專利名稱：折回三螺旋形成寡核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成寡核苷酸。更詳細(xì)地說，本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的合成寡核苷酸。
自從Zamecnik和Stephenson(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75280-284(1978))首次證實合成寡核苷酸對病毒復(fù)制的抑制以來，人們對作為治療劑的寡核苷酸已引起極大興趣。近些年來，對作為治療劑和基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸的開發(fā)活動也越來越激烈了。最大的進(jìn)展是在可與目標(biāo)mRNA形成Watson-Crick雙螺旋的所謂反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide)的使用上。Agrawal(Trends in Biotechnology，10152-158(1992))詳細(xì)綜述了反義寡核苷酸作為抗病毒藥劑的進(jìn)展情況。
一個同樣重要，但還沒有充分開發(fā)的方法是所謂的反基因寡核苷酸方法(antigene oligonucleotide approach)，其中，寡核苷酸通過Hoogsteen堿基配對與目標(biāo)DNA雙螺旋形成三螺旋。Chang和Pettitt(Prog.Biophys.Molec.Biol.，58225-257(1992))最近曾對后一方法進(jìn)行了綜述。曾觀察到DNA和不同類型的寡核苷酸之間形成的三螺旋結(jié)構(gòu)。Cooney等(Science，241456-459(1988))講述了DNA和寡脫氧核苷酸磷酸二酯之間三螺旋的形成。Latimer等(Nucleic Acids Res.，221549-1561(1989))公開了寡脫氧核苷酸硫代磷酸酯參與的三螺旋的形成。Kibler-Herzog等(NucleicAcids Res.，183545-3555(1990))公開了短的寡脫氧核苷酸甲基膦酸酯參與的三螺旋的形成。也已知了促進(jìn)三螺旋形成的不同的堿基修飾，包括胞嘧啶核苷的C5-甲基化(Xodo等，J.Molec.Biol，195625-5631(1991))，使用二環(huán)胞嘧啶核苷類似物，MODA(Young等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，8810023-10100(1991))，和使用合成α-異構(gòu)核苷酸(Praseuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，851349-1353(1988))。Giovannangeli等(J.Am.Chem.Soc.1137775-7777(1991))講述了在加帽的寡核苷酸5′端加上吖啶插入物也增加三螺旋的穩(wěn)定性。寡核苷酸中介的三螺旋的形成，至少在體外可造成轉(zhuǎn)錄的抑制(參閱Cooney等和Young等前述文獻(xiàn))。
反義寡核苷酸方法和反基因寡核苷酸方法二者都能調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并以此為目標(biāo)，這對理解基因的表達(dá)，和涉及基因表達(dá)的疾病或狀況的治療都是有益的。非常適于達(dá)到這些目標(biāo)的寡核苷酸化合物的兩個主要特點是高度的特異性和結(jié)合后對基因表達(dá)的干擾能力。增強這些特性總是人們所期望的。因而，需有一種具有更強的特異性和能形成更穩(wěn)定的復(fù)合物的新的寡核苷酸，使其比現(xiàn)有化合物具有更強的干擾基因表達(dá)的能力。
本發(fā)明提供了比現(xiàn)有寡核苷酸具有更強特異性和能與目標(biāo)核酸形成更穩(wěn)定復(fù)合物的新的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有一個雙螺旋形成區(qū)，該區(qū)通過Watson-Crick堿基配對與一個單鏈目標(biāo)核酸雜交，并有一個三螺旋形成區(qū)，該區(qū)折回到雙螺旋形成區(qū)與目標(biāo)核酸形成的雙螺旋上，落入大溝，并在此通過Hoogsteen堿基酸對與目標(biāo)核酸形成三螺旋。雙螺旋形成區(qū)和三螺旋形成區(qū)是由連接區(qū)連接在一起的，該連接區(qū)可以是允許雙螺旋形成區(qū)和三螺旋形成區(qū)都結(jié)合到目標(biāo)核酸上的一個寡核苷酸環(huán)或任一種柔韌的化學(xué)結(jié)構(gòu)。因而，根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)核酸與寡核苷酸之間形成的復(fù)合物，在調(diào)節(jié)基因表達(dá)方面，既具有類似于反義方法中的雙螺旋結(jié)構(gòu)的特點，也具有類似于反基因方法中的三螺旋結(jié)構(gòu)的特點。因為同一個寡核苷酸既具有雙螺旋形成的功能也具有三螺旋形成的功能。該結(jié)構(gòu)被稱為折回三螺旋(foldback triplex)，而根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸，即與目標(biāo)核酸結(jié)合而形成折回三螺旋的寡核苷酸被稱為折回三螺旋形成寡核苷酸(foldback triplex-forming oligonucleo-tides)。
折回三螺旋形成寡核苷酸的增強的特異性產(chǎn)生于這樣一個事實，即它們必須兩次解讀目標(biāo)核酸，一次是通過Watson-Crick堿基配對形成雙螺旋，再一次是通過Hoogsteen堿基配對形成三螺旋。折回復(fù)合物提高的穩(wěn)定性產(chǎn)生于寡核苷酸和目標(biāo)核酸之間形成的氫鍵數(shù)目的增加。根據(jù)本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸可用于進(jìn)行不同的參數(shù)下雙螺旋和三螺旋形成動力學(xué)的體外研究。它們也可用于組織培養(yǎng)或動物模型中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)研究。最后，根據(jù)本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸作為治療劑，可用于具有反義和反基因治療方法特點的新型治療方法中。
附圖簡要說明

圖1表示調(diào)節(jié)基因表達(dá)的反義和反基因方法。
圖2表示具有與三螺旋形成有關(guān)的Watson-Crick和Hoogsteen氫的鍵合類型的C-G·C+和T-A·T堿基三聯(lián)體。
圖3顯示根據(jù)本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸，通過Watson-Crick(＝)和Hoogsteen()堿基配對與目標(biāo)核酸結(jié)合。黑鏈代表三螺旋形成區(qū)。
圖4顯示4種不同類型的折回三螺旋。
圖5顯示G四聯(lián)體和A四聯(lián)體的氫的鍵合類型。
圖6顯示折回四螺旋形成引起的分子結(jié)節(jié)。
圖7顯示證實目標(biāo)RNA或DNA與本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸之間折回三螺旋形成的分光光度結(jié)果。
圖8顯示證實目標(biāo)DNA與本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸在pH5.0時形成，但在pH7.4時不形成(除非有多胺精胺存在)折回三螺旋的分光光度結(jié)果。
圖9顯示RNA酶H對結(jié)合于根據(jù)本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸或，結(jié)合于作為對照的雙螺旋形成寡核苷酸的目標(biāo)RNA分子的水解類型。
圖10是圖9所示的RNA酶H水解類型的圖解圖。細(xì)箭頭代表RNA酶H的核酸內(nèi)切酶活性。粗箭頭代表RNA酶H核酸外切酶活性的抑制點。
圖11展示所使用的寡核苷酸，以顯示折回三螺旋復(fù)合體增強的穩(wěn)定性，以及它們之間相互雜交的方式。
圖12A顯示反義寡核苷酸和目標(biāo)序列23所形成的不同復(fù)合物的熔解曲線。圖12B是圖12A所示曲線的一次導(dǎo)數(shù)曲線圖。
圖13是DNA酶I對目標(biāo)序列23的不同復(fù)合物消化的分布圖。
圖14是顯示目標(biāo)序列23形成的復(fù)合物對DNA酶I敏感和保護(hù)的放射自顯影圖。
圖15是顯示與目標(biāo)序列23形成的復(fù)合物泳動率變化的放射自顯影圖。
本發(fā)明涉及用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的合成寡核苷酸。本發(fā)明提供了比現(xiàn)有寡核苷酸具有更高特異性和能與目標(biāo)核酸形成更穩(wěn)定復(fù)合物的合成寡核苷酸。
現(xiàn)有的寡核苷酸中介的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法是反義方法和反基因方法，如圖1所示。在反義方法中，目標(biāo)核酸是一單鏈核酸，基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑是一互補寡核苷酸。該互補寡核苷酸與該目標(biāo)核酸通過互補堿基間的Watson-Crick堿基配對形成雙螺旋?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)可能是通過多種機(jī)制進(jìn)行的，包括RNA酶H對RNA的降解、阻止核糖體在RNA上的功能、或阻止RNA或DNA上酶的功能。相比之下、反基因方法中，目標(biāo)核酸是雙鏈核酸，基因表達(dá)調(diào)節(jié)劑是寡核苷酸，該寡核苷酸能夠落入該目標(biāo)雙螺旋的大溝，與該目標(biāo)雙螺旋的一條鏈形成Hoogsteen堿基配對，例如圖2所示的配對。這一相互作用的結(jié)果是三螺旋的形成?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)可能是通過干擾轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行的。
根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸具有反義和反基因方法兩者的特點。本發(fā)明的寡核苷酸的目標(biāo)核酸是單鏈核酸，同反義方法。本發(fā)明的寡核苷酸有一雙螺旋形成區(qū)，該區(qū)與目標(biāo)核酸互補，并通過互補堿基對之間的Watson-Crick堿基配對與目標(biāo)核酸形成雙螺旋，這一點也同反義方法。然而，本發(fā)明的寡核苷酸也有一個三螺旋形成區(qū)，該區(qū)的核苷酸序列與該寡核苷酸雙螺旋形成區(qū)的核苷酸序列相同，但極性相反，即為一反向重復(fù)或半回文結(jié)構(gòu)。該三螺旋形成區(qū)通過Hoogsteen堿基配對，在該寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)與目標(biāo)核酸形成的雙螺旋大溝中，與目標(biāo)核酸相互作用。這一相互作用的結(jié)果是三螺旋的形成。這樣的復(fù)合物被稱為折回三螺旋(foldback tripl-ex)，圖3所示的是根據(jù)本發(fā)明的兩個寡核苷酸與它們的目標(biāo)核酸形成的兩個復(fù)合物。簡言之，折回三螺旋是一寡核苷酸與一目標(biāo)核酸形成的一復(fù)合物，其中，該寡核苷酸首先與該目標(biāo)核酸形成雙螺旋，然后，該同一個寡核苷酸分子折回來并與在該目標(biāo)核酸和該寡核苷酸之間形成的雙螺旋形成三螺旋。因為本發(fā)明的寡核苷酸能夠與目標(biāo)核酸形成折回三螺旋，該寡核苷酸特此被稱為折回三螺旋形成寡核苷酸。
折回三螺旋形成寡核苷酸確能形成雙螺旋和三螺旋這一事實已被相互獨立的證據(jù)證實。首先，在允許含有胞苷的三螺旋形成鏈參與的Hoogsteen堿基配對形成的條件下(pH5.0，這時胞苷被質(zhì)子化)，折回三螺旋形成寡核苷酸與一目標(biāo)核酸形成一復(fù)合物，該復(fù)合物在熱變性時產(chǎn)生兩個明顯A260增加(每一增加代表一次變性的發(fā)生)。這兩個A260增加發(fā)生的溫度大約在三螺旋和雙螺旋熱變性的預(yù)期溫度?？紤]到G＋C含量，較高溫度(第二個)的A260增加發(fā)生在由Watson-Crick堿基配對形成的復(fù)合物解離時的預(yù)期溫度。較低溫度(第一個)的A260增加被認(rèn)為是由較熱不穩(wěn)定的Hoogsteen堿基配對形成的復(fù)合物的解離引起的。相比之下，若變換條件，阻止含有胞苷的三螺旋形成鏈參與的Hoogsteen堿基配對的形成(ph7.4，這時胞苷不被質(zhì)子化)，只有較高溫度的S260增加可觀察到。并且，在多胺的生理濃度下(3.0mM精胺，穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu))，就恢復(fù)為兩個A260增加。
對由折回三螺旋形成寡核苷酸形成的折回三螺旋結(jié)構(gòu)存在的獨立的支持來自RNA酶H的水解分析。當(dāng)一反義寡核苷酸磷酸二酯和一目標(biāo)RNA(下文實施例2)形成雙螺旋時，該RNA被賦予對RNA酶H消化的敏感性，先由RNA酶H的核酸內(nèi)切酶活性作用，再由RNA酶H的核酸外切酶活性作用。然而，當(dāng)使用折回三螺旋形成寡核苷酸磷酸二酯時，參與三螺旋形成的區(qū)域并不抑制或減弱RNA酶H核酸內(nèi)切酶活性，但抑制RNA酶H的核酸外切酶活性。因而，在反義寡核苷酸或折回三螺旋形成寡核苷酸的專門的雙螺旋形成區(qū)，與其目標(biāo)核酸之間形成雙螺旋時，RNA酶H的核酸外切酶活性不被抑制，而在所有形成三螺旋的區(qū)域中該活性都被抑制。這就提示，若需得到激活RNA酶H的折回三螺旋形成寡核苷酸，只需要留下專門形成雙螺旋和含有激活RNA酶H的核苷酸的一段寡核苷酸(如核苷酸磷酸二酯或硫代磷酸酯)。觀察到的RNA酶H水解的結(jié)果與這樣一個觀念相一致，即三螺旋的形成使RNA酶H的核酸外切酶活性不能觸及雙螺旋的大溝，這是由于三螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生于涉及一寡核苷酸鏈的Hoogsteen堿基的配對，并且該寡核苷酸鏈將大溝占據(jù)。用折回三螺旋形成寡核苷酸硫代磷酸酯或嵌合體應(yīng)得到相同的結(jié)果，因為在嵌合寡核苷酸中的寡核苷酸硫代磷酸酯或單獨的寡核苷酸硫代磷酸酯，在與RNA形成的雙螺旋中也能激活RNA酶H(參閱美國專利NO5149797，其內(nèi)容在本文中引作參考)。兩相變性的觀察的結(jié)果與三螺旋形成區(qū)特異的RNA酶H核酸外切酶抑制現(xiàn)象二者結(jié)合起來，有力地支持了折回三螺旋形成寡核苷酸與其目標(biāo)核酸之間折回三螺旋的形成。這些發(fā)現(xiàn)的意義包括以下方面。它們提示，折回三螺旋形成寡核苷酸能夠干擾與核酸雙螺旋的大溝相互作用的酶的活性，這些很有可能包括任一種加工酶活性(processive enzymatic activity)，如聚合酶活性。另外，與一般的反義寡核苷酸相反，折回三螺旋形成寡核苷酸和它們的目標(biāo)核酸形成的拉鏈狀或夾子狀復(fù)合物不能被核糖體解離。
折回三螺旋形成寡核苷酸一般來說具有至少三個結(jié)構(gòu)特征，一個雙螺旋形成區(qū)，一個三螺旋形成區(qū)，和一個連接區(qū)。本文中提及的完整的折回三螺旋形成寡核苷酸和各個結(jié)構(gòu)區(qū)域，除另有特別說明外，結(jié)構(gòu)特征包括(但不限于)具有5′-3′連接的核糖核苷、2′取代的核糖核苷、和/或脫氧核糖核苷酸聚合物；其中，核苷酸間連鍵可以是天然的磷酸二酯連鍵或人造的連鍵，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基硫代膦酸酯、磺酸酯、氨基甲酸酯和/或磷酸三酯連鍵；并且，這樣的寡核苷酸包括在堿基和/或糖基上具有修飾的寡核苷酸，也包括在3′和/或5′端具有攜帶核酸酶抗性的取代基或大取代基的寡核苷酸。折回三螺旋形成寡核苷酸的選樣示于表1。
折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)的特征是，它具有與目標(biāo)核酸序列足以互補的核苷酸序列，從而在實驗或生理條件下與目標(biāo)核酸序列雜交。該雙螺旋形成區(qū)最好具有約8-50個核苷酸，更優(yōu)選的是，具有約12-約35個核苷酸。作為實驗用途，該目標(biāo)核酸可具有實際上任一種核苷酸序列。然而，當(dāng)折回三螺旋形成寡核苷酸用于治療和醫(yī)學(xué)時，該雙螺旋形成區(qū)最好具有與引起特定疾病或生理狀態(tài)的核酸的核苷酸序列在生理條件下足以互補并雜交的核苷酸序列。一些雙螺旋形成區(qū)具有HIV gag-互補序列的折回三螺旋形成寡核苷酸示于表1。
折回三螺旋形成寡核苷酸的三螺旋形成區(qū)的特征是，其核苷酸序列是雙螺旋形成區(qū)的鏡像，從而與整個或部分雙螺旋形成區(qū)形成回文結(jié)構(gòu)。換句話說，若不考慮任何堿基修飾，三螺旋形成區(qū)的堿基序列是同一個折回三螺旋形成寡核苷酸的全部或部分雙螺旋形成區(qū)的反向重復(fù)(從而與目標(biāo)序列反向互補)。三螺旋形成區(qū)最好至少有8個核苷酸，并且可以是直至雙螺旋形成區(qū)長度的任一長度。在優(yōu)選的實施方案中，三螺旋形成區(qū)的堿基包括5-溴脫氧尿嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶，這兩者在生理pH值或接近生理pH值時促進(jìn)Hoogsteen堿基配對的形成。雙環(huán)胞嘧啶類似物MODA，α-異構(gòu)核苷酸和/或末端吖啶，其它末端插入物，或DNA剪切或修飾劑(如EDTA-FeII和CC-1065)，或疏水或雙親性基團(tuán)(如膽甾醇、環(huán)糊精或多胺)也可出現(xiàn)于三螺旋(或雙螺旋)形成區(qū)，從而促進(jìn)三螺旋的穩(wěn)定性或目標(biāo)核酸的解體。
三螺旋形成寡核苷酸的連接區(qū)是連接雙螺旋形成區(qū)和三螺旋形成區(qū)的柔韌性區(qū)域。連接區(qū)可以是約3個至約10個核苷酸的寡核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，該連接區(qū)是有約5個核苷酸的寡核苷酸?；蛘撸B接區(qū)是一些其它柔韌性化學(xué)結(jié)構(gòu)，如具有約4-20個碳原子的取代的或非取代的烷基或芳香基(如異丙基，鄰二甲苯基)，或核糖或1′，2′-二脫氧核糖鏈。在優(yōu)選的實施方案中，該連接區(qū)是六甘醇。最少時，該連接區(qū)是一個單獨的共價鍵。下面表1列出幾種優(yōu)選方案的折回三螺旋形成寡核苷酸。表1部分折回三螺旋形成寡核酸和一種作為對照的反義寡核苷酸環(huán)或 三螺旋 寡核苷酸雙螺旋形成區(qū)連接區(qū) 形成區(qū) 序列編號5′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT--CACAC--TCTTCCTCTCTCTAC 15′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT----L*----TCTTCCTCTCTCTAC25′-CATCTCTCTCCTTCT--CACAC--TCTTCCTCTC 35′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCACGCT 45′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCACGC55′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCACG 65′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCAC 75′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCCA 85′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACCC95′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTACC105′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTAC 115′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCTA 125′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTCT 135′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCTC145′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTCT 155′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--CTCTC--TTCCTCTC 165′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--TCTCT--TTCCTCTCTCTACCCACGCT 175′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--TCTCT--TTCCTCTCTCTACC185′-TCGCACCCATCTCTCTCCTT--TCTCT--TTCCTCTC 193′-TTCCTCTCTCTACCCACGCT--TCTCT--TCGCACCCATCTCT203′-TTCCTCTCTCTACCCACGCT--TCTCT--TCGCACCC 215′-CTCTCGCACCCATCTCTCTCCTTCT22六甘醇根據(jù)雙螺旋形成區(qū)是在環(huán)或連接區(qū)的該5′一邊至3′一邊，也根據(jù)三螺旋形成區(qū)的長度，折回三螺旋形成寡核苷酸可通過四種不同的方式與目標(biāo)單鏈核酸形成折回三螺旋。這四種構(gòu)型示于圖4。如圖4所示，表1所示的寡核苷酸中，4號和17號形成A型折回三螺旋，而1-3號，5-16號，18號和19號形成C型折回三螺旋，20號和21號形成D型折回三螺旋(這二者也示于圖4)。
因為DNA能呼吸(參閱，如，Ussery和Sindem，Biochemistry，326206，1993)，折回三螺旋形成寡核苷酸可與DNA形成三螺旋(參閱，如，Helene和Toulme，Biochemica et Biophysica Acta99(1990)，第100頁)。
癌細(xì)胞比普通細(xì)胞具有較低的pH值(參閱，如，Lutz F.Tietzein Molecular Aspects of ChemotherapyProceedings of theSecond International Symposium on Molecular Aspects ofChemotherapy，第5章(E.Borowski and D.Shugar Eds.，PergamonPress，1990))。因而，可設(shè)計出僅能在癌細(xì)胞中形成折回三螺旋的折回三螺旋形成寡核苷酸，通過將折回三螺旋形成寡核苷酸設(shè)計成具有短的三螺旋形成區(qū)并含有很多的胞嘧啶(必須質(zhì)子化，最好在低pH值條件下)才能形成Hoogsteen鍵，可在癌細(xì)胞中獲得該寡核苷酸的活性。
通過精心選擇目標(biāo)序列，以及折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋和三螺旋形成區(qū)序列，應(yīng)有可能創(chuàng)造出參與形成四螺旋(a/k/a四螺旋)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。這種寡核苷酸應(yīng)被稱為折回四螺旋形成寡核苷酸，因為同一個核苷酸與目標(biāo)核酸參與不同類型的Hoogsteen堿基的配對，以形成四螺旋。對四條并排的、不同的鏈和僅限于分子內(nèi)部構(gòu)型的四螺旋較高級結(jié)構(gòu)已進(jìn)行過描述(參閱，如，Zimmerman等，J.Mol.Biol.92181-192(1975)； Lee等，NucleicAcids Res.84305-4320(1980)；Sen和Gilbert，Nature334364-366(1988)和344410-414(1990))。然而，具有可使其與單鏈目標(biāo)核酸形成四螺旋的結(jié)構(gòu)的寡核苷酸還未見描述。在這種寡核苷酸中，目標(biāo)核酸和寡核苷酸應(yīng)含有四個相連的G堿基或與G堿基相鄰的A堿基，以形成四螺旋形成所需的四聯(lián)體。G四聯(lián)體包含對稱地分布于一個中心軸周圍的以Hoogsteen方式氫鍵連結(jié)在一起的四個G堿基，如圖5所示。由分子模型推測的A四聯(lián)體包含由類似的Hoogsteen方式氫鍵連結(jié)在一起的四個A堿基，也如圖5所示。A4四聯(lián)體中心配置的6-NH2基影響該結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并且不利于四螺旋DNA中相連著的A4四聯(lián)體。然而，相鄰的G4四聯(lián)體通過G4四聯(lián)體的O6羰基氧和A4四聯(lián)體的N6氨基質(zhì)子之間有利的靜電相互作用的穩(wěn)定作用，有利于A4四聯(lián)體的形成。同樣，已知存在有C+4四聯(lián)體和U4四聯(lián)體。
能夠形成折回四螺旋的本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸可用于研究四螺旋的結(jié)構(gòu)，最近對其生物學(xué)意義已引起關(guān)注(參閱，如，Blackburn，Nature，350569-573，1991)。另外，這類寡核苷酸可與單鏈mRNA或雙鏈RNA或DNA相互作用，形成復(fù)雜的分子結(jié)節(jié)，如圖6所示的與mRNA作用的情況。這種結(jié)構(gòu)應(yīng)能強烈抑制mRNA到蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯，或RNA或DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄，并且應(yīng)該對細(xì)胞培養(yǎng)中基因表達(dá)調(diào)節(jié)的研究和作為治療劑都是非常有用的。
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)已知的合成寡核苷酸的任一種方法都可合成本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸。例如，美國專利5,047,524講述了寡核苷酸的亞磷酰胺合成方法，其內(nèi)容結(jié)合在本文中作為參考。還有美國專利5,149,748講述了寡核苷酸合成的優(yōu)化的H-膦酸酯方法，其內(nèi)容結(jié)合在本文中作為參考，在將任一個羥基首先用一適當(dāng)?shù)?，如二甲氧基三苯甲基的保護(hù)基保護(hù)，將任一存在的氨基用一適當(dāng)?shù)模缛阴；谋Ｗo(hù)基保護(hù)，并將一端連接于適當(dāng)?shù)摹⑷绂?氰乙基亞磷酰胺或H-膦酸酯基的偶聯(lián)基的條件下，也可根據(jù)這些方法合成含有非寡核苷酸連接區(qū)的折回三螺旋形成寡核苷酸。
本發(fā)明的三螺旋形成寡核苷酸可用于多種目的。首先，它們可用于核酸三螺旋形成的體外研究。在一個折回三螺旋形成寡核苷酸中，可以改變多種參數(shù)，如核苷酸間連鍵類型、堿基修飾、連接長度和柔韌性能等，以研究三螺旋形成和解離的動力學(xué)，這可能是一個重要的生物學(xué)過程。另外，折回三螺旋形成寡核苷酸可代替?zhèn)鹘y(tǒng)的反義寡核苷酸，用于組織培養(yǎng)和動物模型中的基因表達(dá)研究。在這些系統(tǒng)中，折回三螺旋形成寡核苷酸的提高了的特異性和復(fù)合物的穩(wěn)定性應(yīng)該是有益的。
最后，折回三螺旋形成寡核苷酸可作為治療劑用于與特定基因表達(dá)有關(guān)的疾病或生理不適的治療。適于用特定的折回三螺旋形成寡核苷酸治療的疾病或身體不適依賴于生理條件下雙螺旋形成區(qū)足以互補并雜交的核苷酸序列。許多情況下，該核酸序列為病毒核酸序列。使用反義寡核苷酸來抑制各種病毒的方法已公知，最近在Agrawal，Tibtech，10152-158(1992)中有綜述。反義抗病毒方法中獲得的知識可用于雙螺旋形成區(qū)。對許多病毒的可與有效的反義寡核苷酸雜交的病毒核酸序列已有描述，包括人類免疫缺陷I型病毒(U.S Patent NO 4806463，其內(nèi)容結(jié)合在本文中作為參考)、單純性皰疹病毒(U.S Patent NO 4689320，其內(nèi)容結(jié)合在本文中作為參考)，流感病毒(U.S.Patent NO 5194428，其內(nèi)容結(jié)合在本文中作為參考)，和人類乳頭瘤病毒(Storey等，Nucleic Acids Res.，194109-4114(1991))?？膳c這些核酸序列中的任一種序列雜交的序列都可用作。折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)，與來自其它病毒的核酸序列互補的核苷酸序列也一樣可用作折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)。已知核酸序列的，并可制備出與該序列作用的折回三螺旋形成寡核苷酸的另外一些病毒包括，但不限于，口蹄疫病毒(參閱Robertson等，J.Virology，54651(1985)；Harris等，J.Virology，36659(1980))，黃熱病病毒(參閱Rice等，Science，229726(1985))，水痘—帶狀皰疹病毒(參閱Davison和Scott，J.Gen.Virology，672279(1986))，黃瓜花葉病毒(參閱Richards等，Virology，89395(1978))，乙型肝炎病毒(參閱Raney和McLachlen，in Molecular Biology of Hepatitis B Virus(CRC Press，1991))，丙型肝炎病毒(參閱Miller和Purcell，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，872057-2061(1990)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA894942-4946(1992)；J.General Virology，74661-668(1993))，和呼吸道合胞病毒(參閱Collins，in The Paramyxo Viruses，第四章，第103-162頁(David W.Kingsbury，Ed.，1991))。或者，雙螺旋形成區(qū)可以具有與致病生物的核酸序列互補的核苷酸序列。已對多種致病生物的核酸序列進(jìn)行過描述，包括致瘧疾生物惡性瘧原蟲，和許多致病細(xì)菌?？膳c任一種這類致病生物的核酸序列雜交的核苷酸序列都可構(gòu)成折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)。已知核酸序列并對該序列可制備出折回三螺旋形成寡核苷酸的致病真核生物的實例包括，但不限于，岡比亞布氏錐蟲和利什曼原蟲(參閱Campbell等，Nature，311350(1984))，肝片吸蟲(參閱Zurita等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，842340(1987))。制備抗真菌折回三螺旋形成寡核苷酸可用，如，與幾丁質(zhì)合成酶基因的核酸序列互補的核苷酸序列作為雙螺旋形成區(qū)，制備抗細(xì)菌折回三螺旋形成寡核苷酸可用，如，丙氨酸消旋酶基因。在另一個實施方案中，折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)可具有與細(xì)胞基因或基因轉(zhuǎn)錄物互補的核苷酸序列，該細(xì)胞基因或基因轉(zhuǎn)錄物的異常表達(dá)或異常產(chǎn)物導(dǎo)致疾病的發(fā)生。對幾種這類細(xì)胞基因的核酸序列已有描述，包括朊病毒蛋白(Stahl和Prusiner，F(xiàn)ASEB J.，52799-2807(1991))，與早老性癡呆(Alzheimer′s disease)癥相關(guān)的淀粉樣蛋白(U.S Patent NO5015570，其內(nèi)容結(jié)合入本文中作參考)，和各種公知的癌基因和原癌基因，如c-myb，c-myc，c-abl，和n-ras。另外，抑制主要或?qū)ｉT與精子發(fā)生，精子運動，精子與卵子結(jié)合或其它影響精子存活的任一步驟相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白或酶的合成的寡核苷酸可被用作男人的避孕藥物。同樣，用于婦女的避孕藥物可以是抑制與排卵，受精，植入或參與那些過程的激素的生物合成相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶的寡核苷酸。高血壓可通過寡核苷酸抑制血管緊張肽原酶/血管緊張肽系統(tǒng)中的血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶或相關(guān)的酶的合成來進(jìn)行控制；血小板凝集可通過抑制合成血栓烷A2所需的酶的合成來控制，用以治療心肌和腦的循環(huán)障礙、梗塞、動脈硬化、栓塞和血栓的形成；膽固醇在動脈壁的沉積可通過抑制脂酰輔酶A動脈硬化中的膽固醇?；D(zhuǎn)移酶的合成來抑制；抑制膽堿磷酸轉(zhuǎn)移酶的合成可能對低脂血(hypo-lipidemia)非常有益。有許多神經(jīng)異?？捎谜刍厝菪纬晒押塑账釡p輕或消除其負(fù)面效應(yīng)。例如，抑制單胺氧化酶的合成可用于帕金森氏病(Parkinson′s disease)；抑制兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶可用于治療抑郁癥；抑制吲哚N-甲基轉(zhuǎn)移酶可用于治療精神分裂癥。抑制從花生四烯酸級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致生成前列腺素和白細(xì)胞三烯中選出的酶，可能用于控制血小板凝集、變態(tài)反應(yīng)、炎癥、疼痛和哮喘。抑制由多種藥物抗性(mdr)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)(該蛋白質(zhì)導(dǎo)致對各種抗癌藥物的抗性的產(chǎn)生從而成為化學(xué)療法中的主要障礙)，在癌癥的治療中可能非常有益。與上述任一種基因的核酸序列互補的核苷酸序列都可用作本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)；同樣，與其它任一種細(xì)胞基因或基因轉(zhuǎn)錄物(其異常表達(dá)或其異常產(chǎn)物導(dǎo)致疾病的發(fā)生)互補的寡核苷酸序列也可用作本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸的雙螺旋形成區(qū)。植物細(xì)胞中基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)在美國專利5107065中已有描述，其內(nèi)容結(jié)合在本文中作為參考。由于雙螺旋形成區(qū)的核苷酸序列能與基本上任一種基因形成Watson-Crick堿基配對，折回三螺旋形成寡核苷酸的治療范圍應(yīng)該是很寬的。然而，有幾種疾病特別引起人們的關(guān)注。例如各種病毒性疾病可用折回三螺旋形成寡核苷酸治療，包括AIDS、ARC、口腔或生殖器皰疹、乳頭瘤肉贅、流感、口蹄疾、黃熱病、水痘、帶狀皰疹、HTLV-白血病、和肝炎?？捎烧刍厝菪纬晒押塑账嶂委煹恼婢约膊≈杏心钋蚓　⒔M織胞漿菌病、隱球菌病、芽生菌病、曲霉病、孢子絲菌病、著色芽生菌病、dematophytosis和球孢子菌病。該方法也能用于治療立克次氏體病(如、斑疹傷寒、落磯山斑疹熱)，和由沙眼衣原體或性病性淋巴肉芽腫引起的性傳播疾病。多種可用折回三螺旋形成寡核苷酸治療的寄生蟲病包括阿米巴病、Chegas′病、虧形體病、肺孢子蟲病、賈第鞭毛蟲病、隱孢子蟲病、滴蟲病、和卡氏肺囊蟲肺炎；以及蠕蟲病(腸蟲病)，例如蛔蟲病、絲蟲病、旋毛蟲病、血吸蟲病和線蟲或絳蟲感染。用折回三螺旋形成寡核苷酸可治療瘧疾，不管是它是由惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵形瘧原蟲引起的或由三日瘧原蟲引起的。上文所述的傳染性疾病都能用折回三螺旋形成寡核苷酸治療，因為這些疾病的傳染因素都是已知的，因而可制備出根據(jù)本發(fā)明的折回三螺旋形成寡核苷酸，其目標(biāo)形成區(qū)具有可與傳染因子的傳播必須的核酸序列(如必須的基因)雜交的核酸序列。
下述實施例的目的是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，不是為了限定其內(nèi)容。實施例1用分光光度計證實折回三螺旋的形成將目標(biāo)RNA或DNA和折回三螺旋形成寡核苷酸(均為0.2 A260單位)干燥，然后一同溶于500μl 100mM乙酸鈉/1mM EDTA(乙二胺四乙酸)中。加熱該溶液至80℃，保持30分鐘，并緩慢冷卻至室溫，然后在4℃培養(yǎng)12小時。然后將該溶液以0.5℃/分鐘的速率加熱至80-90℃，在此期間測定A260值。A260的增加是螺旋結(jié)構(gòu)解離的標(biāo)志。這些研究的結(jié)果綜合于下面表2。
在pH5.0的乙酸鈉緩沖液中進(jìn)行起始研究，其中，胞嘧啶被質(zhì)子化，并能與鳥嘌呤形成Hoogsteen堿基配對。在這些研究中，寡核苷酸1和2(參閱表1)以兩個明顯A260變換(參閱圖7)與互補RNA或DNA結(jié)合。寡核苷酸1和互補DNA在59.5和65.8℃顯示A260變換。寡核苷酸2具有六甘醇連接區(qū)，在58.8和65.6℃與互補DNA，在55.3和64.3℃與互補RNA顯示A260變換。這些結(jié)果顯示，寡核苷酸1和2都形成折回三螺旋，即與RNA和DNA形成雙螺旋和三螺旋，并且在大約預(yù)期的溫度下雙螺旋解離和在較低的溫度下三螺旋先解離。
為進(jìn)一步測試該結(jié)果的這種解釋，在與起始研究相同的條件下，只是乙酸鈉緩沖液的pH值為7.4，進(jìn)行另一個實驗。在這些條件下，觀察到較高溫度的A260變換。但觀察不到較低溫度的A260變換。這進(jìn)一步支持了在pH5.0觀察到的兩個變換是雙螺旋和三螺旋的形成和解離這一解釋。因為pH7.4時胞嘧啶不被質(zhì)子化，因而不能形成三螺旋結(jié)構(gòu)必須的Hoogsteen氫鍵(參閱圖2)。
最后，為測試這些寡核苷酸在生理條件下是否能與互補RNA或DNA形成折回三螺旋，用寡核苷酸4(參閱表1)，除了乙酸鈉緩沖液為pH7.4并含有3.0mM精胺，在與初始研究相同的條件下進(jìn)行一個實驗。在這些條件下，恢復(fù)了兩個明顯的A260變換(見圖8)。這些結(jié)果顯示，這些寡核苷酸在生理條件下(含有毫摩爾量的多胺)確能形成折回三螺旋。
表2折回三螺旋的分光光度分析結(jié)果Tm.℃*序列三螺旋 雙螺旋 條件(pH)編號 DNA RNA DNA RNA1 58.8- 65.6 - 5.02 59.555.365.8 64.35.03 56.5- 61.3 - 5.04 N**- 65.8 - 7.44 56.0- 68.8 - 7.4＋S**** 兩個值的平均值** 沒有觀察到*** 表示加有精胺實施例2雙螺旋和折回三螺旋的RNA酶H水解分析為檢驗折回三螺旋形成對用以RNA為底物酶活性的影響效果，進(jìn)行RNA酶H的水解分析。在這些研究中，使用具有HIV-1 gag RNA序列的長度為39的核糖核苷酸(RNA)。將該39聚體，5′-AGAAGGAG-AGAGAUGGGUGCGAGAGCGUCAGUAUUAAGC-3′，5′端用32P標(biāo)記，并與不同濃度的專門的雙螺旋形成(反義)或折回三螺旋形成寡核苷酸(DNA)，在30μl 20mM Tris(三羥甲基氨基甲烷)—HCl，pH7.5/10mM MgCl2/100mM KCl，0.1mM DTT(二硫蘇糖醇)，3mM精胺，5％蔗糖(重量/體積)，和40單位RNasin(Promega)中，在4℃溫浴12小時。取出7μl的等分試樣作對照，在剩余試樣中加入10μl(0.8單位)E.coli RNA酶H(Promega)，然后在室溫下溫浴。RNA酶H處理開始后的1、10和20分鐘取出等分試樣。然后將對照和實驗等分試樣用20％變性PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)分析。
圖9是這些實驗所得的放射自顯影圖。這些結(jié)果顯示，折回三螺旋的形成并不抑制RNA酶H的核酸內(nèi)切酶活性，但確實抑制RNA酶H的核酸外切酶活性。這些結(jié)果用圖解法示于圖10，其中，寬箭頭指示觀察到的RNA酶H核酸外切酶抑制點。細(xì)箭頭指示RNA酶H的核酸內(nèi)切酶活性點。當(dāng)RNA酶H作用于底物時，它首先在接近寡核苷酸5′端雙螺旋和單鏈接合處，在RNA上產(chǎn)生一個核酸內(nèi)切切口，然后用核酸外切酶活性從核酸內(nèi)切切口位點降解RNA。在專門的雙螺旋形成的對照中(寡核苷酸22)，在圖9中只見到兩條帶，一個產(chǎn)生于RNA酶H的核酸內(nèi)切活性(慢泳動帶)，一個產(chǎn)生于RNA酶H的核酸外切酶活性(較快泳動帶)。由于沒有抑制的核酸外切酶活性的作用，觀察不到中間的泳動帶。相比之下，當(dāng)使用折回三螺旋形成寡核苷酸時，總存在幾個中間泳動帶。這些帶表示幾個位點對RNA酶H核酸外切酶活性的抑制，這是由于三螺旋的形成封閉了大溝所致。實施例3總的來說，折回三螺旋結(jié)構(gòu)應(yīng)賦予反義寡核苷酸兩個重要的性質(zhì)。1)折回三螺旋復(fù)合物應(yīng)比雙螺旋和常規(guī)三螺旋具有更強的穩(wěn)定性，2)折回三螺旋形成寡核苷酸應(yīng)比常規(guī)反義和反基因(三螺旋)寡核苷酸呈現(xiàn)更強的特異性。
我們設(shè)計了幾種可形成折回三螺旋的寡核苷酸，以進(jìn)一步驗證上述的兩個特性。請參閱圖11。我們從HIV-I的gag mRNA區(qū)選出了一段16堿基長的純嘌呤片段作為目標(biāo)序列，并將其包含于一段30堿基長的序列中(序列編號23，圖1)。預(yù)期寡核苷酸序列24和25通過折回三螺旋結(jié)構(gòu)與目標(biāo)結(jié)合，如圖11所示。寡核苷酸26僅通過雙螺旋的形成與目標(biāo)結(jié)合。伸出的區(qū)域不形成三螺旋，因為它是一段非配對序列。該段寡核苷酸充當(dāng)對照，以驗證寡核苷酸24和25是否形成預(yù)期的折回三螺旋。寡核苷酸27通過雙螺旋的形成與目標(biāo)結(jié)合。寡核苷酸28是一段常規(guī)的三螺旋形成序列。熱變性研究在100mM乙酸鈉，pH5.0和7.4；98mM乙酸鈉和10mM氯化鎂，pH5.0和6.5的緩沖液中進(jìn)行熱熔解研究。將0.2 A260單位的每種反義寡核苷酸(序列編號24-28)與等量的目標(biāo)序列23混合，并在快速真空器中干燥。將干燥的寡核苷酸溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中，加熱至95℃，保持10分鐘，緩慢冷卻至室溫，然后置于4℃過夜。每種樣品的熔解溫度是在連于一個熱控制器的Perkin-Elmer Lambda 2分光光度計上測量的。加熱速率為0.5℃/分。從一次導(dǎo)數(shù)曲線求出的Tm值列于表3。98mM乙酸鈉和10mM氯化鎂、pH5.0緩沖液中典型的熔解曲線及其一次導(dǎo)數(shù)曲線圖示于圖12。
表3反義寡核苷酸與目標(biāo)序列23在不同的鹽和pH條件下的Tm值100mM 98mM 98mM 100mM復(fù)合物 NaOAc*NaOAc+NaOAc+NaOAc(pH5.0)MgCl2MgCl2(pH7.4)(pH5.0) (pH6.5)23＋27 41.0 51.3 53.4 44.023＋27＋28 41.1 52.1 53.5 44.123＋24 46.7 58.842.1；50.5 39.523＋25 47.1 59.442.6；50.2 39.623＋26 36.7 48.2 50.5 38.9*NaOAc為乙酰鈉與23僅形成雙鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸27，在乙酸鈉和氯化鎂、pH5.0的緩沖液中的Tm值為51.3℃。在相同條件下，由寡核苷酸23、27和28形成的常規(guī)三螺旋顯示兩個明顯的熔解變換，一個在20.5℃，另一個在52.1℃。較低溫度變換可歸結(jié)于第三條鏈，寡核苷酸28的解離，較高溫度變換則代表了寡核苷酸23和24形成的雙螺旋的變性。在相同條件下，寡核苷酸24和25各自與23分別呈現(xiàn)出58.8和59.4℃的Tm值。與常規(guī)三螺旋的情況一樣，沒有觀察到其它明顯的變換(見圖12)。作為對照的寡核苷酸26，由于三螺旋形成區(qū)不配對，僅形成雙螺旋，其Tm值為48.2℃。這表明該伸出的序列促使雙螺旋結(jié)構(gòu)一端的解離，從而導(dǎo)致較低Tm值的產(chǎn)生。類似地，在用寡核苷酸24和25時，若寡核苷酸的三螺旋形成區(qū)沒有結(jié)合，與寡核苷酸26的情況一樣，將得到較低的Tm值。在pH7.4的緩沖液中(表3)，這時胞嘧啶不被質(zhì)子化，不能形成完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，這一情況可清楚地觀察到。在這些條件下，由寡核苷酸23與寡核苷酸24、25和26分別形成的復(fù)合物具有相近Tm值，該Tm值低于與寡核酸27得到的Tm值。所有這些結(jié)果結(jié)合起來明確地證實了，在適當(dāng)?shù)臈l件下形成了折回三螺旋，并且比常規(guī)反義雙螺旋和反基因三螺旋結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。折回三螺旋的形成促進(jìn)了所形成的整個復(fù)合物的穩(wěn)定性能。實施例4DNA酶I水解測試用實施例3所討論的同樣的寡核苷酸，我們通過兩種方法進(jìn)行了DNA酶I的水解測試。
分光光度計方法DNA酶I是一種核酶內(nèi)切酶，它在鎂離子的存在下將脫氧核糖核酸水解至單核苷酸水平，沒有強的序列選擇性。雙鏈DNA是其最適底物，但在某種程度上也水解單鏈DNA。當(dāng)DNA被水解成短片段或單體時，260nm處的光吸收將增加。在這一實驗中，我們測量了DNA酶I對雙鏈和單鏈寡核苷酸的水解引起的隨著時間的光吸收增加程度。DNA酶I不水解三鏈DNA結(jié)構(gòu)。
以前節(jié)所述的方式制備樣品。將每一樣品在20℃平衡10分鐘，加入4單位DNA酶I，并混勻，將260nm吸收值作為時間的函數(shù)記錄在Perkin-Elmer Lambda 2分光光度計上。
圖13顯示隨著時間的對單、雙和三鏈結(jié)構(gòu)的水解結(jié)果。24和25與23形成的復(fù)合物具很強的DNA酶I抗性，表明它們具有不同于單鏈和雙鏈的結(jié)構(gòu)。然而，寡核苷酸26(不形成三螺旋)和27(僅形成雙螺旋)被很快地水解。目標(biāo)寡核苷酸23是單鏈結(jié)構(gòu)，也被水解，但其水解速度低于雙鏈。與寡核苷酸23、27和28形成的常規(guī)三螺旋對DNA酶I具有抗性。然而，由于常規(guī)三螺旋較低的穩(wěn)定性，觀察到隨著時間的緩慢水解。
凝膠電泳方法該方法使用32P 5′末端標(biāo)記的寡核苷酸23。將目標(biāo)序列23用T4多核苷酸激酶進(jìn)行32P 5′末端標(biāo)記。將等于3000-5000cpm的末端標(biāo)記的寡核苷酸加進(jìn)適量的同一種無標(biāo)記的寡核苷酸中，使其濃度達(dá)到0.2 A260單位，與等量的反義寡核苷酸(核酸編號24-28)在100mM乙酸鈉，pH5.0、10mM氯化鎂緩沖液中混合，加熱至95℃，冷卻，4℃過夜，如熱變性研究一節(jié)所述。然后，將每個樣品用2單位DNA酶I在20℃處理10分鐘，將水解產(chǎn)物在含有7M尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行分析。
顯示在DNA酶I存在下，不同復(fù)合物水解類型的放射自顯影圖示于圖14?？汕宄乜吹?，單鏈結(jié)構(gòu)的寡核苷酸23，以及寡核苷酸26和27與23形成的雙鏈結(jié)構(gòu)被完全消化(分別為6、2和1道)。相比之下，與24和25形成的折回三螺旋結(jié)構(gòu)具有很高的抗性(分別為4和5道)，常規(guī)三螺旋有一定程度的水解(3道)。這些進(jìn)一步證實了折回三螺旋的形成以及它們的穩(wěn)定性比常規(guī)三螺旋結(jié)構(gòu)高。實施例5凝膠泳動變化分析我們用與實施例3所討論的同樣的寡核苷酸，通過凝膠泳動變化分析，進(jìn)一步檢驗折回三螺旋的形成。其原理是，在非變性凝膠上，由于分子量的影響，三螺旋結(jié)構(gòu)應(yīng)比雙螺旋結(jié)構(gòu)泳動得慢。使用與實施例4凝膠電泳部分所描述的一樣的方法，只是緩沖液中不含有氯化鎂，樣品不用DNA酶I處理。樣品是在20％不含尿素的原本的聚丙烯酰胺凝膠上分析的。一個典型的放射自顯影圖示于圖15。該放射自顯影圖顯示出單獨的寡核苷酸23(1道)和存在有寡核苷酸27(2道)，27和28(3道)，24(4道)，25(5道)和26(6道)的情況。寡核苷酸24和25的復(fù)合物確實形成了折回三螺旋，它在膠上比單鏈、雙鏈和常規(guī)三螺旋結(jié)構(gòu)運動得都慢。24和25的復(fù)合物比26的復(fù)合物運動得稍快，雖然整個復(fù)合物的分子量和電荷都相同。這是由于與24和25形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)具有高度的有序性和致密性。這些進(jìn)一步支持了折回三螺旋的形成。用RNA作目標(biāo)序列得到相似的結(jié)果。實施例6折回三螺旋形成寡核苷酸的序列特異性折回三螺旋寡核苷酸兩次解讀目標(biāo)序列，第一次是它與目標(biāo)序列形成雙螺旋時，第二次是它折回到已形成的雙螺旋上形成三螺旋。正因為如此，我們預(yù)期這些寡核苷酸比常規(guī)的反義(與單鏈目標(biāo)序列僅形成雙螺旋)和反基因(與雙鏈目標(biāo)序列形成三螺旋)寡核苷酸顯示更高的特異性。
為檢驗折回三螺旋形成寡核苷酸的序列特異性，我們合成了幾種類似于目標(biāo)序列的寡核苷酸，但在幾個位點含有錯配堿基，與寡核苷酸25和27通過熱熔解實驗進(jìn)行研究。與寡核苷酸23(完全匹配的目標(biāo)序列)相比的、由目標(biāo)序列中錯配堿基引起的Tm值變化(ΔTm)的結(jié)果示于表4。在所有情況下，折回三螺旋形成寡核苷酸25的ΔTm大于雙螺旋形成寡核苷酸27的ΔTm，表明25比常規(guī)的反義寡核苷酸27具有更強的特異性。表4折回三螺旋的序列特異性
>*FbT＝折回三螺旋結(jié)構(gòu)+D＝雙螺旋結(jié)構(gòu)**nd＝?jīng)]有確定序列表(1)綜合信息(i)申請人Kandimalla，Ekambar RAgrawal，Shuhir(ii)發(fā)明題目折回三螺旋形成寡核苷酸(iii)序列數(shù)22(iv)通信地址(A)ADDRESSEEAllegretti & Witcoff，Ltd(B)STREET10 South Wacker Drive(C)CITYBoston(D)STATEMassachusetts(E)COUNTRYU.S.A.
(F)ZIP02109(v)計算機(jī)可讀方式(A)媒介類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件Patentin Release#1.0，Version#1.25(vi)目前的申請情況(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(viii)代理人(A)姓名Greenfield，Michael S(B)登記號37,142(C)案號93,000-A(ix)通訊號碼(A)電話617/345-9100(B)傳真617/345-9111(2)序列編號(SEQ ID NO)1(i)序列特征
(A)長度45堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號1CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTCACAC TCTTCCTCTC TCTAC 45(2)序列編號2(i)序列特征(A)長度40堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號2CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCTTCTTC CTCTCTC TAC 40(2)序列編號3(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號3CATCTCTCTC CTTCTCACAC TCTTCCTCTC 30(2)序列編號4(i)序列特征(A)長度45堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號4TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC ACCCT 45(2)序列編號5(i)序列特征(A)長度43堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號5TCGCACCATC TCTCTCCTTC TCTCTTCCTC TCTCTACCCA CGC 43(2)序列編號6(i)序列特征(A)長度43堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號6TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC ACG43(2)序列編號7(i)序列特征(A)長度42堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號7TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC AC 42(2)序列編號8(i)序列特征(A)長度41堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號8TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC A 41(2)序列編號9(i)序列特征(A)長度40堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號9TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACCC40(2)序列編號10(i)序列特征(A)長度39堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號10TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTACC 39(2)序列編號11(i)序列特征(A)長度38堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號11TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTAC 38(2)序列編號12(i)序列特征
(A)長度37堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號12TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCTA37(2)序列編號13(i)序列特征(A)長度36堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號13TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTCT 36(2)序列編號14(i)序列特征(A)長度35堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號14TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCTC 35(2)序列編號15(i)序列特征(A)長度34堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號15TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTCT34(2)序列編號16(i)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號16TCGCACCCAT CTCTCTCCTT CTCTCTTCCT CTC 33(2)序列編號17(i)序列特征(A)長度45堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號17TCGCACCCAT CTCTCTCCTT TCTCTTTCCT CTCTCTACCC ACGCT 45(2)序列編號18(i)序列特征(A)長度39堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號18TCGCACCCAT CTCTCTCCTT TCTCTTTCCT CTCTCTACC39(2)序列編號19(i)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號19TCGCACCCAT CTCTCTCCTT TCTCTTTCCT CTC 33(2)序列編號20(i)序列特征(A)長度39堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號20TTCCTCTCTC TACCCACGCT TCTCTTCGCA CCCATCTCT39(2)序列編號21(i)序列特征(A)長度33堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號21TTCCTCTCTC TACCCACGCT TCTCTTCGCA CCC 33(2)序列編號22(i)序列特征(A)長度25堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號22CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT 25(2)序列編號23(i)序列特征
(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號23TAAGGCCAGG GGGAAGAAA AAATATAAAT30(2)序列編號24(i)序列特征(A)長度37堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號24TTTTTTCTTT CCCCCTTCTC TTCCCCCTTT CTTTTTT37(2)序列編號25(i)序列特征(A)長度37堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號25TCCCCCTTTC TTTTTTTCTC TTTTTTTCTTTCCCCCT37(2)序列編號26(i)序列特征(A)長度37堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號26TTTTTTCTTT CCCCCTTCTC TCTTTTTCCC TCCCCCC37(2)序列編號27(i)序列特征(A)長度16堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號27TTTTTTCTTT CCCCCT 16(2)序列編號28(i)序列特征(A)長度16堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號28TCCCCCTTTC TTTTTT16(2)序列編號29(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號29TAAGGCCAGG GGGAAAGAAA ATATATAAAT 30(2)序列編號30(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號30TAAGGCCAGG GGGAAAGAAA TTATATAAAT 25(2)序列編號31(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號31TAAGGCCAGG GGGAAACTAA AAATATAAAT30(2)序列編號32(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號32TAAGGCCAGG GGGAATGTAA AAATATAAAT30(2)序列編號33(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號33TAAGGCCAGG GGGATAGTAA AAATATAAAT30(2)序列編號34(i)序列特征
(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號34TAAGGCCACG GGGAAAGAAA ATATATAAAT30(2)序列編號35(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號35TAAGGCCACG GGGATAGAAA AAATATAAAT30(2)序列編號36(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線型(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)是否假定否(iv)反義是(xi)序列描述序列編號36TAAGGCCAGG GGCTTAGAAA AAATATAAAT30
權(quán)利要求
1.一種折回三螺旋形成寡核苷酸，包括與目標(biāo)核酸形成雙螺旋的雙螺旋形成區(qū)，與該雙螺旋形成區(qū)和該目標(biāo)核酸形成的雙螺旋形成三螺旋的三螺旋形成區(qū)，和一個連接該雙螺旋形成區(qū)和該三螺旋形成區(qū)的連接區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的折回三螺旋形成寡核苷酸，其中，該雙螺旋形成區(qū)具有大約8至大約50個核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的折回三螺旋形成寡核苷酸，其中，該三螺旋形成區(qū)是一段具有大約8至大約50個核苷酸的該雙螺旋形成區(qū)的反向重復(fù)序列。
4.根據(jù)權(quán)要求3的折回三螺旋形成寡核苷酸，其中，該連接區(qū)包含一個化學(xué)取代基，選自寡核苷酸、取代的或未取代的具有約4個至約20個碳原子的烷基或芳香基和一個化學(xué)鍵。
5.一種折回三螺旋，包括寡核苷酸和目標(biāo)核酸形成的雙螺旋和該雙螺旋與該寡核苷酸形成的三螺旋。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的折回三螺旋，其中，該目標(biāo)核酸是單鏈RNA。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的寡核苷酸，它與目標(biāo)核酸形成雙螺旋，然后與該寡核苷酸和該目標(biāo)核酸形成的雙螺旋形成三螺旋。
文檔編號C07H21/00GK1122138SQ94191214
公開日1996年5月8日 申請日期1994年1月21日 優(yōu)先權(quán)日1993年1月21日
發(fā)明者?？钒汀た驳像R拉, 休德海爾·阿格雷瓦爾 申請人:海布里頓公司