專利名稱：一種多克隆抗體、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多克隆抗體，制備方法及其用途。該多克隆抗體由1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單乙酯半抗原，通過二元酸酐作為橋梁與載體蛋白聯(lián)結(jié)而成適于動物免疫的抗原體系，再經(jīng)動物免疫后獲得多克隆抗體，具有催化萘普生酯水解的能力。
八十年代化學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)催化抗體(抗體酶)(Tramontano A，Janda K.D.Lerner R.A.Catalytic Antibodies.Science，1986，2341566-1570；Pollack S.J.Jacobs J.W.，Schultz P.G.Selective Chemical Catalysis by an Antibody，Science，1986，2341570-1573)，把抗體的極其多樣性與酶的巨大催化能力等特性結(jié)合在一起，為傳統(tǒng)的化學(xué)和免疫學(xué)研究開辟了一個嶄新的方向。利用經(jīng)過特殊的設(shè)計(jì)并合成的有機(jī)分子作為半抗原，聯(lián)結(jié)載體蛋白后免疫動物并經(jīng)細(xì)胞雜交技術(shù)，從篩選和分離的單克隆抗體中，成功地獲得具有催化功能的抗體。至今已有五十多個反應(yīng)能用催化抗體來催化(Schultz P.G.，Lerner R.A.，Benkovic S.J.Catalytic Anti-bodies.Chem.Eng.News 1990，May 28，P20-40；Ikeda S.，Janda K.D.Catalytic Antibody(觸媒抗體)の最近の進(jìn)步と應(yīng)用につぃて.有機(jī)合成化學(xué)協(xié)會志，1993，51284-297)，對某些反應(yīng)(如Diels-Alder反應(yīng))，自然界不存在能催化它們的酶，也能用抗體來進(jìn)行催化(Hilvert D.et al.Antibody Catalysis of a Diels-Alder Reaction.Am.Chem.Soc.1989，1119261-9262；Braisted A.C.，Schultz P.G. An Anti-body-CatalyzedBimolecular Diels-Alder Reaction. J.Am.Chem.Soc.1990，1127430-7431)。對用多克隆抗體來催化有機(jī)反應(yīng)的報(bào)道甚少(Gallacher D.et all.A polyclonal antibody preparation with Michaelian catalytic proper-ties.Biochem.J.1991，279，871-881.Polyclonal antibody-catalysed amidehydrolysis.ibid 1992，284，675-680)。我們報(bào)道了1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單乙酯作為半抗原，但至今未見多克隆抗體對手性識別的報(bào)道。因此，設(shè)計(jì)具有特異性的催化抗體，在化學(xué)，生物學(xué)，醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域無疑將顯示巨大的應(yīng)用潛力。萘普生是一種非常重要的非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥，其S構(gòu)型的藥效為R構(gòu)型的38倍，研究用抗體催化水解萘普生乙酯來拆分獲得S構(gòu)型的萘普生，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明的目的是提供一種多克隆抗體。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備該多克隆抗體的方法。
本發(fā)明還有一個目的是提供這種多克隆抗體的用途。
本發(fā)明的一種多克隆抗體是以萘普生酯為水解底物，設(shè)計(jì)其膦酸酯(4)為過渡態(tài)類似物，以1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單甲酯或單乙酯(4)為半抗原，用丁二酸酐或戊二酸酐為橋梁，一個羧基與半抗原的6-羥基聯(lián)結(jié)，得到適合動物免疫的半抗原-載體蛋白體系(5)， 式中R＝Me或Et，R1＝BSA或KLH，R2＝(CH2)2或(CH2)3所述的載體蛋白是牛血清蛋白或鑰孔韓血蘭素，可分別簡稱為BSA或KLH。用半抗原-載體蛋白體系(5)免疫動物，取血后分出血清，經(jīng)純化得到免疫球蛋白(IgG)，即本發(fā)明的多克隆抗體。
換言之本發(fā)明的多克隆是一種以1-(6-羥基-β-萘基)-乙膦酸單酯或乙酯(4)為半抗原制得的多克隆抗體。也可以說本發(fā)明的多克隆抗體是一種以半抗原一載體蛋白體系(5)經(jīng)過免疫動物，取血分出全血清，分離純化得到多克隆抗體。
本發(fā)明的多克隆抗體采用pH為7.3的磷酸緩沖液時毛細(xì)管電泳檢測顯示均一產(chǎn)物。
本發(fā)明的多克隆抗體分子量約達(dá)150000，整個分子由四條多肽鏈組成，其中兩條相同的長鏈為重鏈，分子量各約為50000，兩條相同的輕鏈，分子量約為25000，兩條重鏈藉二硫鍵聯(lián)結(jié)起來，呈Y字形，兩條輕鏈又通過二硫鍵連接在Y字的兩側(cè)，整個抗體分子呈對稱結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的多克隆抗體制備方法，是以1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單甲酯或乙酯(4)半抗原為原料，用丁二酸酐或戊二酸酐作橋梁，使一個羧基與6-羥基聯(lián)接成酯，另一個羧基與載體蛋白聯(lián)接，所述的載體蛋白是牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血蘭素(KLH)，得到適于動物免疫的抗體。 其中R＝Me或Et，R1＝BSA或KLH，R2＝(CH2)2或(CH2)3。具體地說在室溫下和極性溶劑中，以對-二甲氨基吡啶(簡DMAP)為催化劑，化合物(4)和丁二酸酐或戊二酸酐反應(yīng)1-20小時即得化合物(6)，其中化合物(4)、丁二酸酐或戊二酸酐和催化劑的克分子比為1∶1-10∶0.1-2。推薦比例為1∶1-5∶0.8-1.5。所述的溶劑最好是吡啶。
在極性溶劑中，化合物(6)與載體蛋白BSA或KLH反應(yīng)0.5-10小時可獲半抗原-載體蛋白(5)。通常化合物(6)和載體的克分子比為1∶0.001-0.1，以1∶0.001-0.01為好。反應(yīng)可在室溫下進(jìn)行。加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺縮合劑將有利于加快反應(yīng)的進(jìn)行，化合物(6)和縮合劑的克分子比為1∶0.5-10。通常載體蛋白溶于磷酸緩沖液后加入反應(yīng)體系。
上述反應(yīng)所得的半抗原-載體蛋白(5)可以用半透膜透析除去小分子的未反應(yīng)的半抗原和縮合劑。
將半抗原-載體蛋白(5)進(jìn)行動物免疫，取血分離出抗全血清，用飽和硫酸銨溶液沉淀得粗制多克隆抗體，具體地說，將半抗原-載體蛋白體系與弗氏佐劑(Freund′s adjurant)等體積混和，制成乳化疫苗，進(jìn)行動物免疫，在小鼠、兔、大鼠或豚鼠等動物的頸、背和足掌等部位皮下注射疫苗作初次免疫。再次免疫時，以不完全弗氏佐劑取代初次免疫的弗氏佐劑制成疫苗以免疫動物。兩次免疫間隔時間為10-30天。最后一次免疫后7天取出血，分離出抗全血清，用40％的飽和硫酸銨溶液沉淀，得粗多克隆抗體?？梢杂肈E-52離子交換層析分離除去其它血清蛋白，得純多克隆抗體，也可用冷凍干燥法獲純多克隆抗體粉末，能長期保存，毛細(xì)管電泳顯示均一。
動物免疫證明兔的免疫效果最好，用酶聯(lián)免疫吸附法(ECISA)測定血清中半抗原的抗體滴度(O.D.值)稀釋6400倍時，其抗體滴度仍為空白對照組的3.4倍。
本發(fā)明的多克隆抗體能催化萘普甲酯或乙酯水解生成萘普生。當(dāng)催化消旋體萘普生乙酯時，其催化水解反應(yīng)動力學(xué)符合Michaelis-Menten速率方程。

圖1為水解反應(yīng)的底物濃度時間關(guān)系曲線，圖1中表示為對照不加催化多克隆抗體，*為加催化多克隆抗體的結(jié)果。圖2為底物濃度的倒數(shù)和其初速度倒數(shù)的關(guān)系曲線，從所得數(shù)據(jù)計(jì)算得到Vmax＝17.4±0.8μmol/L.min，KM＝477±13μmol/LKcat＝2.26±0.10min-1，kcat/Kuncat＝1240，Vmax/[E0]＝135S-1.表明本發(fā)明的多克隆抗體能催化萘普乙酯水解，加速1240倍。本發(fā)明的多克隆抗體分別對旋光性的S-萘普生乙酯和R-萘普生乙酯催化水解，發(fā)現(xiàn)S-異構(gòu)體的濃度保持不變，而R-異構(gòu)體的濃度在不斷降低，約4-8小時，能完全水解掉R-異構(gòu)體的酯。結(jié)果顯示于圖3和圖4中。圖3表示底物濃度與反應(yīng)時間的關(guān)系，其中□、 ，■和Q，、●分別表示S-萘普生乙酯和R-萘普生乙酯，□、○和■、●分別表示不加和加多克隆抗體的結(jié)果。 、為相應(yīng)加對照組兔的非專一性多克隆的結(jié)果。圖4為R-萘普生乙酯底物濃度的倒數(shù)和其初速度倒數(shù)的關(guān)系曲線，從直線斜率求出KM＝202μM，從直線截距求出Vmax＝417μM.min-1，Kcat＝0.0496s-1/uncat＝1285.即本發(fā)明的多克隆抗體能使R-萘普生乙酯的水解反應(yīng)速度增加1285倍。
本發(fā)明的多克隆抗體不僅制備方法簡便，產(chǎn)物可長期保存，而且可用于拆分混旋的萘普生乙酯，經(jīng)對映選擇性水解掉R-構(gòu)型后，可用稀堿洗滌除去R-構(gòu)型的酸，將反應(yīng)混合物在堿性條件下皂化，可分離出S-構(gòu)型的萘普生。
通過下述實(shí)施例將有助于進(jìn)一步理解本發(fā)明，但并不限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1化合物(6)的制備化合物(4)(0.8mmol)溶于2mL吡啶中，加入丁二酸酐或戊二酸酐(1.4mmol)和DMAP(100mg，0.8mmol)。在室溫下攪拌過夜，薄層層析檢測反應(yīng)完全。硅膠柱層析分離，先用石油醚洗去吡啶，然后用乙酸乙酯淋洗，之后再用乙酸乙酯無水乙醇(1∶2)的混合溶劑淋洗，濃縮得白色產(chǎn)物160-170mg。
當(dāng)R＝Et，采用丁二酸酐時，產(chǎn)物(9)的1H NMR7.86(s，1H，ArH)，7.83(d，J＝8.7Hz，1H，ArH)，7.73(d，J＝8.5Hz，1H，ArH)，7.64(d，J＝8.5Hz，1H，ArH)，7.25(d，J＝2.16Hz，1H，ArH)，7.21(dd，J＝8.7，2.16Hz，1H，ArH)，6.85(d，J＝7.4Hz，1H，OH)，4.02(q，J＝1.5Hz，2H，POCH2CH3)，3.62(q，J＝7.3Hz，2H，ArOCOCH2CH2COOH)，3.37(m，1H，ArCHCH3)，3.25(q，J＝7.3Hz，2H，ArOCOCH2CH2COOH)，1.77(dd，J＝7.2，16.6Hz，3H，ArCHCH3)，1.44(t，J＝1.5Hz，3H，POCH2CH3).
MS381(M＋1)，335，319，303，280，265，171，102.實(shí)施例2化合物(5)的制備將BSA或KLH 10mg溶于3.75mL磷酸緩沖液中，于室溫?cái)嚢柘录尤牖衔?6)30mg的N，N-二甲基甲酰胺1.25mL溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺縮合劑10-30mg，反應(yīng)1小時，以半透膜透析除去小分子，得半抗原載體蛋白(5)。實(shí)施例3多克隆抗體的制備將半抗原-載體蛋白(5)與弗氏佐劑等體積混和，制成乳化的疫苗，在動物的頸、背和足掌等部位皮下注射疫苗作初次免疫。再免疫時，以不完全弗氏佐劑取代初次免疫時的弗氏佐劑，制成疫苗以免疫動物。兩次免疫間隔時間約10-30天。最后一次免疫后7天取血，血液放置過夜，讓其凝結(jié)，經(jīng)離心除去血塊，血清部分用40％飽和硫酸銨溶液沉淀。離心去上清液，沉淀用盡可能少的磷酸緩沖液溶解，經(jīng)透析后用DE-52離子交換樹脂層析分離除去其它血清蛋白，得到免疫球蛋白IgG，毛細(xì)管電泳顯示均一產(chǎn)物(磷酸緩沖液，pH7.3)，即多克隆抗體。
用酶聯(lián)免疫吸咐法(ELISA)測定上述血清中抗半抗原的抗體滴度，采用了以不同于制備疫苗的載體蛋白組成的半抗原-載體作為包被抗原或以封阻、中和抗血清中抗載體蛋白抗體的方法(季永鏞，中國免疫學(xué)雜志，7290-293，1991)，測定結(jié)果如下
免疫血清中抗半抗原的抗體滴度(OD450)
實(shí)施例4催化消旋萘普生乙酯水解反應(yīng)的動力學(xué)測定水解條件在50mmol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，136mmol/L NaCl，pH＝8.2，37℃條件下，消旋萘普生乙酯底物和多克隆抗體的比為50∶1，空白對照條件相同。
分析條件以HPLC C18反相柱跟蹤水解反應(yīng)，檢測波長為240mm，流動相為乙腈∶水＝70∶30，內(nèi)標(biāo)是6-甲氧基-β-萘甲醇。
結(jié)果繪于圖1和圖2。實(shí)施例5催化R-和S-構(gòu)型萘普生乙酯水解反應(yīng)動力學(xué)測定水解條件在50mmol/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，100mmol/L NaCl，pH＝8.2，37℃條件下，R或S-構(gòu)型乙酯各為30mol，多克隆抗體0.7μmol，空白對照條件相同。分析條件同實(shí)施例4，結(jié)果繪于圖3和圖4。
權(quán)利要求
1一種多克隆抗體，其特征是以分子式為 的化合物作為半抗原，制備半抗原-載體蛋白，經(jīng)動物免疫，取血，分出抗全血清，純化制得，其中R＝Me或Et，R1＝BSA或KLH，R2＝(CH2)2或(CH2)3。
2一種如權(quán)利要求1所述的多克隆抗體，其特征是用pH為7.3的磷酸緩沖液毛細(xì)管電泳檢測顯示均一產(chǎn)物。
3一種如權(quán)利要求1所述的多克隆抗體的制備方法，其特征是用下述步驟測得(1)在室溫和極性溶劑中，對-二甲氨基吡啶為催化劑，1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單甲酯或單乙酯(4)和(R2CO)2O反應(yīng)1-20小時得化合物(6)， 其中R＝Me或Et，R1＝OH，R2＝(CH2)2或(CH2)3，化合物(4)、(R2CO)2O和催化劑克分子比為1∶1-10∶0.1-2，(2)在極性溶劑中，化合物(6)和載體蛋白BSA或KLH在室溫下反應(yīng)0.5-10小時得分子式為 的半抗原-載體蛋白(5)，其中R1＝BSA或KLH，R＝Me或Et，R2＝(CH2)2或(CH2)3，化合物(6)和載體蛋白的克分子比為1∶0.001-0.1，(3)將半抗原-載體蛋白(5)與弗氏佐劑等體積混和后制成乳化疫苗，進(jìn)行動物初次免疫，再次免疫時以不完全弗氏佐劑取代弗氏佐劑制成疫苗免疫動物，兩次免疫時間間隔10-30天，最后一次免疫后7天取出血，分出抗全血清，用40％的飽和硫酸銨溶液沉淀，得粗多克隆抗體。
4一種如權(quán)利要求3所述的多克隆抗體的制備方法，其特征是在制備化合物(6)時，化合物(4)、(R2CO)2O和催化劑的克分子比為1∶1-5∶0.8-1.5。
5一種如權(quán)利要求3所述的多克隆抗體的制備方法，其特征是在制備化合物(6)時，溶劑是吡啶。
6一種如權(quán)利要求3所述的多克隆抗體的制備方法，其特征是在制備半抗原載體蛋白(5)時還加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺縮合劑，化合物(6)和縮合劑的克分子比為1∶0.5-10。
7一種如權(quán)利要求3所述的多克降抗體的制備方法，其特征是動物免疫時，推薦動物采用兔。
8一種如權(quán)利要求3所述的多克隆抗體的制備方法，其特征是將粗多克隆抗體用DE52離子交換樹脂分離除去其它血清蛋白。
9一種如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的多克隆抗體的用途，其特征是催化水解萘普生甲酯或乙酯。
10一種如權(quán)利要求1、2、3、4、5、6、7或8所述的多克隆抗體的用途，其特征是催化水解R構(gòu)型萘普生甲酯或乙酯，從消旋的萘普生甲酯或乙酯中拆分得到S構(gòu)型萘普生甲酯或乙酯。
全文摘要
本發(fā)明是一種多克隆抗體。從1-(6-羥基-β-萘基)-乙基膦酸單甲酯或單乙酯為半抗原，用丁二酸酐或戊二酸酐作橋梁，一個羧基與半抗原的6-羥基聯(lián)接成酯，另一個羧基與牛血清白蛋白或鑰孔血蘭素等載體蛋白聯(lián)接成半抗原-載體蛋白體系，經(jīng)動物免疫，分出抗原血清，純化而成。不僅方法簡便，能催化萘普生酯水解，而且對手征性萘普生酯有專一選擇性，可用于拆分純化S-構(gòu)型的萘普生。
文檔編號C07K16/00GK1116548SQ95111630
公開日1996年2月14日 申請日期1995年5月9日 優(yōu)先權(quán)日1995年5月9日
發(fā)明者楊炳輝, 趙河, 胡允金, 吳毓林, 季永鏞, 葉敏 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所