專利名稱：二聚體塊的合成及其在裝配寡核苷酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及寡核苷酸的化學合成。尤其是，本發(fā)明涉及具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸的合成。
自從Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.75280-284，1978)發(fā)現(xiàn)合成的寡核苷酸能抑制勞氏肉瘤病毒的復制以來，人們對使用寡核苷酸和具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸類似物來控制基因調節(jié)和處理病理狀況表現(xiàn)出極大興趣。
為了這種目的，已研究出多種方法用于合成寡核苷酸。早期的合成方法包括磷酸二酯和磷酸三酯化學方法。Khorana等(J.Molec.Biol.72209，1972)公開了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化學方法。Reese(Tetrahedron Lett.343143-3179，1978)公開了用于合成寡核苷酸和多核苷酸的磷酸三酯化學方法。這些早期的方法已在很大程度上讓位于更有效的亞磷酰胺和H-膦酸酯方法去合成。Beauca-ge和Caruthers(Tetrahedron Lett.221859-1862，1981)公開了在多核苷酸合成中使用脫氧核苷亞磷酰胺的方法。Agrawal和Zamecn-ik在美國專利No.5149798(1992)中公開了通過H-膦酸酯途徑合成寡核苷酸的優(yōu)化方法。
這兩個現(xiàn)代方法都已被用來合成具有各式各樣經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild(Tetrahedron Lett.283539-3542，1987)講授了用亞磷酰胺化學方法合成寡核苷酸甲基膦酸酯(oligonucleotide mathylphosponatas)的方法。Connolly等(Biochemistry 233443，1984)公開了用亞磷酰胺化學方法合成寡核苷酸硫代磷酸酯(oligonucleotide phosphorothioates)的方法。Jager等(Biochemistry 277237，1988)公開了通過亞磷酰胺化學方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯的方法。Agrawal等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857079-7083，1988)公開了通過H-膦酸酯化學方法合成寡核苷酸氨基磷酸酯(oligonucleotide phosphoramidates)和硫代磷酸酯的方法。
亞磷酰胺化學合成法和H-膦酸酯化學合成法都是在存放于反應容器中的固體支持物上進行的。偶聯(lián)每一個核苷酸必須的反應步驟包括脫三苯甲基、偶聯(lián)、加帽和氧化。對于小規(guī)模合成(達到1μm摩爾)來說，增加一個核苷酸所需總時間約為6分鐘。裝配一個30個鏈節(jié)長的寡核苷酸可在180分鐘內(nèi)完成。在這些條件下，合成的寡核苷酸具有化學純度和生物學活性。然而，當寡核苷酸以較大規(guī)模合成(達到1毫摩爾)時，在CPG上增加每一個核苷酸的時間約為50-60分鐘，裝配一個具有25個鏈節(jié)的寡核苷酸大約需要25小時。時間的增加是由于合成中使用的固體支持物的體積所致。周期時間的增加使已經(jīng)被裝配的寡核苷酸序列暴露于所有反應步驟(包括二氯乙酸步驟、偶聯(lián)步驟、氧化步驟和加帽步驟)較長的時間。裝配總時間的增加不僅影響該化合物的化學性質和生物學性質，也影響其產(chǎn)率?；瘜W性質和生物學性質主要受脫嘌呤作用、堿基修飾等的影響。
為減少這些問題的影響，可以用二聚體或多聚體合成子(Syn-thon)合成寡核苷酸，從而減少周期數(shù)，并由此減少合成寡核苷酸所需時間。為達到這一目的，幾位研究者都曾為開發(fā)出可接受的二聚體或多聚體合成子方法做出了努力。Khorana(Science 203614-625，1979)用磷酸二酯方法，提出了多聚體合成子的概念。Crea和Itakura(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.755765-5769，1978)；Reese(Tetrahedron Lett.343143-3179，1978)；和Ohtsuka等(NucleicAcids Res.106553-6570，1982)都公開了在磷酸三酯方法中使用二聚體或三聚體合成子的方法。Kumar和Poonian(J.Org.Chem.494905-4912，1984)和Wolter等(Nucleosides and Nucleotides 565-77，1986)公開了用二聚體合成子合成寡核苷酸磷酸二酯的亞磷酰胺方法。Marugg等(Nucleic Acids Res.129095-9110，1984)講述了用二核苷酸硫代磷酸三酯制備含有一個硫代磷酸酯連鍵的寡核苷酸的方法。Connolly等(Biochemistry 233443，1984)；和Coss-tick和Eckstein(Biochemistry 243630，1985)公開了用亞磷酰胺方法在正在增長的寡核苷酸鏈上增加一個二核苷酸硫代磷酸酯的方法。Brill和Caruthers(Tetrahedron Lett.283205，1987)公開了合成胸腺嘧啶二核苷酸甲基硫代膦酸酯的方法。Roelen等(NucleicAcids Res.167633-7645，1988)公開了液相反應中用二聚體核苷酸甲基硫代膦酸酯TA在一短的六聚體寡核苷酸中引入單個甲基硫代膦酸酯連鍵的方法。
上述的研究工作代表了用二聚體或多聚體合成子合成寡核苷酸方法的進展。遺憾的是仍存在一些不足。例如，現(xiàn)有的制備包含有硫代磷酸酯或甲基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵的二聚體核苷酸的化學方法非常復雜。因而，至今已報道的僅有兩例含有甲基硫代膦酸酯的二聚體(TT和TA)。而且，沒有一個現(xiàn)有的二聚體合成子被成功地用于合成唯一由烷基膦酸酯，氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵的寡核苷酸。因而，人們需要一種用簡化的化學方法合成二聚體合成子的新方法，也需要一種用這樣的二聚體合成子裝配寡核苷酸的新方法。
本發(fā)明提供了制備二聚體核苷酸合成子(下文簡稱二聚體塊(dimer block))的新方法，該二聚體塊具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵，并最好為烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵。根據(jù)本發(fā)明這一方面的內(nèi)容，不管二聚體塊中核苷酸間連鍵為何類型，二聚體塊的合成是以單罐液相反應進行的例如，為合成二聚體塊烷基膦酸酯，將核苷3′-烷基亞磷酰胺與3′保護的核苷縮合。為合成二聚體塊氨基磷酸酯，核苷酸之間H-膦酸酯縮合后加入烷基胺。為合成二聚體塊硫代磷酸酯，被保護的單體核苷酸液相偶聯(lián)，進行核苷酸縮合，產(chǎn)生二聚體后，用一適當硫化劑進行硫化作用。為制備二聚體塊烷基硫代膦酸酯，在與所述二聚體塊硫代磷酸酯相同的單罐反應中使用烷基亞膦酰胺。這一簡單的化學方法首次允許合成所有可能的二聚體塊甲基硫代膦酸酯，其中，先前已知的僅有TT和TA，并有助于制備具有3′縮合基的二聚體塊。
這樣，本發(fā)明的第二方面提供了新型的二聚體塊，該二聚體塊包括含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯連鍵的GG、GA、GT、GC、AG、AA、AT、AC、TG、TA、TC、TT、CG、CA、CT或CC，并具有各種保護基和縮合基組合。這些新的二聚體塊也導致了用這些二聚體塊裝配含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯連鍵的寡核苷酸的方法出現(xiàn)。并且，根據(jù)本發(fā)明的二聚體塊首次提供了一種用這些二聚體塊裝配只含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵、或它們的混合連鍵的寡核苷酸的方法。
這樣，本發(fā)明的第三方面提供了用二聚體塊裝配具有烷基膦酸酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯或烷基硫代膦酸酯連鍵或這些連鍵組合的寡核苷酸的方法。本發(fā)明的一個目的是提供減少寡核苷酸的總裝配時間的有效方法。本發(fā)明的另一個目的是提供減少寡核苷酸裝配所需的總溶劑消耗的有效方法。本發(fā)明的又一個目的是提供通過增加全長寡核苷酸的產(chǎn)量，簡化寡核苷酸純化操作的有效方法。本發(fā)明的再一個目的是提供通過減少部分裝配的寡核苷酸對化學藥品暴露的時間來減少副反應的有效方法。本發(fā)明的最后一個目的是通過允許使用廉價的液相化學方法來達到半數(shù)的總合成反應，減少寡核苷酸裝配的總體費用。


圖1表示含有硫代磷酸酯的二聚體塊5′-O-二甲氧基三苯甲基胸苷-3′-O-甲基硫代磷酸酯-5′-O-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷的合成步驟。圖中，(a)是無水乙腈和四唑，(b)是Beau-cage試劑，(c)是四氫呋喃和氟化四丁銨，(d)是在二氯甲烷和4-甲基嗎啉中的三氯亞磷和三唑，DMT是二甲氧基三苯甲基，TBDMS是叔丁基二甲基甲硅烷基，Et3NH+是三乙基銨。
圖2表示含有硫代磷酸酯的二聚體塊5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷-3′-O-甲基硫代膦酸酯-5′-O-胸苷的合成步驟。圖中，(a)是乙腈和四唑，(b)是Beau-cage試劑，(c)是乙酸吡啶和水合肼，(d)是二氯甲烷和4-甲基嗎啡中的三氯亞磷和三唑，DMT是二甲氧基三苯甲基，Lev是乙酰丙?；?levulinyl)，Et3NH+是三乙基銨。合成相應二聚體塊甲基膦酸酯的方法，除在步驟(b)中用I2代替Beaucage試劑外，其余相同。
圖3表示含有硫代磷酸酯的二聚體塊5′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2′-脫氧胞苷-3′-O-氰乙基硫代磷酸酯-5′-O-胸苷的合成步驟。標示同圖2。
圖4表示含有硫代磷酸酯的二聚體塊5′-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲?；?2′-脫氧腺苷-3′-O-硫代磷酸酯5′-O-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷的合成步驟。標示同圖2。
圖5表示根據(jù)本發(fā)明的二聚體塊，其中，R1是諸如二甲氧基三苯甲基、單甲氧基三苯甲基或三苯甲基的保護基，L是烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵，R2是羥基、或β-氰乙基亞磷酰胺或H-膦酸酯縮合基，或諸如乙酰丙?；?、叔丁基、或二甲基甲硅烷基的保護基，B1是G、A、T或C，B2是G、A、T或C。
本發(fā)明涉及用于裝配寡核苷酸的試劑和方法。尤其是本發(fā)明涉及裝配具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸。
首先，本發(fā)明提供了制備二聚體塊的新方法。二聚體塊是具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵和具有5′-羥基端封閉基的核苷酸二聚體。優(yōu)選的封閉基包括叔丁基二甲基甲硅烷基，二甲氧基三苯甲基、乙酰丙酰基、單甲氧基三苯甲基和三苯甲基。二聚體塊的3′位可以有封閉基、自由羥基、H-膦酸酯、磷酸三酯、或β-氰乙基亞磷酰胺基。優(yōu)選的經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵包括硫代磷酸酯、烷基膦酸酯和烷基硫代膦酸酯連鍵。二聚體塊的經(jīng)修飾的連鍵有一個烷氧基或烷基。
從一般意義上來說，根據(jù)本發(fā)明合成二聚體塊的方法可被認為是一種合成具有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵的二聚體單元的方法，該方法包括以下步驟(a)將第一個5′端有保護基，3′端有縮合基的核苷衍生物與第二個3′端有保護基，5′端有羥基的核苷衍生物縮合，形成一個具有還原的核苷酸間連鍵的二核苷酸衍生物，和(b)用適當?shù)难趸瘎⒑塑账衢g連鍵氧化，產(chǎn)生二聚體塊烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代磷酸酯。
準確的二聚體塊的獲得，當然依賴于如下表1所示的第一個核苷衍生物和氧化劑的種類。
表1二聚體塊的合成二聚體塊類型 第一個核苷衍生物 氧化劑烷基膦酸酯核苷-3′-烷基N，N-二異丙 碘基亞磷酰胺氨基磷酸酯核苷-3′-H-膦酸酯 烷基或芳基胺硫代磷酸酯核苷-3′-O-烷基N，N-二異丙基亞磷酰胺硫化劑或核苷-3′-H-膦酸酯烷基硫代膦核苷-3′-烷基N，N-二異丙 硫化劑酸酯 基亞磷酰胺本發(fā)明這一方面內(nèi)容的第一個實施方案中，用這一方法制備了具有5′和3′封閉基和硫代磷酸酯核苷酸間連鍵的二聚體塊。在此實施方案中，該方法包括以下步驟(a)通過亞磷酰胺或H-膦酸酯化學方法，將具有5′封閉基的核苷和具有3′封閉基的核苷連接，和(b)加入適宜的硫化劑，如Beaucage試劑。Beaucage試劑(3H-1，2-苯并二硫酚-3-(一)1，1-二氧化物)在美國專利US NO.5003097中有講述，其內(nèi)容通過參考在此引入。
硫代磷酸酯二聚體塊也可用三酯方法制備。這種情況下，5′-DMT保護的核苷將首先由硫代磷酸化試劑轉變?yōu)榛钚灾虚g體，然后與5′-羥基核苷偶聯(lián)，生成硫代磷酸酯二聚體。然后，該二聚體可被亞磷酸酯化(Phosphitylated)，并用作裝配寡核苷酸硫代磷酸酯和其類似物的合成子。
在本發(fā)明這一方面內(nèi)容的第二個實施方案中，用這一方法制備具有5′封閉基、3′自由羥基和硫代磷酸酯核苷酸間連鍵的二聚體塊。在此實施方案中。該方法包括上述第一個實施方案中的(a)和(b)步驟，還包括對3′-羥基去保護的步驟(c)。這是通過使用僅除去3′保護基的選擇性條件達到的。例如，若5′保護基是二甲氧基三苯甲基，單甲氧基三苯甲基或三苯甲基，3′基是叔丁基二甲基甲硅烷基，則3′基的選擇性去除是通過用氟化四丁基胺處理獲得的。另外，若5′基是二甲氧基三苯甲基，單甲氧基三苯甲基或三苯甲基，3′基是乙酰丙?；?′基的選擇性去除是通過在吡啶/乙酸中用水合肼處理獲得的。
在本發(fā)明這一方面內(nèi)容的第三個實施方案中，用這一方法制備具有5′封閉基，3′H-膦酸酯基和硫代磷酸酯核苷酸間連鍵的二聚體塊。在這一實施方案中，該方法包括上述前兩個實施方案的(a)、(b)和(c)步驟，還包括將自由3′羥基轉變?yōu)镠-膦酸酯基的步驟(d)。該轉變反應在下面實施例5中給予詳細描述。
在本發(fā)明這一方面內(nèi)容的第四個實施方案中，用這一方法制備具有5′封閉基，3′β-氰乙基亞磷酰胺基和硫代磷酸酯核苷酸間連鍵的二聚體塊。在這一實施方案中，該方法包括上述前兩個實施方案的(a)、(b)和(c)步驟，還包括將自由3′羥基轉化為β-氰乙基亞磷酰胺基的步驟(d)。該轉變反應在下面實施例8中給予詳細描述。
本領域的普通技術人員將認識到，作為第三和第四實施方案的改變，根據(jù)已公知的方法，可制備出具有磷酸三酯3′基的二聚體塊。
在本發(fā)明這一方面內(nèi)容的其它實施方案中，用該方法制備具有5′封閉基，烷基硫代膦酸酯、烷基膦酸酯或氨基磷酸酯核苷酸間連鍵，和可能為封閉基、自由羥基、H-膦酸酯基、β-氰乙基氨基磷酸酯基，或磷酸三酯基的3′基的二聚體塊。在這些實施方案中，除起始物為核苷烷基亞磷酰胺外，本方法就按上文所述四個實施方案進行以制備二聚體塊烷基硫代膦酸酯。類似的二聚體塊烷基膦酸酯是按與二聚體塊烷基硫代膦酸酯相同的方式制備的，只是用I2取代硫化劑，類似的二聚體塊氨基磷酸酯是用H-膦酸酯縮合，再用烷基或芳基胺氧化該連鍵而制備的。
本發(fā)明第一方面提供了一種制備二聚體塊產(chǎn)物的方法，該二聚體塊產(chǎn)物作為裝配具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸的中間體是非常有用的。人們能夠在一個罐反應中制備這些二聚體塊，大大簡化了其制備方法。
第二方面，本發(fā)明提供了具有5′封閉基，被修飾的核苷酸間連鍵，和，可能是封閉基、自由羥基、H-膦酸酯基、或一些情況下為β-氰乙基亞磷酰胺或磷酯三酯基的3′基的新二聚體塊產(chǎn)物。制備這些二聚體塊的方法與該二聚體塊中的核苷酸序列無關，因而，可以制備含有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯連鍵的所有可能的二聚體序列，即，GG、GA、GT、GC、AG、AA、AT、AC、TG、TA、TT、TC、CG、CA、CT和CC。這些二聚體示于圖5。
第三方面，本發(fā)明提供了一個用二聚體塊裝配具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸的方法。在這一方面，具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵(即硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯)的二聚體塊被用來裝配具有如此經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸(使用具有5′封閉基和3′β-氰乙基亞磷酰胺基或H-膦酸酯基的二聚體塊)。然后，根據(jù)亞磷酰胺方法或H-膦酸酯方法進行合成反應。寡核苷酸與二聚體塊合成的支持物可以是可溶性聚合體，也可以是不溶性的CPG和聚合物珠。本領域的一般技術人員將認識到，用這一方法也可方便地合成混合的磷酸酯骨架的寡核苷酸，即，具有硫代磷酸酯和烷基硫代膦酸酯，或磷酸二酯和烷基硫代膦酸酯，或磷酸二酯和烷基硫代膦酸酯連鍵，或這里講述的經(jīng)修飾的連鍵之間，或與磷酸二酯連鍵之間的任何一種組合的寡核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法提供了相對于寡核苷酸單體合成方法來說的幾個優(yōu)點。首先，由于只需要半數(shù)的反應循環(huán)，總裝配時間減少一半，對于大規(guī)模合成來說，合成一個寡核苷酸的時間可節(jié)省12小時或更多。這一時間的縮短也導致副反應減少，這是因為部分裝配的寡核苷酸暴露于化學藥品中較短的時間。該方法還通過提高全長寡核苷酸的比率從而便于寡核苷酸的純化，這是因為，該比率與反應進行的循環(huán)數(shù)呈反比。最后，本方法通過減少一半的溶劑消耗和允許使用廉價的液相化學方法進行半數(shù)的總合成反應，從而減少合成的費用。本方法將這些優(yōu)點擴展至全部為硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯連鍵的寡核苷酸和具有上述連鍵的任一組合的寡核苷酸。
下述實施例的目的是為更一步說明根據(jù)本發(fā)明方法的一些優(yōu)選的實施方案，不是為了限定本發(fā)明的內(nèi)容。
實施例15′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷的液相合成該被保護的二聚體塊的合成方法示于圖1。該二聚體塊用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
將5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-0-甲基N，N-二異丙基亞磷酰胺，1、(1.4g，2毫摩爾)與N4-苯甲?；?3′-O(叔丁基二甲基甲硅烷基)-2′-脫氧胞苷，2，(0.88g，2毫摩爾)的混合物溶于無水乙腈(25ml)，并加入四唑溶液(0.45M，10ml)。將反應混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入Beaucage試劑(0.6g溶于15ml無水乙腈中)，并將混合物繼續(xù)攪拌15分鐘。在減壓狀態(tài)下，蒸發(fā)該反應混合物，以除去大部分的乙腈。將粗反應產(chǎn)物用二氯甲烷提取，并用鹽水洗滌。將有機層在Na2SO4上干燥，并蒸發(fā)至干，得到3。將產(chǎn)物3重新溶于四氫呋喃(16ml)，并用1M氟化四丁銨溶液(3ml，THF)處理15分鐘。將反應混合物蒸發(fā)至幾乎干燥狀態(tài)，并在二氯甲烷和水之間進行分配。將有機層在Na2SO4上進行干燥，并蒸發(fā)至較小的體積。用硅膠(2.5×20cm)柱層析技術將該產(chǎn)物純化。用含0-7％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)溶液將二聚體塊產(chǎn)物，4，洗提出來；得到1.3g(產(chǎn)率70％)；未經(jīng)優(yōu)化。
31P NMR＝70.06實施例25′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲酰基-2′-脫氧胞苷-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-胸苷的液相合成該二聚體塊的合成步驟示于圖2，它用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
將N4-苯甲?；?′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧胞苷-3′-O-甲基N，N-二異丙基亞磷酰胺，6，(1.6g，2毫摩爾)和3′-O-乙酰丙?；?胸苷，7，(0.68g，2毫摩爾)的混合物溶于無水乙腈(25ml)，并加入四唑溶液(0.45M，10ml)。將該反應混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入Beaucage試劑(0.6g溶于15ml無水乙腈中)，并將該反應混合物繼續(xù)攪拌15分鐘。然后，將該反應混合物蒸發(fā)，以除去大部分溶劑。用二氯甲烷將粗反應產(chǎn)物抽提，并用鹽水洗滌，得到8。將二氯甲烷蒸發(fā)，把固態(tài)殘余物重新溶于20ml吡啶，并與20ml含有1M水合肼的吡啶/乙酸(3/2)溶液混合。攪拌該反應混合物5分鐘。然后，將該反應混合物在冰浴中冷卻，并加入4ml乙酰丙酮，以猝滅多余的水合肼。將該混合物蒸發(fā)至較小體積，然后直接用于硅膠柱層析(2.5×25cm)。將二聚體塊產(chǎn)物，9，用含有0-7％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)洗提出來，得到1.25g(產(chǎn)率67％)。
31P·NMR＝69.86。
實施例35′-O-二甲氧基三苯甲基-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷-3′-O-氰乙基硫代磷酸酯-5′-O-胸苷的液相合成該二聚體塊的合成步驟示于圖3，它用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
將N4-苯甲?；?5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧胞苷-3′-O-β-氰乙基，N，N-二異丙基亞磷酰胺，11，(1.7g，2毫摩爾)和3′-O-乙酰丙?；?胸苷，7，(0.68g，2毫摩爾)混合物溶于無水乙腈(25ml)，并加入四唑溶液(0.45M，10ml)。將該反應混合物在室溫下攪拌15分鐘。加入Beaucage試劑(0.6g溶于15ml無水乙腈中)，并繼續(xù)進行反應15分鐘。蒸發(fā)該反應混合物，以除去大部分溶劑。純化產(chǎn)物12。以實施例2中，用于產(chǎn)物9描述的相同方法，用水合肼進行去保護反應。用硅膠柱純化后得到二聚體塊，產(chǎn)物13，1.2g(產(chǎn)率59％)。
31P NMR＝67.80。
實施例45′-O-二甲氧基三苯甲基-N6-苯甲?；?2′-脫氧腺苷-3′-O-硫代磷酸酯5′-O-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷的液相合成該二聚體塊的合成步驟示于圖4，該二聚體塊用于合成含有硫代磷酸酯的寡核苷酸。
將N4-苯甲?；?5′-O-二甲氧基三苯甲基-2′-脫氧胞苷-3′-O-甲基N，N-二異丙基亞磷酰胺，15，(4g，5毫摩爾)和3′-O-乙酰丙?；?N6-苯甲酰基-2′-脫氧腺苷，16，(2g，4.4毫摩爾)的混合物溶于無水乙腈(18ml)，并加入四唑溶液(0.45M，22ml)。室溫下攪拌該反應混合物30分鐘，然后用Beaucage試劑(1.4g溶于25ml無水乙腈)處理15分鐘。然后，蒸發(fā)該反應混合物以除去大部分溶劑。將該粗反應產(chǎn)物用二氯甲烷抽提，并用鹽水洗滌。蒸發(fā)二氯甲烷，得到固態(tài)產(chǎn)物，17，然后將其重新溶于40ml吡啶，并加入40ml水合肼濃度為1M的吡啶/乙酸(3/2)溶液。7分鐘后，用冰將反應淬火，用二氯甲烷抽提該產(chǎn)物，然后用水洗滌。將有機層在硫酸鈉上干燥，然后與甲苯共同蒸發(fā)至干燥。將該混合物重新溶于少量二氯甲烷中并用硅膠柱層析(5×12cm)純化。用含有0-7％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)洗提二聚體塊產(chǎn)物18，得到3.8g(產(chǎn)率79％)。
31P NMR＝69.84，69.89。
實施例5二聚體塊的H-膦酸酯衍生作用在含有4.9g(70毫摩爾)三唑的二氯甲烷中(60ml)加入0.62ml三氯亞磷(7毫摩爾)，然后再加入4-甲基嗎啉(7.8ml，70毫摩爾)。室溫下攪拌該混合物30分鐘，然后用冰浴冷卻。逐滴加入根據(jù)實施例1制備的、溶于二氯甲烷(20ml)中的、全保護的二聚體塊，4，5′-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-N4-苯甲?；?2′-脫氧胞苷(1.3g，1.4毫摩爾)的溶液，然后室溫下攪動該混合物30分鐘。用1M TEAB緩沖液(pH7.5)將反應淬滅。用二氯甲烷抽提該混合物，用1M TEAB洗滌一次。將有機提取物蒸發(fā)，得到固態(tài)殘余物，用硅膠柱層析技術(2.5×20cm)進一步純化，用含有O-10％甲醇的二氯甲烷(0.2％TEA)洗提，得到0.97g(產(chǎn)率63％)的H-膦酸酯衍生化的二聚體塊5。
31P NMR＝PV70.0，PIII3.8。
分別根據(jù)實施例2、3和4制備的二聚體塊9，13，和18的H-膦酸酯衍生物是通過上述方法合成的，從而分別得到H-膦酸酯衍生化的二聚體塊10，14和19。
實施例6用H-膦酸酯衍生化的二聚體塊裝配合有硫代磷酸酯的寡核苷酸寡核苷酸的裝配是在1微摩爾的規(guī)模上使用美國專利US NO.5149798講述的在自動合成儀(Millipore Model 8700)上用H-膦酸酯方法(在此引用作為參考)進行的。二聚體塊H-膦酸酯10是溶于乙腈/吡啶(1∶1；V/V)的10mM混合溶液中并存于DNA合成儀的U形貯存管內(nèi)。合成了下述兩種寡核苷酸寡核苷酸15′TCCTTCT寡核苷酸25′TCCTTCT寡核苷酸1是用核苷H-膦酸酯為合成子合成的。對于寡核苷酸2的裝配來說，前兩個偶聯(lián)是用核苷H-膦酸酯進行的，然后與根據(jù)實施例2和5制備的二聚體塊H-膦酸酯10偶聯(lián)。最后兩個偶聯(lián)是用核苷H-膦酸酯進行的。
在寡核苷酸1和2裝配的最后，GPG連接的寡核苷H-膦酸酯中間體是用三乙胺/吡啶/二硫化碳(1∶10∶10；V/V/V)中的5％元素硫氧化的，從而將H-膦酸酯連接轉化成硫代磷酸酯連接。去保護反應是在濃縮氨中，55℃下進行10小時完成的。
產(chǎn)物的分析是用高性能毛細管電泳、離子交換HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳進行的。寡核苷酸1和2的結果相似。
用一個二核苷酸H-膦酸酯5單元成功地裝配寡核苷酸2之后，用實施例1和5制備的核苷H-膦酸酯和二聚體塊H-膦酸酯，4，合成下列具有25個鏈節(jié)的寡核苷酸3。
寡核苷酸35′CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT3′在有下標線的地方，是用二聚體塊H-膦酸酯4進行偶聯(lián)的。其余序列是用核苷H-膦酸酯裝配的。上述序列的裝配完成后，用三乙胺/吡啶/二硫化碳(1∶10∶10；V/V/V)中5％的元素硫將CPG連接的寡聚體氧化，從而將H-膦酸酯連接轉化為硫代磷酸酯連接。甲氧基是用苯硫酚處理而除去的。然后，寡核苷酸的去保護是在濃縮的氫氧化胺中，在55℃下進行10小時而完成的。
通過高性能毛細管電泳、離子交換HPLC和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析寡核苷酸。
實施例75′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷基(thymidyl)-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-胸苷的液相合成該二聚體塊用于合成含有烷基硫代膦酸酯的寡核苷酸的亞磷酰胺方法的步驟示于圖5。
將5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-甲基N，N-二異丙基亞磷酰胺(0.5g，0.74毫摩爾)和3′-O-乙酰丙?；?胸苷(0.25g，0.7毫摩爾)的混合物溶于無水乙腈(7ml)，并加入四唑溶液(0.45M，3.5ml)。室溫下攪動該反應混合物30分鐘，用Beaucage試劑(0.29g溶于10ml無水乙腈)處理15分鐘，然后蒸發(fā)，以除去大部分溶劑。將粗反應產(chǎn)物用二氯甲烷抽提，并用鹽水洗滌。除去二氯甲烷后，將該物質再溶于7.5ml吡啶，并加入含有1M水合肼的吡啶/乙酸(3/2)溶液7.5ml。5分鐘后，在冰浴中冷卻該反應混合物，加入2ml乙酰丙酮，以淬滅過量的水合肼。將該混合物蒸發(fā)至較小體積；然后直接加樣至硅膠柱(2.5×25cm)。用含有0-5％甲醇的二氯甲烷(0.5％吡啶)溶液洗提二聚體塊產(chǎn)物，22，得到0.5g(產(chǎn)率82％)。
31P NMR＝97.7，99.0。
實施例8含有烷基硫代膦酸酯的二聚體塊的β-氰乙基亞磷酰胺衍生化作用在溶于無水THF(5ml)中的、根據(jù)實施例7制備的全保護二聚體塊22，5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷基-3′-O-硫代磷酸甲酯-5′-O-胸苷(0.5g，0.58毫摩爾)的溶液中加入N，N-二異丙基乙胺(0.42ml，2.4毫摩爾)，然后再加入β-氰乙基N，N-二異丙基氯化亞磷酰胺(0.27ml，1.2毫摩爾)。在室溫下氮氣中攪動該反應混合物30分鐘，硅膠TLC(含10％三乙胺的乙酸乙酯)的結果顯示，反應是完全進行的。將沉淀物過濾后，蒸發(fā)反應混合物。將產(chǎn)物用乙酸乙酯抽提，并用碳酸氫鈉和鹽水洗滌。用無水硫酸鈉干燥后，將β-氰乙基亞磷酰胺衍生化的二聚體塊產(chǎn)物，23，蒸發(fā)至較小體積，然后在己烷(-78℃)中沉淀。得到0.51g(產(chǎn)率81％)。
31P NMR＝PV97.7，99.0；PIII149.3，149.7。
這一方法同樣用于制備含有硫代磷酸酯的二聚體塊的β-氰乙基亞磷酰胺衍生物。實施例2、4和1中分別制備的含有硫代磷酸酯的二聚體塊9、18和4，被用于上述方法，以分別獲得β-氰乙基亞磷酰胺衍生化的二聚體塊24、25和26。
實施例9用含有烷基硫代膦酸酯的二聚體塊亞磷酰胺裝配含有烷基硫代膦酸酯的寡核苷酸寡核苷酸的裝配是在1微摩爾的規(guī)模上，在自動合成儀(Milli-pore Model 8700)上用標準亞磷酰胺方法(參見美國專利US NO.5047524，其內(nèi)容通過參考在此引入)和碘氧化方法進行的。將甲基硫代膦酸酯二聚體亞磷酰胺23溶于無水乙腈(25mg/ml)并存于DNA合成儀的U形存貯管內(nèi)。合成出了下列寡核苷酸寡核苷酸4 5′TTTTTTTT寡核苷酸5 5′TTTTTTTT合成寡核苷酸4時，前兩個偶聯(lián)是用保護的胸苷亞磷酰胺(用碘氧化)，然后用甲基硫代膦酸酯二聚體偶聯(lián)(無氧化)。最后三個偶聯(lián)是用保護的胸苷亞磷酰胺進行的(用碘氧化)。最后，去保護是在室溫下用濃縮氨進行1小時而完成的。產(chǎn)物的分析是用高性能毛細管電泳和反相HPLC進行的。
在反相HPLC中，寡核苷酸4的保留時間為18.96分鐘、而寡核苷酸5的保留時間為17.11分鐘。寡核苷酸5保留時間的增加正是由于其含有的一個甲基硫代膦酸酯連接而使其疏水性增加的一個標志。
實施例105′-二甲氧基三苯甲基-胸苷基-3′-O-膦酸甲酯-5′-O-胸苷的液相合成將5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-甲基N，N-二異丙基亞磷酰胺(0.5g，0.74毫摩爾)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷(0.17g，0.5毫摩爾)的混合物溶于無水乙腈(7ml)，并加入四唑溶液(0.45M，3.5ml)。室溫下攪動該反應混合物30分鐘，然后在二氯甲烷和水之間分配。將有機層在無水硫酸鈉上干燥，并蒸干。在殘余物中，加入10ml含2.5％碘的2，6-二甲基吡啶/水/THF(1∶1∶2)溶液，并攪動15分鐘。將該混合物例入亞硫酸氫鈉溶液中，并用二氯甲烷抽提。將溶劑除去后，將產(chǎn)物再溶入5ml吡啶，加入5ml含1M水合肼的吡啶/乙酸(3∶2)溶液。7分鐘后，用冰將反應混合物驟冷，用二氯甲烷和水進行抽提。將該混合物在無水硫酸鈉上干燥并蒸干。將二聚體塊產(chǎn)物在硅膠柱(2.5×25cm)上用含0-5％甲醇的二氯甲烷溶液(0.5％吡啶)進行純化，得到0.25g(產(chǎn)物60％)。
31P NMR＝32.4，33。
二聚體塊烷基膦酸酯的所有其它序列都可用同樣的方式制備。為了將這些具有3′羥基的二聚體塊轉化成它們的H-膦酸酯或β-氰乙基亞磷酰胺衍生物，可將3′羥基二聚體塊分別根據(jù)實施例5或實施例8的方法處理。
實施例115′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷基-3′-O-正丁基氨基磷酸酯-5′-O-胸苷的液相合成將5′-O-二甲氧基三苯甲基-胸苷-3′-H-膦酸酯三乙胺鹽(0.5g，0.7毫摩爾)和3′-O-乙酰丙酰基-胸苷(0.2g，0.6毫摩爾)的混合物溶于6ml無水吡啶/乙腈(1∶1)，并加入溶于同一溶劑(6ml)中的1-金剛烷碳酰氯(0.7g，0.5毫摩爾)。室溫下攪動該反應混合物15分鐘，然后在二氯甲烷和水之間分配。將有機層在無水硫酸鈉上干燥并蒸干。在殘余物中加入10ml含有2％正丁胺的四氯化碳溶液，攪動20分鐘。將產(chǎn)物用二氯甲烷抽提，并用水洗滌。除去溶劑后，將殘余物再溶于5ml吡啶，加入5ml含1M水合肼的吡啶/乙酸(3∶2)溶液。7分鐘后，將反應混合物用冰驟冷，并用二氯甲烷和水抽提。將混合物在無水硫酸鈉上干燥，并蒸干。將正丁基氨基磷酸酯二聚體塊產(chǎn)物在硅膠柱(2.5×25cm)上用含有0-5％甲醇的二氯甲烷溶液(0.5％吡啶)純化，得到0.4g(產(chǎn)率74％)。
31P NMR＝10.9。
二聚體塊氨基磷酸酯的所有其它序列都可用相同的方式制備。通過將正丁胺替換成另一烷基胺或芳基胺可改變該氨化物的性質。為了將這些具有3′-羥基的二聚體塊轉化成它們的H-膦酸酯或亞磷酰胺衍生物，可將3′羥基二聚體塊分別根據(jù)實施例5或實施例8的方法進行處理。
權利要求
1.一種合成具有烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵的二聚體塊的方法，該方法包括以下步驟(a)將第一個具有5′端保護基和3′端縮合基的核苷衍生物，與第二個具有3′端保護基和5′端羥基的核苷衍生物縮合，形成具有還原的核苷酸間連鍵的二核苷酸衍生物，(b)用一適當?shù)难趸瘎┭趸摵塑账衢g連鍵，生成二聚體塊烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯或烷基硫代膦酸酯。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中，該核苷酸間連鍵是氨基磷酸酯連接，該第一個核苷衍生物是一個具有H-膦酸酯縮合基，5′端保護的核苷，并且該氧化劑為烷基胺或芳基胺。
3.根據(jù)權利要求1的方法，其中，該核苷間連鍵是烷基膦酸酯連鍵，該第一個核苷衍生物是5′保護的核苷-3′-烷基N，N-二異丙基氨基磷酸酯，并且該氧化劑為碘。
4.根據(jù)權利要求1的方法，其中，該核苷酸間連鍵為烷基硫代膦酸酯連鍵，該第一個核苷衍生物是一個5′保護的核苷-3′-烷基N，N-二異丙基氨基磷酸酯，并且該氧化劑為硫化試劑。
5.根據(jù)權利要求1的方法，其中，該核苷酸間連鍵為硫代磷酸酯連鍵，該第一個核苷衍生物是一個5′保護的核苷-3′-O-烷基N，N-二異丙基氨基磷酸酯或核苷3′-H-膦酸酯，并且該氧化劑為硫化試劑。
6.如圖5所示的二聚體塊，其中，P為保護基，L為烷基膦酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、或烷基硫代膦酸酯基，G為保護基、羥基、或亞磷酰胺或H-膦酸酯基，B1為G、A、T或C，B2為G、A、T或C。
7.根據(jù)權利要求6的二聚體塊，其中，L為烷基膦酸酯基。
8.根據(jù)權利要求6的二聚體塊，其中，L為氨基磷酸酯基。
9.根據(jù)權利要求6的二聚體塊，其中，L為硫代磷酸酯基。
10.根據(jù)權利要求6的二聚體塊，其中，L為烷基硫代膦酸酯基。
11.根據(jù)權利要求6的二聚體塊，其中，G為亞磷酰胺基或H-膦酸酯基。
12.用二聚體塊裝配含有氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、硫代磷酸酯和/或烷基硫代膦酸酯核苷酸間連鍵的寡核苷酸的方法，該方法包括以下步驟將根據(jù)權利要求11的二聚體塊與正在增長的寡核苷酸鏈上的自由5′羥基縮合，或與連接于固體支持物上的自由羥基縮合。
全文摘要
本發(fā)明提供了用簡化的化學方法合成二聚體塊(具有經(jīng)修飾的核苷間連接的二核苷衍生物)的方法、新型的二聚體塊和用二聚體塊裝配具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的寡核苷酸的方法。
文檔編號C07H21/00GK1122137SQ94191181
公開日1996年5月8日 申請日期1994年1月7日 優(yōu)先權日1993年1月8日
發(fā)明者湯錦炎, 帕特里夏·L·亞達羅拉, 休德海爾·阿格里沃爾 申請人:海布里頓公司