專利名稱：人司登尼亞鈣蛋白-α的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸、這些多核苷酸編碼的多肽、這些多核苷酸和多肽的用途、和這些多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為人司登尼亞鈣蛋白-α。本發(fā)明還涉及此多肽活性的抑制。
司登尼亞鈣蛋白(原稱硬骨魚鈣蛋白和血鈣蛋白)是一種由有骨魚類內(nèi)分泌腺司登尼亞小體產(chǎn)生的抗高血鈣的糖蛋白激素。人也產(chǎn)生司登尼亞鈣蛋白糖蛋白。
司登尼亞鈣蛋白-α具有與甲狀旁腺素(PTH)相似的生物學(xué)活性且這兩種蛋白在哺乳動(dòng)物中都顯示雙重功能。它們表現(xiàn)出可能因骨骼回吸作用引起的升高血鈣的活性(Endocrinology 1192249-2255(1986))并在魚類中表現(xiàn)降低血鈣的活性。降低血鈣的活性可能是因鰓中鈣流入的抑制而引起的(J.Exp.Biol.，140199-208(1988))。另外，在骨骼的新陳代謝中PTH具有雙相活性，即，在低劑量時(shí)它增強(qiáng)骨骼的形成，而在高劑量時(shí)它增強(qiáng)骨骼的回吸作用。相應(yīng)地，此多肽本身和其拮抗劑，在不同的條件下，可以用于治療骨質(zhì)疏松。
人們對(duì)非人類的司登尼亞蛋白小體已有了深入的研究。最近，一個(gè)來(lái)源于Anguillaaustralis的司登尼亞蛋白小體已經(jīng)被純化和克隆。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)硬骨魚的腎臟中含有分泌顆粒-司登尼亞小體。電子顯微鏡指示此分泌顆粒有蛋白性質(zhì)，可能是未知生理生化功能的激素或酶(Butkus，A.et al.Mol.Cell Endocrinol，54123-33(1987))。
從鱒魚的司登尼亞小體也已經(jīng)分離純化出了一種糖蛋白，它被認(rèn)作是血鈣蛋白-魚類主要的血鈣激素。這種蛋白在魚的幾個(gè)種(特別是歐洲鰻魚、tilapia金魚和鯉魚)的司登尼亞小體中含量相當(dāng)大。與血鈣濃度在實(shí)驗(yàn)條件下誘導(dǎo)增加相對(duì)應(yīng)，血鈣蛋白典型地從司登尼亞小體中釋放出來(lái)。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示誘導(dǎo)血鈣濃度增加后產(chǎn)生血鈣蛋白的司登尼亞小體類型的細(xì)胞幾乎完全解體。分離得到的糖蛋白表觀分子量為54kDa(Lafeber F.P.et al.，Gen Comp.Endocrinolo，6919-30(1988))。
另外，最近結(jié)果顯示幾個(gè)硬骨魚鈣蛋白的合成多肽片段抑制彩虹鱒幼魚(Salmogairdneri)鈣的吸收。鰻魚和鮭魚的硬骨魚鈣蛋白的N-端肽段(從氨基酸1到20)在鈣吸收循環(huán)的高點(diǎn)上明顯抑制45Ca的吸收(可達(dá)75％)，雖然此肽段的摩爾有效劑量20至200倍于完整分子。與此相反，鰻魚的硬骨魚鈣蛋白的C-端片段(從氨基酸202-231)對(duì)鈣的吸收沒有抑制作用(Milliken C.E.et al.，Gen.Comp.Endocrinol，77416-22(1990))。
兩個(gè)鮭魚司登尼亞鈣蛋白的純化和特性以及用體外和活體模型系統(tǒng)檢測(cè)相對(duì)于鈣的激素分泌調(diào)節(jié)的方法也都有了描述。有關(guān)一個(gè)來(lái)自鮭魚CSλgt10 cDNA文庫(kù)的coho鮭魚司登尼亞鈣蛋白信使RNA(mRNA)的分子克隆和cDNA序列分析也有了描述。鮭魚司登尼亞鈣蛋白mRNA長(zhǎng)度大約為2Kda，編碼一個(gè)256個(gè)氨基酸的初級(jí)翻譯產(chǎn)物。前33個(gè)殘基組成了激素的前蛋白區(qū)，而剩下的223個(gè)殘基構(gòu)成了激素的成熟形式。(Wagner G.F.et al.，Mol.Cell Endocrinol，907-15(1992))。
本發(fā)明的多肽被推斷鑒定為人司登尼亞鈣蛋白-α。此鑒定結(jié)果是氨基酸序列同源性比較的結(jié)果。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種新的推斷的成熟多肽，即人司登尼亞鈣蛋白-α，還提供了此多肽的有生物活性的和有助于診斷或治療的片段、類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了編碼人司登尼亞鈣蛋白-α的分離核酸分子，包括mRNAs，DNAs，cDNAs，基因組DNA和其反義類似物及其有生物活性的和有助于診斷或治療的片段、類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了用重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的方法，包括在促進(jìn)所說蛋白的表達(dá)和所說蛋白的表達(dá)后回收的條件下，培養(yǎng)含有人司登尼亞鈣蛋白-α核酸序列的重組原核和/或真核宿主細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了利用此多肽或編碼此多肽的多核苷酸達(dá)到治療目的的方法，例如，治療引起腎臟、骨骼和心臟疾病的電解質(zhì)紊亂，和由于此多肽的雙相活性而可用于治療骨質(zhì)疏松癥，Paget氏病和骨質(zhì)石化癥。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了抗此多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了此多肽的拮抗劑，可用于抑制此多肽的活性，例如，在治療骨質(zhì)疏松癥和血鈣過少癥時(shí)。引起血鈣過少癥的原因很多，包括腎功能失調(diào)，甲狀旁腺肥大，嚴(yán)重感染，胰液不足或燒傷，這些情況導(dǎo)致從胞間液捕獲鈣。血鈣過少導(dǎo)致痙攣，驚厥和其它相關(guān)紊亂。
根據(jù)本發(fā)明的另外一個(gè)方面，提供了包括足夠長(zhǎng)的與人司登尼亞鈣蛋白-α序列特異性雜交的核酸分子的核酸探針。
通過本文的講授，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)該清楚本發(fā)明的這些和其它一些方面。
下列附圖是本發(fā)明的實(shí)施方案的示意，但并不意味對(duì)權(quán)利要求所限制的本發(fā)明的范圍的限制。


圖1顯示人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)的氨基酸序列。氨基酸用標(biāo)準(zhǔn)的3字母縮寫表示。
圖2是從Anguilla Australis得到的司登尼亞鈣蛋白(下行)和人司登尼亞鈣蛋白-α(上行)氨基酸的比較。在170個(gè)氨基酸的重疊中有35％的相同氨基酸殘基，總體相似性為55％。
圖3是人司登尼亞鈣蛋白(上行)和人司登尼亞鈣蛋白-α(下行)的氨基酸序列比較。
圖4是描述細(xì)菌表達(dá)和純化后的人司登尼亞鈣蛋白-α的凝膠的照片。1道是標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記物，2道和3道都是人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白，但3道的蛋白濃度較高。
圖5是顯示桿狀病毒表達(dá)人司登尼亞鈣蛋白-α的結(jié)果的凝膠。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的成熟多肽，或編碼由1994年7月15日保藏的ATCC保藏號(hào)75831的克隆的cDNA編碼的成熟多肽的分離的核酸(多核苷酸)。
本發(fā)明的多核苷酸是從肺成纖維細(xì)胞衍生的cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)的。它在結(jié)構(gòu)上與人司登尼亞鈣蛋白家族相關(guān)。它包含一個(gè)編碼約251個(gè)氨基酸殘基的開放閱讀框架。其中前40個(gè)氨基酸殘基是推斷的前導(dǎo)序列，因此成熟蛋白包括211個(gè)氨基酸。此蛋白和人司登尼亞鈣蛋白之間有高度同源性，在整個(gè)氨基酸序列中有28％相同且64％相似。
本發(fā)明中的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，其中的DNA包括cDNA、基因組DNA和合成DNA。DNA可以是雙鏈的或單鏈的，如果是單鏈的則可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼此成熟多肽的密碼序列可以和圖l所示的密碼序列相同，也可以和保藏克隆中的相同，或者可以是因?yàn)檫z傳密碼的冗余性和簡(jiǎn)并性而形成的一個(gè)不同的密碼序列，但此密碼序列編碼與圖1的DNA和保藏的cDNA相同的成熟多肽。
編碼圖1的成熟多肽或保藏cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可以包括只有成熟多肽的密碼序列；成熟多肽的密碼序列和諸如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列的附加密碼序列；成熟多肽的密碼序列(和任選的附加密碼序列)和諸如內(nèi)含子或成熟多肽的密碼序列的5′和/或3′端非編碼區(qū)的非編碼序列。
因此，‘編碼多肽的多核苷酸’這個(gè)術(shù)語(yǔ)限定為只包括此多肽密碼序列的多核苷酸和包括附加密碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上面描述的多核苷酸的變異體，其編碼具有圖1推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變體可以是此多核苷酸天然發(fā)生的等位變異體或此多核苷酸的非天然發(fā)生的變異體。
這樣，本發(fā)明包括編碼與圖1所示同樣的成熟多肽的多核苷酸，或與保藏克隆cDNA編碼的多肽相同的成熟多肽的多核苷酸，還有這些多核苷酸的變異體，這些變異體編碼圖1所示的多肽或保藏克隆cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物。這些核苷酸變異體包括缺失變異體，取代變異體和添加或插入變異體。
如上述所示，此多核苷酸可能是一個(gè)圖1所示的密碼序列或保藏克隆的密碼序列的天然發(fā)生的等位變異體的密碼序列。正如本領(lǐng)域所公知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或添加，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還包括這樣的多核苷酸，其中成熟多肽的密碼序列可以在相同的閱讀框架中融合到某個(gè)多核苷酸序列中以幫助多肽在宿主細(xì)胞中的表達(dá)和分泌，比如，作為分泌序列起控制多肽從細(xì)胞中運(yùn)輸出來(lái)的功能的一個(gè)前導(dǎo)序列。有前導(dǎo)序列的多肽是一個(gè)蛋白原，宿主細(xì)胞可以切掉其前導(dǎo)序列以形成此多肽的成熟形式。多核苷酸還可以編碼一個(gè)由成熟蛋白和附加的5′氨基酸殘基組成的蛋白原。有序列原的成熟蛋白是蛋白原，是此蛋白的無(wú)活性形式。一旦序列原被切除就形成了一個(gè)有活性的成熟蛋白。
這樣，例如，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼成熟蛋白，或有序列原的蛋白，或同時(shí)具有序列原和前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸還可以具有與標(biāo)記序列框內(nèi)融合在一起的密碼序列，以利于本發(fā)明的多肽的純化。標(biāo)記序列最好是由例如pQE-9或pQE-60載體提供的六組氨酸標(biāo)記，以用于細(xì)菌宿主中與標(biāo)記融合的成熟多肽的純化，或者，例如，當(dāng)用哺乳動(dòng)物宿主(如COS-7細(xì)胞)時(shí)，標(biāo)記序列可以是血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。HA標(biāo)記與流感血細(xì)胞凝集素蛋白衍生而來(lái)的抗原決定簇相對(duì)應(yīng)(Wilson，I.，et a1.，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明還涉及這樣的多核苷酸，即當(dāng)與上面描述的序列有最少50％和最好70％相同的序列時(shí)可與之雜交。特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。正如此處用到的一樣，‘嚴(yán)格條件’這個(gè)術(shù)語(yǔ)是指只有當(dāng)序列之間有至少95％和最好至少97％相同時(shí)才能雜交。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼與圖1的cDNA或保藏cDNA編碼的成熟多肽的生物功能和活性實(shí)質(zhì)上相同的多肽。
本文提及的保藏物按照國(guó)際承認(rèn)的用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約而保持。這些保藏物只是為了本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員方便才提供，不是對(duì)根據(jù)35U.S.C.§112對(duì)保藏物的索取的認(rèn)可。保藏物中的多核苷酸序列，還有由此編碼的多肽氨基酸序列在本文作為參考，在與本文的序列描述有沖突的情況下，它們是決定性的。制造、使用或銷售這些保藏物需要許可證。這樣的許可證本文不授予。
本發(fā)明還涉及這樣的司登尼亞鈣蛋白-α多肽，即有著圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列或有保藏cDNA編碼的氨基酸序列，和這種多肽的片段、類似物和衍生物。
當(dāng)指圖1的多肽或由保藏cDNA編碼的多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)‘片段’、‘衍生物’和‘類似物’的意思是指保留與此多肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。這樣，類似物就包括切除蛋白原部分能被激活產(chǎn)生活性成熟多肽的蛋白原。
本發(fā)明中的多肽可以是重組多肽、天然多肽或合成多肽，優(yōu)選是重組多肽。
圖1的多肽或保藏cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)由一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選是保守性氨基酸殘基)取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中包括一個(gè)取代基團(tuán)的多肽，或(iii)此成熟多肽與另一個(gè)化合物融合的多肽，比如延長(zhǎng)此多肽半壽期的化合物(例如，聚乙烯乙二醇)，或(iv)有附加氨基酸與此多肽融合的多肽，比如前導(dǎo)序列或分泌序列或用于純化此多肽的序列或蛋白原序列。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，優(yōu)選達(dá)到了純化均一性。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指材料從其原始環(huán)境(如，如果是天然發(fā)生則是其天然環(huán)境)中被移走。例如，在一個(gè)活的動(dòng)物體內(nèi)存在的天然發(fā)生的多核苷酸或多肽不是分離的，而從天然系統(tǒng)中的一部分或所有共存材料中分離出來(lái)的同樣的多核苷酸或多肽就是分離的。這樣的多核苷酸可以是載體的一部分和/或這樣的多核苷酸或多肽可以是某組合物的一部分，只要這些載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分，則其仍是分離的。
本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，用本發(fā)明的載體制造的遺傳工程宿主細(xì)胞和用重組技術(shù)生產(chǎn)的本發(fā)明的多肽的產(chǎn)品。
宿主細(xì)胞是用本發(fā)明的載體(例如克隆載體或表達(dá)載體)進(jìn)行遺傳操作(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)的。載體可以是，例如，質(zhì)粒、病毒顆粒、噬菌體等等的形式。工程化宿主細(xì)胞可以在被修飾成適合激活啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體或擴(kuò)增司登尼亞鈣蛋白-α基因的傳統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，如溫度、pH值等與以前用在表達(dá)用宿主細(xì)胞的條件相同，這些條件對(duì)一般熟練技術(shù)人員是公知的。
本發(fā)明中的多核苷酸可以被用來(lái)通過重組技術(shù)生產(chǎn)多肽。這樣，比如，此多核苷酸序列可以包含在用于表達(dá)多肽的眾多表達(dá)載體中的任一種中。這些載體包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列，比如，SV40的衍生物；細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；質(zhì)粒和噬菌體DNA組合衍生而來(lái)的載體；病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒和假狂犬病病毒。總之，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制存活，任何質(zhì)粒和載體都可以用。
適當(dāng)?shù)腄NA序列可以通過各種各樣的步驟插入載體。一般來(lái)說，DNA序列通過本領(lǐng)域公知的程序插入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)內(nèi)。這些和其它步驟對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是公知的。
表達(dá)載體中的DNA序列與合適的表達(dá)調(diào)控序列(啟動(dòng)子)連接在一起以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動(dòng)子的一些有代表性的例子有LTR或SV40啟動(dòng)子，大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子，λ噬菌體PL啟動(dòng)子和其它一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中的表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體還含有翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體還可以含有擴(kuò)增表達(dá)用的適當(dāng)序列。
此外，表達(dá)載體最好含有提供篩選轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀的基因，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或大腸桿菌用的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
含有上述適當(dāng)DNA序列和適當(dāng)啟動(dòng)子或調(diào)控序列的載體可以用來(lái)轉(zhuǎn)化適當(dāng)宿主以使宿主表達(dá)此蛋白。
適當(dāng)宿主的一些有代表性的例子有諸如大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；諸如酵母的真菌細(xì)胞；諸如果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；諸如CHO，COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動(dòng)物細(xì)胞；腺病毒；植物細(xì)胞等。通過本文的講授，適當(dāng)宿主細(xì)胞的選擇是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的。
更具體地說，本發(fā)明還包括上面廣泛描述的一個(gè)或多個(gè)序列的重組構(gòu)建體。這些構(gòu)建體包括其中本發(fā)明中的序列以正向或反向插入的載體，如質(zhì)?；虿《据d體。在本實(shí)施方案的一個(gè)優(yōu)選方面中，此構(gòu)建體還包括與序列可操作連接的調(diào)控序列，包括，比如，啟動(dòng)子。大量的適當(dāng)載體和啟動(dòng)子都是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的，而且都是可以買到的。下述載體作為例子提供參考。細(xì)菌載體pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pBSKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核載體pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制存活，任何質(zhì)粒和載體都可以用。
啟動(dòng)子區(qū)可以用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或有選擇性標(biāo)記的其它載體從任何目標(biāo)基因中選擇。兩個(gè)合適的載體是PKK232-8和PCM7。特別提到的細(xì)菌啟動(dòng)子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp。真核啟動(dòng)子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和鼠金屬硫蛋白-I。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體和啟動(dòng)子。
在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明還涉及含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。將構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法，或電穿孔法(Davis，L，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in MolecularBiology，(1986))。
宿主細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)建體可以用傳統(tǒng)的方式生產(chǎn)重組序列編碼的基因產(chǎn)物。本發(fā)明中的多肽也可以用傳統(tǒng)的肽合成儀來(lái)合成生產(chǎn)。
在適當(dāng)啟動(dòng)子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，細(xì)菌細(xì)胞或其它細(xì)胞中表達(dá)。用本發(fā)明的DNA構(gòu)建體衍生的RNA通過無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可以用來(lái)生產(chǎn)此蛋白。原核和真核宿主用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體在Sambrook，et al.，MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)中有描述，此處作為參考文獻(xiàn)列出。
編碼本發(fā)明的多肽的DNA在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄在載體插入一個(gè)增強(qiáng)子序列時(shí)得到提高。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用于啟動(dòng)子增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基對(duì)的SV40增強(qiáng)子，細(xì)胞肥大病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子，在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子，和腺病毒增強(qiáng)子。
一般來(lái)說，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起始點(diǎn)和允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記，如大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和S.cerevisiae TRP1基因，和高表達(dá)基因來(lái)源的指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。這樣的啟動(dòng)子可以由編碼諸如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的糖酵解酶，α-因子，酸性磷酸化酶，熱休克蛋白或其它蛋白的操縱子衍生而來(lái)。外源結(jié)構(gòu)序列在適當(dāng)相與翻譯起始和終止序列，和能指導(dǎo)翻譯的蛋白分泌到周質(zhì)空間或細(xì)胞外培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列裝配在一起。外源序列可編碼包括一個(gè)賦予其期望特性的N-端鑒定多肽的融合蛋白，所述特性如表達(dá)的重組產(chǎn)物的穩(wěn)定性和純化簡(jiǎn)便性。
細(xì)菌細(xì)胞用的有用的表達(dá)載體通過將編碼目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列和合適的翻譯起始和終止信號(hào)插入可操作的閱讀框架中，再插入一個(gè)功能啟動(dòng)子構(gòu)建而成。載體將包括一個(gè)或多個(gè)表型選擇性標(biāo)記和確保載體持續(xù)存在的(如果需要，提供載體在宿主體內(nèi)擴(kuò)增的)復(fù)制起始點(diǎn)。轉(zhuǎn)化用的合適的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌和假單胞菌屬、鏈霉菌屬和葡萄球菌屬中的各個(gè)種，雖然其它的菌也可以用來(lái)作宿主。
作為一個(gè)有代表性的但非限制性的例子，細(xì)菌用的有用的表達(dá)載體可以包括一個(gè)選擇性標(biāo)記和從市售的包括克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳元件的質(zhì)粒衍生而來(lái)的細(xì)菌復(fù)制起始點(diǎn)。這些商購(gòu)載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322“骨架”部分與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和待表達(dá)結(jié)構(gòu)序列整合在一起。
當(dāng)合適的宿主轉(zhuǎn)化并生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，選用的啟動(dòng)子即可用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)，細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
細(xì)胞經(jīng)離心后收獲，用物理或化學(xué)的方法破碎細(xì)胞，得到的粗提物留作進(jìn)一步純化用。
表達(dá)蛋白用的微生物細(xì)胞可以用任何傳統(tǒng)的方法進(jìn)行破碎，包括凍融法、超聲波法、機(jī)械破碎法、或使用細(xì)胞裂解試劑，這些方法對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員是公知的。
各種各樣的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可以用來(lái)表達(dá)重組蛋白。哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞系和其它能夠表達(dá)相容載體的細(xì)胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK細(xì)胞系。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，一個(gè)合適的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，和任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多腺苷酸位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，和5′端非轉(zhuǎn)錄序列。SV40剪接而來(lái)的DNA序列和多腺苷酸位點(diǎn)可以用來(lái)提供所需的非轉(zhuǎn)錄遺傳元件。
用硫酸銨或乙醇沉淀，酸抽提，陰離子或陽(yáng)離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析或植物凝集素層析等方法可將人司登尼亞鈣蛋白-α從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化出來(lái)。如果需要，可以使用蛋白質(zhì)再折疊步驟以完成成熟蛋白的構(gòu)象。最后，可以使用高效液相層析(HPLC)來(lái)完成最后的純化步驟。
本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成方案的產(chǎn)物，或是用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中生產(chǎn)。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括一個(gè)起始的甲硫氨酸氨基酸殘基。
人司登尼亞鈣蛋白-α可以用于大量電解質(zhì)類疾病的治療。動(dòng)脈血壓過高的一個(gè)原因是由于Na-K泵缺乏或抑制造成的不正常的Na+穿過血管平滑細(xì)胞細(xì)胞壁的運(yùn)輸，另外一個(gè)原因是如同已經(jīng)在人的幾種形式的高血壓中描述的那樣的Na+通透性提高?？偟慕Y(jié)果是細(xì)胞內(nèi)Na+提高，使細(xì)胞對(duì)血管收縮因子更加敏感。因?yàn)镃a++跟隨著Na+，推測(cè)正是由于細(xì)胞內(nèi)Ca++的積累而非Na+的積累引起交感神經(jīng)刺激敏感性增加。相應(yīng)地，因?yàn)槿怂镜悄醽嗏}蛋白-α可以發(fā)揮降血鈣因子的功能，所以它可以幫助降低這種增加的細(xì)胞內(nèi)Ca++，降低或防止高血壓。
另外，高血鈣還與心率不齊，昏迷和心跳驟停有關(guān)。因此，人司登尼亞鈣蛋白-α可以通過降低自由Ca++的濃度來(lái)發(fā)揮其對(duì)這類紊亂的治療價(jià)值。
高血壓還直接與腎臟紊亂有關(guān)。相應(yīng)地，過高或過低的電解質(zhì)濃度可以引起腎臟功能失調(diào)，并直接導(dǎo)致其它的紊亂。例如，鈣-磷失衡可以引起肌肉和骨骼疼痛，骨骼脫礦化作用和包括大腦、眼睛、心肌和血管的各種器官的鈣化。因此，本發(fā)明的多肽可以用來(lái)緩解由于鈣-磷失衡引起的紊亂。腎臟功能失調(diào)本身導(dǎo)致血液中不正常的高濃度磷酸鹽，用人司登尼亞鈣蛋白-α可以將其降至正常濃度。
人司登尼亞鈣蛋白-α對(duì)某些骨骼疾病的治療也是很有用的。其中，它在骨骼的新陳代謝中可能具有雙相活性，即，在低劑量時(shí)它增強(qiáng)骨骼的形成，而在高劑量時(shí)它增強(qiáng)骨骼的回吸作用。因此，低劑量的人司登尼亞鈣蛋白-α可以用于治療骨質(zhì)疏松，高劑量可以用于治療骨骼石化，骨骼石化是由于骨骼的過度生長(zhǎng)和硬化引起的，標(biāo)志是骨皮質(zhì)的顯著加厚和骨髓腔的窄化和填充。
高血鈣的起因可能也是大量不同的紊亂包括甲狀旁腺肥厚癥，維生素D過多癥，通過破壞骨骼升高血清鈣濃度的腫瘤，肉樣瘤病，甲狀腺腫大，腎上腺機(jī)能不全，血清白蛋白下降，次生腎臟疾病，過量的胃腸鈣吸收和血漿蛋白濃度提高。相應(yīng)地，人司登尼亞鈣蛋白-α在降低高血鈣和其相關(guān)紊亂方面是有效的。
人司登尼亞鈣蛋白-α對(duì)與不正常電解質(zhì)濃度和體液失衡有關(guān)的其它紊亂的治療也是有用的，如migraine頭痛。
全長(zhǎng)的人司登尼亞鈣蛋白-α基因的片段可以用作cDNA文庫(kù)的雜交探針以分離全長(zhǎng)的基因和分離其它的與此基因有高度序列相似性或相似的生物學(xué)活性的基因。這種探針可以是，例如，在20和2000個(gè)堿基之間。但是探針優(yōu)選具有30到50個(gè)堿基對(duì)。此探針還可以用于鑒定與全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本相對(duì)應(yīng)的cDNA克隆和含有包括調(diào)控和啟動(dòng)子區(qū)域，外顯子和內(nèi)含子的完整人司登尼亞鈣蛋白-α基因的基因組克隆。篩選的一個(gè)例子包括通過使用已知的DNA序列合成一個(gè)寡聚核苷酸探針分離基因的編碼區(qū)。具有與本發(fā)明基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記寡聚核苷酸用于篩選人cDNA，基因組DNA或mRNA文庫(kù)以測(cè)定探針雜交到文庫(kù)的哪個(gè)成員上。
本發(fā)明提供了一種鑒定人司登尼亞鈣蛋白-α受體的方法?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所公知的大量方法鑒定編碼此受體的基因，例如，配體淘選法和FACS分類法(Coligan，et al.，Current Protocols in Immun.，1(2)，Chapter 5，(1991))。優(yōu)選是，使用表達(dá)克隆法，其中多腺苷酸RNA是從對(duì)人司登尼亞鈣蛋白-α敏感的細(xì)胞中制備，將從此RNA產(chǎn)生的cDNA文庫(kù)分成多個(gè)集合體并用于轉(zhuǎn)染對(duì)人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白不敏感的COS細(xì)胞或其它細(xì)胞。在玻片上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞用標(biāo)記的人司登尼亞鈣蛋白-α處理?？梢酝ㄟ^碘化作用或引入位點(diǎn)特異性蛋白激酶的識(shí)別位點(diǎn)等不同方法標(biāo)記司登尼亞鈣蛋白-α。固定和溫育后，將玻片進(jìn)行放射自顯影分析。鑒定陽(yáng)性克隆集合體，制備亞集合體并用迭代亞集合和再篩選程序重新轉(zhuǎn)染，最后得到一個(gè)編碼推斷受體的單克隆。
作為受體鑒定的替代方法，標(biāo)記的人司登尼亞鈣蛋白-α可以與細(xì)胞膜或是表達(dá)受體分子的抽提制備物光親合連接。交聯(lián)材料通過PAGE來(lái)分辨并置于X-光膠片上使膠片曝光?？梢郧邢潞信潴w-受體復(fù)合物的標(biāo)記復(fù)合物，分離成多肽片段，并進(jìn)行蛋白質(zhì)微量序列測(cè)定。從微量序列測(cè)定獲得的氨基酸序列用來(lái)設(shè)計(jì)一套簡(jiǎn)并的寡聚核苷酸探針來(lái)篩選cDNA文庫(kù)以鑒定編碼推斷受體的基因。
本發(fā)明還提供了篩選化合物以鑒定人司登尼亞鈣蛋白-α的刺激劑和拮抗劑的方法。作為一個(gè)例子，可以進(jìn)行生物分析測(cè)定，其中分析成分包括在細(xì)胞膜表面表達(dá)人司登尼亞鈣蛋白-α受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或膜制備物，標(biāo)記的鈣，例如45Ca++，和待篩選的化合物。如果化合物是一個(gè)有效的人司登尼亞鈣蛋白-α刺激劑，它將模仿人司登尼亞鈣蛋白-α受體配體，以使在無(wú)人司登尼亞鈣蛋白-α?xí)r細(xì)胞或膜有45Ca++吸收。通過利用放射性標(biāo)記可以測(cè)定45Ca++吸收的量。當(dāng)篩選拮抗劑時(shí)，將人司登尼亞鈣蛋白-α加入生物分析測(cè)定中，以同樣的方式可以測(cè)定化合物通過干擾人司登尼亞鈣蛋白-α和其受體之間的相互作用而抑制45Ca++吸收的能力。
或者，可以在此化合物存在和不存在時(shí)測(cè)定并比較人司登尼亞鈣蛋白-α和其受體之間相互作用后一個(gè)已知的第二信使系統(tǒng)的反應(yīng)。此第二信使系統(tǒng)包括但不限于，cAMP鳥甘酸環(huán)化酶，離子通道或磷酸肌醇水解。
潛在的人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑包括抗體或在有些情況下包括寡聚核苷酸，它們與人司登尼亞鈣蛋白-α結(jié)合并消除其功能。拮抗劑還包括與人司登尼亞鈣蛋白-α受體結(jié)合并有效地將人司登尼亞鈣蛋白-α封閉在受體之外的多肽。這些多肽是與人司登尼亞鈣蛋白-α緊密相關(guān)的但喪失了天然生物學(xué)功能的蛋白，一個(gè)例子是人司登尼亞鈣蛋白-α的突變形式。
人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑還包括反義構(gòu)建體。反義技術(shù)可以通過三螺旋形成或反義DNA或RNA用來(lái)控制基因表達(dá)，兩種方法都是基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’編碼區(qū)用來(lái)設(shè)計(jì)長(zhǎng)度為從10到40個(gè)堿基對(duì)的反義RNA寡聚核苷酸。設(shè)計(jì)一個(gè)DNA寡聚核苷酸與基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域互補(bǔ)(三螺旋-參考Lee et al.，Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al，Science，241456(1988)；和Dervan et al.，Science，2511360(1991))，從而防止轉(zhuǎn)錄和人司登尼亞鈣蛋白-α的產(chǎn)生。反義RNA寡聚核苷酸在體內(nèi)與mRNA雜交并阻斷mRNA分子翻譯成人司登尼亞鈣蛋白-α多肽(反義-Okano，J.Neurochem.，56560(1991)，Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L(1988))。上面描述的寡聚核苷酸也可以送遞到細(xì)胞內(nèi)以使反義RNA或DNA在體內(nèi)表達(dá)，從而抑制人司登尼亞鈣蛋白-α蛋白的產(chǎn)生。
人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑還包括與多肽的活性位點(diǎn)結(jié)合使多肽不能發(fā)揮生物學(xué)功能的小分子。小分子的例子包括但不限于小肽或類肽的分子。
拮抗劑可以用于阻斷高濃度的人司登尼亞鈣蛋白-α引起的骨骼回吸作用的激活，并相應(yīng)地可以用于治療骨質(zhì)疏松癥。
人司登尼亞鈣蛋白-α拮抗劑還可以用于治療需要提高鈣水平的血鈣過少癥和Paget氏病等紊亂。此拮抗劑可以在一個(gè)含有藥物可接受載劑的組合物中使用，例如，按照下面的描述。
本發(fā)明的人司登尼亞鈣蛋白-α多肽和刺激劑和拮抗劑化合物可以與適當(dāng)?shù)乃幬镙d體組合后使用。這樣的組合物包括藥物有效量的本發(fā)明多肽，和藥物可接受的載體和賦形劑。這樣的載體包括但不限于鹽類，緩沖鹽類，葡萄糖，水，甘油，乙醇，和它們的組合。配方應(yīng)當(dāng)適合給藥方式。
本發(fā)明還提供了藥物包或藥盒，包括裝有一種或多種本發(fā)明的藥物組合物成分的一個(gè)或多個(gè)容器。隨這些容器還附有一份控制藥品與生物制品的制造，使用或銷售的政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的公告，此公告反映制造，使用或銷售機(jī)構(gòu)同意此藥物用于人類使用。另外，此藥物組合物可以與其它藥物化合物聯(lián)合使用。
此藥物組合物可以以諸如口服，局部，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，或皮內(nèi)途徑的傳統(tǒng)方式給藥。此藥物組合物以對(duì)特定適應(yīng)癥的治療和/或預(yù)防有效的劑量使用。一般來(lái)說，此藥物組合物的使用劑量為最低大約每天每千克體重10微克，大多數(shù)情況下使用劑量不超過每天每千克體重約8毫克，在大多數(shù)情況下，考慮到給藥途徑、癥狀等，劑量為每天每千克體重約10微克至1毫克。
根據(jù)本發(fā)明，人司登尼亞鈣蛋白-α多肽，和也是多肽的刺激劑和拮抗劑可以經(jīng)體內(nèi)表達(dá)而應(yīng)用，即經(jīng)常被稱為“基因治療”。
如此，例如，在體外用編碼此多肽的多核苷酸(DNA或RNA)可以將病人的細(xì)胞進(jìn)行工程化，然后將工程化的細(xì)胞提供給需用此多肽治療的病人。這些方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，通過使用含編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒用本領(lǐng)域公知的程序?qū)⒓?xì)胞進(jìn)行工程化。
同樣地，可以用，例如，本領(lǐng)域公知的程序，將細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行工程化，以使多肽在體內(nèi)表達(dá)。正如本領(lǐng)域公知的那樣，將生產(chǎn)含有編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞給予患者，以使細(xì)胞在體內(nèi)工程化并在體內(nèi)表達(dá)此多肽。通過本發(fā)明的講授，這些和其它一些有關(guān)本發(fā)明的多肽的給藥方法對(duì)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來(lái)說應(yīng)該是清楚的。例如，工程化細(xì)胞的表達(dá)載體可以不僅僅是反轉(zhuǎn)錄病毒，例如，可以是結(jié)合一種適當(dāng)送遞載體后用于將細(xì)胞在體內(nèi)工程化的腺病毒。
本發(fā)明還涉及司登尼亞鈣蛋白-α基因作為檢測(cè)與突變的人司登尼亞鈣蛋白-α的存在相關(guān)的疾病或疾病的易感性的診斷測(cè)試的一部分。這類疾病涉及人司登尼亞鈣蛋白-α的低水平表達(dá)，例如，高血壓。
可以通過各種各樣的技術(shù)在DNA水平上檢測(cè)在人司登尼亞鈣蛋白-α基因內(nèi)攜帶突變的個(gè)體。用于診斷的核酸可以從患者的諸如血液，尿液，唾液，組織活體解剖和尸檢材料的細(xì)胞中獲得?；蚪MDNA可以直接用于檢測(cè)或在分析之前通過PCR(Saili etal.，Nature，324163-166(1986))酶法擴(kuò)增。RNA和cDNA也可以用于同樣目的。作為一個(gè)例子，與編碼人司登尼亞鈣蛋白-α的核酸互補(bǔ)的PCR引物可以用于鑒定和分析人司登尼亞鈣蛋白-α突變。例如，可以通過與正?；蛐拖啾葦U(kuò)增產(chǎn)物大小的變化來(lái)檢測(cè)缺失和插入?？梢酝ㄟ^將擴(kuò)增DNA與放射性標(biāo)記的人司登尼亞鈣蛋白-αRNA或與放射性標(biāo)記的人司登尼亞鈣蛋白-α反義RNA序列雜交來(lái)鑒定點(diǎn)突變。通過RNase A消化或通過解鏈溫度的不同可以將配對(duì)正確的序列從錯(cuò)配雙螺旋中區(qū)分出來(lái)。
基于DNA序列差異的遺傳測(cè)試可以通過檢測(cè)在有或沒有變性試劑時(shí)凝膠中DNA片段電泳遷移率的改變來(lái)完成。通過高分辨率凝膠電泳可以看見小的序列缺失和插入。在變性甲酰胺梯度凝膠上可以區(qū)分不同序列的DNA片段，其中根據(jù)其特定解鏈溫度或部分解鏈溫度，不同DNA片段的遷移被阻滯在凝膠的不同位置(參考，例如，Myers et al.，Science，2301242(1985))。
這樣，通過諸如雜交，RNase保護(hù)，化學(xué)裂解，直接DNA測(cè)序或使用限制酶(例如，限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern雜交的方法來(lái)完成某特定DNA序列的檢測(cè)。
除了更常規(guī)的凝膠電泳和DNA測(cè)序外，還可以通過原位分析來(lái)檢測(cè)突變。
本發(fā)明的序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。此序列特別指向并能與某單個(gè)人類染色體的特定位點(diǎn)雜交。更進(jìn)一步地，目前需要鑒定染色體上的特定位點(diǎn)。目前僅有很少幾個(gè)在實(shí)際序列數(shù)據(jù)(重復(fù)多態(tài)性)基礎(chǔ)上的染色體標(biāo)記試劑可用于標(biāo)記染色體位點(diǎn)。根據(jù)本發(fā)明，將DNA定位到染色體在聯(lián)系序列與疾病相關(guān)基因方面是重要的第一步。
簡(jiǎn)單地說，通過從cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)可以將序列定位到染色體上。序列的3’不翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析用于快速選擇在基因組DNA中不跨越超過一個(gè)外顯子的引物，否則將會(huì)使擴(kuò)增過程復(fù)雜化。然后這些引物被用于PCR法篩選含有單個(gè)人類染色體的體細(xì)胞雜交體。只有含與引物相對(duì)應(yīng)的人類基因的雜交體才能產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜交體的PCR定位是將某特定DNA定位于某特定染色體的一個(gè)快速方法。用與本發(fā)明相同的寡聚核苷酸引物，和特定染色體來(lái)源的片段或大的基因組克隆集合體，可以以類似的方式完成亞定位。其它類似的可用于定位到染色體的作圖策略包括原位雜交，用標(biāo)記的流選的染色體預(yù)篩選和通過與結(jié)構(gòu)染色體特定cDNA文庫(kù)雜交進(jìn)行預(yù)篩選。
將某cDNA克隆熒光原位雜交(FISH)到某中期染色體帶上可以用來(lái)提供精確的一步法染色體定位。此技術(shù)可使用短到500或600個(gè)堿基的cDNA；但是，大于2,000個(gè)堿基對(duì)的克隆更有可能以適于簡(jiǎn)單識(shí)別的足夠的信號(hào)強(qiáng)度結(jié)合到一個(gè)單一的染色體位點(diǎn)上。FISH需要使用可以產(chǎn)生表達(dá)序列標(biāo)記(EST)的克隆，而且越長(zhǎng)越好。例如，2,000堿基對(duì)是好的，4,000堿基對(duì)更好，從時(shí)間的合理百分比的角度來(lái)說，超過4,000個(gè)堿基對(duì)對(duì)得到好的結(jié)果可能是不必要的。有關(guān)此技術(shù)的綜述，參閱Verme et al.，Human ChromosomesA Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某序列被精確定位到染色體上，此序列在染色體上的物理位置可以與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相吻合。舉例來(lái)說，這些數(shù)據(jù)在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(通過Johns Hopkins University Welch Medical Library可以找到)被發(fā)現(xiàn)。然后，已經(jīng)被定位到相同染色體區(qū)域的基因與疾病之間的相互關(guān)系通過連鎖分析(物理相鄰基因的共遺傳)進(jìn)行鑒定。
下一步，有必要分析感染的和未感染的個(gè)體之間cDNA或基因組序列的差異。如果觀察到在一部分或全體感染個(gè)體中有突變，而在正常個(gè)體中沒有，那么此突變可能就是病因。
以目前的物理圖譜和遺傳圖譜技術(shù)的分辨率，精確定位到與疾病相關(guān)的某染色體區(qū)域的cDNA可能是50-500個(gè)潛在病原基因中的一個(gè)。(假設(shè)圖譜分辨率為1百萬(wàn)個(gè)堿基，每2萬(wàn)個(gè)堿基為一個(gè)基因)。
本發(fā)明的多肽，它們的片段或其它衍生物，或類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞可以用來(lái)作為抗原以產(chǎn)生抗體。這些抗體可以是，例如，多克隆或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合，單鏈和人源化抗體，還有Fab片段，或Fab表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。本領(lǐng)域所公知的各種各樣的方案都可以用來(lái)生產(chǎn)這樣的抗體和片段。
抗與本發(fā)明的序列相對(duì)應(yīng)的多肽的抗體可以通過將此多肽直接注射動(dòng)物或以此多肽給予動(dòng)物(最好是非人類)的方法得到。這樣獲得的抗體即可與此多肽結(jié)合。以這種方式，甚至只編碼此多肽的一個(gè)片段的序列也可以用來(lái)產(chǎn)生結(jié)合整個(gè)天然多肽的抗體。這樣的抗體可以用來(lái)從表達(dá)多肽的組織中分離此多肽。
為了制備單克隆抗體，可以使用任何的通過連續(xù)細(xì)胞系培養(yǎng)提供抗體的技術(shù)。例子包括雜交瘤技術(shù)(Kohler and Milstein，1975，Nature，256497)，三瘤技術(shù)，人B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor et al.，1983，Immunology Today，472)，和生產(chǎn)人單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
可以采用描述單鏈抗體生產(chǎn)的技術(shù)(U.S.Patent 4,946,778)來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠也可以用于表達(dá)本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。
本發(fā)明將以下面的實(shí)施例為參考進(jìn)一步描述；但應(yīng)理解本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。除非有具體說明，所有的份和量均指重量。
為了理解下面實(shí)施例的方便，下面將描述某些常用的方法和/或術(shù)語(yǔ)。
“質(zhì)?！庇芍糜谇懊娴男懽帜竝和/或其后的大寫字母和/或數(shù)字表示。本文的起始質(zhì)粒或是可以買到的，或是無(wú)限制基礎(chǔ)上公用的，或是可以根據(jù)發(fā)表的方案從已有質(zhì)粒構(gòu)建。另外，與描述的那些質(zhì)粒等效的質(zhì)粒是本領(lǐng)域公知的，對(duì)一般熟練技術(shù)人員來(lái)說是清楚的。
DNA的“消化”是指用對(duì)DNA的特定序列起作用的限制酶對(duì)DNA的酶促剪切。本文用到的各種各樣的限制酶都是可以買到的，其反應(yīng)條件，輔助因子和其它需要的條件對(duì)一般熟練技術(shù)人員來(lái)說是公知的。為了催化反應(yīng)的完成，應(yīng)在約20μl的緩沖液中含1μg質(zhì)粒或DNA片段和約2個(gè)單位的酶。為了分離所需的DNA片段用于質(zhì)粒構(gòu)建，應(yīng)在更大的反應(yīng)體積中用20-250單位的酶將5-50μg DNA片段消化。特定限制酶所用的適當(dāng)?shù)木彌_液和底物由制造商詳細(xì)說明。一般酶切反應(yīng)在37℃溫育約1小時(shí)，但也有可能依供應(yīng)商的說明而有所改變。消化結(jié)束后，反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上電泳以分離所需片段。
酶切片段的大小分離用Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)描述的8％的聚丙烯酰胺凝膠完成。
“寡核苷酸”是指可以化學(xué)合成的單鏈脫氧多核苷酸或兩個(gè)互補(bǔ)的脫氧多核苷酸鏈。這樣合成的寡核苷酸沒有5’磷酸基團(tuán)，如果不在激酶存在的情況下用ATP加上一個(gè)磷酸基團(tuán)，將不能與另一個(gè)寡聚核苷酸連接。合成的寡聚核苷酸將連接到?jīng)]有去磷酸化的片段上。
“連接”是指在兩個(gè)雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非用別的連接酶，每0.5μg等摩爾數(shù)的待連接DNA片段加10單位的T4DNA連接酶(“連接酶”)，用已知的緩沖液和反應(yīng)條件即可完成連接反應(yīng)。
除非另有聲明，轉(zhuǎn)化是按Graham，F(xiàn).and Van der Eb，A.，Virology，52456-457(1973)描述的方法進(jìn)行。
實(shí)施例1人司登尼亞蛋白-α的細(xì)菌表達(dá)和純化編碼人司登尼亞蛋白-α(ATCC#75652)的DNA序列首先用與司登尼亞蛋白-α密碼序列的5’和3’端序列對(duì)應(yīng)的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增。5’寡核苷酸引物的序列為5’-GACTACATGTGTGCCGAGCGGCTGGG-3’，其中含有一個(gè)Afl III限制酶位點(diǎn)和開始于甲硫氨酸起始密碼子的20個(gè)核苷酸的司登尼亞蛋白-α的密碼序列；3’端引物序列3’-GACTAGATCTCTCCTGGGCTCTGGGAGGTG-5’含有Bgl II位點(diǎn)的互補(bǔ)序列，后接司登尼亞蛋白-α的20個(gè)核苷酸。pQE-60載體(Qiagen，Inc.9259 Eton Ave.，Chatsworth，CA91311)編碼抗生素抗性(Ampr)，一個(gè)細(xì)菌性復(fù)制起始點(diǎn)(ori)，一個(gè)IPTG可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子操縱子(P/O)，一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個(gè)6-His標(biāo)記和限制酶位點(diǎn)。pQE-60用Afl III和Bgl II消化。用Afl III和Bgl II消化后擴(kuò)增序列連接到pQE-60中且插入帶編碼組氨酸標(biāo)記和序列RBS的框架中。然后，用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli菌株M15/rep4，商標(biāo)為M15/rep4的菌株可以從Qiagen公司得到，連接程序按照Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989)的描述進(jìn)行。M15/rep4含有質(zhì)粒pREP4的多個(gè)拷貝，pREP4表達(dá)lacI阻遏物和帶有卡那霉素抗性(Kanr)。通過其在LB板上的生長(zhǎng)能力來(lái)鑒定轉(zhuǎn)化體，選擇有氨芐青霉素/卡那霉素抗性的菌落。分離質(zhì)粒DNA，并用限制酶分析予以確認(rèn)。含有所需構(gòu)建體的克隆在加有Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(O/N)。過夜培養(yǎng)物以1∶100到1∶250的稀釋倍數(shù)用于大規(guī)模培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)到光密度600(0.D.600)為0.4到0.6之間。然后，加入IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)至終濃度為1mM。IPTG通過使lacI阻遏物失活，清除P/O，增加基因表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)。細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)3到4小時(shí)。然后離心(6000×g，20分鐘)收獲細(xì)胞。細(xì)胞沉淀物溶于6克分子的鹽酸胍離液試劑中。澄清后，在能夠使含6-His標(biāo)記的蛋白與柱結(jié)合緊密的條件下，從此溶液中用鎳螯合柱層析純化溶解的司登尼亞鈣蛋白-α(Hochuli，E.et al.，GeneticEngineering，Principles&Methods，1287-98(1990)。從鹽酸胍(GnHCl)中復(fù)性蛋白可以通過幾種方法完成(Jaenicke，R.and Rudolph，R.，Protein Structure-A Practical Approach，IRL Press，New York(1990)。首先，用透析步驟清除GnHCl，或者是，從鎳螯合柱上分離出來(lái)的純化蛋白可以結(jié)合到GnHCl以線性梯度下降的第二根層析柱上。當(dāng)?shù)鞍捉Y(jié)合到層析柱上時(shí)蛋白質(zhì)被復(fù)性，隨后用含250mM咪唑，150mM NaCl，25mMTris-Hcl pH7.5和10％甘油的緩沖液洗脫。最后，可溶性蛋白對(duì)含5mM碳酸氫銨的儲(chǔ)存緩沖液透析。純化的蛋白用SDS-PAGE分析(圖4)。
實(shí)施例2重組人司登尼亞鈣蛋白-α在COS細(xì)胞中的表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒stanniocalcin-αHA來(lái)源于一個(gè)含有1)SV40復(fù)制起始點(diǎn)，2)氨芐青霉素抗性基因，3)大腸桿菌復(fù)制起始點(diǎn)，4)CMV啟動(dòng)子，后面跟隨著多接頭區(qū)，一個(gè)SV40內(nèi)含子和聚腺苷酸位點(diǎn)的pcDNAI/Amp(Invitrogen)載體。將編碼整個(gè)司登尼亞鈣蛋白-α前體和框內(nèi)融合到其3’末端的HA標(biāo)記的DNA片段克隆到載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白的表達(dá)是在CMV啟動(dòng)子的指導(dǎo)下進(jìn)行的。HA標(biāo)記與以前描述的來(lái)源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白的抗原決定簇相對(duì)應(yīng)(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，ACherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell37，767)。用識(shí)別HA抗原決定簇的抗體，HA標(biāo)記與目標(biāo)蛋白的融合可以容易地檢測(cè)重組蛋白。
質(zhì)粒構(gòu)建策略描述如下用兩個(gè)引物通過PCR在克隆的原始表達(dá)序列標(biāo)記(EST)上構(gòu)建編碼司登尼亞鈣蛋白-α的DNA序列5’引物5’GACTAAGCTTATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 3’含有一個(gè)Hind III位點(diǎn)，后接從起始密碼子開始的司登尼亞鈣蛋白-α密碼序列的21個(gè)核苷酸；3’序列5’GACTTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTCCTGGGCTCTGGGAGGTG3’含有Xba I位點(diǎn)，翻譯終止密碼子，HA標(biāo)記和司登尼亞鈣蛋白-α密碼序列的最后20個(gè)核苷酸(不包括終止密碼子)的互補(bǔ)序列。因此，PCR產(chǎn)物包含一個(gè)Hind III位點(diǎn)，司登尼亞鈣蛋白-α密碼序列，其后的融合到框架中的HA標(biāo)記，與HA標(biāo)記相鄰的一個(gè)翻譯終止密碼子，和一個(gè)Xba I位點(diǎn)。用Hind III和Xba I限制酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcDNAI/Amp并連接。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株SURE(Stratagene Cloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037有售)。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物涂于含氨芐青霉素的培養(yǎng)基平板上，挑選抗性菌落。從轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒DNA，用限制分析檢測(cè)正確片段的存在。為了重組司登尼亞鈣蛋白-α的表達(dá)，用DEAE-DEXTRAN方法使表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。司登尼亞鈣蛋白-αHA蛋白的表達(dá)用放射標(biāo)記和免疫沉淀的方法檢測(cè)(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。轉(zhuǎn)染后兩天，蛋白用35S-半胱氨酸標(biāo)記8小時(shí)。然后收集培養(yǎng)基，用去污劑緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5))裂解細(xì)胞(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))。細(xì)胞裂解物和培養(yǎng)基用HA特異性的單克隆抗體進(jìn)行免疫沉淀。用15％的SDS-PAGE凝膠分析沉淀的蛋白。
實(shí)施例3用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)人司登尼亞鈣蛋白-α編碼全長(zhǎng)司登尼亞鈣蛋白-α蛋白的DNA序列ATCC#75831用與基因的5’和3’序列相對(duì)應(yīng)的PCR寡聚核苷酸引物擴(kuò)增5’引物的序列為5’GACTGGATCCGCCACCATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 3’并包含一個(gè)BamH I限制酶位點(diǎn)(粗體)，和隨后的正好在司登尼亞鈣蛋白-α的前21個(gè)核苷酸(翻譯起始密碼子“ATG”有下劃線)之后的代表一個(gè)有效的在真核細(xì)胞中起始翻譯的信號(hào)的6個(gè)核苷酸(Kozak，M.，J.Mol.Biol.，196947-950(1987))。
3’引物的序列為5’GACTGGTACCCTACTCCTGGGCTCTGGGAGG 3’并包含Asp718限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和21個(gè)與司登尼亞鈣蛋白-α基因的3’序列互補(bǔ)的核苷酸。用一個(gè)商品試劑盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離擴(kuò)增的序列。然后，片段用BamH I和Asp 718消化并在1％瓊脂糖凝膠上再次純化。此片段命名為F2。
用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(綜述參見M.D.and Smith，G.E.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)程序方法手冊(cè)Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No.1555)使用載體pRG1(pVL941載體的修飾物，見下述)表達(dá)司登尼亞鈣蛋白-α蛋白。此表達(dá)載體包含首蓿夜紋銀蛾核多角體病毒(AcMNPV)的多角體蛋白強(qiáng)啟動(dòng)子，和接下來(lái)的限制性內(nèi)切酶BamH I和Asp 718的識(shí)別位點(diǎn)。猿猴病毒(SV)40的聚腺苷酸化位點(diǎn)用于有效的聚腺苷酸化。為了容易地選擇重組病毒，以與多角體蛋白啟動(dòng)子相同的方向插入大腸桿菌來(lái)源的β-半乳糖苷酶基因，接下來(lái)是多角體蛋白基因的聚腺苷酸化信號(hào)。在多角體蛋白序列的兩側(cè)是用于共轉(zhuǎn)染的野生型病毒DNA的細(xì)胞介導(dǎo)的異源重組的病毒序列。可以使用諸如pAc373，pVL941和pAcIM1的很多其它載體代替pRG1(Luckow，V.A.and Summers，M.D.，Virology，17031-39)。
質(zhì)粒用限制酶BamH I和Asp 718消化，然后通過本領(lǐng)域公知的程序用小牛腸磷酸酶去磷酸化。然后，用一個(gè)商品試劑盒(“Geneclean，”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離DNA。此載體DNA命名為V2。
用T4 DNA聚合酶連接片段F2和去磷酸化質(zhì)粒V2。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞，用限制酶BamHI和Asp718鑒定含有攜帶司登尼亞鈣蛋白-α基因的質(zhì)粒(pBac-stanniocalcin-alpha)的細(xì)菌。通過DNA序列測(cè)定確認(rèn)克隆片段的序列。
5μg的質(zhì)粒pBac-stanniocalcin-alpha與1.0μg的商購(gòu)線性桿狀病毒(“BaculoGoldTMbaculovirus DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)用脂轉(zhuǎn)染法(Felgner et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，847412-7417(1987))共轉(zhuǎn)染。
在含有50μl無(wú)血清Grace’s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的無(wú)菌微量滴定板的一個(gè)孔內(nèi)混合1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的質(zhì)粒pBac-stanniocalcin-alpha。然后加入10μl Lipofectin和90μl Grace’s培養(yǎng)基，混合并在室溫溫育15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入植于一個(gè)含1ml無(wú)血清Grace’s培養(yǎng)基的35mm的組織培養(yǎng)板中的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL1711)，將培養(yǎng)板前后振蕩以混合新加入的溶液。然后將培養(yǎng)板在27℃溫育5小時(shí)。5小時(shí)后從培養(yǎng)板中除去轉(zhuǎn)染溶液并加入1ml補(bǔ)加10％胎牛血清的Grace’s昆蟲培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)在27℃培養(yǎng)4天。
4天后收集上清并按Summers and Smith(見上述)描述的相似的方法進(jìn)行噬斑分析。作為一個(gè)修飾方法，使用可以容易地分離藍(lán)色噬斑的帶”Blue Gal”(Life TechnologiesInc.，Gaithersburg)的瓊脂糖凝膠。(在Life Technologies Inc.，Gaithersburg分發(fā)的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南的第9-10頁(yè)也可以找到“噬斑分析”的詳細(xì)描述)。
系列稀釋后4天，將病毒加入細(xì)胞，用Eppendorf移液頭挑取藍(lán)色噬斑。然后將含有重組病毒的瓊脂重新懸浮在含有200μl Grace’s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。短暫離心除去瓊脂，含有重組病毒的上清用于感染植于35mm培養(yǎng)皿的Sf9細(xì)胞。4天后收獲這些培養(yǎng)皿的上清并于4℃貯藏。
Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)在補(bǔ)加10％熱失活的FBS的Grace’s培養(yǎng)基中。以感染復(fù)數(shù)(MOI)2用重組桿狀病毒V-stanniocalcin-alpha感染細(xì)胞。6小時(shí)后除去培養(yǎng)基并用SF900 II無(wú)甲硫氨酸和半胱氨酸培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)代替。42小時(shí)后，加入5μCi的35S-甲硫氨酸和5μCi的35S半胱氨酸(Amersham)。在離心收獲前繼續(xù)將細(xì)胞培養(yǎng)16小時(shí)，通過SDS-PAGE和放射自顯影可以看到標(biāo)記的蛋白(圖5)。在圖5中凝膠指示司登尼亞鈣蛋白-α以同型二聚體的形式存在。
經(jīng)上述教導(dǎo)，本發(fā)明的大量改進(jìn)和變動(dòng)是有可能的，因此，在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)，除了特別描述的以外本發(fā)明可以以其它方式實(shí)施。
序列表(1) 一般信息(i) 申請(qǐng)者OLSEN，等(ii) 發(fā)明題目人司登尼亞鈣蛋白-α(iii)序列數(shù)8(iv) 通訊地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州 NEW JERSEY(E)國(guó)家USA(F)郵政編碼07068(V) 計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型3.5英寸軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi) 本申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(C)分類號(hào)(vii) 在先申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)?B)申請(qǐng)日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號(hào)36,134(C)文檔號(hào)/案號(hào)325800-200(ix) 通訊信息
(A)電話201-994-1700(B)電傳201-994-1744(2) SEQ ID NO1信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度892堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型cDNA(xi) 序列描述SEQ ID NO1GAATTCGGCA CGAGAGGAGG AGGAGGAAGA GGGGAGCACA AAGGATCCAG GTCTCCCGAC60GGGAGGTTAA TACCAAGAAC CATGTGTGCC GAGCGGCTGG GCCAGTTCAT GACCCTGGCT 120TTGGTGTTGG CCACCTTTGA CCCGGCGCGG GGGACCGACG CCACCAACCC ACCCGAGGGT 180CCCCAAGACA GGAGCTCCCA GCAGAAAGGC CGCCTGTCCC TGCAGAATAC AGCGGAGATC 240CAGCACTGTT TGGTCAACGC TGGCGATGTG GGGTGTGGCG TGTTTGAATG TTTCGAGAAC 300AACTCTTGTG AGATTCGGGG CTTACATGGG ATTTGCATGA CTTTTCTGCA CAACGCTGGA 360AAATTTGATG CCCAGGGCAA GTCATTCATC AAAGACGCCT TGAAATGTAA GGCCCACGCT 420CTGCGGCACA GGTTCGGCTG CATAAGCCGG AAGTGCCCGG CCATCAGGGA AATGGTGTCC 480CAGTTGGAGC GGGAATGCTA CCTCAAGCAC GACCTGTGCG CGGCTGCCCA GGAGAACACC 540CGGGTGATAG TGGAGATGAT CCATTTCAAG GACTTGCTGC TGCACGAACC CTACGTGGAC 600CTCGTGAACT TGCTGCTGAC CTGTGGGGAG GAGGTGAAGG AGGCCATCAC CCACAGCGTG 660CAGGTTCAGT GTGAGCAGAA CTGGGGAAGC CTGTGCTCCA TCTTGAGCTT CTGCACCTCG 720GACATCCAGA AGCCTCCCAC GGCGCCCCCC GAGCGCCAGC CCCAGGTGGA CAGAACCAAG 780CTCTCCAGGG CCCACCACGG GGGAAGAAGG ACATCACCTC CCAGAGCCCA GGAGTAGGGA 840GACTGGCCGA GGTGCCAAGG GTGAGCGAGG TAGCAAGAGC CACCCAAACG CC 892(2) SEQ ID NO2信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度251個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型蛋白質(zhì)(xi) 序列描述 SEQ ID NO2Met Cys Ala Glu Arg Leu Gly Gln Phe Met Thr Leu Ala Leu Val-40 -35 -30Leu Ala Thr Phe Asp Pro Ala Arg Gly Thr Asp Ala Thr Asn Pro-25 -20 -15Pro Glu Gly Pro Gln Asp Arg Ser Ser Gln Gln Lys Gly Arg Leu-10 -5 1 5Ser Leu Gln Asn Thr Ala Glu Ile Gln His Cys Leu Val Asn Ala10 15 20Gly Asp Val Gly Cys Gly Val Phe Glu Cys Phe Glu Asn Asn Ser25 30 35Cys Glu Ile Arg Gly Leu His Gly Ile Cys Met Thr Phe Leu His40 45 50Asn Ala Gly Lys Phe Asp Ala Gln Gly Lys Ser Phe Ile Lys Asp55 60 65Ala Leu Lys Cys Lys Ala His Ala Leu Arg His Arg Phe Gly Cys70 75 80Ile Ser Arg Lys Cys Pro Ala Ile Arg Glu Met Val Ser Gln Leu85 90 95Gln Arg Gly Cys Thr Leu Lys His Asp Ley Cys Ala Ala Ala Gln100 105 110Glu Asn Thr Arg Val Ile Val Glu Met Ile His Phe Lys Asp Leu115 120 125Leu Leu His Gly Pro Tyr Val Asp Leu Val Asn Leu Leu Leu Thr130 135 140Cys Gly Glu Glu Val Lys Glu Ala Ile Thr His Ser Val Gln Val145 150 155Gln Cys Glu Gln Asn Trp Gly Ser Leu Cys Ser Ile Leu Ser Phe160 165 170Cys Thr Ser Asp Ile Gln Lys Pro Pro Thr Ala Pro Pro Glu Arg175 180 185Gln Pro Gln Val Asp Arg Thr Lys Leu Ser Arg Ala His His Gly190 195 200Gly Arg Arg Thr Ser Pro Pro Arg Ala Gln Glu205 210(2) SEQ ID NO3信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度26堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO3GACTACATGTGTGCCGAGCGGCTGGG26(2) SEQ ID NO4信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度30堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO4GACTAGATCTCTCCTGGGCTCTGGGAGGTG30(2) SEQ ID NO5信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO5GACTAAGCTTATGTGTGCCGAGCGGCTGGGC 31(2) SEQ ID NO6信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度60堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO6GACTTCTAGACTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACTCCTGGGCTCTGGGAGGT 60(2) SEQ ID NO7信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度37堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO7GACTGGATCCGCCACCATGTGTGCCGAGCCGGCTGGGC 37(2) SEQ ID NO8信息(i) 序列特點(diǎn)(A)長(zhǎng)度31堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii) 分子類型寡核苷酸(xi) 序列描述SEQ ID NO8GACTGGTACCCTACTCCTGGGCTCTGGGAGG 3權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，所說的多核苷酸選自于下述一組(a)編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽或所說多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸；(b)編碼具有由包含在ATCC保藏號(hào)75831中的cDNA編碼的氨基酸序列的多肽或所說多肽的片段、類似物或衍生物的多核苷酸。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸為DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸為RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中的多核苷酸為基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所說的多核苷酸編碼由ATCC保藏號(hào)75831的cDNA編碼的多肽。
7.權(quán)利要求1的多核苷酸，其具有圖1所示多肽的密碼序列。
8.一種包含權(quán)利要求2的DNA的載體。
9.一種用權(quán)利要求8的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
10.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞表達(dá)由所說DNA編碼的多肽。
11.一種生產(chǎn)能夠表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求8的載體遺傳工程化細(xì)胞。
12.與權(quán)利要求2的DNA可雜交并編碼具有司登尼亞鈣蛋白-α活性的多肽的分離的DNA。
13.一種多肽，選自下列一組(i)具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列的多肽及其片段，類似物和衍生物和(ii)由ATCC保藏號(hào)75831的cDNA編碼的多肽和所說多肽的片段，類似物和衍生物。
14.權(quán)利要求13的多肽，其中的多肽具有圖1的推導(dǎo)的氨基酸序列。
15.抗權(quán)利要求13的多肽的抗體。
16.抗權(quán)利要求13的多肽的拮抗劑。
17.權(quán)利要求13的多肽的刺激劑。
18.治療需要使用人司登尼亞鈣蛋白-α的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求13的多肽。
19.治療需要抑制人司登尼亞鈣蛋白-α的患者的方法，包括給予患者治療有效量的權(quán)利要求16的拮抗劑。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所說的治療有效量的多肽以提供給患者編碼所述多肽的DNA并在體內(nèi)表達(dá)所說多肽的方式給藥。
21.一種鑒定刺激劑和拮抗劑的方法，包括制備在其細(xì)胞表面表達(dá)司登尼亞鈣蛋白-α受體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；在任選地存在司登尼亞鈣蛋白-α的條件下組合哺乳動(dòng)物細(xì)胞，標(biāo)記的鈣和待篩選的化合物；和測(cè)定化合物是否刺激或抑制鈣吸收。
22.診斷與人司登尼亞鈣蛋白-α多肽的低水平表達(dá)有關(guān)的疾病或疾病易感性的方法，包括從來(lái)源于宿主的樣品中分離編碼人司登尼亞鈣蛋白-α的核酸序列；和測(cè)定人司登尼亞鈣蛋白-α核酸序列中的突變。
全文摘要
本發(fā)明披露了人司登尼亞鈣蛋白-α和編碼此多肽的DNA(RNA)以及通過重組技術(shù)生產(chǎn)此多肽的程序。本發(fā)明還披露了此多肽用于治療導(dǎo)致腎，骨和心臟疾病的電解質(zhì)紊亂、骨質(zhì)疏松癥和Paget氏病的方法。還披露了抗此多肽的拮抗劑及其對(duì)治療血鈣過少和骨質(zhì)疏松癥的用途。還公開了將司登尼亞鈣蛋白-α序列用作檢測(cè)與司登尼亞鈣蛋白-α的突變體形式相關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷劑的用途。
文檔編號(hào)C07K14/585GK1167490SQ9419521
公開日1997年12月10日 申請(qǐng)日期1994年11月10日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月10日
發(fā)明者亨里克·奧森, 羅伯特·D·弗雷施曼 申請(qǐng)人:人體基因組科學(xué)有限公司