專利名稱：L-苯丙氨酸甲酯和n-芐氧羰基-天冬氨酸的酶催偶合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，該方法利用N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介質(zhì)中發(fā)生高轉(zhuǎn)化率的酶催偶合，同時形成沉淀。
N-保護(hù)的α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，特別是例如N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯，是“強(qiáng)力甜味劑”天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的重要前體，這種甜味劑是甜度約為蔗糖的200倍的一種產(chǎn)品，具有優(yōu)良的味型，沒有其它甜味劑(例如糖精和環(huán)已烷氨基磺酸鹽)那種發(fā)苦的后味。甜味劑天冬氨酰苯丙氨酸甲酯用在許多種產(chǎn)品中，例如軟飲料、糖果、餐桌甜味劑、藥物等。
已知有各種制備天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的方法。除了化學(xué)制備方法以外，還有酶催制備法，酶催制備法的重要性主要在于酶催偶合以立體選擇性和區(qū)域選擇性的方式進(jìn)行。至今已經(jīng)對N-保護(hù)的天冬氨酸(特別是N-芐氧羰基天冬氨酸，以后還稱作Z-Asp)和L-(或DL-)苯丙氨酸甲酯之間，或者由它們衍生的酸式鹽(例如鹽酸鹽，以后也用PM表示)之間形成N-保護(hù)的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前體的酶催L，L-偶合作了充分的研究和描敘。K.Oyama在“工業(yè)中的手性”(Chirality in Industry，John Wiley & Sons公司，1992)一書的第11章(237-247頁)對天冬氨酰苯丙氨酸甲酯的制備方法作了評論。
上述的酶催偶合反應(yīng)是一種平衡控制的反應(yīng)，它通常在6-7.5的pH下和一種中性蛋白酶(特別是金屬蛋白酶，例如嗜熱菌蛋白酶)存在下進(jìn)行。為了在這類酶催偶合反應(yīng)中實現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率，按照現(xiàn)有工藝必須采取特別措施。例如，US-A-4165311(它被認(rèn)為代表了最新工藝水平)利用了下述事實通過N-保護(hù)的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，特別是N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯(以后也稱作Z-APM)，與反應(yīng)混合物中存在的D-或L-苯丙氨酸甲酯形成沉淀的加成化合物，可以將偶合反應(yīng)的平衡移向右方。天冬氨酰苯丙氨酸甲酯前體的這些加成化合物還分別稱作Z.APM.D-PM或Z.APM.L-PM。為了形成這種加成產(chǎn)物，根據(jù)現(xiàn)有的工藝，對于Z-Asp和L-PM的偶合反應(yīng)最好是Z-Asp與至少兩倍摩爾數(shù)量的L-PM反應(yīng)，或者是在有至少相當(dāng)數(shù)量的D-PM存在下反應(yīng)，以便達(dá)到高的轉(zhuǎn)化率，即，按Z-Asp計轉(zhuǎn)化率≥60%，優(yōu)選≥80%。實際上，這些酶催偶合反應(yīng)因此常用PM對Z-Asp之比來描述，例如此比例為2.0至2.5∶1或更高。雖然用這種實施方案確實達(dá)到了所要產(chǎn)物的高轉(zhuǎn)化率，但是這些方法有一些缺點(diǎn)，即(a)為得到最終要求的天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(以下稱作APM)而要作的處理和進(jìn)一步的加工很麻煩，部分原因是該加成產(chǎn)物較難過濾，而為了得到只含少量雜質(zhì)的APM必須洗徹底;
(b)必須將過量存在的組分和從偶合產(chǎn)物的沉淀加成產(chǎn)物中釋放出的非APM組分回收和/或再循環(huán);如果偶合反應(yīng)是與DL-PM進(jìn)行，則剩余的D-PM在加工時通常也應(yīng)被外消旋化，一般是利用DL-苯丙氨酸。因此這些方法不太適合在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用。
應(yīng)當(dāng)指出，WO-A-92/02617敘述了基本上等量的Z-Asp和L-PM.HCL(摩爾比約為1.2∶1)在水介質(zhì)中和乙酸存在下(pH＝7)的酶催偶合反應(yīng)。在這種情況下，使用了通過交聯(lián)而固定的蛋白酶晶體，但是所達(dá)到的轉(zhuǎn)化率只有20%。EP-A-0149594介紹了利用甲酰-Asp(F-Asp)以1∶1的F-Asp∶L-PM比在水介質(zhì)中進(jìn)行酶催偶合反應(yīng)。但是，因為形成了F-APM·L-PM加成產(chǎn)物，該F-Asp的轉(zhuǎn)化率明顯地仍低于50%，發(fā)現(xiàn)此過程達(dá)到的產(chǎn)率很低(在加工得到F-APM后約為12%)。
同樣方式，Zhou F.等(化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，1992，8(4)，413-419頁，中文;化學(xué)文摘120(NO.35)，31-1-94，文摘48817V)也在其中敘述了Z-L-Asp和L-PM在初始pH6下進(jìn)行1∶1酶催偶合的試驗。但是，由于通常會形成Z-APM·PM加成產(chǎn)物，在這些條件下的Z-Asp的轉(zhuǎn)化率至多也不過是46.1%。應(yīng)該指出，Zhou F.等人報道的L-PM轉(zhuǎn)化率(最高92.2%)將化學(xué)偶合到Z-APM中的L-PM和與Z-APM同時沉淀的一當(dāng)量L-PM加在一起考慮。該文章沒有提到L-PM的化學(xué)轉(zhuǎn)化率能達(dá)到50%以上。
順便說說，還應(yīng)該指出在偶合反應(yīng)體系中存在的酯對化學(xué)水解相當(dāng)敏感。例如，PM水解形成苯丙氨酸(下面也用phe表示);Z-APM水解成Z-保護(hù)的天冬氨酰苯丙氨酸(有時用Z-AP表示)。在pH≥6或≤4時尤其會發(fā)生這種不良的副反應(yīng)，而且pH偏離該值越大和在反應(yīng)條件下停留的時間越長，副反應(yīng)就越強(qiáng)。
至今一般都假定，在由等當(dāng)量或基本上等當(dāng)量的Z-Asp和L-PM出發(fā)進(jìn)行Z-Asp和L-PM的酶催偶合而不存在相應(yīng)數(shù)量的D-PM時，或者不采取其它的移動偶合平衡的措施時，按照Z-Asp計算的轉(zhuǎn)化率不能達(dá)到50%以上。就在水介質(zhì)中的酶催偶合而言，Zhou和Huang(Indian J.Chem.，32B，35-39，1993)最近指出，在采用固定的蛋白酶時反應(yīng)的最佳條件是Z-Asp與PM之比為1∶4。在這方面應(yīng)當(dāng)注意，當(dāng)使用固定的蛋白酶時(例如見Biotechnology，3，459-464頁，1985;Nakanishi等)，所形成的大部分產(chǎn)物都被吸收在用于固定的樹脂之中，必須利用一個分離的萃取步驟從中取出。Nakanishi等用1∶1的Z-Asp和L-PM在水介質(zhì)中達(dá)到的結(jié)果(在較低濃度(80mm)下產(chǎn)率至多58%)因此不切合工業(yè)實際。另外，在常常用來確定初始反應(yīng)速度的這樣低的濃度下，偶合反應(yīng)進(jìn)行時不形成沉淀。
在以下文獻(xiàn)中敘述了移動偶合平衡的其它方式，(ⅰ)J.Org.Chem 46，5241頁(1981)使用固定的蛋白酶和與水不混溶的有機(jī)溶劑;類似地，JP-B-8533840在使用1∶1摩爾比時產(chǎn)率只有約20-30%;(ⅱ)GB-A-2250023使用固定的蛋白酶和與水混溶的有機(jī)溶劑;類似地，EP-A-0272564是在乙腈中反應(yīng)，該專利建議N-保護(hù)的Asp與L-PM之比可以在10∶1和1∶10之間，但其實施例表明，只考慮有L-PM大量過剩的情形，在化學(xué)計量比或基本上化學(xué)計量比的情形下得到的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率差?；瘜W(xué)計量比也稱作等摩爾比。順便說說，由GB-A-2250023中所述的實施例同樣可見，L-PM與N-保護(hù)的Asp之比越高，所達(dá)到的產(chǎn)率越高(在2∶1時產(chǎn)率約為85%，1∶1時只約為50%)。在這類其它的實施方案中，平衡的移動不是由形成沉淀實現(xiàn)的，而是由于所形成的偶合產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到了有機(jī)相。除了在使用有機(jī)溶劑時由于常常不可避免的溶劑損失而增高了成本之外，這類其它的實施方案的另一缺點(diǎn)是，在加工制造天冬氨酰苯丙氨酸甲酯期間，必須采取特別措施來除掉在偶合反應(yīng)中使用的有機(jī)溶劑。在加入有機(jī)溶劑(或者某些情形可能在有機(jī)溶劑中、或在有機(jī)溶劑存在下反應(yīng))，例如加入乙腈或二甲基甲酰胺、或者諸如二或三甘醇二甲醚等物質(zhì)時(見EP-A-0278190)，除非在L-PM(·HCL)與Z-Asp的高摩爾比下進(jìn)行反應(yīng)，否則Z-APM和類似物質(zhì)的產(chǎn)率一般只能很低。
另外還應(yīng)當(dāng)指出，在化學(xué)偶合反應(yīng)的情形(由N-保護(hù)的天冬氨酸酐，例如N-甲?；苌铮蚅-Phe或L-PM)，反應(yīng)物按化學(xué)計量比或基本上按化學(xué)計量比發(fā)生反應(yīng)并不罕見，但是這與用Z-Asp作為起始物的在水中的酶催偶合反應(yīng)無關(guān)。
但是，應(yīng)當(dāng)注意DE-A-3517361。該專利披露，對于酶催偶合反應(yīng)，該反應(yīng)物Z-Asp和L-PM確實可以以基本上等化學(xué)計量比存在，但是，為了形成加成物(不是前述現(xiàn)有工藝要求的L-PM或D-PM的極小的當(dāng)量過剩)使用了至少等當(dāng)量數(shù)量的一種有機(jī)胺化合物，該胺中有至少一上C5烴基。實際上，這樣一種方法是不大能用于制備APM，因為一方面，所形成的加成產(chǎn)物必須用酸化法分解，釋放出胺，另一方面，引入了作為“工藝過程雜質(zhì)”的另一種有機(jī)組分，在工藝過程的再循環(huán)及濾液物流中，很難將該組分與合成APM所用的起始物分開。
因此，需要實現(xiàn)Z-Asp和L-PM之間的簡單而有效的、最好是化學(xué)計量的酶催化偶合，它具有高的轉(zhuǎn)化率、低的起始物消耗率和有限的再循環(huán)物流，同時形成容易過濾的產(chǎn)物而無需至少等當(dāng)量的D-PM(或額外當(dāng)量的L-PM)或類似物質(zhì)存在，而且不必在偶合反應(yīng)中加入有機(jī)溶劑或胺。
本發(fā)明的目的是提供一種用于Z-Asp和L-PM酶催偶合的高轉(zhuǎn)化率的簡單方法，該法避免了上述的缺點(diǎn)，可以使用化學(xué)計量或基本上化學(xué)計量數(shù)量的反應(yīng)物，而且得到的產(chǎn)物容易過濾，令人驚奇的是，本發(fā)明利用等摩爾或基本上等摩爾數(shù)量的Z-Asp和L-PM在作為酶的一種中性蛋白酶的作用下進(jìn)行偶合反應(yīng)實現(xiàn)了這一目標(biāo)，上述反應(yīng)在初始pH為4.5-6.0的條件下進(jìn)行，同時有占反應(yīng)混合物總重量的3-25%的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或胺鹽存在?？紤]到反應(yīng)速度，并且為了限制不良的水解反應(yīng)，該偶合反應(yīng)最好在初始pH值為4.7-5.5的條件下進(jìn)行。
還出乎意料地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的方法在實施時，該偶合反應(yīng)也可以在相當(dāng)高的起始物濃度下進(jìn)行。已發(fā)現(xiàn)這樣高的濃度在現(xiàn)有的工藝方法中是不可能的，因為反應(yīng)過程中反應(yīng)體系的粘度會上升到過高的水平。本申請人設(shè)想(但并不受任何特定解釋的約束)，本發(fā)明的優(yōu)越結(jié)果可能要?dú)w因于Z-APM和Z.APM.L-PM在不同pH值和鹽濃度下溶解度的不同。
在本發(fā)明的方法中使用了含有堿金屬鹽、堿土金屬鹽或胺鹽的水介質(zhì)(鹽含量為反應(yīng)混合物總重量的3-25%)，在初始pH為4.5至6.0和有中性蛋白酶存在下，按照化學(xué)計量比或基本上化學(xué)計量比，進(jìn)行了Z-保護(hù)的天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯之間的酶催偶合反應(yīng)，同時形成沉淀。
本申請正文中的水介質(zhì)一詞是指任何均勻的極性含水介質(zhì)，其中可以含有少量(最多達(dá)30%左右)的有機(jī)溶劑，例如甲醇或乙腈。
在本發(fā)明的方法中可以使用各種堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽。合適的鹽有例如鉀、鈉、鋰、鈣、鎂和銨的鹵化物或硫酸鹽，或者它們的混合物。這里的銨一詞也指用一個或多個C1-3烷基取代的銨;這類取代的銨鹽的實例是三(甲)乙基氯化銨、二(甲)乙基氯化銨等。就本發(fā)明規(guī)定的3-25wt%的重量百分?jǐn)?shù)范圍而言，可能的應(yīng)用部分地由各個鹽的溶解度決定。堿金屬和銨鹽通常溶解度最高，因此優(yōu)選使用。特別優(yōu)選使用氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、氯化銨和/或硫酸銨。
在反應(yīng)體系中鹽含量越高，轉(zhuǎn)化就進(jìn)行得越快，而產(chǎn)率不會受明顯影響。但是在鹽含量較高時，體系的粘度很快會顯著升高，和/或一種或多種起始物和/或鹽本身的溶解度極限將被超過，于是所得到的沉淀不必要地被鹽沾污，或者導(dǎo)致反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率降低。鹽濃度高于25%時，該體系的粘度已使得反應(yīng)基本上無法進(jìn)行。反應(yīng)體系中的鹽含量越低，所需的總反應(yīng)時間將越長，結(jié)果使水解(尤其是L-PM的水解)增加，在鹽含量低于3%時，鹽的存在據(jù)信對反應(yīng)沒有顯著影響。在較低的鹽濃度下也對偶合產(chǎn)物的溶解度有不良的影響。如果加成產(chǎn)物(Z-APM.L-PM)過早地沉淀，這并不干擾本發(fā)明的反應(yīng)，因為平衡的移動會自動地使這一產(chǎn)物在所考慮的特定條件下反應(yīng)的過程中全部或部分地轉(zhuǎn)化成Z-APM沉淀。該鹽含量最好是從10-18%，因為在此范圍內(nèi)以下幾個方面都處在最有利的條件a)體系的粘度;b)起始物的溶解度和末端產(chǎn)物的沉淀形成;和c)反應(yīng)時間。在后面討論該體系受到的機(jī)械條件時將對此作更詳細(xì)的說明。
酶催偶合一般在10到60℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。溫度越低，偶合反應(yīng)和諸如L-PM及Z-APM水解等副反應(yīng)進(jìn)行得越慢。溫度越高，酶的失活越快。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易確定，為了在轉(zhuǎn)化成Z-APM的百分率和酶的壽命方面達(dá)到最佳結(jié)果，應(yīng)當(dāng)選擇多高的溫度。
本發(fā)明的酶催偶合用中性蛋白酶進(jìn)行。這里所說的中性蛋白酶是指可以用于從Z-Asp和L-PM合成Z-APM的任何已知的中性蛋白水解酶以及它們的活性相當(dāng)甚至更高的突變體。其實例是金屬蛋白酶，例如由嗜熱解蛋白桿菌(Bacillus thermoproteolyticus)制得的嗜熱菌蛋白酶，以及由各種桿菌如嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus Stearother-mophilus)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、膠原酶等制造的其它蛋白酶。一般來說，這些酶在pH約為6至8時具有最佳的蛋白酶活性，但是業(yè)已發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在本發(fā)明的條件下使用時，在初始pH為4.5至6.0、特別是從4.7至5.5時也得到良好的結(jié)果，而不需要使用額外的大量酶。應(yīng)當(dāng)指出，少量的Ca2+離子的存在一般對酶的穩(wěn)定性和作用起著有利的影響。
本申請中提到的能夠利用本發(fā)明得到良好結(jié)果的pH范圍值(表示成初始pH值)，應(yīng)當(dāng)理解為含水反應(yīng)體系在開始酶催偶合時pH值;在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行酶催偶合反應(yīng)期間，通常先觀察到pH略有減小，而后隨反應(yīng)進(jìn)行pH增大。在減小和增大期間可以突破所述的pH極限而對結(jié)果沒有不利影響。但是，偶合反應(yīng)期間的pH，特別是后期階段的pH，以保持低于6.2為佳，最好是低于5.7。
在初始pH低于4.5時，由于酶的活性較低，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率減小。在初始pH高于6.0時，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率也減小，這特別是因為酯的不良水解的增加以及Z-APM.L-PM的形成，該物質(zhì)在這些條件下不再轉(zhuǎn)化成Z-APM。順便應(yīng)當(dāng)指出，pH的這些極限也可以根據(jù)所用的酶而有小范圍的變化。例如，當(dāng)使用一種在較低的pH下有活性的酶突變體時，可以進(jìn)一步降低pH范圍的低限，例如到pH為3.5-4。
在反應(yīng)循環(huán)結(jié)束時，即，當(dāng)達(dá)到最終的轉(zhuǎn)化率時，酶的活性一般不變或者幾乎不變，所以酶可以重新使用。因此建議在分離出所得的沉淀之后將酶再用于酶催偶合反應(yīng)，特別是當(dāng)使用溶解的酶時。在這樣作時，若有必要應(yīng)當(dāng)對水介質(zhì)的成分略加調(diào)節(jié)，直到再次達(dá)到正確的起始狀態(tài)。因此該酶催偶合反應(yīng)可以用同樣數(shù)量的酶重復(fù)幾次;如果起始活性略有下降，則在必要時補(bǔ)加新鮮的酶，以便在對于這一應(yīng)用來說可以接受的時間內(nèi)達(dá)到所要求的轉(zhuǎn)化率。
在本申請中提到Z-的場合，應(yīng)當(dāng)理解為其非極性特點(diǎn)與Z-有關(guān)的任何保護(hù)基團(tuán)，例如芐基環(huán)被一個或多個烷基、烷氧基、?；螓u素等基團(tuán)取代的芐氧羰基化合物。在本申請中提到L-苯丙氨酸甲酯(L-PM)的場合，還應(yīng)該理解是指由其衍生的酸式鹽，例如，鹽酸鹽(L-PM.HCI)。在本申請中提到芐氧羰基天冬氨酸(Z-Asp)的場合，也應(yīng)該理解是指由其衍生的鹽，例如，二鈉鹽(Z-Asp.2Na)。顯然，在使用酸式鹽代替L-PM和/或用鹽代替Z-Asp時，有必要在有限的程度內(nèi)調(diào)節(jié)為達(dá)到所設(shè)定的pH值而使用的化學(xué)物質(zhì)的數(shù)量。
術(shù)語化學(xué)計量比或基本上化學(xué)計量比在本申請中是指Z-Asp∶L-PM的摩爾比處在從1∶0.7到0.7∶1的范圍。最好是使用從1∶0.8到1∶1的摩爾比。輕微過量的Z-Asp會導(dǎo)致最佳的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。在1∶1的情形下，需要再循環(huán)的一種或兩種未反應(yīng)的起始物減至最少。
本發(fā)明方法中的沉淀在化學(xué)組成和結(jié)晶性質(zhì)及可濾性方面都與在現(xiàn)有工藝方法中得到的Z-APM.(D/L)-PM加成產(chǎn)物不同。特別是，所得的結(jié)晶較大，因此過濾速度也較高，結(jié)果是產(chǎn)物的純化比較簡單，因為夾雜或保留在所附著的水分內(nèi)的雜質(zhì)較少。
申請人發(fā)現(xiàn)，就進(jìn)行反應(yīng)而言，在裝置方面和可以用來固定或保持體系運(yùn)動(如果需要的話)的方式的本質(zhì)方面，都可以有很多形式。該偶合反應(yīng)可以在所有各種反應(yīng)器和反應(yīng)柱內(nèi)進(jìn)行，只要它們由不以有害的方式影響反應(yīng)的材料制成，例如玻璃、不銹鋼等。在使用固定的酶(例如承載的酶)時，反應(yīng)柱特別合適。設(shè)備的尺寸可以在很寬的范圍內(nèi)變化。因此可以在所希望的任何規(guī)模上進(jìn)行該反應(yīng)，從試管或燒杯到例如10m3的規(guī)模。
還可以選擇采用間歇式或部分連續(xù)式反應(yīng)。如果本發(fā)明方法(半)連續(xù)地進(jìn)行，最好是在初始的反應(yīng)混合物的轉(zhuǎn)化率已達(dá)到至少約60%時才開始連續(xù)分離沉淀，此后可以根據(jù)沉淀被分離的程度進(jìn)一步加入基本上化學(xué)計量比的起始物。
根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化在反應(yīng)體系不受任何機(jī)械作用下進(jìn)行得很完全，此種情形處于所謂靜止?fàn)顟B(tài)。因此所選擇的反應(yīng)器不必裝配攪拌器或者保持反應(yīng)介質(zhì)以某種其它方式運(yùn)動的裝置。如果利用機(jī)械攪動或者以搖動反應(yīng)容器的方式使反應(yīng)體系保持或多或少的激烈運(yùn)動狀態(tài)(連續(xù)地或間歇地)，也達(dá)到了很好的結(jié)果。在這里攪動和搖動兩個術(shù)語包括了本領(lǐng)域技術(shù)人員可以考慮的所有實施方案。例如，對于攪動，原則上可以使用任何類型的攪拌器;但是，使用可調(diào)速的攪拌器比較方便，因為這樣可以使攪速固定到最佳值，而且還可以進(jìn)行調(diào)節(jié)以適應(yīng)粘度及類似變量的變化。順便說說，攪速只有很小的影響。用外設(shè)泵循環(huán)反應(yīng)器的內(nèi)容物應(yīng)該被看作是攪動的一種形式。泵速和反應(yīng)器的尺寸決定了體系內(nèi)的混合程度。顯然，當(dāng)反應(yīng)在最大約1000L的較小規(guī)模上進(jìn)行時，采用搖動的實施方式更為合適。申請人所作的實驗表明，在使用“搖動法”時達(dá)到了很高的轉(zhuǎn)化率。一項也很合適的實施方案是在靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行第一部分反應(yīng)，直到達(dá)到約20-60%、最好是30-50%的轉(zhuǎn)化率，然后在攪拌的條件下繼續(xù)該反應(yīng)，直到達(dá)到所要求的轉(zhuǎn)化度。這些“機(jī)械”處理的所有可能的組合同樣可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用。
偶合反應(yīng)中的酶的用量并非關(guān)鍵，但是一般來說酶的用量應(yīng)當(dāng)使該反應(yīng)達(dá)到高轉(zhuǎn)化率(≥60%，最好是≥80%)所需的時間不超過150小時。通常，用反應(yīng)混合物總重量的百分?jǐn)?shù)表示的酶(這里應(yīng)理解為是具有所討論的酶活性的蛋白質(zhì)，所謂的活性蛋白)的數(shù)量以從0.08%到1.5%為宜，最好是從0.15%到0.75%。如果酶的數(shù)量表示成所用的(干)酶制劑的總量，即，活性蛋白和其它蛋白以及其它輔助劑(例如鹽)的總量，則上面提到的百分含量一般相當(dāng)于從約0.5%到10%，或者最好是從1%到5%。酶常常以酶制劑的形式使用，市場上買到的也是這種形式。通常，這類制劑中活性蛋白的含量約占制劑重量的15%。
在本發(fā)明的方法中酶可以以適合這一用途的任何形式使用，即，溶解的形式或是固定化的形式。最好是作用溶解的酶(將酶制劑溶在反應(yīng)介質(zhì)中得到)，因為這在分離出所得的沉淀物并作進(jìn)一步處理以及重新使用生物催化劑本身方面都更為方便。如前所述，也可以使用所討論的酶的突變體。上面規(guī)定的酶的用量百分?jǐn)?shù)可以根據(jù)所用的酶的活性有所變動，在使用酶突變體時肯定是這樣。
起始物Z-Asp和L-PM的濃度同樣可以在很廣的范圍內(nèi)變化，它特別要由這些物質(zhì)在該初始反應(yīng)混合物中的溶解度決定。但是，少量不溶解的起始物的存在不影響反應(yīng)的進(jìn)程，因為這些數(shù)量在反應(yīng)期間會進(jìn)入溶液。在現(xiàn)有工藝方法中，由于產(chǎn)物抑制以及反應(yīng)期間粘度上升過高，不可能在起始物摩爾濃度高于約200-700mM下進(jìn)行反應(yīng);本發(fā)明則可以在高達(dá)約1200mM量級的較高的起始物(以及因此較高的偶合產(chǎn)物)摩爾濃度下達(dá)到良好的轉(zhuǎn)化率。這表明了本發(fā)明的另一個優(yōu)越性，因為這有可能提高每單位反應(yīng)器容積的產(chǎn)量。
現(xiàn)在將參照以下實施例和對照實施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。事先應(yīng)當(dāng)指，實施例中給出的反應(yīng)混合物的組成(初始溶液中的摩爾濃度和重量百分?jǐn)?shù))是以實際確定的用量和所制備的反應(yīng)混合物的重量和容積為基礎(chǔ)計算的。轉(zhuǎn)化率(在反應(yīng)結(jié)束時發(fā)生的L-PM水解的結(jié)果也一樣)是用所謂反相高效液相色譜(反相HPLC)測定的，使用紫外分光光度計在257nm下檢測，采用裝有Nucleosil C18和pH3.0的多梯度洗脫體系(水/乙腈/磷酸三乙銨)的柱子。將取自該反應(yīng)混合物的樣品在每種情形里都立即加入到甲醇中以便停止酶催反應(yīng)，在分析(自動注射到洗脫液的連續(xù)液流中)之前于低溫下貯存。下述實施例中提到的酶濃度和初始酶活性均以所用的酶制劑的數(shù)量為基礎(chǔ)。所提到的L-PM水解值在反應(yīng)結(jié)束時測定，根據(jù)開始時存在的L-PM的數(shù)量表示成平均每小時水解百分?jǐn)?shù)。
實施例Ⅰ將一定數(shù)量的L-PM.HCL(4.01g;18.6mmol)和Z-Asp·2Na(7.28g;23.4mmol)，在水(20.57g)中的溶液，在室溫下于100ml燒杯中攪拌混合。接著將所得的溶液與2.59g Nacl和0.17g Cacl22H2O在攪拌下混合，然后加入3N HCl將pH調(diào)到5.0。將此透明溶液與2.98g的嗜熱菌蛋白酶(粉末，Daiwa公司，含約15%的嗜熱菌蛋白酶蛋白質(zhì)和70%NaCl)混合。
這樣就得到了成分如下的反應(yīng)混合物總重量39.7g總體積33.1ml[Z-Asp]。707mM(按L-PM計過量26%)[L-PM]。562mM[NaCl]14.5%[酶]7.5%(制劑)pH5.0
在所有情形下，都將約2.0ml的許多份反應(yīng)化合物立即轉(zhuǎn)移到15根試管中，同時將試管置于40℃的水浴中，懸掛在與搖蕩機(jī)(Gyrotory)水浴搖蕩機(jī)，G76D型，New Brunswick Scientific公司)相連的支架上。該搖蕩機(jī)的速度固定為每分鐘200轉(zhuǎn)。在一定時間間隔之后，在某一時刻從水浴中取出一根試管以確定該反應(yīng)的進(jìn)展。為此，在加入約15ml甲醇以便停止該反應(yīng)之后，將試管冷卻到約5℃，隨后用反相HPLP分析內(nèi)容的成分。測得酶制劑的初始酶活性為32nmol.min-1mg-1。另外，確定了在約30分鐘后首次出現(xiàn)沉淀，在2.5小時的反應(yīng)時間后，最終轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到87%。如果該反應(yīng)持續(xù)更長，轉(zhuǎn)化率不再增加。在反應(yīng)2.5小時后沒有可檢測出的L-Phe形成。因此，在這些條件下L-PM未發(fā)生水解。
實施例Ⅱ?qū)-PM.HCL(3.34g;15.5mmol)和Z-Asp(4.96g;18.6mmol)在水(14.9g)中的懸浮液與一定量的重量濃度22%的NaOH(6.72g;37.0mmol NaOH)在室溫下于燒杯中攪動混合，從而形成pH＝5.0的透明溶液。接著仍然在攪拌下使此溶液與3.26g的NaCl、0.12g的CaCl2.2H2O和1.40g嗜熱菌蛋白酶(粉末，Amano公司，約含15%的嗜熱菌蛋白酶蛋白質(zhì)和34%NaCl)混合。于是得到成分如下的反應(yīng)混合物總重量34.7g總體積29.3ml[Z-Asp]。634mM(按L-PM計過量20%)[L-PM]。529mM[NaCl]13.5%[酶]4.0%
pH5.0將該反應(yīng)混合物立即分配到各試管之中，象實施例1中所述作進(jìn)一步處理。測得酶制劑的初始酶活性為27nmol.min-1mg-1。還發(fā)現(xiàn)在約120分鐘后可以觀察到初次出現(xiàn)沉淀，在反應(yīng)9小時后最終轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到80%。在連續(xù)該反應(yīng)時，轉(zhuǎn)化率不再增加。在反應(yīng)9小時后，產(chǎn)生了少量L-Phe(0.21mmol)，相當(dāng)于L-PM每小時水解0.16%。
實施例Ⅲ重復(fù)實施例Ⅱ的步驟，但是現(xiàn)在采用下述括號內(nèi)的初始物用量L-PM.HCl(4.70g;21.8mmol);Z-Asp(5.28g;19.8mmol);水(13.68g);22%NaOH(6.36g;35.0mmol NaOH);NaCl(2.95g);CaCl2.2H2O(0.13g);嗜熱菌蛋白酶(粉末，Amano公司，1.50g;與實施例Ⅱ中相同)。
這形成了成份如下的初始反應(yīng)混合物總重量34.6g總體積29.0ml[Z-Asp]。683mM[L-PM]。752mM(按Z-Asp計過量10%)[NaCl]13.7%[酶]4.3%pH5.0將該反應(yīng)混合物立即分配到各試管之中，如實施例Ⅰ中所述作進(jìn)一步處理。測得酶制劑的初始酶活性為32nmol.min-1mg-1。還觀察到在約60分鐘后初次形成沉淀。在反應(yīng)13.5小時后轉(zhuǎn)化率達(dá)到57%(按L-PM計)，在繼續(xù)反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率有所提高。在反應(yīng)13.5小時后觀察到有少量的L-Phe(0.32mmol)，相當(dāng)于L-PM每小時約水解0.1%。
實施例Ⅳa重復(fù)實施例Ⅱ的步驟，但是現(xiàn)在采用下述括號內(nèi)的初始物用量L-PM.HCl(4.31g;20.0mmol);Z-Asp(5.87g;22.0mmol);水(14.53g);22% NaOH(6.89g;37.9mmol NaOH);NaCl(3.20g)；CaCl2.2H2O(0.12g);嗜熱菌蛋白酶(Amino公司，1.42g;同實施例Ⅱ)。這形成了成分如下的初始反應(yīng)混合物總重量36.3g總體積30.8ml[Z-Asp]。714mM(按L-PM計過量10%)[L-PM]。649mM[NaCl]13.4%[酶]3.9%pH5.0將該反應(yīng)混合物立即分配到各試管之中，按照實施例Ⅰ中所述作進(jìn)一步處理。測得酶制劑的初始酶活性為27.9nmol.min-1mg-1。還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)15小時后轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到83%，連續(xù)反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率不再增加。在反應(yīng)15小時后只觀察到很小量的L-Phe，相當(dāng)于每小時水解0.2%。
實施例Ⅳb重復(fù)實施例Ⅳa的步驟，但是水、22%NaOH和NaCl的用量不同，即水(13.58g);22%NaOH(7.30g;40.1mmol);NaCl(4.60g)。這形成了成分如下的初始反應(yīng)混合物
總重量37.2g總體積31.2ml[Z-Asp]。706mM(按L-PM計過量10%)[L-PM]。641mM[NaCl]17.2%[酶]3.8%pH5.0將該反應(yīng)混合物立即分配到各試管之中，按實施例Ⅰ中所述作進(jìn)一步處理。測得酶制劑的初始酶活性為42.0nmol.min-1mg-1。還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)約4小時后轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到77%，繼續(xù)該反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率不再增加。在反應(yīng)4小時后，觀察到少量的L-Phe(0.23mmol)，即，每小時水解0.16%。
實施例Ⅳc再次重復(fù)實施例Ⅳa的步驟，但是使用的水、22% NaOH和NaCl的數(shù)量又不同，即水(15.78g);22% NaOH(6.82g;37.5mmol);NaCl(2.00g)。這形成了成份如下的初始反應(yīng)混合物總重量36.3g總體積30.8ml[Z-Asp]。714mM(按L-PM計過量10%)[L-PM]。649mM[NaCl]10.0%[酶]3.9%pH5.0將該反應(yīng)混合物立即分配到各試管中，按實施例Ⅰ中所述作進(jìn)一步處理。測得酶制劑的初始酶活性為18.0nmol.min-1mg-1。還發(fā)現(xiàn)，在反應(yīng)約16小時后轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到84%，繼續(xù)反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率不再增加。在反應(yīng)16小時后，觀察到一定數(shù)量的L-Phe(1.1mmol)，相當(dāng)于每小時水解0.3%實施例Ⅴ重復(fù)實施例Ⅱ的步驟，但是這次采用括號內(nèi)的下述起始物的數(shù)量，同時為了確定運(yùn)動程度的影響，還在不同的搖動速度和靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行了試驗L-PM.HCl(12.93g;60.0mmol);Z-Asp(18.33g;68.6mmol);水(43.86g);22% NaOH(19.99g;109.9mmol NaOH);NaCl(9.75g);CaCl2.2H2O(0.42g);嗜熱菌蛋白酶(粉末，Amano公司，4.26g;與實施例Ⅱ相同)。這形成了成分如下的初始反應(yīng)混合物總重量109.5g總體積91.2ml[Z-Asp]。752mM(按L-PM計過量14%)[L-PM]。658mM[NaCl]13.4%[酶]3.9%pH5.0在所得的該反應(yīng)混合物中，取15ml立即轉(zhuǎn)移到直徑3.3cm的玻璃反應(yīng)器中，該反應(yīng)器置于40℃水浴中，懸掛在與搖蕩機(jī)相連的支架上。搖蕩機(jī)的速度固定為每分鐘150轉(zhuǎn)。
與此同時，將第二份15ml的同一反應(yīng)混合物在轉(zhuǎn)速固定為250轉(zhuǎn)/分的搖蕩機(jī)中用類似方式處理。另外，第三份10ml反應(yīng)混合物在靜止?fàn)顟B(tài)下于40℃貯存。
在一定時間間隔后從各容器中取樣以確定反應(yīng)的進(jìn)展(第一批樣中仍然沒有或只有少量的沉淀，它們用移液管取樣;如果反應(yīng)混合物的粘度由于形成沉淀而升高，后面各批擇用括勺取樣)。為此將取出的樣品用約15ml甲醇稀釋，冷卻到約5℃，用反相HPLC分析。發(fā)現(xiàn)酶制劑的初始酶活性分別為37.8、30.0和21.0nmol.min-1mg-1(分別在150rpm、250rpm和靜止條件下)。還發(fā)現(xiàn)，在這三種情況下，分別在反應(yīng)時間短至8小時(150rpm)和12小時后，轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到約89%，在繼續(xù)該反應(yīng)時，轉(zhuǎn)化率不再增加。在這三種情形中，L-PM水解量約為每小時0.2%。對于施加搖動的情形，另外分析了4小時后出現(xiàn)的一定量的沉淀的化學(xué)成份，發(fā)現(xiàn)含Z-APM至少98%。
實施例Ⅵ將另一份50ml實施例Ⅴ中制備的初始反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移到直徑約5cm的恒溫玻璃反應(yīng)器中，該反應(yīng)器恒溫40℃，裝有帶葉片的可調(diào)速攪拌器，葉片剛好高于器底而低于液面。該攪拌器的速度設(shè)定在每分鐘60轉(zhuǎn)。在一定的時間間隔后象實施例Ⅴ中一樣分別用移液管或用刮勺取樣并進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)酶制劑的初始酶活性為20.1nmol.min-1mg-1。還觀察到，在反應(yīng)25小時后轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到67%，繼續(xù)反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率仍進(jìn)一步增加。在反應(yīng)25小時后，觀察到少量的L-Phe(0.55mmol)，即，水解量為每小時0.07%。
分析在4小時和20小時后得到的沉淀成分，發(fā)現(xiàn)這兩個時刻的樣品成分不同4小時后，98%以Z-APM.L-PM、2%以Z-APM的形式存在，但20小時后這兩個百分?jǐn)?shù)分別改變成67%和33%。
實施例Ⅶ
與實施例Ⅴ和Ⅵ的起始溶液相似，也配制起始溶液，其中占13.4%重量的鹽含量主要是用KCl或Na2SO4達(dá)到，其它成分則相同。在混合物A中，有12.1%KCl和1.3%NaCl;在混合物B中，有8.9%Na2SO4和4.5%NaCl。在進(jìn)行偶合反應(yīng)時，觀察到與實施例Ⅴ和Ⅵ相似的結(jié)果。
實施例Ⅷ按照實施例Ⅴ中所述的相同方式，配制一個新的反應(yīng)混合物。其中取50ml立即轉(zhuǎn)移到保持在40℃的實施例Ⅵ的恒溫玻璃反應(yīng)器中。但是這次在反應(yīng)于靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行5小時后才開動攪拌器，隨后固定在每分鐘60轉(zhuǎn)。在一定時間間隔后，象實施例Ⅴ中一樣取樣并分析。測得酶制劑的初始酶活性為20.6nmol.min-1mg-1。5小時后轉(zhuǎn)化率為43%。還觀察到，在反應(yīng)20小時后，轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到86%，而且隨著反應(yīng)的繼續(xù)，轉(zhuǎn)化率還進(jìn)一步增加。在反應(yīng)25小時后，觀察到少量L-Phe(1.1mmol)相當(dāng)于水解度約為每小時0.17%。
實施例Ⅸ配制成分如下的反應(yīng)混合物(總重量339.96g;總體積275.6ml)[Z-Asp]。745mM(按L-PM計過量14%)[L-PM]。653mM[NaCl]。13.0%[酶]3.8%(制劑;Amono公司的嗜熱菌蛋白酶)pH5.3將此混合物分成各為90ml的三份(A、B、C)，按照實施例Ⅵ中所述使用各份。A份的pH在偶合反應(yīng)期間不作進(jìn)一步的調(diào)節(jié);B份的pH用逐滴加入NaOH溶液(如果pH減小)和HCl溶液(如果pH增加)的方法保持在5.3左右;在C份的情形，用逐滴加入HCl溶液的方法(當(dāng)pH升至5.3以上時)小心地將pH保持在5.3左右。
在用A份和B份溶液的偶合反應(yīng)中，在30分鐘后都已經(jīng)形成了晶體，在C份的情形則花費(fèi)了約1小時。在A份中(酶制劑的初始酶活性為33.0nmol.min-1mg-1)，24小時后的轉(zhuǎn)化率達(dá)到約70%，繼續(xù)反應(yīng)不再增加;最終的pH為6.16，PM水解約為每小時0.1%。在B份和C份中(初始酶活性相同)，分別在60和45分鐘后達(dá)到95%至96%的轉(zhuǎn)化率，PM的水解約為每小時0.07%。
對照實施例A重復(fù)實施例Ⅱ的步驟，但是現(xiàn)在使用括號內(nèi)的下述起始物，pH固定在6.0L-PM.HCl(4.04g;18.8mmol);Z-Asp(5.34g;20.0mmol);水(44.35g);22% NaOH(7.56g;41.6mmol NaOH);NaCl(8.08g);CaCl2.2H2O(0.12g);嗜熱菌蛋白酶(粉末，Amano公司，1.429g;用實施例Ⅱ)。這形成了成分如下的透明的起始反應(yīng)混合物溶液總重量70.1g總體積61.7ml[Z-Asp]。324mM(按L-PM計過量6%)[L-PM]。305mM[NaCl]13.4%[酶]1.0%pH6.0將此反應(yīng)混合物分配到試管中，按實施例Ⅰ中所述作進(jìn)一步的處理。發(fā)現(xiàn)酶制劑的初始酶活性為61nmol.min-1mg-1。還發(fā)現(xiàn)在反應(yīng)3小時后最終轉(zhuǎn)化率(按L-PM計)達(dá)到46%，繼續(xù)反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率不再增加。在反應(yīng)3小時后發(fā)現(xiàn)，由于L-PM水解而形成了0.65mmol的L-Phe(即，按最初為18mmol計，每小時約水解1.15%)。
權(quán)利要求
1.通過N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介質(zhì)中以高轉(zhuǎn)化率酶催偶合并形成沉淀來制備N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，其特征在于，該偶合反應(yīng)用等摩爾或基本上等摩爾數(shù)量的N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在以中性蛋白酶作為酶的作用下進(jìn)行，初始pH值是從4.5至6.0，反應(yīng)時有占反應(yīng)混合物總重量3-25%的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽存在。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，初始pH值是從4.7到5.5的范圍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1～2中任一項的方法，其特征在于，堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的用量為10-18%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項的方法，其特征在于，所用的堿金屬鹽或銨鹽是氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸鉀、氯化銨和/或硫酸銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項的方法，其特征在于，偶合反應(yīng)在有占反應(yīng)混合物總重量0.08%至1.5%、特別是從0.15%至0.75%的酶(活性蛋白質(zhì))存在下進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任何一項的方法，其特征在于使用溶解的酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任何一項的方法，其特征在于，所用的N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯摩爾比在從1∶0.7到0.7∶1的范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯的摩爾比在1∶0.8至1∶1的范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1～8中任何一項的方法，其特征在于，偶合反應(yīng)的含水反應(yīng)體系的pH保持低于6.2，最好是低于5.7。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～9中任何一項的方法，其特征在于，在進(jìn)行偶合反應(yīng)時，至少在偶合過程的部分時間內(nèi)反應(yīng)混合物保持運(yùn)動狀態(tài)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1～10中任何一項的方法，其特征在于，至少在偶合過程的部分時間內(nèi)用搖動的方法使反應(yīng)混合物保持運(yùn)動。
12.根據(jù)權(quán)利要求1～11中任何一項的方法，其特征在于，偶合反應(yīng)以半連續(xù)的方式進(jìn)行，在初始反應(yīng)混合物的轉(zhuǎn)化率至少達(dá)到60%時，開始連續(xù)取出沉淀物，同時基本上按照化學(xué)計量比補(bǔ)加起始物。
13.根據(jù)權(quán)利要求1～12中任何一項的方法，其特征在于，在轉(zhuǎn)化率達(dá)到20-60%之前的第一部分偶合過程是在靜止?fàn)顟B(tài)下進(jìn)行，在隨后的偶合過程的至少一部分時間內(nèi)保持反應(yīng)混合物處于運(yùn)動狀態(tài)。
14.基本上如正文和實施例中所述的制備N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法。
15.根據(jù)權(quán)利要求1～14中任何一項的方法可以得到的N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備N-芐氧羰基-α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯的方法，該方法利用N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在水介質(zhì)中形成沉淀的酶催偶合反應(yīng)，該偶合反應(yīng)用(基本上)等摩爾的N-芐氧羰基-L-天冬氨酸和L-苯丙氨酸甲酯在中性蛋白酶作用下進(jìn)行，初始pH值是從4.5至6.0，反應(yīng)時有占反應(yīng)混合物總重量3—25％的堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽存在。
文檔編號C07K5/072GK1113266SQ9510130
公開日1995年12月13日 申請日期1995年1月19日 優(yōu)先權(quán)日1994年1月20日
發(fā)明者人野滋哲, 中村伸一郎, 小山清孝, P·J·L·M·夸弗里格, T·J·G·M·范杜倫 申請人:荷蘭加甜劑公司