專利名稱：用新的色譜分離條件純化α-1蛋白酶抑制劑的制作方法
一般來講，本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的純化方法，具體來講，本發(fā)明涉及用陽離子交換在能使活性α-1 PI不與柱結(jié)合而污染蛋白質(zhì)與柱結(jié)合的條件下純化得自血漿部分的α-1蛋白酶抑制劑。
α-1蛋白酶抑制劑(α-1 PI)是分子量為約55000道爾頓的糖蛋白。α-1 PI是蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰彈性蛋白酶、皮膚膠原酶、血管緊張肽原酶、尿激酶和多形核淋巴細(xì)胞的蛋白酶的抑制劑。α-1 PI的現(xiàn)行治療用途是抑制肺中的淋巴細(xì)胞彈性蛋白酶。該蛋白酶通過分解異種蛋白起作用。當(dāng)α-1 PI存在的量不足以調(diào)節(jié)彈性蛋白酶的活性時(shí)，該彈性蛋白酶會(huì)破壞肺組織。此不平衡經(jīng)過一定時(shí)間后會(huì)導(dǎo)致慢性肺組織損害和肺氣腫。補(bǔ)給α-1 PI已成功地用于治療這種肺氣腫。
目前對α-1 PI的需求量超過了供給量。已將α-1 PI基團(tuán)轉(zhuǎn)移并在微生物、細(xì)胞株和綿羊中表達(dá)。但尚未制得令人滿意的重組體產(chǎn)品。人血漿是治療用α-1 PI的唯一被認(rèn)可的來源。α-1 PI用于代替治療并以正常基準(zhǔn)長期給予病人。由于微量雜質(zhì)能刺激病人的免疫反應(yīng)，因此該產(chǎn)品的高純度對成功的治療是個(gè)關(guān)鍵。血漿-α-1 PI源是有限的，因此α-1 PI高收率的純化方法是必要的。至今尚無可用的能獲得高收率和高純度的α-1 PI的實(shí)用的方法。
現(xiàn)已發(fā)表了多種由人血漿中提純?chǔ)?1 PI的方法。Bollen等人(美國專利4629567(1986))使用5個(gè)不同的色譜步驟從酵母、大腸桿菌和人血漿中提純?chǔ)?1 PI。這5個(gè)步驟包括DEAE離子交換、硫醇-二硫化物交換、肝素親和、鋒螯合色譜和氨基己基離子交換。未給出純度和收率的數(shù)據(jù)。
Novika等人，Gematol.Transfuziol.3446-50(1989)報(bào)道了制備血液制品和副產(chǎn)物的分離方法。他們采用了親和、DEAE纖維素和凝膠過濾色譜。未給出純度和收率數(shù)據(jù)。
Podiarene等人，Vopr.Med.Khim.3569-99(1989)報(bào)道了用親和層析以單克隆抗體，從人血漿中分離α-1 PI的一步法。α-1 PI活性增加61.1倍，收率為20％。
Burnouf等人，Vox.Sang.52，291-297(1987)以血漿上清液A(相當(dāng)于Cohn部分II＋I(xiàn)II)為原料，使用DEAE色譜法和篩析色譜法制備α-1 PI，其純度為80-90％(以SDS-PAGE)，純度增大36倍。由上清液A的回收率為65-70％。
Hein等人，Eur.Respir.J.916s-20s(1990)提出了這樣一個(gè)方法用Cohn部分IV-作原料，采取用聚乙二醇分級沉淀，隨后在DEAE Sepharose上進(jìn)行陰離子交換色譜。終產(chǎn)品的純度為約60％，收率為45％。
Dubin等人，Prep.Biochem.2063-70(1990)提出了兩步色譜純化法。先將α-1 PI、CI抑制劑、α-1抗胰凝乳蛋白酶和內(nèi)α-1胰蛋白酶抑制劑(inter α-1 trypsin inhibitor)從Blue Sepharose中洗脫出來，然后將α-1 PI用凝膠過濾法純化。未給出純度和收率的數(shù)據(jù)。
Ballieux等人采用4-苯基丁胺新和層析、陽離子交換和最后的免疫親和步驟從化膿性痰中提純?chǔ)?1 PI和蛋白酶3-復(fù)合體(Ballieux，B.E.等人，J.Immunol.Methods 15963-70(1993)，在所用的條件下，大多數(shù)痰蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合，而α-1 PI和蛋白酶-3能不結(jié)合通過。
Jordan等人，美國專利第4748783(1988)描述了在病毒滅活步驟后用親和層析除去制劑中的無生物活性的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)的天然形式和變性形式之間進(jìn)行分離的基礎(chǔ)是天然蛋白質(zhì)對親和性樹脂的生物活性，而不是天然的和變性的蛋白質(zhì)之間的物理差異。
這些方法均未使用以強(qiáng)陽離子樹脂在低pH低鹽濃度和適中的蛋白質(zhì)濃度下的流過色譜作純化步驟。出乎意料的是，在例如這些條件下，僅活性α-1 PI流過柱子。該方法從色譜柱的回收率可達(dá)到90％，在使用兩去陽離子交換柱后純度可達(dá)約95％。本發(fā)明提供以高純度和高收率大規(guī)模地從人血漿中提純?chǔ)?1 PI的改進(jìn)的方法。
“活性α-1 PI”或“天然的α-1 PI”是指在體外彈性蛋白酶測定中能顯示抑制彈性蛋白酶活性的α-1 PI。
“非活性α-1 PI”或“變性的α-1 PI”是指在體外彈性蛋白酶評定中對彈性蛋白酶和活性無影響的α-1 PI。
“高度純化的”指含20％以下的污染蛋白質(zhì)。
“基本上不含非活性α-1 PI”指非活性α-1 PI和含量低于10％。
“基本上不含非活性病毒”指由于已經(jīng)認(rèn)可的病毒滅活步驟處理(例如巴氏滅菌或化學(xué)處理)活性病毒的含量降低。一般來講這是指模型病毒的效價(jià)降低至少約4logs。
所有的電導(dǎo)率測定均在25℃進(jìn)行。
本發(fā)明是由含蛋白質(zhì)水溶液中提純?chǔ)?1 PI的方法，即在足以能確?；钚驭?1 PI不與介質(zhì)(或離子交換樹脂)結(jié)合的pH、離子強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度的條件下，在陽離子交換色譜介質(zhì)上進(jìn)行流通色譜。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟(1)將蛋白質(zhì)溶液滲析或透析濾過至離子強(qiáng)度為約≤10mmho/cm；(2)將溶液pH調(diào)至約≤6.0；(3)將蛋白質(zhì)溶液調(diào)至約≤10mg蛋白質(zhì)/ml；(4)使溶液通過陽離子交換色譜樹脂；和(5)收集色譜的流過部分作為純化的α-1 PI。


圖1是說明一般用于提純按照本發(fā)明的α-1 PI的Cohn分級分離法、得自這些流分的蛋白質(zhì)和兩個(gè)原料(Cohn組分IV-1和Cohn流出液II和III)的流程圖。
圖2是顯示我們的α-1 PI純化方法的優(yōu)選的步驟的流程圖。
圖3是說明與在先技術(shù)相比本申請中所述的方法在純度和比活性方面的改進(jìn)的棒狀圖。
本發(fā)明是由人血漿中提純?chǔ)?1 PI的改進(jìn)的方法。本方法涉及在pH≤6.0下在低離子強(qiáng)度緩沖液中進(jìn)行陽離子交換色譜。收集流過部分，該部分含純化和α-1 PI。該陽離子交換色譜對α-1 PI是特異性的，實(shí)際上可用作直接由Cohn組分IV-1懸浮液的兩步提純法一個(gè)陽離子交換柱接著第二只陽離子交換柱。
該方法是通用的，陽離子色譜足以能處理包括Cohn組分流出液II＋I(xiàn)II、Cohn組分IV-1糊狀物(目前鋮選的原料)和純化的α-1 PI在內(nèi)的各種原料，并仍能制備基本上純的產(chǎn)品。
作為大規(guī)模制備藥用產(chǎn)品的可供選擇的方案，可以增加多個(gè)附加步驟包括病毒的滅活以使收率最佳化、增進(jìn)病毒的安全性并保證調(diào)節(jié)的一致性。這些步驟可以包括以下步驟，但不限于這些(1)在弱離子交換樹脂(DEAE)上進(jìn)行初色譜；(2)在強(qiáng)陰離交換樹脂(QAE)上進(jìn)行初色譜；(3)用干熱法或巴氏滅菌法將溶液中的病毒滅活；(4)將病毒排阻過濾以除去可能的病毒污染物；(5)化學(xué)處理例如溶劑凈化處理以將病毒滅活；和(6)沉淀步驟以在陽離子色譜前部分純化原料。
pH通過改變蛋白質(zhì)上的帶電基團(tuán)而在離子交換色譜中起關(guān)鍵作用。它能改變蛋白質(zhì)與色譜樹脂的結(jié)合行為，或者由未結(jié)合的轉(zhuǎn)變成結(jié)合的，或者與此相反。優(yōu)選用在本發(fā)明中的強(qiáng)陽離子樹脂配體是與樹脂珠直接或通過短碳基鏈相連的磺酸根(-SO3-)。該配體在1-14的pH范圍內(nèi)帶有負(fù)電荷。若在給定的pH下蛋白質(zhì)的凈有效表面電荷是負(fù)的，則該蛋白質(zhì)將無阻滯地流過該柱。一般來講，若該溶液的pH在其pI以上，則該蛋白質(zhì)具有負(fù)電荷。
在人血漿中的兩個(gè)很特別的蛋白質(zhì)是α-1 PI和白蛋白，其平均pI分別為4.8和5.3。這兩種蛋白質(zhì)在pH5.45均應(yīng)帶負(fù)電并應(yīng)流過陽離子交換柱。出人意料的是，這些實(shí)驗(yàn)顯示，在低鹽濃度和pH5.45的條件下，白蛋白和變性的(或無活性的)α-1PI與該樹脂結(jié)合，而僅天然的(或活性的)α-1 PI流過該柱。對α-1 PI的這一觀察結(jié)果提示在離子交換中，不僅蛋白質(zhì)的pI而且其三級結(jié)構(gòu)也是重要的。α-1PI的天然形式顯然具有負(fù)性電荷表面，而變性形式的表面可能帶有更多正電荷。因此，變性蛋白質(zhì)意外地與陽離子樹脂相結(jié)合。α-1 PI的天然形式在較高pH下要穩(wěn)定得多。若考慮α-1 PI的穩(wěn)定性和用離子交換色譜純化α-1 PI，則pH5.45是實(shí)用的最低pH值。
離子交換樹脂和蛋白質(zhì)溶液之間的平衡受該溶液的離子強(qiáng)度、蛋白質(zhì)濃度、pH和該樹脂上的特定配體所影響。Yamamoto等人在Biote-chonl.Bioeng.251373-1391(1983)中提出了關(guān)于作為在低蛋白質(zhì)濃度溶液的離子強(qiáng)度的函數(shù)的分布系數(shù)的半經(jīng)驗(yàn)公式。該公式為K＝A(I)B＋Kcrt式中K代表分布系數(shù)，A和B代表經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，I代表溶液的離子強(qiáng)度，Kcrt代表在靜電相互作用可被忽略的高離子強(qiáng)度下蛋白質(zhì)的分布系數(shù)。在給定的離子強(qiáng)度下不同的蛋白質(zhì)的分布系數(shù)不同。因此，不同的蛋白質(zhì)在相同的條件下以不同的速度遷移。這適用于用該色譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離。在低鹽濃度下，多數(shù)蛋白質(zhì)的遷移速度由于在進(jìn)樣步驟中與樹脂結(jié)合而減慢，天然的α-1 PI由于其獨(dú)特的表面電荷性質(zhì)通過該柱。若流過緩沖液的離子強(qiáng)度增大，則其它蛋白質(zhì)與樹脂的相互作用被改變，較大百分比例的蛋白質(zhì)會(huì)流過該柱。因此，增加該溶液的離子強(qiáng)度會(huì)降低流過該柱的α-1 PI的純度。
鹽濃度能能過陽離子例如Na+與樹脂上的氫離子進(jìn)行可逆性交換而改變流出液的pH。增加鹽濃度能使更多的H+從樹脂轉(zhuǎn)移至流出液中，從而導(dǎo)致洗脫液pH降低。因此，當(dāng)初始蛋白質(zhì)溶液用平衡緩沖液超濾時(shí)，進(jìn)樣溶液的離子強(qiáng)度應(yīng)等于或略高于平衡緩沖液的離子強(qiáng)度。于是pH在進(jìn)樣過程中應(yīng)保持相同或僅略微降低，若在進(jìn)樣后將平衡緩沖液用作洗滌劑，則它可由于降低了離子強(qiáng)度而導(dǎo)致pH增大。因此，在該洗滌劑中可使用略高的離子強(qiáng)度緩沖劑以保持該pH。
如前所述，高蛋白質(zhì)濃度也能影響蛋白質(zhì)與樹脂的結(jié)合平衡。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度增高時(shí)，吸附等溫線通表常表現(xiàn)出飽和曲線(Yamamoto等人，“Ion Exchange Chromatography of Proteins”，1988，Chromat-ograpHic Science Serise)。因此，當(dāng)接近結(jié)合的飽和水平時(shí)，結(jié)合的雜質(zhì)的實(shí)際量達(dá)最大。在達(dá)到最大后，通過該柱的雜質(zhì)的相對百分?jǐn)?shù)在樣品的蛋白質(zhì)濃度增加時(shí)會(huì)增大。因此，蛋白質(zhì)濃度在低至足以在雜質(zhì)的吸附曲線的線性范圍內(nèi)時(shí)最佳。
由于蛋白質(zhì)往往能緩沖溶液的pH，因此蛋白質(zhì)濃度還能影響流出液的pH。當(dāng)將蛋白質(zhì)通過與色譜介質(zhì)結(jié)合從溶液中選擇性去除時(shí)，該溶液的實(shí)際緩沖作用(即pH)被改變。對色譜法的影響是復(fù)雜的，因?yàn)閜H變化將取決于被吸附到該柱上的蛋白質(zhì)的相對百分?jǐn)?shù)。吸附受柱的流通量、溶液的緩沖能力、蛋白質(zhì)混合物的改變的性質(zhì)和各種蛋白質(zhì)的競爭性結(jié)合的影響。
我們的實(shí)驗(yàn)表明，在給陽離子交換柱進(jìn)樣時(shí)，用較高的蛋白質(zhì)濃度給該陽離子交換柱進(jìn)樣，能導(dǎo)致流出液的pH逐漸增大。pH升高會(huì)導(dǎo)致α-1 PI的純度降低。為使大規(guī)模純化用的陽離子交換柱的載荷最大，可在雜質(zhì)曲線和pH影響的可接受的范圍內(nèi)使用較高的濃度，盡管一般來講較稀的蛋白質(zhì)溶液是α-1 PI純化色譜的較好的原料。
實(shí)施例1優(yōu)選的實(shí)施方案在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，用陰離子交換色譜從在加至強(qiáng)陽離子交換柱之前的Cohn組分IV-1(Fr.IV-1)懸浮液中部分提純?chǔ)?1 PI。根據(jù)比活性。Cohn組分IV-1懸浮液為約10％α-1 PI。IV-1懸浮液象其它血漿組分一樣，含多種蛋白質(zhì)脂蛋白、免疫球蛋白、球蛋白、變性蛋白等。脂蛋白存在一個(gè)特殊問題。若它們與色譜樹脂結(jié)合，則它們難以去除并能堵塞樹脂孔，使整個(gè)樹脂床的壓力增大。而且，由于蛋白質(zhì)殘余累積在樹脂上，結(jié)合能力喪失。為從Fr.IV-1懸浮液中除去脂蛋白和其它雜質(zhì)，第一步采用DEAE離子交換色譜，而不用強(qiáng)陽離子色譜。DEAE荷載條件應(yīng)為能使大部分脂蛋白通過該柱而不結(jié)合。DEAE離子交換色譜的α-1 PI洗脫條件基于獲取α-1 PI的95-100％回收率來選擇。
將IV-1懸浮液的電導(dǎo)率調(diào)至≥5mmho/cm，pH調(diào)至8.0。然后將該蛋白質(zhì)溶液加在DEAE樹脂上。用20mM磷酸氫二鈉和95mM氯化鈉在pH8.0洗脫α-1 PI。將DEAE流出液用20mM磷酸二氫鈉和5mM氯化鈉在pH6.5進(jìn)行透析濾過。將經(jīng)透析濾過的洗脫液調(diào)至pH5.45，然后將其加至強(qiáng)陽離子樹脂上，α-1 PI流過該柱。將流出液調(diào)至pH7.0，并加入0.15M氯化鈉。
若期望，可在此時(shí)將α-1 PI冷凍。對于病毒的滅活，將α-1 PI溶液融化，若有必要，在60mM組氨酸和5mM氯化鈣中調(diào)至pH6.5，然后凍干，然后將凍干物于80℃加熱72小時(shí)以將病毒滅活。然后將凍干物溶于凈化水中，并加入37％(W/V)蔗糖和0.38M檸檬酸鹽作穩(wěn)定劑。加入0.3％磷酸三正丁酯(TNBP)和0.2％膽酸鈉作為處理包膜病毒(enveloped viruses)的溶劑洗滌劑。于30℃培養(yǎng)3小時(shí)后，用透析濾過法除去TNBP和膽酸鹽。
將已經(jīng)病毒滅活處理的溶液用20mM磷酸二氫鈉和5mM氯化鈉在pH6.5進(jìn)行透析濾過。將經(jīng)透析濾過的溶液調(diào)至pH5.45，并加至第二強(qiáng)陽離子樹脂中以除去任何剩余的污染物和由于病毒滅活步驟變性的α-1 PI。α-1 PI的天然形式流過該柱。將收集的流出液調(diào)至pH17.0，加入0.15M氯化鈉，并使其通過0.15μM濾器作為補(bǔ)充的病毒滅活步驟。制得高純度的基本上不含其它蛋白質(zhì)的α-1 PI(≥95％)。DEAE色譜能除去脂蛋白，將α-1 PI的純度增至20％。第一陽離子柱能制得約60-70％純度的α-1 PI，同時(shí)回收率為約90％。第二陽離子柱能使終產(chǎn)品的純度達(dá)到95％。將陽離子交換柱用1MNacl和1MNaOH洗滌以除去結(jié)合的蛋白質(zhì)。將與兩個(gè)陽離子交換柱結(jié)合的蛋白質(zhì)依次用1M氯化鈉和1M氯化鈉和1M氫氧化鈉除去。
實(shí)施例2在本實(shí)施例中Cohn組分II＋I(xiàn)II流出液是原料。將其用20mM磷酸二氫鈉和5mM氯化鈉在pH6.5和5℃進(jìn)行透析濾過以除去醇并降低離子強(qiáng)度。然后將該溶液調(diào)至pH5.45并加至預(yù)平衡的強(qiáng)陽離子交換柱中。收集流出液作為顯著富集的α-1 PI部分。在該原料中的污染蛋白質(zhì)被滯留在陽離子交換柱中。
在一次通過陽離子交換柱后。α-1 PI被純化至基本上不含Cohn組分流出液II＋I(xiàn)II中的其它蛋白質(zhì)。該流出液的純度據(jù)DSD-PAGE為82％α-1 PI。比活性增大20倍，由每毫克總蛋白質(zhì)0.03mg彈性蛋白酶抑制活性增至每毫克蛋白質(zhì)0.59mg彈性蛋白酶抑制活性。
實(shí)施例3本實(shí)施例使用部分純化的可商購的α-1 PI(Prolastin，Miles，Inc.)作原料。將Prolastin用0.1MNaCl和0.02M磷酸鈉在pH7.0緩沖。α-1 PI的濃度約為30mg/ml，蛋白質(zhì)濃度為約60ml/ml。白蛋白通常為總蛋白質(zhì)的1％。IgA的含量通常為約1mg/ml(總蛋白質(zhì)的2.5％)。將Prolastin用5mMNaCl和20Mm磷酸二氫鈉透析濾過的降低離子強(qiáng)度。將溶液的pH降至5.45，蛋白質(zhì)濃度降至5.3mg/ml，并使該溶液流過強(qiáng)陽離子交換柱。收集流出液作為純化的α-1 PI在SDS-PAGE上僅顯示出單體和二聚體α-1 PI，蛋白質(zhì)分別為95.4％和4.6％。然后使該溶液于pH7.0在0.15MNaCl中穩(wěn)定，并可被過濾或濃縮并凍干，得到最終的穩(wěn)定的產(chǎn)品。
將結(jié)合的蛋白質(zhì)流分洗脫，并在SDS-PAGE上進(jìn)行電泳。用Coomassie Blue顯色的蛋白質(zhì)的44％是在α-1 PI的分子量范圍內(nèi)。該部分的彈性蛋白酶抑制作用測定表明無α-1 PI活性。這表明該帶中的蛋白質(zhì)是失活的α-1 PI。
對上述實(shí)施例的總結(jié)見下表。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)
也成功地用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模..由Coomassie Blue可染色的蛋白質(zhì)測得的純度百分?jǐn)?shù)，并經(jīng)Western Blot鑒定為單體和二聚體的混合物?！偸章释肝鰹V過后給出。透析濾過后觀察到α-1 PI活性增強(qiáng)。
以上描述了本發(fā)明，我們認(rèn)為，蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)對其做出變動(dòng)。因此，以上實(shí)施例應(yīng)僅被認(rèn)為是對本發(fā)明的舉例說明，本發(fā)明的范圍應(yīng)僅受附權(quán)利要求的限制。
權(quán)利要求
1.在含有α-1蛋白酶抑制劑和其它蛋白質(zhì)的水溶液中提純?chǔ)?1蛋白酶抑制劑的方法，它包括以下步驟(A)調(diào)節(jié)該水溶液的pH、離子強(qiáng)度和蛋白質(zhì)濃度以使得活性α-1蛋白酶抑制劑不能與離子交換樹脂結(jié)合，而溶液中的其它蛋白質(zhì)能與離子交換樹脂結(jié)合；和(B)使該溶液流過該離子交換樹脂并收集流出液中的α-1蛋白酶抑制劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，在步驟(A)中的水溶液的pH不超過約6.0。
3.權(quán)利要求1的方法，其中，水溶液的離子強(qiáng)度不超過約10mmho/cm。
4.權(quán)利要求1的方法，其中，水溶液的蛋白質(zhì)濃度不超過約10g/ml。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟被實(shí)施一次以上。
6.權(quán)利要求5的方法，其中，在純化步驟之間對該溶液實(shí)施病毒滅活步驟。
7.權(quán)利要求6的方法，其中，其中病毒滅活步驟包括將α-1蛋白質(zhì)酶抑制劑在不低于約60℃加熱不少于約10小時(shí)。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述的病毒滅活步驟包括加入化學(xué)試劑。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述的病毒滅活步驟包括向溶液中加入磷酸三正丁酯和洗滌劑。
10.高純度的α-1蛋白酶抑制劑的制劑，它包括含活性α-1蛋白酶抑制劑基本上不含活性病毒和無活性α-1蛋白質(zhì)酶抑制劑并且活性為每mg總蛋白質(zhì)至少約0.9mg彈性蛋白酶抑制活性。
11.權(quán)利要求10的制劑，其中α-1蛋白酶抑制劑的純度大于90％。
12.在藥學(xué)上可接受的載體中的權(quán)利要求10的產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及用在pH低于6.0和低離子強(qiáng)度下溶液的陽離子色譜從生物流體包括血漿和血漿組分中提純?nèi)甩?1蛋白酶抑制劑(α-1PI)的方法。陽離子色譜的優(yōu)點(diǎn)在于在這些條件下活性α-1PI不與該陽離子柱結(jié)合而其它蛋白質(zhì)包括變性的α-1PI和白蛋白與該陽離子柱結(jié)合。結(jié)果，活性α-1PI流過該色譜柱。而污染蛋白質(zhì)留在柱上。α-1PI的回收率高，且純度的提高是驚人的。
文檔編號C07K14/81GK1125231SQ95108778
公開日1996年6月26日 申請日期1995年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1994年8月24日
發(fā)明者W·R·利賓, S·X·陳 申請人:美國拜爾公司