎn)物的餾分(Rf＝0.62)得到2.1g(3.44mmol，95%)的標題產(chǎn)物，為灰黃色玻璃體。1H NMR表明該產(chǎn)物為構象或幾何異構體的2∶1的混合物。
1H NMR(CDCl3，50℃)8.137(d)，8.128(d)，7.398(d)，7.385(d)，3.82(s)，3.76(s)，3.75(s)，3.74(s)，3.68(s)，1.5-3.52(m);
13C NMR(CDCl3，50℃ 75MHz)175.8，174.2，174.1，174.0，149.0，129.5，129.3，123.6，60.1，55.1，52.8，52.7，52.6，52.4，52.2，52.1，52.0，51.2，51.1，51.0，49.1，48.8，47.5，45.2，34.2，32.6。
實施例7α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，1，4，7，10-四甲酯將1.41g(2.31mmol)的α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10四乙酸1，4，7，10-四甲酯(按實施例6的方法制備)通氮氣下溶于含400mg 10%鈀/碳催化劑25ml的甲醇中。在一大氣壓下用過量氫氣吹洗溶液三小時。TLC表明形成了水合茚三酮強陽性的產(chǎn)物(RJ＝0.62，溶劑體系2)。通過硅藻土(Celite)過濾甲醇的催化劑漿液，蒸發(fā)溶劑得到標題產(chǎn)物1.21g(2.08mmol，91%)，為白色固體玻璃狀(為2∶1的構象異構體的混合物)。通過閃色譜以10%甲醇的氯仿溶液洗脫從大量的異構體中分離出小量的構象或幾何異構體，得到標題產(chǎn)物，為灰白色粉末(MP＝89-95℃)，其結構特征為1H NMR(CDCl3，50℃)6.94(d)，6.89(d)，6.69(d)，6.66(d)，3.91(s)，3.80(s)，3.78(s)，3.74(s)，3.73(s)，3.72(s)，3.71(s)，1.5-3.5(m);
13C NMR(CDCl3，50℃，75MHz)176.1，174.0，173.9，172.2，170.4，169.6，144.2，144.1，130.6，130.5，129.5，129.1，115.9，115.8，62.6，58.7，55.1，54.3，52.7，52.5，52.3，52.2，52.1，52.0，51.9，51.8，51.7，50.2，50.0，47.3，44.7，32.8，31.8，30.0，25.2;
快速原子轟擊質譜，m/e 602〔M+Na+〕，618〔M+K+〕+，〔624M+2Na+-H+〕+實施例8α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(PA-DOTA)的制備將1.5g(2.59mmol)的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，1，4，7，10-四甲酯(按實施例7的方法制備的粗的2∶1混合物)溶于50ml濃鹽酸中。將反應混合物在大約105℃下回流六小時。TLC分析(溶劑體系1)表明該酯(Rf＝0.88)轉化為標題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽(Rf＝0.43)。用旋轉式蒸發(fā)器除去過量溶劑，干燥得到的白色固體。得標題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽，產(chǎn)量為1.6g，其結構特征為1H NMR(D2O，PD＝1.0，90℃)7.48(d)，7.42(d)，2.8-4.3(m)，2.23(m)，2.03(m);
13C NMR(D2O，PD＝1.0，90℃，75MHz)176.4，174.9，171.6，144.7，132.9，132.8，130.4，125.7，61.7，56.8，56.0，53.7，53.1，51.6，47.9，34.3，37.6，快速原子轟擊質譜m/e524〔M+H〕+，546〔M+Na〕+，568〔M+2Na+-H+〕+使用閃色譜法和溶劑體系1從標題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽中除去酯的任何微量的雜質。該1.10g標題產(chǎn)物的鹽酸化物鹽加至1英吋×23英吋閃蒸硅膠柱中，合并僅含標題產(chǎn)物的混合銨鉀鹽的餾分得到580mg。HPLC分析表明產(chǎn)物在230和254nm區(qū)域純度大于98%面積。
快速原子轟擊質譜，m/e562(M+K)+，584〔M+K++Na+-H+〕，600〔M+2K+-H+〕+。
實施例9α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-三乙酸，混合銨，鉀鹽的分離。
將含有四和三酸的粗溶液(2.05g)(按實施例8的方法制備，溶于少量的溶劑體系1中，并將溶液加至12英吋×3英吋的閃色譜硅膠柱中，用同樣溶劑預洗脫。收集含標題產(chǎn)物(Rf＝0.63用溶劑體系1)的洗脫餾分，得到200mg的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸，混合銨鉀鹽。1H和13C NMR分析表明該三酸為對稱異構體(1，4，10-三酸位置異構體)1H NMR(D2O，PD＝0.5用DCl，T＝90℃)7.52(d)，7.46(d)，3.60(m)，3.54(m)，3.19(m);
13C NMR(D2O，PD＝0.5，T＝90℃)176.1，170.2，140.0，132.7，131.1，126.1，57.6，57.2，56.1，54.9，53.2，51.5，51.2，31.2。
快速原子轟擊質譜，m/e466〔M+H+〕+，488〔M+Na+〕+，504〔M+K+〕+，526〔M+K++Na+-H++〕，542〔M+2K-H〕+實施例10α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，四甲酯的制備將溴乙酸甲酯(565μl，5.97mmol)加到攪拌的α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷，1-乙酸，甲酯(580mg，1.47mmol)(按實施例N的方法制備)和粉狀碳酸鉀(1.15g，8.32mmol)的乙腈(20ml)溶液的混合物中。將反應混合物在室溫下攪拌2小時。然后過濾混合物，真空濃縮濾液得一油液。用色譜法(硅膠，8%甲醇的二氯乙烷溶液)提純粗產(chǎn)物。得到標題產(chǎn)物，為黃色固體(469mg，52%)，TLC Rf＝0.4(硅膠，10% CH3OH的CHCl3溶液)，產(chǎn)物的進一步結構特征為13C NMR(CDCl3)173.2，172.6，161.2，139.1，125.1，124.6，120.5，110.7，57.0，55.6，53.5，52.6，51.3，50.8，46.8，46.0，44.0。
實施例11α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸的制備將α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，四甲酯(按實施例10的方法制備)的濃鹽酸(5ml，J.T.Baker ULTREX)溶液通氮氣回流5小時。然后真空濃縮溶液至干燥得到固體殘余物。用色譜法(硅膠，溶液體系6)提純該固體得到標題產(chǎn)物，為灰白色固體(209mg)。將這種物質轉化為四鹽酸化物鹽，其結構特征為13C NMR(D2O-DCl，80℃)
171.0，166.9，161.2，139.0，125.5，119.3，110.7，56.8，54.5，52.7，51.0，49.2，49.0，46.3，42.9實施例12α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，四銨鹽將氧化鉑(20mg)加到α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(157mg)(按實施例11的方法制備)的水(20ml)溶液中。將此混合物在室溫下氫化1小時(1個大氣壓氫氣)。過濾后，用色譜法(硅膠，溶劑體系5)進一步提純該物質得到標題化合物(141mg)，為灰白色的固體，其結構特征為13C NMR(D2O-DCl)175.5，172.6，172.3，159.9，128.8，127.5，124.6，123.8，115.5，61.2，58.1，57.3，55.7，53.4，51.6，49.6，47.4。
實施例131-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將100mg(0.236mmol)的1-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷四鹽酸化物鹽(按實施例J的方法制備)。260mg(1.88mmol)的碳酸鉀和108mg(0.708mmol)的溴乙酸甲酯在攪拌下加到4ml氬吹洗的乙腈中，將混合物在25℃下攪拌48小時。然后將含溶液的鹽加至1cm×4cm閃蒸硅膠柱中，用乙腈洗脫。合并含有所要產(chǎn)物的餾分，并用旋轉式蒸發(fā)器除去溶劑，得到65mg(0.132mmol，56%)的標題產(chǎn)物，其進一步的結構特征為1H NMR(CDCl3)7.29(d)，6.75(d)，4.62(s)，4.20(寬s)，3.70(s)，3.69(s)，3.64(s)，3.62(t)，3.27(s)，3.06(t)，2.82(寬t)，2.79(寬t);
13C NMR(CDCl3，75MHz)171.4，171.0，148.4，132.8，117.5，115.0，55.9，55.3，54.7，53.1，51.7，51.4，50.6，50.5，47.4。
實施例141-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，鹽酸化物鹽的制備將42mg(0.085mmol)的1-(4-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯(按實施例13的方法制備)的2ml6N鹽酸溶液2小時內加熱至80℃。TLC分析表明有幾種產(chǎn)物(對于所要的標題產(chǎn)物來說Rf＝0.60，溶劑體系1)，除去溶劑得到41mg粗標題產(chǎn)物。
實施例151-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將3.17g無水碳酸鉀在烈烈攪拌下加到2.24g(6.97mmol)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10四氮雜環(huán)十二烷(按實施例G的方法制備)的75ml氬吹洗的乙腈溶液中。然后在5分鐘內將3.20g(20.9mmol)溴乙酸甲酯滴加到此反應混合物中。將反應混合物通氬氣攪拌17小時。TLC分析表明起始原料(Rf＝0.73，溶劑體系1)轉化為新產(chǎn)物(Rf＝0.46，溶劑體系1)。將70ml氯仿加到溶液中，然后將有懸浮鹽的溶液加至1英吋×7英吋閃色譜硅膠柱中。用10%甲醇的氯仿溶液洗脫產(chǎn)物，得到2.95g標題產(chǎn)物，為淡黃色油液，真空干燥該油液形成易碎的玻璃狀物(78%)，標題產(chǎn)物的結構特征為1H NMR(CDCl3)8.17(m，m)，7.4-7.66(m)，2.38-3.95(m)。
13C NMR(CDCl3，75MHz)171.5，171.2，146.7，144.5，130.3，123.9，56.0，55.2，53.5，53.4，52.6，51.9，51.8，50.6，48.1，29.5。
實施例161-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將2.8g(5.18mmol)粗的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯(按實施例15的方法制備)溶于50ml甲醇中。10%鈀/碳催化劑(600mg)加入到在氮氣吹洗攪拌過的溶液中。在氮氣氛中放置溶液，然后用氫氣(1atm，20-25℃)吹洗攪拌的溶液2.5小時。再用氮氣吹洗溶液幾分鐘，通過硅藻土短床過濾除去催化劑。TLC分析(10%甲醇的氯仿溶液)表明為標題產(chǎn)物(Rf＝0.14)。用氯仿從硅膠中洗脫標題產(chǎn)物得到2.2g(4.33mmol，83%)，為白色玻璃狀，其結構特征為1H NMR(CDCl3)7.03(d，m)，6.63(d)，3.4-3.6(m)，2.7-3.2(m);
13C NMR(CDCl3，75MHz)171.4，171.2，145.6，129.7，125.6，115.5，55.9，54.4，54.3，53.0，52.8，51.8，51.6，50.3，47.8，28.6;
快速原子轟擊質譜，m/e508〔M+H+〕+。
實施例171-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸鹽酸化物鹽(-EA-DO3A)的制備將850mg(1.69mmol)的1-〔2-4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯(按實施例16的方法制備)溶于30ml濃鹽酸中。在70-80℃下攪拌溶液2.5小時，然后攪拌冷卻溶液至25℃，繼續(xù)攪拌大約18小時。減壓下(10mm，75℃)用旋轉式蒸發(fā)器除去溶劑。通過真空干燥(10-1mm，45℃)從所得的清亮油液中除去溶劑化物和過量的鹽酸。得到標題產(chǎn)物，為白色固體，產(chǎn)量為890mg，(RJ＝0.46，溶劑體系2)，其進一步的結構特征為1H NMR(D2O，PD＝1.9，T＝90℃)7.50(d)，7.41(d)，4.26(s)，3.43-3.68(m)，3.0-3.3(m)13C NMR(D2O PD＝1.9，T＝90℃)176.7，170.9，139.8，133.0，131.2，125.9，57.5，57.1，55.4，54.4，52.7，51.0，50.6，31.3;
快速原子轟擊質譜，m/e466(M+H+)，488〔M+Na+〕，510〔M+2Na+-H+〕+。
使用10cm Partisil-5 OD53 RACⅡ反相柱的HPLC分析表明區(qū)域性純度(254mm)大于92%。洗脫液為10%乙腈的0.05M PH＝7.0的磷酯鉀溶液。
實施例181-〔2-(4-異硫氰酸根合苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(SCN-EA-DO3A)的制備在通氮氣并攪拌下將1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸鹽酸化物鹽(按實施例17的方法制備，106mg，0.21mmol)溶于2ml水中。慢慢加入碳酸氫鈉(105.6mg，1.26mmol)防止二氧化碳釋出起泡(所得PH＝8.0)。加入硫光氣(16.8μl，0.22mmol)并劇烈攪拌1小時后，TLC分析(20%乙腈水溶液)表明起始原料(Rf＝0.12)已轉化為標題產(chǎn)物(Rf＝0.26)。用旋轉式蒸發(fā)器從粗產(chǎn)物中除去溶液得到130mg含氯化鈉的標題產(chǎn)物。此物質的紅外分析(KBr片)證實有異硫氰酸鹽的部分(SeN＝2150cm-1)存在。
實施例191-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，三乙酯的制備將496μl(4.5mmol)溴乙酸乙酯一次加到攪拌的含有395mg(1.12mmol)的1-〔2-(4-硝基苯基)-乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(按實施例G的方法制備)和1.5g(11mmol)K2CO3的5ml乙腈溶液中。在68℃下通氮氣加熱1小時后過濾所得的懸浮液。用CH3CN(2×10ml)洗滌濾餅，濃縮濾液得到粗產(chǎn)物，為粘性油液，用30ml二乙酯研制油液，濃縮得到650mg(100%產(chǎn)率)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，三乙酯，其結構特征為1H NMR(CDCl3)8.2(d)，7.6(d)，4.3(q)，2.6-3.8(m)，1.55(t);
快速原子轟擊質譜〔M+H〕+＝588。
實施例201-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將59μl NaOH(50%wt/wt，3eq)加到200mg(0.35mmol)的1-〔2-4-硝基苯基)乙基〕-11，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，三乙酯(按實施例19的方法制備)的15ml水懸浮液中，在80℃下攪拌混合物6小時，然后將得到的均勻橙色溶液冷卻至室溫，并冷凍干燥得到褐色固體，使用線性梯度的0-10%HOAC水溶液通過HPLC(Q-SepharoseTM，HPLC體系Ⅲ)在60分鐘內提純褐色固體得到(產(chǎn)率50%)水解了的產(chǎn)物1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，其結構特征為1H NMR(D2O)8.22(d)，7.55(d)，3.60-3.90(m)，3.10-3.40(m)實施例211-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，(EA-DO3A)的制備將214mg(0.43mmol)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(按實施例20的方法制備)和40mg10%Pd/C的50ml水溶液置于帕爾-氫化器中。振蕩該懸浮液直至停止吸收氫氣。過濾后，冷凍干燥水溶液得到197mg(98%)1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，為棕黃色固體，其結構特征為1H NMR(D2O)7.35(d)，7.20(d)，3.10-3.70(m);
13C NMR(D2O)173.85，172.50，137.90，131.90，130.22，121.55，56.25，55.14，54.42，50.12，49.65，49.31，31.00實施例221-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，4，7，10-三甲酯的制備將1.6g溴乙酸甲酯(11mmol)一次加到含有1.0g的1-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(3mmol)(按實施例E的方法制備)的攪拌的乙腈溶液(20ml)中，1小時后加入碳酸鉀(0.3g)，在室溫下繼續(xù)攪拌12小時。然后過濾反應混合物并真空濃縮濾液。得到的殘余物進行色譜柱分離(硅膠，CH3CN/CH3OH，9∶1，V∶V)得到三酯，為白色固體，濃縮后產(chǎn)率為68%，其進一步的結構特征為1H NMR(CDCl3)8.19(d)，8.14(s)，7.18(d)，2.58-3.99(m);
13C NMR(CDCl3)
173.53，172.83，164.59，142.28，128.51，127.69，126.49，112.30，57.25，56.90，55.03，54.21，53.06，52.09，52.00，51.54，50.68，50.30，49.85，49.63，49.31，49.00，48.68，48.37，48.05，47.70，47.39。
實施例231-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將含有0.25g的1-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸4，7，10-三甲酯(0.45mmol)(按實施例22的方法制備)的6M鹽酸溶液(3ml)在100℃熱并攪拌24小時。冷卻至室溫后，加入5ml水，冷凍干燥水溶液得到棕黃色固體，接著進行柱色譜分離(硅膠，溶劑體系5)得到三酸，產(chǎn)率為60%，為灰白色固體，MP＝228-230℃(dec)，其進一步的結構特征為1H NMR(D2O)8.18(d)，8.09(s)，7.12(d)，3.87(s)，2.10-3.60(m)13C NMR(D2O)180.45，179.80，163.66，140.22，128.60，126.24，122.66，111.50，59.91，59.06，56.44，52.75，50.92，48.84。
實施例241-(2-甲氧基-5-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將50mg的1-(2-甲氧基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(按實施例23的方法制備)加到含50mgptO2的氮氣吹洗的水(50ml)溶液中。在帕爾彈中氫化1小時后，過濾溶液，冷凍干燥含水濾液得到苯胺衍生物，為棕黃色固體(95%產(chǎn)率)，MP＞240℃ dec，其他進一步的結構特征為1H NMR(D2O)7.54(bs)，7.21(d)，7.09(d)，7.05(s)，6.88(s)，3.84(s)，3.78(s)，2.85-3.56(m);
13C NMR(D2O)180.59，179.77，153.38，124.16，124.03，122.82，120.18，113.68，112.43，59.06，57.02，55.96，53.67，50.52，50.08，49.70，49.04，48.32。
實施例251-(2-羥基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將溴乙酸(309mg，2.2mmol)和NaOH(3.5ml，≈1M)在室溫下攪拌加到1-(2-羥基-5-硝基芐基-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷(200mg，0.62mmol)(按實施例F的方法制備)的水溶液(1ml)中。用LC(陰離子交換，Q-SepharoseTM)監(jiān)測反應進程并通過加入所需的NaOH保持PH為大約8。12小時后冷凍干燥溶液，用硅膠以溶劑體系5洗脫進行固體殘余物的(柱)色譜分離。濃縮主要的黃色餾分，并溶于H2O中，冷凍干燥得到所要的產(chǎn)物，為亮黃色粉末(150mg，49%);MP＝230-235℃(dec)，其進一步的結構特點為13C NMR(D2O)166.41，165.60，160.00，119.91，116.02，113.85，111.71，104。59，45.20，44.50，43.96，36.43。
實施例261-(2-羥基-5-氨基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸的制備將PtO2(130mg)加到1-(2-羥基-5-硝基芐基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(200mg，0.4mmol)(按實施例25的方法制備)氬氣吹洗的水溶液(25ml)中，接著通入H2(帕爾氫化器)。在黃色全部消失后，用氬氣吹洗溶液并過濾。然后冷凍干燥水溶液得到產(chǎn)物(146mg，78%)為棕黃色固體實施例27α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R.S)-乙酸-4，7，10-三(R-甲基乙酸)，1-異丙基(4，7，10-三甲酯(PN-DOTMA三甲異丙酯)的制備將1.15g(8.32mmol)無水碳酸鉀通氮氣并劇烈攪拌下加到1.00g(2.37mmol)的α-〔3-(4-硝基苯基)丙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯(按實施例P的方法制備)的35ml無水乙腈溶液中。然后加入旋光乳酸甲酯的α-苯磺酸鹽(1.79g，7.36mmol)S∶R＝98.2)，在室溫下攪拌混合物60小時。TLC分析表明形成了新產(chǎn)物(對于標題的四酯，Rf＝0.71，溶劑體系2，對于三酯，Rf＝0.89)。將得到的懸浮碳酸鹽的溶液倒入40ml氯仿中，濾去沉淀的無機鹽。除去此濾液中的溶劑，用1英吋×16英吋閃色譜硅膠柱的溶劑體系2為洗脫液色譜分離粗橙色油液兩次，得到標題產(chǎn)物，為自由和烷基化下產(chǎn)物，是四酯非對映體(1.00g，1.47mmol，62%產(chǎn)率)未拆分的混合物。
這種物質的1H NMR分析表明其含有大約0.5當量未反應的苯磺酸鹽的衍生物。在60℃氯仿中這種物質的NMR譜為不結合的1H NMR(CDCl3，60℃)7.9-8.1(m，2H)，7.2-7.4(m，2H)，5.06(m，1H)，3.4-4.0(m，9H)，1.7-3.4(m，20H)，1.0-1.7(m，15H);
IR(CDCl3)Cm-12980，2840，1725，1710(酯羰基)，1590，1510，1440，1340;
快速原子轟擊質譜，m/e702〔M+Na+〕+，687。
實施例28α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R、S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)，1-異丙基-4，7，10-三甲酯;(PA-DOTMA三甲異丙酯)的制備將含有未反應的α-〔3-(4-硝基苯基)丙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-乙酸，1-甲酯的α-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)，1-異丙酯-4，7，10-三甲酯(950mg，1.40mmol未校正)(按實施例27的方法制備)通氮氣溶于含1.0g10%鈀/碳催化劑的10ml的30%甲醇水溶液中。用過量的氫氣吹洗溶液7小時。此時TLC檢測表明有水合茚三酮試驗為強陽性的物質形成(Rf＝0.62，溶劑體系2，Rf＝0.71為起始物質)。用硅藻土過濾甲醇的催化劑漿液，并蒸發(fā)溶劑得到800mg粗標題產(chǎn)物，含有由苯磺酸酯附隨物質氫解而得的苯磺酸(Rf＝0.09溶劑體系2)的清亮油液。用1英吋×8英吋閃色譜硅膠柱色譜分離粗油液，以10%甲醇的氯仿溶液洗脫淺黃色帶為空體積。再以溶劑體系2洗脫得到標題產(chǎn)物(480mg)，產(chǎn)率52%，為未拆分的非對映和幾何異構體的混合物。在1H NMR的芳香區(qū)域內觀察到三個不同的ab四重峰1H NMR(CDCl3，30℃)6.63-8.0(m(四重峰)，4H)，5.07(m，1H，異丙基次甲基H)，3.53-3.9(m，在3.85，3.73，3.69和3.56處有四個單13H)，3.46(m，1H)，3.25(寬t，3H)，2-3.1(m，14H)，1.0-2.0(m，15H);
13C NMR(CDCl3，30℃)177.3，177，176.4，176.2，175.9，174.3，172.9，170.6，145.3，144.9，130.8，129.7，129.3，129.1，128.8，128.4，127.5，126.3，115.2，115.1，114.9，69.0，68.4，67.3，61.6，57.8，57.4，56.7，56.5，56.4，52.9，52.7，52.1，50.8，507，50.6，47.3，47.1，47.0，46.9，46.5，46.3，46.1，44.8，44.5，44.3，34.1，32.9，32.5，32.2，31.8，24.8，22.2，22.1，22.0，21.8，21.6，15.8，14.9，7.7，7.5，7.4，7.1;
IR(CDCl3)Cm-12960，2840，1720，1510，1450，1375;
快速原子轟擊質譜，m/e672〔M+Na+〕+，686。
實施例29α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三(R-甲基乙酸)，(PA-DOTMA)的制備將α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)，1-異丙基-4，7，10-三甲酯(400mg，0.59mmol)(按實按例28的方法制備)的非對映的混合物溶于50ml6N濃鹽酸中，并回流30小時。TLC分析(溶劑體系1)表明酯(Rf＝0.98，溶劑體系1)轉化為兩個新斑點(Rf＝0.6，高非對映體和Rf＝0.54，低非對映體溶劑體系1，兩斑點UV，水合茚三酮和碘為陽性)。用旋轉式蒸發(fā)器除去過量溶劑并干燥后，得到標題產(chǎn)物的粗非對映體混合物(403mg)，為鹽酸化物鹽。將290mg(0.51mmol)粗鹽加至1×13Cm硅膠閃色譜柱中，以溶劑體系8洗脫進行制備標題產(chǎn)物分開的兩種非對映體。因為高Rf非對映體從柱中首先洗脫，所以得到的高Rf非對映體(119mg，0.21mmol)的純度高于低Rf非對映體(90mg，0.16mmol)。
1H NMR為高Rf非對映體1H NMR(D2O，90℃，PD＝7.5)7.12(d，2H)，6.80(d，2H)，3.66(m，1H)，3.57(寬t，3H)，2-3.4(m，19H)，1.89(m，1H)，1.37(m，1H)，1.15(d，3H)，1.10(d，3H)，1.06(d，3H)13C NMR(D2O，90℃ PD＝7.5)184.4，184.2，184.0，183.3，135.9，132.6，131.7，119.1，78.2，69.0，61.7，61.5，61.1，57.4，54.1，49.7，49.6，48.2，47.7，47.2，34.8，33.8，9.6，9.1，9.0;
快速原子轟擊質譜，m/e566〔M+H+〕+，588〔M+Na+〕+，604〔M+K+〕+，626〔M+K++Na+-H+〕+，642〔M+2K+-H+〕+。
最終產(chǎn)物的制備-配合物金屬配位體配合物可由下述的幾種方法制備。這些方法包括金屬和配位體的水溶液的混合，并調PH至所需值，配合是在含有鹽和/或緩沖劑以及水的溶液中進行。有時發(fā)現(xiàn)加熱溶液得到的配合物產(chǎn)率比在室溫下進行配合得到的產(chǎn)率高。在BFC的合成中使用污跡(work-up)表明也影響配合。
實施例30α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸銨鹽，釤(Ⅲ)配合物;Sm(BA-DOTA)的制備。
將少量試樣，53mg(0.094mmol)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(按實施例3的方法制備)溶于100μl水中，然后在PH6-7下用3ml0.043MSm(OAC)3溶液(48.8mg，0.128mmol)處理。在100℃下加熱此溶液，通過陰離子交換HPLC測定配合的程度。當通過陰離子交換色譜，HPLC體系Ⅲ，完成配合時，將配合物的溶液冷卻至室溫(大約25℃)，并冷凍干燥。用硅膠色譜(用溶劑體系1洗脫)，提純釤配合物。此方法得到標題產(chǎn)物的產(chǎn)率為82%，這種配合物的特征由TLC，快速原子轟擊質譜，陰離子交換HPLC證實，其進一步的結構特征為1H (D2O)(T＝？)8.94，7.81，7.21，6.97，6.80，5.63，5.01，4.58，4.01，3.56，1.78，1.53，1.24，1.10，0.77，-2.80，-2.95，-3.21，-3.91;
13C NMR(D2O)190.3，184.9，181.4，146.8，1134.3，122.7，116.4，80.8，72.6，64.2，57.2，55.8，54.7，53.4，51.5，49.7，45.5，43.5，23.6(5太多的碳峰)實施例31α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備通過將Sm-153溶液加到SmCl3溶液中制備150μlSm-153(3×10-4M，0.1N鹽酸溶液)和600μlSmCl3(3×10-4M)的0.1N鹽酸溶液。然后加入5.0μl2.0M NaOAC，接著加入45μl的50mM配位體(按實施例3的方法制備)的HEPES緩沖液，用275μl的0.5m HEPES調溶液的PH至7。將此溶液分為每份50μl的兩份，在100℃下加熱1小時。
將溶液通過SP-SephadexTM陽離子交換樹脂。使用以前描述的方法測定作為配合物的金屬百分比。結果表明對于加熱試樣配合物的金屬為99.6%，對于未加熱試樣為96.6%。
通過PH剖視圖確定螯合物的穩(wěn)定性金屬配位體配合物的穩(wěn)定性通過調它們的各種PH值并分析溶液中的配合物進行測定。在低PH時，配位體的質子化作用引起金屬的釋出，在高PH時，金屬氫氧化物與螯合物的形成競爭。因此，在選擇惰性螯合物時，一種所需要的惰性螯合物，應該在高和低PH值的條件下，仍然保持是一種螯合物。
使用下列實施例中所描述的方法得到本發(fā)明的一些螯合在各種PH值下的惰性剖視圖，在某些情況下，將溶液通過陽離子交換樹脂除去自由金屬。用稀釋的氫氧化鈉和鹽酸溶液調配合物溶液的PH為1至14。用以前所描述的方法測定作為配合物的百分比。
用同樣的方法制備幾種雙官能螯合物的共軛并調PH為2.8，4和6。使用放射探測器通過HPLC測定保存在溶液中的共軛的量。其結果列于實施例XX的生物學部分中。
實施例32α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性將由實施例30得到的加熱和未加熱試樣分為2×250μl等分試樣。用HCl調一份250μl等分試樣的PH值列于下表，用NaOHμl量調第二份250μl等分試樣得到所需PH值，一旦達到所需PH值，則除去25μl等分試樣，并用以前所述方法測定作為配合物的金屬的百分比，其結果如下
實施例33α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔(Ⅲ)配合物的制備。
將10μl含有1.4mg/100μl的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實施例3的步驟制備)的溶液加入到100μl的摻有Y-90的Y(OAC)3(0.003μ)的溶液中。往該溶液中再加入500μl水，隨后加入125μl的NaOAC(0.5μ)溶液。265μl水加入到該溶液中使總體積達到1ml。將這一溶液分成等量的兩份。一份加熱到100℃一小時。用前面所述的陽離子交換步驟來確定加熱和未加熱樣品中以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。測試結果表明加熱和未加熱樣品中以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)分別為84%和4%。
實施例34α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，镥(Ⅲ)配合物的制備。
將α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸溶液(用實施例3的步驟制備)溶解到蒸餾水中，達到濃度為1.63mg/ml。
將氯化镥溶解到0.1NHCl中，制得濃度為3.9mg/ml(0.01μ)的氯化镥溶液。镥-177(0.3毫摩爾)用作示蹤劑。
將體積為30μl的0.01μ的镥溶液加入到2μl的Lu-177溶液中。加入適量的上述配位體，再加入HEPES緩沖液(0.1μ，PH＝7.6)使總體積達到1.0ml。所得溶液中配位體和镥的量為0.3毫摩爾。然后將該溶液加熱到100℃一小時，用前面所述的陽離子交換方法測定作為配合物的Lu的百分數(shù)為86%。
實施例35α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將7mg，(10.8微摩爾)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物(用實施例30的步驟來制備)的樣品溶解到400μl水中。加入過量的硫光氣(50μl)，隨后再加入400μl CHCl3，兩相反應在激烈攪拌下進行30分鐘。這段時間結束時，水層用500μl CHCl3萃取4次，然后將水層凍干，定量地得到所需要的標題產(chǎn)物。
紫外光譜顯示出這種化合物在272和282nm處有一譜帶。薄層色譜，硅膠，用75∶25(V∶V)的CH3CN∶H2O展開，給出Rf＝0.38。原料具有Rf＝0.19。紅外光譜顯示出-SCN在2100Cm-1處有伸張;快速原子撞擊質譜，〔M+H+〕+＝687。
實施例36α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，銨鹽，釔(Ⅲ)配合物的制備。
將90mg(160毫摩爾)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實施例3的步驟來制備)樣品溶解到1ml水中。向這個溶液中加入3ml含有51mg(192毫摩爾)的Y(OAC)3的水溶液。然后該反應混合物，PH＝6-7，被加熱到100℃兩小時。然后所得溶液通過玻璃毛，并且凍干得到126mg的黃色固體。這種固體在硅膠上進行色譜分離(溶劑體系1)，得到71mg(76%)的所需的配合物的產(chǎn)物。陰離子交換的分析表明，其與類似物釤配合物具有相同的保留時間，標題產(chǎn)物的特征數(shù)據(jù)為13C NMR(D2O)180.8，180.5，179.9，146.1，133.4，122.0，116.1，74.9，56.3，55.8，55.4，55.1，54.8，52.2，46.0，44.0，23.6，1H NMR(D2O)6.90(d)，6.70(d)，4.40(s)，3.45-3.06(m)，2.71-2.10(m)，1.75(s)。
快速原子撞擊質譜，〔M+H+〕+＝582。
實施例37α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，鈉鹽，釔(Ⅲ)配合物的制備。
將α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔配合物(用實施例36的步驟制備)的樣品(10mg，17μmole)溶解到400μl水中。向這種溶液中加入64μl硫光氣(過量)和400μlCHCl3，所得混合物激烈攪拌40分鐘。在這段時間內分幾次少量加入固體NaHCO3以保持PH在8左右。反應結束時，分離出水層，用1ml CHCl3萃取4次，并且凍干。用薄層色譜和紫外光譜檢定標題產(chǎn)物。
實施例38α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備;NH4〔Y(PA-DOTA)〕。
通過一強陽離子交換樹脂(SP-SephadexTMC-25，Pharmacia)柱色譜將配位體α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實施例8的步驟制備)轉化成混合的質子化了的銨鹽。該柱子呈質子化了的形式，用蒸餾水洗滌。配位體的液縮的水溶液被用到柱子上，隨后用蒸餾水洗滌該柱子。用0.5M NH4OH將配位體從柱子上洗脫下來。洗脫液被濃縮至干。
將5ml Y(OAC)3·4H2O(0.0728g，0.215mmole)的蒸餾水溶液加入到溫熱的5ml混合的質子化了的銨鹽配位體(0.120g，0.215mmole)水溶液中。將溶液進行回流并用0.1MNH4OH調PH到大約7.0?；亓饕恍r后，將溶液冷卻并濃縮至干。真空條件下，在大約105℃的油浴上加熱白色固體以除去過量的NH4OAC標題產(chǎn)物(其含有大約一當量的乙酸銨)的產(chǎn)量為0.142g(94%)，并且其特征數(shù)據(jù)如下13C NMR(D2O，88℃，75MHZ)23.8，27.6，35.4，49.6，55.0，56.2，56.9，57.1，65.7，68.0，121.7，132.6，138.8，180.7，181.4，182.0，183.1，快速原子撞擊質譜，m/e610(正離子，〔M-+2H+〕+，)，608(負離子，M-)。
實施例39α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備，NH4〔Sm(PA-DOTA)〕。
重復實施例38的步驟，用Sm(OAC)3·3H2O(0.082g，0.215mmole)代替Y(OAC)3·4H2O，制備出的標題產(chǎn)物(其含有大約一當量的乙酸銨)的產(chǎn)量為0.155g(94%)，其特征數(shù)據(jù)如下13C NMR(D2O，88℃，75MHz)23.5，27.2，35.6，50.5，54.5，56.0，57.2，57.9，69.5，71.5，122.3，133.0，139.7，181.2，188.4，189.3，190.9。
快速原子撞擊質譜，m/e673(正離子，〔M-+2H+〕+，Sm同位素型式)，m/e671(負離子，M-，Sm同位素型式。)實施例40α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備，NH4〔Sm(SCN-PA-DOTA)〕。
將10ml Sm(OAC)3·3H2O(27.9mg，381.56g/mole，73.1μ mole)的蒸餾水溶液和10ml含有42mg PA-DOTA，混合的銨一鉀鹽(632.97g/mole，66.4μmole)(用實施例8的步驟制備)的蒸餾水溶液混合，并在蒸汽浴上加熱。三十分鐘后，(用實施例41中描述的方法)通過HPLC測定形成〔Sm(PA-DOTA)〕的反應已進行完全。在分離漏斗中，通過搖動使該溶液與20ml含有45.4mg CSCl2(114.98g/mole，395μmole)的氯仿溶液反應。大約一分鐘后反應進行完全，這是通過HPLC測定的，并通過當把該水溶液點樣到硅膠TLC板上時，用茚三酮(0.2%的乙醇液)陽性測示結果消失來測定，(起始螯合物，〔Sm(PA-DOTA)〕測試呈陽性)。除去氯仿層，水層用兩份20ml的氯仿洗滌。在氮氣流下，并在室溫下通過加入100ml乙腈并蒸發(fā)使水層濃縮至干，得到標題產(chǎn)物56mg。
快速原子撞擊質譜，m/e715(正離子，〔m-+2H+〕+，Sm同位素型式)，m/e713(負離子，M-Sm同位素型式)。
實施例41Y3+與PA-DOTA的螯合速率的HPLC分析。
以在PA-DOTA合成中建立使用的函數(shù)形式來研究PA-DOTA與Y3+螯合的速率。通過HPLC用-Alltech EconosphereTMC18 100mm的柱子來監(jiān)測螯合度。采用的梯度是A)95∶5，PH6.0，0.05M NaOAC緩沖液CH3CN，B)30∶70，PH6.0，0.05M NaOAC緩沖液CH3CN，A到B用15分鐘。均用實施8的步驟制備的PA-DOTA·nHCl溶液(保留時間＝1.31分)和PA-DOTA混合的銨一鉀鹽溶液(保留時間＝4.55分)，被制備成1.6mm，PH6.0，0.5MNaOAC緩沖液。兩種溶液中每一種取一毫升(1.6μmole)與0.2ml(8μmole)的Y(OAc)3·4H2O溶液(40mm的，PH6.0的0.5M NaOAc緩沖液)反應。通過在保留時間值為3.96分時的峰值的出現(xiàn)來確定螯合物的形成(通過與實施例38的樣品比較來證實)。以下示出螯合形成的結果。
很明顯，BFC的純化方法對螯合速率有影響。
實施例42α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R·S)-乙-4，7，10-三-(甲基乙)酸，釤(Ⅲ)配合物，銨鹽的制備，NH4〔Sm(PA-DOTA)〕。
將Sm(OAC)3·3H2O的溶液(13.2mg在2ml蒸餾水中)加入到α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R·S)-乙-4，7，10-三-(甲基乙)酸的溶液(30mg在2ml的蒸餾水中)中去，(用實施例29的步驟制備，高Rf的非對映體)。該PH為6.5的溶液在蒸汽浴上加熱，并用HPLC來監(jiān)測反應。加熱30分鐘后，溶液在旋轉蒸發(fā)儀上被濃縮至干，并在真空爐中干燥。
快速原子撞擊質譜，m/e715(正離子，〔M-+2H+〕+，Sm同位素型式)，737(正離子，〔M-+H++Na+〕+，Sm同位素型式)，713(負離子，(M-)，Sm同位素型式)。
在下面的例子中，配合物溶液經(jīng)過一離子交換柱除去溶液中任何過量的游離金屬。不穩(wěn)定的體系將恢復平衡，且相同量的游離金屬將存在于溶液中。惰性體系將不會達到再平衡，且游離金屬的量會減少。這樣的話既使一配合物形成的產(chǎn)率并不高，令其通過一離子交換樹脂的純化作用也能形成一可用的穩(wěn)定的無非配合金屬的配合物。
實施例43α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將5.8mg的α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實施例12的步驟制備)溶解在325μlNANOPureTM的水中制成濃度為3×10-2M的溶液。將一份10μl的這種溶液加入到990μl的摻有Sm-153的3×10-4M的溶液中。SmCl3(在0.1NHCl中)然后用NaOH調PH到7.0。這溶液被分成每份500μl的兩份，一份在100℃時加熱一小時，測試加熱和未加熱的兩個樣品，用前面所述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。然后將該溶液通過SP-SephadexTM樹脂。用純化的樣品再測一次其配合程度。結果示于下表中
實施例44α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
實施例43中的加熱和未加熱的純化后的樣品分別都分成2×250μl的兩份。一份用HCl調節(jié)，另一份用NaOH調節(jié)，分別都達到下表中所表示的PH值。達到了欲期的PH值后，讓樣品保持10分鐘，用前面所述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的量。其結果示于下表中
實施例45α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備將7.9mg的α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(用實施例11的步驟制備)溶解在464μlNANO PureTM的水中制成濃度為3×10-2M溶液。將一份10μl的這種溶液加入到950μl的摻有Sm-153的3×10-4M的溶液中。SmCl3(在0.1NHCl中)然后用NaOH調PH到7.0。這種溶液被分成每份為500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時。測示加熱和未加熱的兩個樣品，用前面所述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。然后將這些溶液通過SP-SepnadexTM樹脂。然后采用前面描述的一般方法測定純化了的樣品的配合程度。其結果示于下表中
<p>實施例46α-(2-甲氧基-5-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
實施例45中的加熱和未加熱的經(jīng)純化的樣品分別被分成二份。一份用稀釋的HCl調節(jié)，另一份用NaOH來調節(jié)，使PH值達到下表中所示之值。欲期的PH達到后，將樣品保持10分鐘，然后用前面所述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的量。其結果示于下表中 實施例47α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
使0.0219M(100μl，2.195mmole)的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(用實施例4的步驟制備)的溶液與0.043M(25μl，1.075mmole)的Sm(OAc)3的溶液接觸。反應混合物經(jīng)陰離子交換的HPLC處理(Q-SepharoseTM柱子，1cm×25cm，流速＝2ml/min，用0-1M的NH4OAc洗脫，梯度超過30分鐘)。一小時后，配合物(保留時間＝11.1分鐘)以77%的產(chǎn)率形成(面積百分比)，并且從配位體峰(保留時間＝15.5分鐘)可被完全分辨出來。標題配合物已形成的進一步的證據(jù)是由硅膠TLC(溶劑體系4)得到的，其中配位體有Rf＝0.59，配合物有Rf＝0.00。
實施例48α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
使0.022M(100μl，2.2μmole)的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(用實施例5的步驟制備)溶液與0.043M(6.4μl，0.275mmole)的Sm(OAc)3溶液接觸。反應混合物經(jīng)陰離子交換的HPLC處理(Q-SepharoseTM柱子，1cm×25cm，流速＝2ml/分鐘，用0-0.25M NH4OAc洗脫，梯度超過30分鐘)。40分鐘后，配合物(保留時間＝9.0分鐘)以66%的產(chǎn)率形成(面積百分比)，并且從配位體峰(保留時間＝18.5分鐘)可被完全分辨出來。
實施例49α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將4.2mg的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸五鹽酸鹽和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸五氯化物(用實施例5的步驟制備)溶解在300μl NANOPureTM的水中制成濃度為3×10-2M的溶液。將一份10μl的該溶液加入到15μl的摻有Sm-153的2×10-2M的SmCl3(0.1NHCl液)中，通過加水使體積達到1ml。然后用NaOH調PH到7.0。該溶液被分成分別為500μl的兩份，一份在100℃時加熱一小時。
測示加熱和未加熱的兩個樣品，用前面描述的陽離子交換的方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。其結果表明對于加熱的和未加熱的樣品，其以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)分別為89%和96%。
實施例50α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物，和α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
將實施例49中的加熱的和未加熱的樣品都分成兩份。一份用HCl，另一份用NaOH調到PH到下表中所示出的PH值。一但達到所期望的PH，即將樣品保持10分鐘，然后用前面描述的陽離子交換的方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。下表中表示出了其結果
實施例51α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將13μl 2×10-2M的α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸(用實施例4的步驟制備)溶液，15μl的SmCl3(0.02M 0.1NHCl)和2μl的Sm-153合并，用NANOPureTM水使體積達到1ml。用NaOH調PH到7.0。該溶液被分成各500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時。測示加熱和未加熱的樣品用前面所述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。結果表明對于加熱的和未加熱的樣品，以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)分別為74%和42%。
實施例52α-(4-硝基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
實施例51中的加熱的樣品被分成二份。一份用HCl調節(jié)，另一份用NaOH調節(jié)，使其PH值達到下表中所給出的PH值。予期的PH值達到后，將樣品放置十分鐘，用前面描述的陽離子交換的方法測定以配合物形式存在的金屬的量。下表中給出了其結果 實施例531-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，镥(Ⅲ)配合物的制備。
將EA-DO3A(用實施例17中的步驟制備)固體溶解于水中制備成溶液。最終的濃度為0.01M。
將氯化镥溶解于0.1N HCl中制備成氯化镥溶液。最后的濃度為含氯化镥3.9mg/ml(0.01MLu)。镥-177被用作示蹤劑。
將30μl0.01M的Lu溶液加入到2μl的Lu-177溶液中。加入30μl的配位體溶液然后加入HEPES緩沖劑(0.1M，PH＝7.6)，使總體積達到1.0ml。最終的溶液對配位體和镥來說是0.3mm。
用前面所述的陽離子交換方法測定的以配合物形式存在的Lu的量為98%。
實施例541-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釔(Ⅲ)配合物的制備〔Y(EA-DO3A)〕。
通過強陽離子交換樹脂(SP-SephadexTMC-25，Pharmacia)柱色譜將配位體1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實施例17的步驟制備)轉化成混合的質子化了的銨鹽。色譜柱處于質子化的形式，用蒸餾水洗滌。將濃的配位體水溶液加到柱中，隨后用蒸餾水洗滌柱子，用0.5M的NH4OH從柱子上將配位體洗脫下來。在旋轉蒸發(fā)儀上將洗脫液濃縮至干，并在蒸空爐中將其干燥。
將10ml Y(OAc)3·4H2O(0.203g，338.101g/mole，0.600mmole)的蒸餾水溶液加到溫熱的10ml混合的質子化了的銨鹽配位體(0.300g，499.615g/mole，0.600mmole)的蒸餾水溶液中。將該溶液進行回流，并用0.1MNH4OH調PH到大約7.0?；亓魇宸昼姾?，將該溶液冷卻，并在旋轉蒸發(fā)儀上濃縮至干。真空條件下，在大約105℃的油浴上通過加熱白色固體將過量的乙酸銨除去。得到標題產(chǎn)物(其含有大約一當量的乙酸銨)373mg(99%)，并由以下數(shù)據(jù)來確定
13C NMR(88℃，D2O，75MHz)24.4，28.4，51.2，56.5，57.2(2c)，57.7，67.2，67.6，120.5，132.3，135.2，182.1，182.5，183.0;
快速原子撞擊質譜，m/e552(正離子，〔M+H+〕+)，m/e610(負離子，〔M+OAc-〕-)。
實施例551-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤配合物的制備〔Sm(EA-DO3A)〕。
重復實施例54的步驟，用Sm(OAc)3·3H2O(0.229g 381.531g/mole，0.600mmole)代替Y(OAc)3·4H2O，制備出標題產(chǎn)物(其含有約一當量的乙酸銨)408mg(99%)，并用以下數(shù)據(jù)來確定13C NMR(88℃，D2O，75MHz)23.8，27.9，51.4，57.5，58.1(3c)，68.7，73.4，120.3，132.2，134.7，185.0，186.8，192.1;
快速原子撞擊質譜，m/e615(正離子，〔M+H+〕+，Sm同位素形式)，m/e673(負離子，〔M+OAc-〕-，Sm同位素型式)。
實施例561-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將10μl1.48mg/100μl(0.03M)的1-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實施例20的步驟制備)的溶液加入到15μl摻有Sm-153的SmCl3溶液(0.02M的0.1NHCl溶液)中，加入NANO PureTM水使體積達到1ml。這種溶液被分成500μl的兩份，將一份在100℃加熱一小時，測試加熱和未加熱的樣品，用前面描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。結果表明對于加熱的和未加熱的樣品，以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)分別為81%和43%。
實施例571-〔2-(4-硝基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
將實施例56的加熱的樣品分成兩份。一份用HCl調節(jié)，另一份用NaOH調節(jié)，以達到下表中所示出PH值。所期望的PH達到后，將樣品放置十分鐘，然后用前面所述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的量。下表中示出了其結果。
實施例581-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將3μl4.65mg/100ml的1-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(由實施例20的步驟制備)溶液加入到15μl摻有Sm-153的SmCl3(0.02M的0.1N HCl溶液)溶液中。用NANOPureTM水使體積達到1ml。用NaOH將溶液的PH值調節(jié)到7.3。該溶液分成兩份，一份在100℃加熱一小時。測試加熱和未加熱的樣品，用前面描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。結果表明加熱的和未加熱的樣品中以配合物形式存在的金屬百分數(shù)分別為96%和93%。
實施例591-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性。
將實施例58的加熱的和未加熱的樣品均分成兩份。每一樣品的其中一份用HCl調節(jié)，另一份用NaOH調節(jié)以達到下表中示出的PH值。達到希望的PH值后，將樣品放置十分鐘，然后用前面描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的量。下表中示出了其結果 實施例601-(2-羥基-5-硝基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備。
將3.9mg1-(2-甲氧基-5-硝基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實施例25的步驟制備)溶解在260μlNANOPureTM水中，制成3×10-2M的溶液。將一份10μl這種的溶液加入到15μl摻有10μl Sm-153的0.1N HCl溶液(3×10-4M)2×10-2M SmCl3的溶液(水溶液)中。加入965μl DI水使體積達到1ml。然后用NaOH調節(jié)PH到7.0。將這個溶液分成500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時。測試加熱和未加熱的樣品，用前面描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。結果表明加熱的和未加熱的樣品中以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)分別為71%和74%。
實施例611-(2-羥基-5-硝基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH值穩(wěn)定性。
實施例60的加熱的和未加熱的樣品都被分成250μl的兩份。一份用HCl調PH，另一份用NaOH來調節(jié)PH值以達到下表中示出的PH值。達到期望的PH值后，將樣品放置十分鐘，然后用前面所描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的量。結果示于下表中
實施例621-(2-羥基-5-氨基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的制備將3.2mg的1-(2-羥基-5-氨基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸(用實施例26的步驟制備)溶解于100μl NANO PureTM水中制備成3×10-2M的溶液。將一份10μl的這種溶液(稀釋到20μl)加入到15μl摻有Sm-153的2×10-2M SmCl3(水溶液)的溶液中。加入950μl DI水和20μl 0.1N NaOH使體積達到1ml。這種溶液被分成500μl的兩份，一份在100℃加熱一小時。測試加熱的和未加熱的樣品，用前面所描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。當被配合的金屬少于95%時，將該溶液通過SP-SephadexTM樹脂。再測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。其結果示于下表中 實施例631-(2-羥基-5-氨基苯甲基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤(Ⅲ)配合物的PH穩(wěn)定性將實施例62的加熱的和未加熱的經(jīng)色譜純化的樣品分別分成兩個250μl的份，一份用HCl調節(jié)，另一份用NaOH調節(jié)以達到表中所示的PH值。當希望的PH值達到后，將樣品放置10分鐘，然后用前面描述的陽離子交換方法測定以配合物形式存在的金屬的百分數(shù)。下表中示出了其結果 我們已知道，在一些分子內具有金屬螯合基團如DTPA和反應活性的連接基(芳胺)的雙官能螯合劑能夠共價連接到各種對癌或腫瘤細胞抗原決定基或抗原具有特性的直接的生物分子靶上。這種共軛物的放射性核素配合物在診斷和/或治療的應用上是有效的，是輸送放射性核素到癌或腫瘤細胞上的一種手段?！矃⒖?，Meares等人，Anal.Biochem.142，68-78，(1984);也參看討論部分，P215-216，J.Protein Chem.，3(2)(1984)，Meares和Goodwin;最近的參考文獻是Meares，美國專利4，678，677，1987.7.7發(fā)行，Warshawsky等人，美國專利4，652，519，1987.3.24.發(fā)行，和Brechbiel等人，Inorg.Chem.，25，2772-2781(1986)〕。可以想象到，使用了放射活性的或發(fā)光的金屬的產(chǎn)物，也可被用于體外免疫檢定。
標記抗體的應用決定于一些因素，例如1)抗體的特性，2)在應用條件下配合物的惰性或穩(wěn)定性(即，血清穩(wěn)定性)，3)標記技術，即整個抗體可以具有同天然分子一樣的特性和免疫反應性。
對于放射核素抗體共軛物用作診斷和/或治療試劑的效果，其配合物的穩(wěn)定性或惰性是極為重要的。動力學的不穩(wěn)定性可能導致不穩(wěn)定性，例如，在血清中，以及放射性核素從配合物上的離解作用。這樣，便降低了診斷和治療的效果。另外，也形成了對于正常組織的一般放射性損害的巨大潛在性〔Cole等人，J.Nucl.Med.，28，83-90(1987)〕。
放射性核素向抗體的結合可以采用兩種方法進行，或者通過現(xiàn)有技術中已知的步驟使BFC連接到抗體上，然后在與抗體相配伍的條件下進行放射性核素的螯合。或者，將抗體共軛到已成型的(室溫或高溫)金屬-BFC配合物上。〔Meares等人，Acc.Chem.Res.17，202-209(1984)〕。后面將提供實施例。
實施例ZA(比較例)1-(4-異硫氰酰苯甲基)-二亞乙基三胺五乙酸，釤-153配合物向CC-49的IgG和F(ab′)2的共軛;〔153Sm(SCN-Bz-DTPA)〕-IgG和〔153Sm(SCN-Bz-DTPA)〕-F(ab′)2片段。
通過將150μl153Sm的0.1N HCl溶液與9μl的1-(4-異硫氰酰苯甲基)二亞乙基三胺五乙酸混合，再向其中加入HEPES緩沖劑(0.5M，PH8.9，大約30μl)使PH達到約6，制備成1-(4-異硫氰酰苯甲基)二亞乙基三胺五乙酸，釤-153配合物〔153Sm(SCN-Bz-DTPA)〕。為了共軛，將22.5×10-9moles的CC-49的IgG或F(ab′)2(在50mmole HEPES中，PH8.5，蛋白質濃度約為1×10-4M)與153Sm配合物混合，并加入碳酸鈉溶液(1.0M，12～15μl)調節(jié)PH到8.9。共軛作用在室溫(約25℃)下進行大約3小時。153Sm配合物標記的IgG或F(ab′)2被分離出來，并用與實施例Ⅻ中描述的相似方法進行鑒定。
實施例Ⅰ和Ⅱ及對比例A-D雙官能螯合物的體內篩選某些確定的稀土螯合物的穩(wěn)定性已在動物體內測試中得到了檢驗。例如，Rosoff等人，在the International Journal of Applied Radiation and Isotopes 14，129-135(1963)中報告了具有放射活性的稀土螯合物在鼠體中對確定的氨基羧酸的分布情況。已發(fā)現(xiàn)在體內，“螯合劑與體內成份(無機的和有機的)對稀土離子的競爭決定了它的沉積和排泄”。強的稀土螯合物被認為離解的很少而被排泄出來，而弱的或中等強度的螯合物離解迅速，被沉積在諸如肝臟等器官中。但是，放射性核素在肝臟中的濃度并不總是由于弱的配合物形成的，在一些情況下，是由于金屬螯合物對肝臟具有的親合性。事實上，螯合物早已被制備并用來評價肝臟的功能〔Fritzberg，Alan.R.，Raoliopharma CeuticalsProgress and Clinical Perspectives，Vol.1，1986;美國專利4，088，747和4，091，088〕。
實施例3化合物的釔和釤的螯合物的生物分布已被測定，且其在肝臟中的百分比劑量被用作在體內的掩蔽方法來定性地評估螯合物的穩(wěn)定性。為比較，包括了NTA和EDTA的螯合物。作為對照，也注射了釤，以未螯合的氯化釤形式。
從Charles River實驗室購進重量在150-200g的Sprague-Dawoey鼠。將這些動物放在籠中，并隨意喂以水和食物。使用前讓這些動物馴化至少五天。在注射配合物前，將動物放在熱的燈下(15-30分鐘)，使其尾端靜脈膨脹。然后將動物放在約束籠中，用酒精棉棍清潔其尾部，通過尾端靜脈向動物注射(50-200μl)。注射后，動物被放到另一籠中兩小時，在這之后，通過頸脫位使動物死去，然后將動物解剖，各部分用去離子水漂洗，輕拍至干，在一配衡的計量小瓶內稱重。制作出注射后的同一材料的至少三個標準，并以動物的組織計數(shù)。劑量百分數(shù)等于器官中的計數(shù)值除以標準中的計數(shù)值，乘以100(參看下表)。
表生物分布數(shù)據(jù) ＊配合物是按以下配位體/金屬的比例制備的，對實施例Ⅰ和Ⅱ為1∶1;對實施例A為5∶1，對實施例B和C為大約300∶1。
實施例Ⅲ和E用前面所述的方法制備1∶1的釔(摻有示蹤劑量的90Y)與實施例3中的配位體，即BA-DOTA，和EDTA(比較例E)的配合物，然后將幾份100μl的溶液轉移到離心分離管中。加入過量的Y(Ⅲ)，總體積的變化可以乎略，并且記錄時間。金屬加入一個半小時后，用前面描述的陽離子交換方法測定配合物的百分數(shù)，把這個結果與起始的配合物的量進行比較。配合物百分數(shù)與加入的金屬的比值能表示出配位體-金屬配合物的不穩(wěn)定性。表中給出了其結果。
表配合物的研究 實施例Ⅳ1-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(SCN-EA-DO3A)〕配合物向100μl153Sm的0.1N HCl溶液中加入5μl的SCN-EA-DO3A(5mM，在50mM HEPES中，PH8.2)(實施例18中制備)。該溶液在渦流混合器上混合，逐漸加入HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9)(總共大約25μl)調節(jié)PH值到7左右。通過HPLC在GF-250柱上(HPLC體系Ⅰ)監(jiān)測螯合過程。得到大約50%的產(chǎn)率。
實施例Ⅴα-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(PA-DOTA)〕配合物向150μl153Sm的0.1N HCl溶液(大約4.6mCi)中加入1μl的乙酸鈉(2.0M)和9μl的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸混合的銨-鉀鹽(5mmole，在50mmole HEPES中，PH8.5，用實施例8的步驟制備)。機械振動該混合物，并逐步滴加HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9;加入大約31μl)到PH為7。然后在沙浴上于98℃加熱該溶液一小時。以上過程結束后，取5μl混合物在Mono-QTM柱上用HPLC體系Ⅱ進行分析，用梯度溶劑體系來洗脫(0-15分鐘，從0至100%的B;其中A＝水，B＝1.0M乙酸銨和0.1mmole EDTA)。得到85-95%的產(chǎn)率，以153Sm計。這樣制備的α-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物通過與相同的無放射活性的樣品的比較進行鑒定，即通過它們各自的在Mono-QTM和GF-250柱子上的色譜行為。存在放射活性的配合物的進一步證據(jù)是通過其向異硫氰酰衍生物的轉化和其后來的向抗體的螯合作用來確定的。配合物也可在不加熱(在環(huán)境溫度下)通過保溫6-18小時來制備，其產(chǎn)率為70-80%。
實施例Ⅵα-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕配合物向實施例Ⅴ中得到的反應混合物中加入2μl的HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9)，2μl的硫光氣和0.2ml的氯仿。激烈地機械振動混合物2或3次，每次幾秒鐘。棄去氯仿層，留下主要含有所需產(chǎn)物的水層，并進一步純化。采用HPLC，在GF-250柱子上用HPLC體系Ⅰ測出α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的產(chǎn)率，以活性153Sm計，為85-90%。為了純化，讓水層經(jīng)過Sep-PakTMC-18柱體，并用90%的乙腈水溶液洗脫。棄去開始的300μl流出物，隨后出來的900μl的SCN-衍生物用HPLC在GF-250柱上檢定?；钚?53Sm的回收率優(yōu)于90%。然后將溶劑蒸發(fā)，歷時1.5-2小時，剩余物被用來向抗體螯合。
實施例Ⅶα-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(BA-DOTA)〕配合物向200μl153Sm的0.1N HCl溶液中加入1μl的乙酸鈉(2.0M)和12μl的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(5mmole，在50mmole HEPES中，PH8.5)(用實施例3的步驟制備)。機械振動該混合物，并逐漸滴加HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9;加入大約38μl)使PH到7。然后將該溶液在沙浴上98℃下加熱一小時。結束后，取5μl的混合物在Mono-QTM柱上進行分析(HPLC體系Ⅱ，用梯度溶劑體系洗脫0-15分鐘，從0至100%的B;其中A＝水;B＝1.0M乙酸銨和0.1mmole EDTA)。通常得到的產(chǎn)率以153Sm計為85-95%。該配合物也可用在室溫下將混合物保溫12-18小時的方法制備，其標題產(chǎn)物的產(chǎn)率為80-90%。如此制備的α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物通過與一個真正的樣品進行比較，即比較它們在Mono-QTM柱上的色譜行為、向異硫氰酰衍生物的轉化作用和其后來向抗體的螯合作用來進行檢定。
實施例Ⅷα-〔4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的制備;〔153Sm(SCN-BA-DOTA)〕配合物向實施例Ⅶ中得到的反應混合物中加入2μl的HEPES緩沖液(0.5M，PH8.9)，2μl的硫光氣和0.2ml的氯仿。將混合物繳烈地機械振動2或3次，每次幾秒鐘。棄去氯仿層，留下主要含有所需產(chǎn)物的水層。并進一步純化?；?53Sm活性，用HPLC體系Ⅰ，通過HPLC在GF-250柱上分析，α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物的產(chǎn)率為90%以上。為了純化，使水層經(jīng)過Sep-PakTMC-18柱體，并用90%的乙腈水溶液洗脫，棄去開始的0.3ml流出物，隨后出來的1.2ml是所需產(chǎn)物，回收率為86-93%。然后蒸發(fā)掉溶劑大約需2小時，剩余物被用來對抗體螯合。
實施例Ⅸ1-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤-153配合物向抗體的螯合;〔153Sm(SCN-EA-DO3A)〕-IgG螯合物使用的抗體是CC-49，-鼠科單克隆IgG，它可以結合到TAG-72，一個瘤締合抗原，的抗原決定基上。為了螯合，將187μl的抗體溶液(1.20×10-4M，在50mM HEPES中，PH8.5)與4.5×10-8moles的153Sm(SCN-EA-DO3A)(按照實施例Ⅳ中描述的方法制備)進行混合，隨后加入碳酸鈉溶液(1.0M)，使PH值升到8.9。反應在室溫下持續(xù)進行2小時。結束后，在SepadaxG-25(2.2ml)一次應用的柱子上用離心凝膠過濾法將153Sm標記的IgG分離出來，并在GF-250柱子上用HPLC進一步純化，用檸檬酸緩沖液(0.25M，PH7.4)洗脫。將含有標記IgG的部分沉淀下來，用CentriconTM濃縮器進行濃縮并交換(3×1)到PBS中。如此制備的153Sm標記的IgG的放射性比度大約是0.16μ Ci/μg蛋白質。通過HPLC(Sivakoff，S.I.，Biochrom1(1)，42-48(1986)〕和標準的生物化學方法，例如，十二烷基磺酸鈉聚丙酰胺凝膠電泳和放射自顯影法，及固相放射免疫測定法(RIA)〔參見David Colcher等人，Cancer Res.，43，736-742(1983)〕來鑒定〔153Sm(EA-DO3A)〕-IgG制備的定整性。
實施例X1-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-4，7，10-三乙酸，釤-153配合物向CC-49的片段F(ab′)2的螯合;〔153Sm(SCN-EA-DO3A)〕-CC-49的片段F(ab′)2使CC-49的F(ab′)2片段，根據(jù)Lamoyi和Nisonoff描述的方法，用酶水解方法制備〔E.Lamoyi和A.Nisonoff，J.Immunol.Methods，56，235-243(1983)〕〔225μl，1×10-4M于50mM HEPES中的溶液，PH8.5〕與2.9×10-8moles的153Sm(SCN-EA-DO3A)(用實施例Ⅳ中描述的方法制備)進行混合。加入碳酸鈉(1.0M，大約5μl)使PH到8.9，讓反應持續(xù)進行大約2.5小時。結束后，將153Sm標記的片段分離出來，用實施例Ⅸ中描述的方法進行檢定。
實施例Ⅺ(A和B)〔153Sm(EA-DO3A)〕-IgG和〔153Sm(EA-DO3A)-F(ab′)2在體內的定位153Sm(EA-DO3A)標記的IgG(實施例Ⅸ)和CC-49的F(ab′)2(實施例Ⅹ)的應用可通過異種移植到無胸腺的鼠身上的人類腫瘤對標記材料的吸收來證實。雌性無胸腺(Nu/Nu，CD1背景)鼠皮下接種(S.C.(0.1ml/源)以人類結腸癌細胞鏈，LS-174T(大約1×106個細胞/動物)。接種后大約兩周，每一動物都被通過尾部靜脈注射以大約2μCi(15-30μg)的在PBS中的153Sm標記的抗體。在不同的時間間隔里，這些鼠都死去了。放血后，癌和選擇的組織被切下來并稱重。在一γ射線測定器中測定其放射性活性。測定在每一組織中的153Sm的每分鐘記數(shù)(CPM)，并被表示為CPM每克組織每一注射劑量剩以100(%注射劑量/克)。結果示于圖1～4和表ⅠA和ⅠB中。在研究中153Sm(SCN-Bz-DTPA)標記的IgG和CC-49的F(ab′)2(實施例ZA)被作為比較例。結果示于表ⅠC和ⅠD中。
實施例Ⅻα-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向抗體的共軛;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-IgG共軛物使用的抗體是CC-49，一鼠科單克隆IgG，其結合于TAG-72的抗原決定基，一個腫瘤締合的抗原。為了共軛，使178μl的抗體溶液(1.26×10-4M，在50mmole的HEPES中，PH8.5)與3.4×10-8moles的α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤配合物(用實施例Ⅵ中描述的步驟制備)進行混合，隨后加入碳酸鈉溶液(1.0M，大約17μl)使PH值升到大約8.9。使反應在室溫下持續(xù)2小時。結束后，用離心凝膠過濾法，在SephadexTMG-25(2.2ml)一次性應用的柱子上，將153Sm標記的IgG分離出來，并進一步在GF-250柱子上用HPLC純化，用檸檬酸緩沖液(0.25M，PH7.4)洗脫。含有標記IgG的部分被沉淀下來，用CentriconTM濃縮器濃縮并交換(3次)到PBS中。如此制備的153Sm標記的IgG的放射性比度大約為0.16μCi/μg蛋白質。采用HPLC和標準的生化方法如實施例Ⅸ中描述的來檢驗α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物-IgG制備的完整性和一致性。
下面的實施例是制備標記抗體共軛物的一種選擇方法，它包括先將BFC共軛到抗體上，然后再進行螯合，生成放射性核素-BFC標記的Ab。
實施例ⅫAα-〔2-(4-氨基苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸-Ab CC49共軛物(IgG CC49-PA-DOTA)的制備;第二步與153Sm螯合形成153Sm標記的抗體(IgG CC49-PA-DOTA-153Sm)153Sm(PA-DOTA)標記的抗體可以通過下列步驟制備首先將BFC，例如，α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸(SCN-PA-DOTA)，在PH8～9的條件下偶合到抗體上，然后在PH為6時，室溫下與153Sm螯合幾小時。
在一典型的實驗中，CC-49在-Amicon濃縮器中(截去30K分子重量)被濃縮并經(jīng)三次交換進入到碳酸鹽緩沖液中(50mM，PH9.1)使溶液中抗體濃度大于1.5×10-4M。向形成的共軛物中加入161μl含有25×10-9mole的IgG CC-49并混有5μl的SCN-PA-DOTA(5mM的濃度，在同樣的碳酸鹽緩沖液中，由實施例18的方法制備)的抗體溶液。使混合液在室溫下放置5小時，最后在5000轉/分的Sorvall RT離心機上，通過Amico濃縮器中的30K膜片過濾。濃縮液進一步用2ml0.25M，PH值為7.4的DTPA的PBS溶液洗滌，并用MES緩沖液(20mM，PH5.8)洗滌5次(2ml每次)，每次洗滌時離心30分鐘。最后，PA-DOTA-IgG共軛物被濃縮到最小體積(大約100μl)，在GF-250柱上用HPLC分析證實其完整性。向純化了的共軛物中加入153Sm的0.1N HCl溶液(50μl)和20μl的MES緩沖液(1.0M，PH6)的在渦流混合器上混合后的混合液，并使其在室溫下放置過夜。結束后，未結合的153Sm的量，經(jīng)HPLC分析估計，是0.22BFC-Sm/抗體。153Sm與抗體的結合是通過與BFC的螯合來完成的，它是共價結合到抗體上的，通過對照實驗證實了其并不屬于非特性結合。在對照實驗中，IgG CC-49溶液，是在相同的條件下與153Sm混合液混合的，并根據(jù)相同的方法被分離出來，其沒有顯示出明顯量的153Sm與其結合。
實施例ⅩⅢα-〔2-(4-異硫氰酰苯基)-乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向CC-49的片段F(ab′)2的共軛;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-F(ab′)2片段使CC-49的F(ab′)2片段〔根據(jù)E.Lamoyi等人，J.Immunol.Methods 56，235-243(1983)描述的方法，通過酶水解制備〕，(225μl的1×10-4M的溶液，在50mmoles HEPES中，PH8.5)與2.9×10-8moles的α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物(用實施例Ⅵ中描述的方法制備)進行混合，加入碳酸鈉(1.0M，9μl)使PH值達到8.9左右，反應持續(xù)進行約2.5小時。分離出153Sm標記的片段，并用實施例Ⅸ中描述的方法鑒定。其放射性比度大約是0.4μCi/μg。
實施例ⅩⅣ(A和B)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標記的IgG和F(ab′)2的共軛物的體內定位;〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-IgG和〔153Sm(SCN-PA-DOTA)〕-F(ab′)2α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標記的IgG和CC-49的F(ab′)2(實施例Ⅻ和ⅩⅢ)的共軛物的應用可通過異種移植到無胸腺鼠體內的人類腫瘤對標記材料的吸收來證實。用實施例Ⅺ中描述的方法測定生物定位。IgG的結果示于圖1-7，F(xiàn)(ab′)2的結果示于圖8-14中，以及表ⅡA和ⅡB中。
在研究中，153Sm(SCN-Bz-DTPA)與IgG和F(ab′)2共軛物標記的材料(由實施例ZA制備)被用來作為比較，〔參見表ⅠC和ⅠD〕。
實施例ⅩⅤα-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向抗體的共軛;〔153Sm(SCN-BA-DOTA)〕-IgG將CC-49的整個IgG(174μl，1.2×10-4M，在0.25M HEPES中，PH8.7)與2.0×10-8moles的α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153(2.8mCi)(用實施例Ⅷ中的方法制備)進行混合，隨后加入碳酸鈉溶液(1.0M，大約2μl)以保持PH大約為8.7。在室溫下讓反應持續(xù)2.5小時。結束后，在SephadexTMG-25(2.2ml)一次性使用的柱子上用離心凝膠過濾法分離出153Sm標記的IgG，并用HPLC在GF-250柱子上進一步純化，用檸檬酸緩沖液(0.25M，PH7.4)洗脫。將含有標記的IgG部分沉淀下來，利用CentriconTM濃縮器將其濃縮，并交換(3次)到PBS中。通過HPLC和標準的生化方法，如在實施例Ⅸ中描述過的，來驗證釤-153標記的IgG制備的一致性和完整性。
實施例ⅩⅥα-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物向CC-49的片段F(ab′)2的共軛;〔153Sm(SCN-BA-DOTA)〕-CC-49的F(ab′)2片段將CC-49的F(ab′)2(84μl，2.4×10-4M，在0.25M HEPES緩沖液中，PH8.7)，根據(jù)Lamoyi等描述的方法用酶水解制備，與2.1×10-8moles的α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物(用實施例Ⅷ的方法制備)進行混合，加入碳酸鈉(1.0M，大約2μl)使PH值到8.7，讓反應持續(xù)進行大約2小時。結束后，分離出153Sm標記的片段，并用實施例Ⅻ中描述的方法來鑒定。
實施例ⅩⅦ(A和B)α-(4-異硫氰酰苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標記的IgG(實施例ⅩⅤ)和F(ab′)2(實施例ⅩⅥ)的體內定位;〔153Sm(BA-DOTA)〕-IgG和〔153Sm(BA-DOTA)〕-F(ab′)2。
根據(jù)實施例ⅩⅣ或Ⅺ中描述的步驟來進行體內研究，結果示于圖1-14和表ⅢA和ⅢB中。
實施例ⅩⅧ(A和B)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，177Lu-配合物標記的IgG和F(ab′)2的體內定位;〔177Lu(PA-DOTA)〕-IgG和〔177Lu(PA-DOTA)〕-F(ab′)2
根據(jù)實施例Ⅴ，Ⅵ，Ⅻ，和ⅩⅢ中描述的步驟，制備出標題化合物，并進行體內研究，其結果示于表ⅣA和ⅣB中。
實施例ⅩⅨ(A和B)α-〔2-(4-異硫氰酰苯基)乙基〕-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釔-90配合物標記的IgG和F(ab′)2的體內定位;〔90Y(PA-DOTA)〕-IgG和〔90Y(PA-DOTA)〕-F(ab′)2根據(jù)實施例Ⅴ，Ⅵ，Ⅻ，和ⅩⅢ中描述的步驟，制備標題化合物，并進行體內研究，其結果示于表ⅤA和ⅤB中。
實施例ⅩⅩ〔153Sm(BFC)〕-CC-49-IgG和〔177Lu(BFC)〕-CC-49-IgG的體內PH穩(wěn)定性將〔153Sm(BFC)〕-CC-49-IgG或〔177Lu(BFC)〕-CC-49-IgG放置在0.2M NaOAc緩沖液中，其PH值分別為6.0，4.0和2.8，且在室溫下，蛋白質的濃度大約為5×10-6M，并有大約0.5配合物/抗體。在一定的時間間隔內取樣，用HPLC(GF-250柱)分析活性153Sm或177Lu從蛋白質上的離解作用。通常該研究要進行5天，或直到有90%的放射性同位素都已離解。結果以每天放射性同位素的損失的初始速度來表示。結果證實了153Sm(PA-DOTA)，177Lu(PA-DOTA)，153Sm(BA-DOTA)和153Sm(OMe-BA-DOTA)與標準的〔153Sm(Bz-DTPA)〕配合物相比較，在酸性PH下具有很好的穩(wěn)定性。結果示于下表中。
配合物的這個較大的穩(wěn)定性也與153Sm和177Lu從人體和非目標組織上(如腎、肝)較快速的排除有密切的關系。參看圖1-14。
實施例ⅩⅪ(A和B)α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸，釤-153配合物標記的IgG和F(ab′)2的體內定位;〔153Sm(MeO-BA-DOTA)〕-IgG和〔153Sm(MeO-BA-DOTA)〕-F(ab′)2根據(jù)實施例Ⅴ，Ⅵ，和Ⅻ中描述的方法制備標題化合物，用實施例Ⅺ中的方法進行體內研究。結果示于表ⅥA和ⅥB中。
實施例ⅩⅫ153Sm(PA-DOTMA)配合物的制備向100μl的153Sm(0.3×10-3M，在0.01N HCl中;5mCi)中加入6μl的PA-DOTMA(用實施例29的方法制備的高Rf的非對映體;5mM，在Milli-QTM水中)，20μl的MES緩沖液(1.0M，PH6)和1μl的HEPES緩沖液(0.5M，PH8.7)。該溶液在渦流混合器上混合，且該混合物最終的PH值大約為6。在90℃下，將混合物加熱30分鐘后，通過HPLC在GF-250柱上分析其螯合效果，一般能得到90%或更好的產(chǎn)率。153Sm-PA-DOTMA配合物的檢定可以通過與非放射性活性的Sm配合物比較而得到。非放射性活性的配合物已在實施例42中分別被合成和鑒定過。
實施例ⅩⅩⅢ153Sm(SCN-PA-DOTMA)的制備向實施例ⅩⅫ中制備的，并已在室溫下冷卻了20分鐘的153SmPA-DOTMA配合物中加入10μl1%的硫光氣在90%的乙腈-水介質中形成的溶液。將該混合物在渦流混合器上激烈地混合，并在室溫下放置5～20分鐘。反應連續(xù)進行，并用HPLC分析來監(jiān)測。為了純化具有活性的153Sm配合物，用氯仿將其萃取3次(每次200μl)，使水層經(jīng)過預先用5ml的甲醇和5ml的MES緩沖液(20mM，PH5.8)處理的PRP柱體(PRP柱體＝Mini-CleanTM柱子。來自Alltech Associates，Deerfield，IL)。先用5ml的MES緩沖液和5ml的Milli-QTM水洗滌后，用900μl90%的乙腈將其萃取，回收了大約90%的活性153Sm，將開始的100μl棄去。減壓下在溫度低于40℃時將混合物蒸發(fā)至干，主要含有標題產(chǎn)物的剩余物被用來對抗體進行共軛作用。
實施例ⅩⅩⅣ153Sm(SCN-PA-DOTMA)對IgG和F(ab′)2CC49的共軛作用通常在一個CentriconTM濃縮器上(斷掉30K分子重量)將抗體濃縮，并交換到碳酸鹽緩沖液中(PH9.1或9.5，50mM)，使蛋白質的濃度為1.5×10-4M或更大。為了共軛，將少量的碳酸鹽緩沖液，利用它使最終的蛋白質濃度達1.5×10-4M，加入到153Sm(PA-DOTMA)的異硫氰酰衍生物中(實施例ⅩⅩⅡ中制備)，隨后濃縮抗體，與BFC-153Sm配合物等當量。在渦流混合器上混合該混合物，使反應在室溫下進行1小時或直到有40～50%的153Sm結合到了抗體上，經(jīng)HPLC分析在GF-250柱子上表現(xiàn)出來。通過兩個串聯(lián)的離心凝膠過濾SephadexTMG-25柱(2.2ml)分離出標記的抗體。標記的抗體的免疫反應性、完整性和一致性通過HPLC和前面所述的標準的生化技術來分析。
實施例ⅩⅩⅤ153Sm(PA-DOTMA)標記的IgG和F(ab′)2CC-49的生物分布研究利用實施例Ⅺ中描述的相似方式進行研究，結果示于表ⅦA和ⅦB中。參看圖15-28。
實施例ⅩⅩⅥ177Lu(PA-DOTMA)配合物的制備向30μl的177Lu(6×10-3M，在1.1N HCl中;4mCi)中加入36μl的PA-DOTMA(用實施例29的方法制備;5mM milli-QTM水溶液)。該溶液在渦流混合器中混合，加入115μl的MES緩沖液(1.0M，PH6.0)中和溶液使PH約為5.5～6。將該溶液在90℃時加熱30分鐘，使螯合率大于90%。讓混合物經(jīng)過預先用5ml的甲醇和5ml的MES緩沖液(20mM，PH5.8)處理的PRP柱體，用5ml的milli-QTM水洗滌柱體，用1000μl 90%的乙腈萃取絡合物，其占起始活性177Lu的78%(棄去開始的100μl的萃取液)。
實施例ⅩⅩⅦ177Lu(SCN-PA-DOTMA)的制備向實施例ⅩⅩⅥ中得到的存在于90%的乙腈中的177Lu(PA-DOTMA)配合物中加入6μl的10%硫光氣在90%的乙腈中形成的溶液。該溶液在渦流混合器上混合，20分鐘后，用HPLC分析異硫氰酸鹽衍生物的形成。一般地，該反應是定量進行的。在減壓條件下，溫度低于40℃時，蒸發(fā)1～2小時除去溶劑和過量的硫光氣，剩余物被用來與抗體進行共軛作用。
實施例ⅩⅩⅧ177Lu(PA-DOTMA)對IgG CC-49的共軛作用將在碳酸鹽緩沖液(50mM，PH9.1)中的抗體IgG CC-49與在相同緩沖液中的等摩爾量的異硫氰酰衍生物(用實施例ⅩⅩⅦ中的方法制備)進行混合，反應持續(xù)進行70分鐘，抗體濃度為1.5×10-4M，分離出標記的抗體，并根據(jù)實施例ⅩⅩⅣ中描述的方法進行鑒定。
實施例ⅩⅩⅨ177Lu(PA-DOTMA)標記的IgG CC-49的長期生物分布研究用177Lu標記的抗體進行長期的動物實驗，利用其半衰期長的優(yōu)點(161小時)。根據(jù)實施例Ⅺ中描述的方式，該實驗在Balb/C老鼠體中進行三個多星期，結果示于表ⅧA中。參看圖29-34。
在圖中，下表中的點和數(shù)據(jù)，所用的符號是

*在帶有LS174-T腫瘤的裸體小鼠中。
**在Blab/C鼠中
*在帶有LS174-T腫瘤的裸體小鼠中**在Blab/C鼠中

















根據(jù)本文公開的發(fā)明說明書和實例，本發(fā)明的其它具體實例對于那些熟練的技術人員來說將是明顯的，說明書和實施例僅僅是作為例證，發(fā)明的真正范圍和實質是由下面的權利要求書表示的。
權利要求
1.一種制備具有配位體、金屬離子和抗體或抗體碎片的共軛物的方法，該方法包括下列步驟中的任何一種步驟(A)將與一種La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y或Sc金屬的離子配合的具有下式的配位體或其藥學上可接受的鹽 其中每個Q分別是氫或(CHR5)pCO2R；Q1是氫或CO2R；每個R分別是氫或C1-C4烷基；條件是Q和Q1總和中至少兩個必須不是氫，以及當Q1是氫時，R3必須不是氫；每個R5分別是氫或C1-C4烷基；n是包括0到5的整數(shù)；p=1或2；R2是氫、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基；R3是C1-C4烷氧基、-OCH2CO2H基、羥基或氫；R4是氫、氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基；條件是R2和R4不能兩個都是氫，但R2和R4中的一個必須是氫；與一種抗體或抗體碎片，在常規(guī)條件下，進行反應，使該配合物以共價鍵與該抗體或抗體碎片配合；或(B)將一種具有以共價鍵與一種抗體或抗體碎片結合的如步驟(A)中定義的配位體的化合物，在常規(guī)條件下，與一種La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y或Sc進行反應。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中該金屬是153Sm、166Ho、90Y、149Pm、159Gd、140La、177Lu、175Yb、47Sc或142Pr。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中該金屬是153Sm、166Ho、177Lu和90Y。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中該抗體或抗體碎片是一種單細胞系抗體或其碎片。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中該抗體或抗體碎片是CC-49、CC-49F(ab′)2、CC-83、CC-83F(ab′)2或B72.3。
6.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)其中Q1是氫。
7.根據(jù)權利要求6的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)和R3是C1-C4烷氧基、-OCH2CO2H或羥基。
8.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)其中Q1是CO2R。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體屬于式(ⅠA)其中Q1是CO2R，R2是氨基、異硫氰酸根合、脲氨基、硫代脲氨基、馬來酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基。
10.根據(jù)權利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-氨基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸4，7，10-三-(R-甲基乙酸)。
11.根據(jù)權利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-異硫氰基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1-(R，S)-乙酸-4，7，10-三-(R-甲基乙酸)。
12.根據(jù)權利要求9的方法，其中該配位體是α-(4-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
13.根據(jù)權利要求9的方法，其中該配位體是α-(4-異硫氰基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
14.根據(jù)權利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-氨基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
15.根據(jù)權利要求9的方法，其中該配位體是α-[2-(4-異硫氰基苯基)乙基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中該配位體是屬于式(ⅠA)其中Q1是CO2R，R4是氨基、異硫氰酸根合、脈氨基、硫代脲氨基、馬來酰亞胺基、溴乙酰胺基或羧基。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中該配位體是α-(2-甲氧基-5-氨基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸、四氨鹽。
18.根據(jù)權利要求16的方法，其中該配位體是α-(2-甲氧基-5-異硫氰基苯基)-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸、四氨鹽。
19.根據(jù)權利要求1步驟(A)的方法，其中該反應條件包括應用一種PH為8-9的緩沖溶液，在室溫下，進行一段足以進行共軛作用的時間，然后再將所得到的共軛物提純。
20.根據(jù)權利要求1步驟(B)的方法，其中該反應條件包括應用一種化合物的緩沖水溶液和金屬離子的水溶液并在室溫下攪拌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備式(IA)的一組官能化聚氨基羧酸鹽螯合劑的方法，該螯合劑可與稀土金屬離子形成配合物。該種以共價鍵與抗體或抗體片段連接的配合物可用于治療和/或診斷。本發(fā)明在癌癥治療領域中具有重大的意義。
文檔編號C07D257/02GK1109469SQ9411913
公開日1995年10月4日 申請日期1994年12月15日 優(yōu)先權日1988年6月24日
發(fā)明者羅伯特·C·鄭, 威廉·A·福代斯, 威廉·F·葛凱勒, 小威廉·J·克魯帕, 沙朗·包曼, 約瑟夫·R·加里希, 加里·基法, 肯尼思·麥克米倫, 賈米·J·西蒙, 戴維·A·威爾遜, 理查德·基思·弗蘭克 申請人:唐化學原料公司