專利名稱：檢測(cè)從體液或組織提取的合成寡核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)特定核酸序列的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及檢測(cè)存在于體液或組織內(nèi)的合成寡核苷酸的方法。
對(duì)存在于細(xì)胞內(nèi)的特定核酸序列的檢測(cè)方法在現(xiàn)有技術(shù)中通常是已知的。Southern(J.Mol.Biol.98503-517，1975)提出了在由凝膠電泳分離的DNA片斷中檢測(cè)特定序列的方法，該方法使用“印跡”方法將DNA片斷轉(zhuǎn)移至薄膜，然后用放射性探針與變性的DNA片斷雜交并放射自顯影。這一方法也已經(jīng)用于檢測(cè)從細(xì)胞或組織中提取出的RNA分子，近些年來，已經(jīng)開發(fā)了更快且定量的“點(diǎn)印跡”方法用于快速檢測(cè)從組織或細(xì)胞中獲得的DNA或RNA。
最近，人們對(duì)開發(fā)合成寡核苷酸在所謂的反義方法中作為治療劑或基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑方面已產(chǎn)生相當(dāng)大的興趣。例如，Agrawal(Trends in Biotechnology 10152-158，1991)廣泛地闡述了反義治療方法的發(fā)展。為了使反義治療方法有效，必須將寡核苷酸引入患者體內(nèi)并達(dá)到所需治療的特定組織處。因此，需要在體液或組織中檢測(cè)寡核苷酸的存在。在動(dòng)物模型中，已經(jīng)將放射性標(biāo)記的寡核苷酸施用給動(dòng)物，它們?cè)趧?dòng)物體液和組織中的分布也已經(jīng)由提取這些寡核苷酸然后用放射性自顯影術(shù)檢測(cè)到。(參見Agrawal，Tems-amani和Tang，Proc.Natl.Acad.Sci.887595-7599，1991)。然而，作為一種實(shí)用的方式，這些方法都不能延用于人類患者。不幸的是，用于檢測(cè)存在于體液或組織內(nèi)的特定未標(biāo)記核酸序列的各種技術(shù)僅適用于多核苷酸，例如大的DNA或RNA分子。由于寡核苷酸分子較小，存在與非特異性結(jié)合或背景以及無結(jié)合相關(guān)的、檢測(cè)不到或假陰性的特殊問題。因此，仍需要開發(fā)一種用于檢測(cè)存在于體液和組織中的特定合成寡核苷酸序列的方法。
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或人類患者獲得的體液或組織樣品中合成寡核苷酸存在的方法。在本發(fā)明的方法中，體液或組織樣品是從已經(jīng)施用了寡核苷酸的動(dòng)物或人類中獲取的，經(jīng)蛋白酶消化后進(jìn)行提取，然后將全部核酸轉(zhuǎn)移至雜交膜。將該附著有核酸的雜交膜進(jìn)行預(yù)雜交，然后與被標(biāo)記的寡核苷酸雜交。該被標(biāo)記的寡核苷酸與給動(dòng)物或患者施用的寡核苷酸是互補(bǔ)的。然后用標(biāo)準(zhǔn)的方法檢測(cè)雜交上的被標(biāo)記的寡核苷酸。本發(fā)明的方法用于在經(jīng)歷反義寡核苷酸治療的患者和用于研究寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的動(dòng)物模型中檢測(cè)和定位寡核苷酸。
附圖的簡單要說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明方法，使用如實(shí)施例1-5中詳細(xì)描述的放射性標(biāo)記探針的一個(gè)方案的圖解表示。
圖2表示從描述于實(shí)施例1-5的使用放射性標(biāo)記探針的實(shí)驗(yàn)中獲得的放射自顯影結(jié)果。在A組(即對(duì)照組)中，將50、25、12.5、6.2、3.1、0ng寡核苷酸(從上到下)直接涂于雜交膜上。B組表示將相同量的寡核苷酸加至血清中，然后如實(shí)施例1-5中所述的方法處理。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的方法，使用如實(shí)施例1-5中詳細(xì)描述的抗原標(biāo)記探針的一個(gè)方案的圖解表示。
圖4表示從描述于實(shí)施例1-5的、使用放射性標(biāo)記探針的實(shí)驗(yàn)中獲得的放射自顯影結(jié)果。上圖表示放射自顯影。下圖表示放射自顯影的掃描光密度測(cè)定對(duì)已知濃度的寡核苷酸的曲線圖。
圖5說明使用同位素或非同位素檢測(cè)的本發(fā)明方法的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及檢測(cè)存在于體液或組織中的特定核酸序列的方法。具體地說，本發(fā)明涉及在施用過這類寡核苷酸的動(dòng)物或人類患者的體液或組織中檢測(cè)合成寡核苷酸的方法。
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)從體液或組織中提取的合成寡核苷酸的方法。這里所使用的“寡核苷酸”包括(但不限于)所有5＇至3＇連接的、2＇一修飾的核苷和/或脫氧核糖核苷聚合物，其中的連接可以是天然的磷酯連接或諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯或磷酸三酯的人造連接。另外，這樣的寡核苷酸還包括在堿基和/或糖殘基上有修飾的寡核苷酸以及那些在3＇端和/或5＇端具有核酸酶抗性的大取代基的寡核苷酸。這里所用的“體液”包括(但不限于)血液、尿液、汗液、粘性分泌物、腦脊髓液和滑液。當(dāng)使用血液時(shí)，最好離心分離出細(xì)胞以獲得血清或血漿，并從血清或血漿中提取核酸。“組織”包括構(gòu)成任一器官的那些物質(zhì)，例如淋巴組織、肝、腎、肺、腦、腸、平滑肌、心肌、橫紋肌、真皮和表皮等等。
在本發(fā)明的方法中，按下列方式處理體液樣品或組織樣品。首先，用合適的蛋白酶，例如蛋白酶K、鏈霉蛋白酶或另一種常規(guī)蛋白酶，將體液進(jìn)行蛋白酶消化。然后，用分配劑，優(yōu)選用苯酚/氯仿/異戊醇抽提該樣品。然后，用異丁醇和乙醚提取核酸。下一步，將核酸重新懸浮于溶液中，使其單鏈化并將其涂覆且結(jié)合于合適的雜交膜上。這樣的膜包括(但不限于)尼龍和Pall A膜。下一步，用標(biāo)記的寡核苷酸處理該結(jié)合有核酸的膜，該標(biāo)記的寡核苷酸與待檢測(cè)的寡核苷酸是互補(bǔ)的。用該互補(bǔ)的寡核苷酸雜交，然后將未雜交的寡核苷酸洗掉。適宜的標(biāo)記包括放射性同位素標(biāo)記，如32P或35S，和任何其它常規(guī)標(biāo)記，如熒光標(biāo)記(如若丹明或熒光素)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或生物素和酶。
這樣的標(biāo)記可直接結(jié)合在寡核苷酸探針上?？梢赃x擇的是，在優(yōu)選方案中將抗原連接在寡核苷酸上，通過將標(biāo)記與特異地與抗原結(jié)合的抗體偶聯(lián)使標(biāo)記與探針相連接(該探針與其靶序列雜交)。最優(yōu)選的方案使用連接有抗原地高辛配基(digoxigenin DIG)的探針和接合有堿性磷酸酯酶的抗DIG抗體或抗原結(jié)合抗體片斷。在這一方案中，通過加入穩(wěn)定的磷酸化的化合物來檢測(cè)探針，這種化合物一經(jīng)去磷酸化作用就產(chǎn)生可用放射自顯影術(shù)檢測(cè)的發(fā)光。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“放射自顯影”意為通過將底片與經(jīng)探針雜交的雜交膜并置而使照相底片曝光的曝光方法，不管該光線是日光、X射線，或由放射活性化合物衰變而釋放的α或β粒子或γ射線。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到在本發(fā)明的方法中任何其它抗原均可用來代替DIG而且在作用上與DIG相當(dāng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到其它配體一受體對(duì)能取代抗原抗體對(duì)并與其功能相當(dāng)。最后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認(rèn)識(shí)到任何其它產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶一底物的組合都可代替堿性磷酸酶和其試劑，而且功能相當(dāng)。
雜交和洗滌的條件是特別重要的，對(duì)于具有離子型核苷酸間連結(jié)的寡核苷酸，如寡核苷酸磷酸二酯或硫代磷酸酯來說，發(fā)現(xiàn)在6×SSC中37℃下雜交3-16小時(shí)，然后在6×SSC中室溫下洗滌5-10分鐘，對(duì)于使用具有62％G＋C含量的25個(gè)堿基的探針檢測(cè)具有56％G＋C含量的25個(gè)堿基的寡核苷酸來說是適宜的。當(dāng)使用的條件較重時(shí)，檢測(cè)不到靶寡核苷酸。但當(dāng)使用的條件較輕時(shí)，背景雜交會(huì)掩蓋真正的信號(hào)。對(duì)于具有非離子型修飾的核苷酸間連結(jié)或較低G＋C含量的寡核苷酸來說，使用較輕的條件(例如較低的溫度、較高的鹽濃度)可能是有益的。對(duì)較長的寡核苷酸或具有較高G＋T含量或RNA組分的寡核苷酸，使用較重的條件(例如較高溫度、較低鹽濃度和/或存在如甲酰胺的氫鍵競爭劑)可能是有益的。解鏈溫度和不同經(jīng)修飾的核苷酸間連接之間的關(guān)系已有詳細(xì)的描述(參見例如美國專利5,149,798號(hào)的圖9，其內(nèi)容在此引入作為參考)。對(duì)于任何給定的經(jīng)修飾的寡核苷酸，雜交是用靶寡核苷酸直接涂布的雜交膜，以下面實(shí)施例4所述的條件開始的。然后，對(duì)于不同修飾的寡核苷酸，減輕或增重所用條件，直至達(dá)到可檢測(cè)3ng靶寡核苷酸的檢測(cè)極限。只有在這時(shí)，背景和檢測(cè)不到的問題才被解決。
洗滌后，將膜干燥，并用常規(guī)方法，如熒光檢測(cè)、β-放射檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)或放射自顯影術(shù)，來檢測(cè)信號(hào)。
本發(fā)明方法在寡核苷酸藥物動(dòng)力學(xué)的動(dòng)物研究中非常有用，該方法不需要在動(dòng)物中使用大量放射性標(biāo)記的寡核苷酸。此外，本發(fā)明的方法對(duì)于檢測(cè)在經(jīng)歷反義寡核苷酸治療的人類患者體內(nèi)寡核苷酸的濃度和分布非常有用，為劑量的優(yōu)化工作提供了便利。
下述實(shí)施例意在進(jìn)一步說明本發(fā)明的某些優(yōu)選方案，并不在本質(zhì)上限制。
實(shí)施例1體液和組織樣品的制備將已知量的寡核苷酸摻入血清或血液中。將250μl摻料的血液血清于含有2mg/ml蛋白酶K的提取緩沖液(0.5％SDS/10mM NaCl/20mM Tris-HCl，pH7.6/10mM EDTA)中，在60℃下溫育1.5至2小時(shí)。加入200毫升的水至樣品中，然后用500μl苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1體積/體積)抽提一次并用500μl氯仿抽提一次，然后用1ml異丁醇將水相抽提兩次并用500μl乙醚抽提一次。將含有核酸的剩余溶液干燥成丸。將這些丸再懸浮于10μ1TE緩沖液中(10mMTris-HCl，pH8.0/1mM EDTA)，然后加熱至95℃，保持5分鐘。再加入40μl20×SSC(3M NaCl/0.3 M檸檬酸鈉，pH7.0)。使用500μl尿或0.25cm3淋巴樣組織也可進(jìn)行相似的處理。
實(shí)施例2將提取的核酸轉(zhuǎn)移至膜在10×SSC中將每張尼龍膜(Zeta ProbeTM，Bio Rad)和Whatman3MM紙浸濕。將浸濕的Whatman紙放置在一個(gè)點(diǎn)雜交裝置中(Minif-old IITM，Schleicher & Schuell)，并將浸濕的尼龍膜放置在Whatman紙的上面。將具有多個(gè)加樣孔的蓋放在裝置上并鎖緊，然后將該裝置與真空源相連接。用100μl 20×SSC漂洗加樣孔，然后將根據(jù)實(shí)施例1制備的樣品在10μl TE＋40ml 20×SSG中加至加樣孔，然后用100μl 20×SSC漂洗加樣孔。隨后將真空關(guān)閉并將尼龍膜移走。然后在10cm距離處，膜上側(cè)正對(duì)UV源，將尼龍膜在短波(＜300mm)UV光下照射十分鐘使得核酸交聯(lián)至膜上。
實(shí)施例3
被標(biāo)記探針的制備為了制備放射性標(biāo)記探針，在37℃，在含有100ng寡核苷酸(5μ1)、3μl[γ-32P]ATP(3000居里/毫摩爾，在10毫居里/毫升中)、1μl 10×激酶緩沖液和1μl T4聚核苷酸激酶(8-10單位/μl)的反應(yīng)混合液中，用32P，將與摻入血液、尿或組織樣品的寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸的5＇末端標(biāo)記30分鐘，然后加熱至65℃，保持3分鐘。然后用0.4M NH4OAc和乙醇使被標(biāo)記的寡核苷酸沉淀，并再懸浮于50μl H2O中。
或者，根據(jù)制造商的說明，用Genius 5TM寡核苷酸加尾儀(Boehringer Mannheim)制備非放射活性的化學(xué)發(fā)光探針。在末端轉(zhuǎn)移酶的存在下，使1μg寡核苷酸在3＇與辛高地配基-11-dduTP/dATP(DIG-11-dduTP/dATP)接尾。20μl反應(yīng)混合液體積包括4μl 5X反應(yīng)緩沖液(1M卡可酸鉀、125mM Tris-HCl、1.25mg/ml牛血清白蛋白，在25℃時(shí)pH6.6)、4μl 25mM氧化鈷、100微微摩爾寡核苷酸、1μl 1mM的DIG-ll-dduTP(2＇，3＇-二脫氧尿苷-5＇-三磷酸酯通過一個(gè)11原子的間隔臂與辛高地配基偶聯(lián))和50單位的末端轉(zhuǎn)移酶。在37℃溫育反應(yīng)混合物15分鐘，然后置于冰上。向反應(yīng)混合物中加入1μl 20mg/ml的糖原和1μl 200mM的EDTA(pH8.0)，然后通過加入0.1體積4M的氯化鋰和2.5體積的冰乙醇，然后在-70℃混合、溫育30分鐘使其沉淀。將寡核苷酸制成小球并用70％的乙醇洗滌該小球，直接重新懸浮于30μl的10mM Tris-HCl(pH7.0-8.0)/1mM EDTA/1％SDS。
實(shí)施例4探針寡核苷酸的預(yù)雜交和雜交在37℃下，10ml雜交緩沖液(1M NaCl/1％SDS/10％葡聚糖硫酸酯和150μg/ml tRNA)中將按照實(shí)施例2制備的膜預(yù)雜交1至3小時(shí)。向雜交溶液中的膜加入用3μg/ml最終濃度的未標(biāo)記互補(bǔ)寡核苷酸(5×105cpm/ml；250ng/ml探針最終濃度)稀釋的被標(biāo)記寡核苷酸探針。在37℃下溫育連續(xù)進(jìn)行3-16小時(shí)。在6×SSC中洗滌膜2次(每次5-10分鐘)，然后在室溫下干燥。
實(shí)施例5檢測(cè)與膜特異性連接的探針檢測(cè)按照實(shí)施例4制備的與膜特異性連接的探針按如下步驟進(jìn)行。將膜曝光于X射線底片，然后將其沖洗并經(jīng)掃描光密度測(cè)定，與直接涂于膜的已知量的寡核苷酸樣品比較。示于圖2的對(duì)于血清樣品的結(jié)果表明，每0.25ml血清檢測(cè)到約3ng寡核苷酸。用尿和組織樣品獲得了相似的結(jié)果。
在抗原DIG連結(jié)至探針的實(shí)驗(yàn)中，探針是通過堿性磷酸酯酶接合的抗-DIG抗體Fab片斷的結(jié)合，并按照制造商的說明，使用Genius 3TM核酸檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim)來檢測(cè)的。簡單地說，在100mM Tris-HCl(pH7.5)/150mM NaCl溶液中，用封閉劑將實(shí)施例4所述方法制備的、具有特異連接的探針寡核苷酸的雜交膜封閉30-60分鐘，然后在相同溶液中，將與堿性磷酸酯酶接合的抗-DIG抗體Fab片斷加至膜上。將抗體溶液與膜一起溫育30分鐘，然后將膜移走并放置于一個(gè)新的雜交袋中。然后在室溫下，在預(yù)先通過0.45μM濾膜過濾的100mM Tris-HCl(pH7.5)/150mMNaCl中將膜洗滌兩次，每次15分鐘。洗滌后，在膜還是濕的情況下，將膜置于兩層醋酸纖維素膜之間。然后將0.5ml(每100cm2膜)的0.33mM4-甲氧基-4-(3-磷酸苯基)-螺(1，2＇-二氧雜環(huán)丁烷-3，2＇-金剛烷)二鈉鹽/750mM2-氨基-2-甲基-1-丙醇(pH9.6)/0.88mM MgCl2/1.13mM十六烷基三甲基溴化銨/0.035mM熒光素表面活性劑涂敷至膜的上表面，并在膜和乙酸纖維素膜之間形成液封。然后使覆蓋有乙酸纖維膜的膜在一片XARTM底片(Kodak)上曝光60分鐘。沖洗該曝光的底片并使用光密度檢測(cè)儀和RV9342.0版光密度測(cè)定軟件(EC儀器公司)掃描至計(jì)算機(jī)中。然后將平均密度對(duì)寡核苷酸的已知濃度作圖。結(jié)果示于圖4中。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的方法能檢測(cè)出體液或組織中以低至3ng/ml濃度存在的寡核苷酸。而且，用本發(fā)明的方法可對(duì)存在于體液或組織內(nèi)的寡核苷酸進(jìn)行定量分析。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)存在于體液或組織中的合成寡核苷酸的方法，該方法包括下列步驟(a)用蛋白酶消化體液或組織樣品；(b)用分配劑抽提該蛋白酶消化的樣品；(c)用異丁醇和乙醚抽提存在于樣品中的核酸，包括待檢測(cè)的合成寡核苷酸；(d)將核酸重新懸浮至溶液中；(e)將核酸連接至雜交膜上；(f)用與待檢測(cè)的合成寡核苷酸互補(bǔ)的標(biāo)記寡核苷酸探針處理具有連接核酸的膜；(g)洗滌膜以除去任何不與連接在膜上的核酸雜交的標(biāo)記寡核苷酸；和(h)檢測(cè)膜上探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中體液是血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中體液是尿液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中組織是淋巴樣組織。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記的寡核苷酸探針是放射性標(biāo)記的探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中標(biāo)記的寡核苷酸探針是抗原或配體，而且探針的檢測(cè)包括下列步驟(a)用合適的封閉劑封閉膜；(b)將膜與特異性地與抗原或配體連接的、并與能作用于底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的酶接合的抗原-結(jié)合性抗體片斷或受體一起溫育；(c)洗滌膜以除去任何非特異性連接的抗體、抗原結(jié)合性抗體片斷或受體；(d)加入酶作用的底物；和(e)使膜曝光至照片底片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)存在于體液或組織樣品中特異性合成寡核苷酸的方法，該體液或組織樣品取自服用過寡核苷酸的動(dòng)物或人類患者。
文檔編號(hào)C07H1/06GK1116859SQ94190976
公開日1996年2月14日 申請(qǐng)日期1994年1月7日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月8日
發(fā)明者賈馬爾·坦薩馬尼, 休德海爾·阿格里沃爾 申請(qǐng)人:海布里頓公司