專利名稱：：抗表皮生長因子受體的單鏈可變區(qū)片段和抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新的抗EGFR抗體和抗體片段，優(yōu)選可從由免疫哺乳動物(優(yōu)選小鼠)細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體抗體文庫獲得的單鏈可變區(qū)片段(scFv)。從噬菌體抗體文庫分離到的抗體片段可用基因工程方法產(chǎn)生部分人源化的完全抗體分子。這些嵌合的抗EGFR抗體含有人免疫球蛋白的恒定區(qū)，它們及其片段可用作診斷和治療人腫瘤的試劑。另外，本發(fā)明證明噬菌體抗體文庫與標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)相比，是一種從免疫哺乳動物分離抗體的更通用的替代方法。本發(fā)明還涉及用于治療諸如黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤或癌的腫瘤的含有所述抗體或片段的藥物組合物。所述抗體或片段還可用于所述腫瘤的體外或體內(nèi)定位和評估的診斷應(yīng)用。本說明書涉及的幾種技術(shù)術(shù)語定義如下“FR”(框架區(qū))指支持三個CDR的輕鏈或重鏈可變區(qū)的四個亞區(qū)。“CDR”(互補(bǔ)性決定區(qū))指具有高變序列并形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的輕鏈或重鏈可變區(qū)的三個亞區(qū)，主要負(fù)責(zé)與抗原直接接觸。“嵌合的”或部分人源化抗體指含有來自人的恒定區(qū)和來自非人(如鼠)的可變區(qū)(包括CDR)的抗體。“人源化”或完全人源化抗體指含有來自人的恒定區(qū)和FR，而含有非人源的CDR的抗體?！癊GF”和“EGFR”指表皮生長因子和其受體。“PCR”指聚合酶鏈反應(yīng)?！皊cFv”指作為一種抗體片段的單鏈可變區(qū)片段?！癡L”指輕鏈可變區(qū)?！癡K”指K輕鏈可變區(qū)。“VH”指重鏈可變區(qū)。PBS指磷酸鹽緩沖的鹽水FCS指胎牛血清HBSS指Hanks平衡鹽溶液FITC指異硫氰酸熒光素MTC指混合細(xì)胞培養(yǎng)表皮生長因子(EGF)是一種促表皮和上皮細(xì)胞有絲分裂的多肽激素。當(dāng)EGF與敏感細(xì)胞作用時，其與膜受體(EGFR)結(jié)合。EGFR是一種約170KD的跨膜糖蛋白，是C—erb—B原一致癌基因的基因產(chǎn)物。MAb425是針對熟知的人A431癌細(xì)胞系(ATCCCRL1555)產(chǎn)生的鼠單克隆抗體，其與人EGFR外部功能區(qū)的多肽表位(抗原決定簇)結(jié)合，抑制EGF的結(jié)合。發(fā)現(xiàn)MAb425(ATCCHB9629)體外介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞毒性，抑制類表皮的結(jié)腸直腸癌衍生的細(xì)胞系體外腫瘤細(xì)胞生長(Rodeck等，CancerRes.1987，473692)。WO92/15683中公開了MAb425的人源化和嵌合抗體的形式。近幾年來，已描述了可在原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌中產(chǎn)生功能性抗體片段的方法(SkerraandPluckthun，Science1988，2401038；Better等，Science1988.2401041)。這包括Fv片段和Fab片段，其中Fv片段特別有意義。還描述了單鏈Fv(其中VL和VH鏈連接在一起)(Bird等，Science1988，242423；Huston等，ProcNatl，AcadSciUSA1988，855879)。噬菌體抗體文庫提供了從免疫動物分離抗體的對雜交瘤技術(shù)的一種替代技術(shù)。雜交瘤技術(shù)是使產(chǎn)生抗體的細(xì)胞無限增殖化。噬菌體抗體技術(shù)是使編碼抗體的基因無限增殖化(Winter，G.和MilsteinC.，Nature1991，349293)。在噬菌體抗體技術(shù)中，PCR擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，可變區(qū)隨機(jī)組合并在噬菌體顆粒的表面表達(dá)為抗體片段，然后從噬菌體抗體文庫篩選與目標(biāo)抗原結(jié)合的抗體。當(dāng)可能在動物的脾臟造成強(qiáng)免疫應(yīng)答時，雜交瘤技術(shù)分離鼠單克隆抗體是非常成功的。例如，用人A431腫瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)免疫小鼠，從其脾中分離到了抗人表皮生長因子受體(EGFR)的鼠MAb(Marthy等，Arch，Biochem，Biopbys，1987，252549)。噬菌體抗體技術(shù)比雜交瘤技術(shù)的潛在優(yōu)勢是可使用幾乎任何來源的抗體表達(dá)細(xì)胞作為起始材料，可迅速篩選出大量不同抗體。噬菌體抗體技術(shù)的另一優(yōu)點(diǎn)是已克隆了目標(biāo)抗體可變區(qū)的編碼基因，隨時可進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作。曾報導(dǎo)將從噬菌體抗體文庫分離的抗破傷風(fēng)類毒素Fab片段轉(zhuǎn)化為全抗體分子(Berder等，Hum.Antibod.Hybridomas1993，474)。近十年中，已使用體外免疫作為主動免疫的一種替代技術(shù)來產(chǎn)生人和鼠系統(tǒng)的大量不同抗原的單克隆抗體(mAb)(如Vanx，D.J，T；Helenius，A，和Mellman，I；Nature，1988，33636；Gathu-ru，J.K等；J.Immunol.Methods，1991，13795；Borrebaeck，C.A.K；Immunol，Today，1988，9355)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是只需要少量的抗原，并且此方法可用于產(chǎn)生雜交瘤。但體外免疫后產(chǎn)生弱親和力IgM抗體及難于使人淋巴細(xì)胞無限增殖化成為此技術(shù)的一直存在的問題。獲得抗體的一種新途徑是PCR擴(kuò)增重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)基因的全部，然后將其隨機(jī)重組并表達(dá)為噬菌體顯示文庫(7—9)。克隆抗體可變區(qū)基因并與小包衣蛋白(基因3)融合成為單鏈Fv片段(scFv)(10)。噬菌體顆粒在其表面顯示抗體片段，可用抗體結(jié)合特性淘選來選擇。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于V基因的隨機(jī)重組可產(chǎn)生具有新特異性和親和性的新配對，這種特異性和親和性在天然過程中可能無法選出。另外，這種方法使得可能使用鼠或人源天然或體外免疫淋巴細(xì)胞。以前用鼠B細(xì)胞體外免疫和雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生抗EGFR的mAb的努力，只得到了低親和力的交叉反應(yīng)性抗體。為了克服這些障礙，開展了體外免疫后結(jié)合PCR克隆技術(shù)。因此，本發(fā)明的目的是提供與EGF受體具有高親和力的抗體和抗體片段，其可通過上文和下文描述的有利方法獲得。本發(fā)明將從三種不同噬菌體抗體文庫分離到的鼠抗EGFR抗體與按標(biāo)準(zhǔn)雜交瘤技術(shù)分離的鼠mAb(425)(Marthy等，Arch，Biochem，Biophys，1987，252549；Kettleborough等，ProteinEng，1991，4773)進(jìn)行了比較。不僅從免疫鼠的脾臟而且從免疫鼠的引流淋巴結(jié)和體外免疫鼠細(xì)胞制備文庫。從文庫中分離的兩個單鏈Fv(scFv)進(jìn)行基因操作，將鼠可變區(qū)連接于人恒定區(qū)以產(chǎn)生嵌合的完全抗體分子。詳細(xì)講，本發(fā)明涉及可從噬菌體抗體文庫獲得的抗FGFR單鏈Fv，所述文庫是從優(yōu)選免疫哺乳動物的脾或引流淋巴結(jié)細(xì)胞或體外免疫細(xì)胞構(gòu)建的。原則上講，本發(fā)明不限于scFv而且還延及其它抗EGFR抗體片段如Fab或F(ab′)2。本發(fā)明的一些scFv的DNA和氨基酸序列已被確定。因此，本發(fā)明的另一目的是一種單鏈Fv片段，其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有選自SEQIDNO.1—32中，優(yōu)選圖5—8中給出的重鏈和輕鏈序列之一的DNA和/或氨基酸序列。因?yàn)樵S多情形下只有功能完全的全抗體才能用于診斷和治療目的，所以本發(fā)明的興趣還在于將來自單鏈Fv的可變區(qū)與人免疫球蛋白的恒定區(qū)連接，形成完全的部分人源化的抗EGFR抗體。因此，本發(fā)明的目的之一是提供從如上文，下文所定義或如權(quán)利要求中所定義的抗體片段的DNA序列，和人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA序列構(gòu)建的抗EGFR完全抗體，其中作為一個優(yōu)選實(shí)施方案，重鏈包含γ—1鏈的氨基酸序列，輕鏈包含K—鏈的氨基酸序列。本發(fā)明的抗EGFRscFv是用噬菌體抗體文庫技術(shù)分離的。因此，本發(fā)明涉及制備抗EGFR的單鏈Fv的方法，包括下列步驟(i)從免疫哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選鼠細(xì)胞分離RNA，(ii)合成第一股cDNA，(iii)擴(kuò)增來自免疫細(xì)胞的cDNA中VH和VK基因，(iv)將所述基因一起以適當(dāng)限制位點(diǎn)克隆到噬菌粒載體中，(v)用此連接混合物轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，(vi)用純化EGFR在噬菌體文庫中篩選針對EGFR的噬菌體抗體，及(vii)在原核宿主細(xì)胞如大腸桿菌中產(chǎn)生所需單鏈Fv。另外，本發(fā)明的目的之一是提供一種制備抗EGFR完全抗體的方法，包括將如上所述或如權(quán)利要求中所定義的方法產(chǎn)生的抗EGFR抗體片段的可變區(qū)編碼DNA克隆到至少一種真核表達(dá)載體中，該載體含有編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的基因組DNA，用所述載體轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，表達(dá)并分離抗體?？笶GFRscFv和首要的抗EGFR完全抗體可用于診斷和治療人腫瘤。因此本發(fā)明涉及含有如上所定義或如權(quán)利要求中所定義的抗EGFR單鏈Fv或抗EGFR完全抗體的藥物組合物。本發(fā)明的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)綜合如下從噬菌體抗體文庫分離了新的鼠抗EGFR抗體。該新抗體至少有四種不同的VH亞組和四種不同的VK亞組(Kabat等，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thEds.，U.S.Dept，ofHealthandHumanServices，Bethesda1991)。它們顯示的配對和序列與用雜交瘤技術(shù)分離的鼠MAb所用的配對和序列不同。鼠425MAb有一VH2b和VK4配對，而在噬菌體抗體中沒有觀察到。scFvL311D的VH與425VH具有最高的一致率(84.9％)。主要差別在CDR中。scFvS42D與425VK具有最高一致性(83.2％)。主要差別也在CDR中，特別是CDR3。本發(fā)明中，從噬菌體抗體文庫中分離了許多不同的新的抗EGFR抗體，這些抗體都與425MAb不同，至少兩個scFv識別與425MAb所識別的不同的EGFR表位。這與以前的報導(dǎo)不同，后者報導(dǎo)說從組合文庫中分離的抗體與雜交瘤技術(shù)分離的抗體非常相似(CatonandKoprowski，ProcNatlAcadSciUSA1990，876450)。三個噬菌體抗體文庫中，從得到高親和力抗體所需要的選擇步驟數(shù)目和分離到高親和力抗體的多樣性來看，最好的文庫是從分流淋巴結(jié)產(chǎn)生的文庫。選擇淋巴結(jié)作為構(gòu)建噬菌體抗體的RNA源有兩個原因。首先，以前的工作已說明經(jīng)腳墊免疫接種后從腘淋巴結(jié)比經(jīng)腹膜免疫接種后從脾能獲得更高比例的產(chǎn)生高親和力IgG抗體的B細(xì)胞(Venn和Dresser，J.Immunol.Methods1987.10295)。第二，分流淋巴結(jié)被認(rèn)為是分離人抗腫瘤抗體的良好來源。因此，從免疫接種小鼠的腘淋巴結(jié)分離鼠抗EGFR抗體是從乳腺癌病人腋窩淋巴結(jié)分離人抗EGFR抗體的模型。證明了從少量淋巴結(jié)材料制備適當(dāng)大小的文庫再從文庫中分離高親和力抗體的可行性。雖然從三個噬菌體抗體文庫中都分離了鼠抗EGFR抗體，但不清楚哪些新分離的抗體的親和力高于用雜交瘤技術(shù)分離的鼠425MAb。在第一種分析中，噬菌體抗體產(chǎn)生的scFv與EGFR的結(jié)合看來好于從425MAb構(gòu)建的scFv(圖2)。在用嵌合的全抗體分子的另一些實(shí)驗(yàn)中，一種嵌合抗體(S42D)顯示EGFR親和力與嵌合的425抗體的親和力相等。第二個嵌合抗體(L311D)的親和力低于嵌合的425抗體的親和力4倍(圖4)。用scFv獲得的結(jié)合數(shù)據(jù)令人誤解，可能因?yàn)閟cFv制劑可含有單體和二聚體的混合物(Grif-fiths等，EMBOJ.1993，12725)。而嵌合IgG抗體按理不會形成二聚體，已證明嵌合的L311D和S42D抗體具有二價單體IgG嵌合抗體的適當(dāng)大小。但對425，L311D和S42DscFv親和純化制劑的分析表明，這些制劑確實(shí)含有單體、二聚體和其它多聚體形式。另外，每個scFv的單體和多聚體形式的相對比例不同。425scFv的二聚體形式的百分比最低。如所預(yù)想的那樣，二聚體和特別是更高的多聚體形式顯示與純化EGFR的結(jié)合比單體形式強(qiáng)。425scFv似乎比新分離的scFv的二聚化傾向要弱。雖然抗體片段在噬菌體顆粒表面的表達(dá)形成了迅速篩選具有目標(biāo)特性之抗體的有力方法的基礎(chǔ)，但噬菌體抗體和抗體片段本身(scFv或Fab)都不可能是目標(biāo)終產(chǎn)品。接下來說明從噬菌體文庫分離的鼠scFv如何迅速轉(zhuǎn)化成完全的抗體分子。這可以將鼠的可變區(qū)與人的恒定區(qū)結(jié)合，以形成部分人源化的嵌合抗體。這些結(jié)果表明可能利用噬菌體抗體技術(shù)從免疫小鼠中分離到各種抗EGFR抗體片段。然后可從這些抗體片段構(gòu)建帶有適當(dāng)恒定區(qū)的完全抗體分子。某些情形下，雜交瘤技術(shù)仍是從小鼠分離單克隆抗體的一種供選擇的方法。如果有高免疫原性抗原可利用，并且如果產(chǎn)生一種或幾種不同抗抗原抗體的少數(shù)雜交瘤細(xì)胞系就足夠用的話，可能就沒有什么理由考慮噬菌體抗體技術(shù)。但如果特殊免疫接種方法如腳墊注射對產(chǎn)生高親和力抗體有利，或如果要求抗某種抗原的各種不同表位的多種抗體，或要求針對非常隱蔽的表位和免疫原性可能較弱的表位的抗體，則可選擇噬體抗體技術(shù)。另外，如果希望對抗體進(jìn)行進(jìn)一步的遺傳操作，則噬菌體抗體技術(shù)是有利的，因?yàn)橐芽寺×丝贵w基因。這種用顆?？乖w外免疫和PCR—克隆技術(shù)結(jié)合的途徑產(chǎn)生了與EGFR反應(yīng)而不與其它抗原交叉反應(yīng)的scFv片段。這里報導(dǎo)的免疫程序取決于抗原呈遞(它不是可溶的而為膜泡囊制劑)和培養(yǎng)基自身(不含F(xiàn)CS)。據(jù)報導(dǎo)這兩種方法都是通過將抗原提供給抗原遞呈細(xì)胞而增加體外免疫效力的方法(如Brams，P等；J.Im-munol，Methods，1987，9811)。用MTC獲得的結(jié)果與先有的報導(dǎo)一致(如Borrebacck，C.A.K和Mller，S.A；J.Immunol.，1986，1363710；MllerS，A和Borrebaeck，C.A.K，在Borrebaeck，C.A.K(編)的InVitroImmunizationinHybridomaTcchnology，ElsevierSciencePub-lishersB.V.，Amsterdam1988，P3中所述)，這些文獻(xiàn)建議使用MTC上清作為改進(jìn)體外免疫方法的淋巴因子的來源。膜泡囊制劑應(yīng)被看作多抗原，因?yàn)樵谶@種泡囊中存在許多不同抗原決定簇。因此，它們似乎應(yīng)誘導(dǎo)一定水平的多克隆激活。我們已將此排除，因?yàn)榭笶GFR特異反應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)多克隆激活物得到的反應(yīng)明顯不同。體外免疫后我們不是去將B細(xì)胞無限增殖化，而是使用了分子戰(zhàn)略將抗體VH和VL基因無限增殖化。這些單克隆抗體片段在細(xì)菌中表達(dá)并產(chǎn)生。噬菌體顯示系統(tǒng)是分離抗特異抗原的抗體片段的有利方法。在抗體片段和g3p包被蛋白間存在終止密碼子使得在表面顯示和用含抑制基因或不合抑制基因的菌株分泌可溶性scFv片段之間轉(zhuǎn)換(Hoogenboon等，MuclAcidsRes1991194133)。由于特異反應(yīng)和體外抗原刺激的B細(xì)胞中mRNA水平的提高，體外免疫對分離抗原的高特異性抗體片段有貢獻(xiàn)。經(jīng)兩輪選擇后，100％的克隆對EGFR結(jié)合為陽性。相反，體內(nèi)免疫接種方法產(chǎn)生的克隆只有在四輪選擇后才為100％陽性(Kettleporough等，EP94104160和Eur.J.Immunol1994，24952)。利用天然抗體基因的噬菌體顯示文庫可使得在不進(jìn)行免疫接種或在體外免疫后制得特異人抗體片段。抗體片段可直接產(chǎn)于細(xì)菌中，因此是一種簡單、快速且經(jīng)濟(jì)的方法。生物材料和一般方法本申請中提及的微生物、細(xì)胞系、質(zhì)粒、噬菌粒、啟動子、抗性標(biāo)記、復(fù)制起始區(qū)和載體的其它片段有商品供應(yīng)或以別的途徑能為公眾所得。只要在此申請中沒有其它信息，它們僅用作舉例，對本發(fā)明不是必需的，可分別用其它適合的工具和生物材料來代替。優(yōu)選使用細(xì)菌宿主克隆scFv并產(chǎn)生scFv蛋白。這些宿主的實(shí)例為大腸桿菌或芽胞桿菌。根據(jù)本發(fā)明，為了產(chǎn)生完全的抗EGFR抗體，優(yōu)選用真核宿主如COS、CHO或酵母。在說明書中詳細(xì)描述了本發(fā)明必需的技術(shù)。其它沒有詳細(xì)描述的技術(shù)相應(yīng)于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，或?yàn)樵谒龅奈墨I(xiàn)和專利申請及標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)中更詳細(xì)描述的方法。附圖的簡要說明圖1.從噬菌體抗體文庫中分離的scFv的氨基酸序列。(A)來自淋巴結(jié)文庫的scFv。(B)來自脾文庫的scFv。指明了互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和框架區(qū)(FR)。圖2.scFv與EGFR的結(jié)合。估測了細(xì)菌上清液中scFv的濃度，用ELISA測定了scFv與純化EGFR的結(jié)合。(A).來自淋巴結(jié)文庫的scFv。(B).來自脾文庫的scFv。P1(陽性對照)為來自MAb425的scFv。L1和S1(陰性對照)為來自選擇前的淋巴結(jié)和脾文庫的非結(jié)合性scFv。圖3.用于構(gòu)建可變區(qū)的哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的中間載體。(A)VH載體。(B)VK載體。圖4.嵌合全抗體與EGFR的結(jié)合。用ELISA測定了COS細(xì)胞上清液中的抗體濃度，用ELISA測試了抗體與純化EGFR的結(jié)合。圖5.scFvNo.L211C的DNA和氨基酸序列。(A)輕鏈；(B)重鏈。氨基酸位置(A)FR-11-23，CDR-124-34，F(xiàn)R-235-49，CDR-250-56，F(xiàn)R-357-88，CDR-389-97，F(xiàn)R-498-109.(B)FR-11-30，CDR-131-35，F(xiàn)R-236-49，CDR-250-66，F(xiàn)R-367-98，CDR-399-108，F(xiàn)R-4109-119.圖6.scFvNo.L212B的DNA和氨基酸序列。(A)輕鏈；(B)重鏈。氨基酸位置(A)FR-11-23，CDR-124-38，F(xiàn)R-239-49，CDR-250-56，F(xiàn)R-357-88，CDR-389-97，F(xiàn)R-498-109.(B)FR-11-30，CDR-131-35，F(xiàn)R-236-49，CDR-250-66，F(xiàn)R-367-98，CDR-399-108，F(xiàn)R-4109-119.圖7.scFvNO.L311D的DNA和氨基酸序列。(A)輕鏈；(B)重鏈。FR和CDR的氨基酸位置相應(yīng)于圖6中給出的那些。圖8.scFvNO.S42D的DNA和氨基酸序列。(A)輕鏈；(B)重鏈。氨基酸位置(A)FR-11-23，CDR-124-35，F(xiàn)R-236-50，CDR-251-57，F(xiàn)R-358-89，CDR-390-98，F(xiàn)R-499-110(B)FR-11-30，CDR-131-35，F(xiàn)R-236-49，CDR-250-66，F(xiàn)R-367-98，CDR-399-107，F(xiàn)R-4108-118.圖5—8的序列也在所附序列表中給出，該序列表是本發(fā)明公開的一部分。(1)噬菌體抗體文庫的構(gòu)建和篩選構(gòu)建了三個噬菌體文庫，一個來自用人癌細(xì)胞系A(chǔ)431(8.8×105個)免疫的鼠脾臟，一個來自用純化EGFR(6.5×106個)腳墊免疫的鼠腘淋巴結(jié)，一個來自用A431泡囊(1.1×105個)體外免疫的鼠淋巴細(xì)胞(A431泡囊的詳細(xì)構(gòu)建和體外免疫見實(shí)施例1，2)。選擇前，每個文庫中至少46個克隆均用BstNI酶作指紋法分析(Clackson等，Nature1991，352624)以確定所有組成成分(repertoires)的多樣性。觀察到了多種不同的消化圖譜。在選擇前還用ELISA法測試了每個文庫中96個克隆的scFv與EGFR的結(jié)合。來自脾和淋巴結(jié)文庫的scFv沒有一個與EGFR結(jié)合。體外免疫文庫的一個scFv與EGFR結(jié)合。用EGFR包被的免疫管(im-munotabes)進(jìn)行一輪選擇后，觀察到淋巴結(jié)文庫和體外免疫文庫中EGFR結(jié)合性scFv有明顯富集。需要第二輪選擇才能從腺文庫中檢測到任何EGFR結(jié)合性scFv。第三輪選擇后，淋巴結(jié)文庫和體外免疫文庫中大部分scFv的EGFR結(jié)合為陽性。第4輪選擇后，脾文庫中大部分scFv的EGFR結(jié)合為陽性(表1)。表1每輪選擇后存在的EGFR結(jié)合性克隆數(shù)(％)(2)EGFR結(jié)合性克隆的序列分析每輪選擇后，用BstNI指紋法(Clackson等，Nature1991，352624)分析了插入EGFR結(jié)合性克隆中的scFv。已顯示某些消化圖譜的富集。為了VH和VK的測序，從淋巴結(jié)文庫的第二和第三輪選擇和脾文庫的第三和第四輪選擇選出了具有不同BstNI指紋的克隆。分析后幾輪選擇的克隆是因?yàn)轭A(yù)期較高親和性的抗體在于后幾輪選擇中(Clackson等，Natare1991，352624)。對淋巴結(jié)文庫的16個克隆進(jìn)行了測序，獲得六種不同的scFv(圖1)。其中五種是具有獨(dú)特的VH和VK配對。第六種是以前存在的VH的變異體，其中有6個氨基酸變化，5個是在框架區(qū)(FR)1內(nèi)。這種變化中兩個可歸因于簡并的VH1BACKSFI引物的應(yīng)用(Hoogenboon等，Nucl.AcidsRes.1991，194133)。其它的可能是PCR錯誤的結(jié)果。VH被分為兩個亞組VH2b和VH3d，而VK分為四個亞組VK3、VK4、VK5和VK6(Kabat等，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thEds.，U.S.Dept.ofHealthandHu-manServices，Bethesda1991)。對脾文庫的10個單一克隆進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)4種不同的scFv。其中三種為獨(dú)特的VH和VK配對，而第四種與已有配對之一相似，僅在VH有兩個氨基酸差異，其中之一在互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)2；在VK中有兩個氨基酸差異。VH亞組分類為VH2a、VH2c和VH3d，VK分為VK3和VK4亞組。比較從淋巴結(jié)和脾文庫中獲得的scFv，發(fā)現(xiàn)只有一種scFv是兩個文庫中共有的scFvL310A/scFvS410H(圖1)。當(dāng)用ELISA檢測時該克隆表現(xiàn)與EGFR強(qiáng)結(jié)合。盡管非常小心以消除兩種文庫的交叉污染，但難以排除少量強(qiáng)EGFR結(jié)合性克隆的污染。但考慮到Balb/c小鼠的近交性，從兩個不同文庫中獨(dú)立地產(chǎn)生同一scFv是可能的。(3)與EGFR結(jié)合的親和性和特異性的分析基于對抗原的良好結(jié)合和DNA序列的多樣性，選擇來自淋巴結(jié)和脾文庫的幾種scFv進(jìn)行進(jìn)一步分析。用ELISA分析這些scFv與純化的EGFR的結(jié)合，與不相關(guān)抗原的結(jié)合，和與不表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合。作為陽性對照的scFv從鼠425MAb制得(P1)。作為陰性對照的scFv從由選擇前的淋巴結(jié)和脾文庫分離的噬菌體抗體制得(分別為L1和S1)。比較要檢測的scFv的稀釋度與Western印跡中已知濃度的純化scFv的稀釋度，確定scFv的濃度。用ELISA測定scFv與純化EGFR的結(jié)合，并繪出結(jié)果(圖2)。按照它們與EGFR的結(jié)合將scFv分級是可能的。這些分級在多次實(shí)驗(yàn)中有可重復(fù)性。與EGFR結(jié)合最強(qiáng)的scFv是來自淋巴結(jié)文庫的L21C和L310A和來自脾文庫的S410H。如前所述，scFvL310A和S410H具有相同的DNA序列。在VH和VK區(qū)各有兩個氨基酸變化的與scFvS410H非常相似的一種scFv(S45A)始終比S410H較低級。相反，L212B和L311D之間觀察到的序列差異則沒有顯示對結(jié)合的顯著影響。所分離的scFv中，只有四種，L28C和L211C顯示結(jié)合性比scFv425差。用ELISA測試了這些scFv與塑料和一系列標(biāo)準(zhǔn)不相關(guān)蛋白(卵白蛋白、雞蛋水解酶、細(xì)胞色素C、甘油醛—3—磷酸脫氫酶、CBA白蛋白和BSA)的結(jié)合。沒有一種scFv給出基線以上的信號。用ELISA測試了這些scFv與三種腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合。細(xì)胞系A(chǔ)431和MDAMB468是分別從陰門和乳房分離到的含EGFR的腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞系SK—MEL—23是一種含神經(jīng)節(jié)苷脂的黑素瘤細(xì)胞系，在此作為陰性對照。在測試的十種scFv中，僅有四種既與純化EGFR也與帶EGFR的腫瘤細(xì)胞結(jié)合(L212B，L311D，L211C和S42D，圖5—8)。沒有檢測到與SK—MEL—23的結(jié)合。對這種意外結(jié)果有幾種可能的解釋。一種是用于免疫接種、選擇、和ELISA的EGFR是分泌的EGFR相關(guān)蛋白(Weber等，Science1984，224294)。這種蛋白在C—末端多出17個氨基酸(Gunther等，J.Biol.Chem.1990，26522082)。用ELISA測試了scFv與這種17個氨基酸的肽的結(jié)合，沒有觀察到任何結(jié)合。分泌的EGFR相關(guān)蛋白可能與腫瘤細(xì)胞表面的EGFR在構(gòu)象或糖基化上有差別。為了進(jìn)一步研究與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，純化了三種scFv(L211A、L311D和S42D)，并用流式細(xì)胞儀分析了與A431腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。425scFv用作陽性對照。受試的三種scFv中，只有L311D和S42D與A431細(xì)胞結(jié)合。這兩種scFv與scFv425具有相似的結(jié)合特性。從與EGFR和含EGFR的腫瘤細(xì)胞(L311D和S42D)都結(jié)合的兩種分離物制備的純化scFv，在與鼠425MAb的競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了測試。純化的scFv425在一定濃度內(nèi)能夠抑制鼠425MAb與EGFR的結(jié)合，而scFvL311D和S42D在這些濃度下不能抑制鼠425MAb與EGFR的結(jié)合。這兩種scFv所識別的EGFR上的表位似乎與鼠425MAb所識別的不同。(4)從scFv得到的嵌合完全抗體選擇了兩種scFv(L311D和S42D)來轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆贵w分子。將編碼鼠VH和VK的DNA克隆到中間載體中，此中間載體含有編碼免疫球蛋白先導(dǎo)序列的DNA序列和剪接供體信號(圖3)。VH中間載體中克隆位點(diǎn)的定位意味著VH的第一殘基由無冬氨酸變?yōu)楣劝彼?。從此中間載體，含有VH和VK并與先導(dǎo)序列及剪接供體序列連接的DNA片段被克隆到含有編碼人γ—1恒定區(qū)域人K恒定區(qū)之DNA的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中(Maeda等，Hum，Antibod.Hybridomas1991，2124)。對每種嵌合抗體，用重鏈和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。作為陽性對照，也用編碼425嵌合抗體的重鏈和輕鏈表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Kettleporough等，ProteinEng.1991，4773)。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA分析以測定存在的抗體濃度和抗體與EGFR結(jié)合的能力(圖4)。當(dāng)比較達(dá)到與抗原結(jié)合的半數(shù)最大值所需要的抗體濃度時，嵌合S42D抗體和425嵌合抗體與EGFR的結(jié)合一樣好。但L311D嵌合抗體與GEFR的結(jié)合比425嵌合抗體的低4倍。已用競爭抑制分析測得425嵌合抗體的親和力為1.9×108M-1。這些結(jié)果出人意料，因?yàn)橐郧暗膕cFv分析數(shù)據(jù)已表明scFvS42D和L311D與EGFR的結(jié)合均比scFv425好(圖2)。經(jīng)蛋白—A純化的L311D和S42D嵌合抗體樣品在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS—PAGE分析。還用流式細(xì)胞儀測試了L311D和S42D嵌合抗體與A431和SK—MEL—23細(xì)胞的結(jié)合。兩種嵌合抗體都與EGFR表達(dá)性A431細(xì)胞結(jié)合良好，而不與EGFR陰性的SK—MEL—23細(xì)胞結(jié)合。(5)治療和診斷應(yīng)用本發(fā)明的抗體片段和完全抗體可給予病人進(jìn)行治療。因此，本發(fā)明的一個目的是提供含有至少一種在上文和權(quán)利要求中所定義的抗體或抗體片段作為活性成分的藥物組合物，其中結(jié)合有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。本發(fā)明的抗體應(yīng)作靜脈內(nèi)或腸外注射，一般地講，抗體的給藥劑量范圍應(yīng)足夠大以產(chǎn)生所希望的腫瘤抑制和腫瘤化解的效果。劑量將取決于病人的年齡、性別和疾病的程度，變化范圍為0.1mg/kg到200mg/kg，優(yōu)選0.1mg/kg到100mg/kg/次，每天一次或多次，持續(xù)數(shù)天。腸外給藥制劑包括無菌水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的實(shí)例為丙二醇、聚乙二醇、植物油和橄欖油、可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯和本領(lǐng)域中已知適于這些目的的其它溶劑。本發(fā)明的抗體可用于含有生理可接受載體的組合物中。這種適當(dāng)載體的實(shí)例有鹽水、PBS、Ringers溶液、或乳酸化Ringers溶液。藥物制劑中還可存在防腐劑和其它添加劑如抗生素、抗氧劑和螯合劑。這種抗體(片段)還可以按已知方法與細(xì)胞因子如IL—2偶合以支持其細(xì)胞毒性。本發(fā)明的藥物制劑適于各種腫瘤，包括黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和癌，以及循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤和實(shí)體瘤。為診斷目的，抗體可與例如不透射線染料偶聯(lián)或做放射標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記方法是Lodogen方法?？贵w優(yōu)選以F(ab′)2或scFv片段形式給藥用于診斷目的。這提供了更佳的結(jié)果，使得沒有必要減去背景。實(shí)施例1A431泡囊對Cohen等描述的方法(J.BiolChem，1982，2571523；Yeaton等，J.Biol，Chem，1983，2589254)進(jìn)行某些修正，制取脫膜的泡囊制劑。長滿A431細(xì)胞的燒瓶用含鈣和鎂的PBC洗滌。加入低滲PBS并振動燒瓶15分鐘，然后用泡囊化緩沖液(100mMNaCl，50mMNa2HPO4，5mMKCl，0.5mMMgSO4，pH8.5)洗滌細(xì)胞。加入泡囊化緩沖液，在室溫及37℃下攪拌。然后通過金屬網(wǎng)將緩沖液潷入冰中的50ml管中，150Xg、4℃離心5分鐘。棄去沉淀，上清液以39000rpm超速離心90分鐘。最終的沉淀重懸于10mMHepes緩沖液(pH7.4)中。為分析來自泡囊的EGFR，樣品用9體積乙醇沉淀，用0.08MTris(pH6.8)重懸，用MAb425作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行SDS—PAGE分析。用改進(jìn)的考馬斯藍(lán)方法對這些制備物的蛋白含量進(jìn)行定量，用BSA作標(biāo)準(zhǔn)，在595nm讀數(shù)。為分析來自泡囊的EGFR，樣品用9體積乙醇沉淀(4℃過夜)。將沉淀用Tris(0.08M，pH6.8)重懸，然后進(jìn)行SDS—PAGE電泳(5％積層凝膠；1小時，35mA；10％電泳膠；2.5小時；40mA)。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均為雙份。其中之一用考馬斯藍(lán)染色，另一個轉(zhuǎn)印在硝基纖維素片上(12V；4℃16小時)并用鼠mAb425(抗EGFR)和與堿性磷酸酶偶合的抗鼠IgG抗體處理。三種培養(yǎng)基用于體外免疫接種。培養(yǎng)基—1(M1)、培養(yǎng)基—2(M2)和混合胸腺細(xì)胞培養(yǎng)基(MTC)。M1由補(bǔ)有50mM2—巰基乙醇和2mML—谷氨酰胺(Gibco)的HL1(VentrexLaboratories，USA)組成。M2由補(bǔ)有50mM2—巰基乙醇；40U/mlIL—2(Gen-zyme)；20mg/ml佐劑肽(sigma)；2mML-谷氨酰胺；100U/ml青毒素(Gibco)；100mg/ml鏈霉素(Gibco)的HL1組成。向M2中加入4％或20％的FCS(BiologicalIndustries)。如Uaux(1)描述的方法制備MTC。要點(diǎn)為將胸腺壓過一無菌的50目篩制備三周齡Balb/c和C57/BL—1小鼠胸腺的單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液，用HBSS洗兩次，用苔盼藍(lán)排阻測定活細(xì)胞的數(shù)目。然后以每毫升2.5×106每株胸腺細(xì)胞的密度在含有4％FCS、2mML—谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg./ml鏈霉素的HL1培養(yǎng)基中培養(yǎng)胸腺細(xì)胞。48小時后，回收上清液，濾過一0.22mm的濾器，于-70℃下保存。如所述胸腺細(xì)胞的制備方法，從非免疫的八周齡BALB/C小鼠獲得脾細(xì)胞懸液。用苔盼藍(lán)排阻法測定生存力。實(shí)施例2體外免疫和篩選三種培養(yǎng)基用于體外免疫接種。培養(yǎng)基—1(M1)、培養(yǎng)基—2(M2)和混合胸腺細(xì)胞培養(yǎng)基(MTC)。M1由補(bǔ)有50mM2—巰基乙醇和2mML—谷氨酰胺(Gibco)的HL1(VentrexLaboratories，USA)組成。M2由補(bǔ)有50mM2—巰基乙醇；40U/mlIL—2(Gen-zyme)；20mg/ml佐劑肽(sigma)；2mML谷氨酰胺；100U/ml青毒素(Gibco)；100mg/ml鏈霉素(Gibco)的HL1組成。向M2中加入4％或20％的FCS(BiologicalIndustries)。如Uaux(1)描述的方法制備MTC。要點(diǎn)為將胸腺壓過一無菌的50目篩制備三周齡Balb/c和C57/BL—1小鼠胸腺的單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液，用HBSS洗兩次，用苔盼藍(lán)排阻測定活細(xì)胞的數(shù)目。然后以每毫升2.5×106每株胸腺細(xì)胞的密度在含有4％FCS、2mML—谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg./ml鏈霉素的HL1培養(yǎng)基中培養(yǎng)胸腺細(xì)胞。48小時后，回收上清液，濾過一0.22mm的濾器，于-70℃下保存。如所述胸腺細(xì)胞的制備制備方法，從非免疫的八周齡BALB/c小鼠獲得脾細(xì)胞懸液。用苔盼藍(lán)排阻法測定生存力。將胸腺壓過一無菌的50目篩制備三周齡Balb/c和C57/BL—1小鼠胸腺的單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞懸液，用HBSS洗兩次，用苔盼藍(lán)排阻測定活細(xì)胞的數(shù)目。然后以每毫升2.5×106每株胸腺細(xì)胞的密度在含有4％FCS、2mML—谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的HL1培養(yǎng)其中培養(yǎng)胸腺細(xì)胞。48小時后，回收上清液，過濾并保存。如所述胸腺細(xì)胞的方法，從非免疫的八周齡BALB/c小鼠獲得脾細(xì)胞懸液。用苔盼藍(lán)排阻法測定生存力。在一6孔板(Costar)上進(jìn)行體外免疫。含有3.5mlM1—培養(yǎng)基(由補(bǔ)有50μm2—巰基乙醇和2mML—谷氨酰胺(Gibco)的HL1—培養(yǎng)基組成)中的107脾細(xì)胞的孔與適當(dāng)濃度的帶EGFR的泡囊一起孵育(37℃，5％CO2)。加入來自不表達(dá)EGFR的細(xì)胞的泡囊或PBS作為對照孔。幾小時后，向每孔中加入3.5ml含4％或10％FCS(BiologocalLndusrties)的M2—培養(yǎng)基(由補(bǔ)有50μM2—巰基乙醇、40U/mlIL—2(Genzyme)、20μg/ml佐劑肽(Sigma)、2mML—谷氨酰胺、100U/ml青霉素(Gibco)、100μg/ml鏈霉素(Gibeo)的HL1組成)。在一些實(shí)驗(yàn)中，用補(bǔ)有佐劑肽(20μg/ml)和IL—2(40U/ml)的MTC培養(yǎng)基(混合胸腺細(xì)胞培養(yǎng)基(Vaax等，Nature1988，33636))代替M2(注意培養(yǎng)物中FCS，IL—2和佐劑肽的終濃度減低了50％)。在相同條件下培養(yǎng)細(xì)胞72、96、120或144小時，最后檢測細(xì)胞是否存在特異免疫球蛋白或進(jìn)行RNA分離。用純化抗原或A431固定化細(xì)胞進(jìn)行篩選。操作步驟基本如前所述(Carroll等，Hybridoma1990，981)，但有些修改。簡言之，無菌的96孔板(Nunc，Maxisorb)用PBS中的EGFR(2.5μg/ml)、GD3神經(jīng)節(jié)苷脂(2μg/ml)或RNase(10μg/ml)包被過夜。當(dāng)A431細(xì)胞用作抗原時，在96孔板中培養(yǎng)細(xì)胞至匯合生長，再用0.1％戊二醛固定。體外免疫的淋巴細(xì)胞沖洗并重懸于補(bǔ)以2％FCS和2mML—葡糖胺的HL1培養(yǎng)基中，密度為5×105細(xì)胞/ml，向每孔中加入1×105個細(xì)胞，孵育48小時(37℃，5％CO2)。每組做16份。將淋巴細(xì)胞在含0.1％Tween—20的PBS中沖洗5次去除。用過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白(Dako)檢測特異免疫球蛋白(1小時，37℃)。檸檬酸—磷酸緩沖液中的2，2′—連氮基—二(3—乙基苯并噻唑啉—6—磺酸—二銨鹽(ABTS)(Sigma)作為底物。實(shí)施例3文庫構(gòu)建從由腹膜內(nèi)A431細(xì)胞免疫的鼠脾(Murthy等，Arch，Biochem，Biophys，1987，252549)、由用純化EGFR腳墊免疫的鼠腘淋巴結(jié)和由用A431泡囊體外免疫的鼠細(xì)胞制得的RNA，構(gòu)建了三種文庫。合成了第一股cDNA。PCR擴(kuò)增并組裝VH和VK基因(Clackson等，Natare1991，352624)。通過PCR，加入了Notl和Sfil限制位點(diǎn)，將scFv克隆到噬菌粒載體pHEN1中(Hoogen-boom等，Nucl.AcidsRes.1991，194133)。將連接混合物電穿孔至大腸桿菌細(xì)胞中，形成的菌落刮到培養(yǎng)基中以產(chǎn)生文庫原種(Marks等，J.Mol.Biol，1991，222581)。實(shí)施例4文庫篩選用M13KO7輔助噬菌體(Promega，Madison，WI)從文庫中拯救噬菌體抗體(Marks等，J.Mol.Biol1991.222581)。免疫管(Nunc，LifeSciences，Paisley，UK)用4mlPBS中的2.5μg/mlEGFR包被過夜。用PBS洗滌三次后，該管在含2％奶粉的PBS(PBSM)中37℃孵育至少1小時。將噬菌體(1012—1013)重懸于4mlPBSM中，在EGFR包被的管中室溫孵育1小時。用PBS，0.1％Tween洗管20次，再用PBS洗20次。在1ml0.1M三乙胺中倒置混合培養(yǎng)10分鐘后，洗脫結(jié)合的噬菌體。洗脫的噬菌體中加入0.5ml1MTris—HCl，pH7.5中和，用于感染大腸桿菌TG1細(xì)胞。將感染細(xì)胞涂板，挑出個體菌落用于小量誘導(dǎo)ScFv。將其余菌落刮到培養(yǎng)基中，一份用于制備下一次篩選的噬菌體。實(shí)施例5scFv的產(chǎn)生和分析按已有的描述(如，Kettleleborough等，I.C.)在大腸桿菌HB2151中產(chǎn)生可溶性scFv。用已知濃度的純化scFv制劑作為標(biāo)準(zhǔn)，評估了細(xì)菌上清液中scFv的濃度。過濾上清液，加入疊氮化鈉至0.1％。將此上清液和標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋液用96孔岐管點(diǎn)在Immobilon—PVDF濾膜(Millipore，Watford，UK)上。如Western印跡法(Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1979，764350)處理此濾膜。用針對C—末端尾的抗體(9E10)(MunroandPelham，Cell1986，46291)，和過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG和IgM抗體(JacksonImmunoResearchLabInc，WestGrove，PA)檢測scFv。用ECL系統(tǒng)進(jìn)行這些反應(yīng)(Amersham，Aytesbury，UK)。閃光前的放射自顯影圖用光密度計掃描。做標(biāo)準(zhǔn)曲線并用于估價上清液中的scFv濃度。用EGFRyy包被的板(2.5μg/ml)進(jìn)行抗原結(jié)合性的ELISA檢測。含scFv的上清液用PBSM稀釋，并加至板上。用如上所述的9E10抗體檢測結(jié)合的scFv。還測試了上清液與一系列標(biāo)準(zhǔn)不相關(guān)蛋白和塑料的結(jié)合。ELISA板用卵白蛋白、雞蛋水解酶、細(xì)胞色素C、甘油醛—3—磷酸脫氫酶、鼠白蛋白(CBA品種)和BSA以100μg/ml包被過夜。向包被板中加入含2％奶粉的未稀釋上清液(兩套)，并按上述方法檢測結(jié)合的scFv。用腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)431(ATCCCRL1555)、MDAMB468(ATCCHTB132)和SK—MEL—23(陰性對照)進(jìn)行細(xì)胞結(jié)合性的ELISA檢測。細(xì)胞在聚—D—賴氨酸處理的96—孔組織培養(yǎng)皿(Nunc)中生長至匯合。這些細(xì)胞用DMEM沖洗，用含2.5％BSA的PBS37℃封閉2小時。吸出后，向每孔中加入上清液和等體積的含4％奶粉的2XYT培養(yǎng)基，4℃培養(yǎng)1小時。如上所述進(jìn)行結(jié)合scFv的檢測。按如下方法進(jìn)行競爭性ELISA；用EGFR包被的ELISA板和50μl純化scFv(100μg/ml)預(yù)培養(yǎng)，計10分鐘，然后加入鼠MAb425(50μl)達(dá)3.13—200ng/ml的濃度。孵育并沖洗后，用過氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG和IgM抗體檢測結(jié)合的鼠MAb425。實(shí)施例6DNA分析為了進(jìn)行BstNI指紋分析，將來自單個克隆的scFv插入序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用BstNI消化(Clackson等，Nature1991，352624)。用測序酶試劑盒(UnitedStatesBiochemical，Cleveland，OH)進(jìn)行DNA測序。實(shí)施例7scFv的純化離心并濾過0.2μm濾膜使細(xì)菌上清液澄清，然后加樣于一1ml裝有純化的EGFR(5mg)與溴化氰活化的Sepharose4B偶聯(lián)(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的柱上。該柱用30mlPBS再用5ml0.2M甘氨酸(pH5.0)沖洗。用0.2M甘氨酸/HCl(pH2.8)洗脫scFv。洗脫液10XPBS中和。收集含蛋白的流份，經(jīng)超濾(Am-icon，Stonehouse，UK)將緩沖液換成含1％BSA和0.05％疊氮化鈉的PBS。實(shí)施例8純化scFv的FACS分析A431細(xì)胞用胰蛋白酶消化并在含10％FCS的DMEM中培養(yǎng)。細(xì)胞用冷DMEM沖洗兩次，濾過一45μm的篩。在冰上，細(xì)胞(106)在50μl含1％BSA的PBS中與純化scFv孵育30分鐘。用冷PBS沖洗兩次后，用50μlFITC偶合的9E10抗體(100μg/ml)檢測結(jié)合的scFv。冰上30分鐘后，細(xì)胞用PBS沖洗一次，在含1％甲醛的PBS中固定，用FACSCAN(Becton—Dickinson，Cow-ley，UK)分析。實(shí)施例9嵌合的完全抗體的構(gòu)建、分析和表達(dá)利用PstI和BstEII位點(diǎn)，將所選擇的scFvVH的編碼DNA亞克隆到一中間VH載體中，該載體含有來自人抗體HG3CL的真核先導(dǎo)序列(Rechavi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1983，80855)和剪接供體位點(diǎn)(圖3)。利用能在5′和3′末端引入XhoI和SstI位點(diǎn)的PCR引物將VK的編碼DNA插入中間VK載體中(VkFor5′-CCGTTTCAGCTCGAGCTTGGTCCC-3′，VkBack5′-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA-3′)將Sstl—XhoI片段克隆到含有真核先導(dǎo)序列和剪接供體位點(diǎn)的中間VK載體中，其中真核先導(dǎo)序列來自重構(gòu)人CAMPATH—1輕鏈(Riechmann等，Nature1988，33221)。將編碼可變區(qū)加真核側(cè)翼區(qū)的DNA以HindIII—BamHI片段克隆到含有編碼人γ—1恒定區(qū)或人K恒定區(qū)的基因組DNA的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體中(Maeda等，Hum.Antibod.Hyridomas19912124)。將重鏈和輕鏈表達(dá)載體電穿孔到COS細(xì)胞中。72小時后，收集培養(yǎng)液，并用ELISA分析嵌合的抗EGFR抗體(Kettleborough等，ProteinEng1991，4773)。實(shí)施例10從體外免疫細(xì)胞中產(chǎn)生scFv以下公開的方法僅對上述方法稍加修飾。免疫、文庫構(gòu)建和篩選如實(shí)施例1—4中所述。下面詳細(xì)描述接下來的步驟篩選初始文庫和三輪淘選后的克隆，選出了一些單氨芐青霉素抗性菌落。堿性裂解制備噬菌粒DNA，并用以熱激轉(zhuǎn)染E.ColiHB2151，后者是一不含抑制基因菌株。將菌落接種到2xTY—Amp—Glu中，30℃生長過夜。將5ml等份接種到含100mg氨芐青霉素/ml和0.1％葡萄糖的2xTY培養(yǎng)液中，30℃振搖培養(yǎng)1小時(到對數(shù)期)。收集細(xì)胞，加入異丙基β—D—硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)達(dá)終濃度1mM以誘異可溶性scFv的表達(dá)(BeBellis，D.和Schwartz，I.；NucleicAcidsRes；1990，181311)。培養(yǎng)物在30℃振搖生長過夜。取出含scFv的上清液，離心并濾過0.22mm的濾膜使澄清，然后檢測。按已有的描述(Kettleborough等，EP94104160和Eur.J.Immunol，1994，24952)，用ELISA測試細(xì)菌上清液與EGFR的結(jié)合。利用以各種與EGFR相關(guān)和不相關(guān)的蛋白包被的培養(yǎng)板以及其它抗原和塑料，用ECISA檢查選出的scFv片段的特異性。所用抗原是RNase、BSA、OVA、GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、玻連蛋白受體(VNR)、血小板糖蛋白IIbIIIa(GPIIbIIIa)和disialyl—lacto—N—四糖(DSLNT)。在每種抗原的最佳濃度下包被過夜。包被的ELISA培養(yǎng)板用1.5％PBS中的脫脂奶粉(w/v)37℃封閉1小時。沖洗后，向微滴定孔中加入100mlscFv上清液，37℃培養(yǎng)2小時。用抗—C—myc抗體9E10(MyC1—9E10.2雜交體培養(yǎng)液)和堿性磷酸酶偶合的兔抗鼠抗體(Dako)檢測結(jié)合的scFv。三種含EGFR的腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)431、MDAMB231人乳腺癌(ATCC，HTB26)和HT29人結(jié)腸腺癌(ATCC，HTB38)，和一種不表達(dá)EGFR的細(xì)胞系WM164用于測試scFv與細(xì)胞上EGFR的結(jié)合能力，用FACS分析和未固定細(xì)胞的免疫熒光進(jìn)行測試。為進(jìn)行間接免疫熒光分析，將細(xì)胞鋪在Terasaki板上(2×104細(xì)胞/孔)并培養(yǎng)24小時。然后細(xì)胞與含有scFv片段的20ml粗細(xì)菌上清液室溫培養(yǎng)90分鐘。第一抗體(抗—C—myc)和第二抗體的孵育在室溫進(jìn)行60分鐘。第二抗體—FICT偶合的兔抗鼠抗體(DaKo)按1∶20稀釋。為進(jìn)行FACS分析，5×105個細(xì)胞用含有1％BSA和0.1％疊氮化鈉的PBS(PBS—BSA)沖洗三次，用50ml粗的細(xì)菌上清液4℃培養(yǎng)20分鐘。用冷的PBS—BSA洗兩次后，用1∶25稀釋于PBS—BSA中的抗—C—myc抗體和FITC偶合的羊抗鼠抗體(BectonPickinson)檢測結(jié)合的scFv。加入碘化丙錠(PI)達(dá)終濃度5mg/ml。在備有空氣冷卻的氬激光器的EPICSProfILeII中進(jìn)行流式細(xì)胞計數(shù)分析。用488nm的光線(15mV)激發(fā)。530nm的帶通濾波器用于收集FITC發(fā)射光，625nm的帶通濾波器用于收集PI發(fā)射光。在前側(cè)方散射器上設(shè)置一數(shù)碼變換器并排除PI染色細(xì)胞來選擇活細(xì)胞。通過克隆化片段的PCR擴(kuò)增(Gssow，D，Clackson，T；Nu-cleicAcidsRes，1989，174000)和BstNI消化圖譜(8)的分析測定了原始文庫和選擇后文庫的多樣性。用測序酶(Sequenase)試劑盒(USB)以雙脫氧鏈終止法對一些克隆測序(Sanger，F(xiàn)等；Proc，Nat，Acad，Sci，U.S.A1977，745463)。粗細(xì)菌上清液(10ml)用12.5％凝膠進(jìn)行SDS—PAGE?；景碩owbin所述方法(Towbin等，J.Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A，1979，764350)進(jìn)行Western印跡。通過電印跡將蛋白轉(zhuǎn)移到Immobilon—P(Millipore)上或硝基纖維素(Bio—Rad)上。用含有2％脫脂牛奶(w/v)的PBS封閉印跡。用抗—C—myc抗體(9E10)、過氧化物酶偶合的抗鼠抗體(Jackson)和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL，Amersham)檢測scFv片段。脫膜泡囊的定量分析表明蛋白總濃度為2.5mg/ml，其中只有10—14％，相當(dāng)于EGFR(Sato等，J.Natl.CancerInst，1989，211601；Yeaton，R等，J.BiolChem.，1983，2589254)含量約為250—350ng/ml。用PAGE—SDS電泳分析然后考馬斯藍(lán)染色，表明泡囊含有相當(dāng)復(fù)雜的蛋白混合物。沒有檢測到蛋白降解。Western印跡分析表明在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，在膜泡囊制劑中存在EGF受體的完全分子。為了確定對FCS和淋巴因子是否需要，比較了含2％或4％FCS的MTC和M2。含EGFR的泡囊和PBS分別用作抗原和對照。脾細(xì)胞在有或無抗原的16孔板上于M1(無血清)中孵育3小時。然后加入MTC或M2，72、96、120或144小時后用A431固定化細(xì)胞進(jìn)行篩選。在所有實(shí)驗(yàn)中，所記錄的活細(xì)胞數(shù)在20—40％之間，與文獻(xiàn)結(jié)果相符(Gavilondo—Cowley，J.等；InVitroImmuniza-tioninHybridomaTechnology，ElsevierSciencePublishersB.V.，Amsterdam，P131)。用MTC時在第4天獲得最大特異性應(yīng)答；而用含4％或20％FCS(終濃度為2％或10％)的M2時，最大應(yīng)答延遲至第6天(表2)。但MTC和10％FCS可能通過多克隆活化激起非特異性應(yīng)答，這可從用特異非特異應(yīng)答比率表示的結(jié)果看出。所以以后的實(shí)驗(yàn)我們決定使用的是以4％FCS補(bǔ)充的M2培養(yǎng)6天。在泡囊表面存在EGFR大大增強(qiáng)了對此抗原的應(yīng)答。按與上述相似的實(shí)驗(yàn)方法，比較了來自表達(dá)或不表達(dá)EGFR的細(xì)胞系的泡囊。淋巴細(xì)胞與泡囊在M1中培養(yǎng)3小時，然后加入含4％FCS的M2。6天后每組的淋巴細(xì)胞在用EGFR、A431—固定細(xì)胞、RNase或GD3包被的96孔板中培養(yǎng)48小時。如所期望的那樣，這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示應(yīng)答的多特異性模式(表3)。當(dāng)表達(dá)EGFR的泡囊用作抗原時，用光密度表示的與EGFR的反應(yīng)性明顯提高。綜上所述，這些結(jié)果提示(雖然還不成熟)體外免疫后存在可測量的抗原依賴性應(yīng)答，這種體外免疫產(chǎn)生數(shù)群適于可變區(qū)PCR克隆的抗EGFR免疫淋巴細(xì)胞。將來自體外免疫的scFv片段克隆到pHEN1噬菌粒中后獲得了1.1×105個克隆的文庫。該文庫是與另兩個進(jìn)行體內(nèi)免疫產(chǎn)生的文庫平行產(chǎn)生的。這些噬菌體文庫的構(gòu)建以前已有描述(Kettleborough等，EP94104160和Eur.J.Immund，1994，24952)。為了選擇與EGFR結(jié)合的scFv片段，用EGFR包被的免疫管淘選噬菌體。洗脫的噬菌體用于再感染大腸桿菌SupE株。共進(jìn)行三輪選擇。每輪中有一無抗原的試管進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)以計算背景。在第一次淘選中，向免疫管中加入1.5×1010個噬菌體顆粒，從包被的免疫管洗脫出了6.6×104個；而從背景噬菌體群中僅得到200個克隆。第三次淘選后，加入1×1011個噬菌體，洗脫出5.6×1010個。為了進(jìn)一步鑒定scFv片段，在選擇前和每輪選擇后，我們共從噬菌體群中選出22個克隆。用克隆化片段的BstNI酶切圖譜來分析文庫的多樣性。選擇前的文庫表現(xiàn)差異極大。第一輪選擇后的結(jié)合克隆的指紋顯示有幾組的限制性圖譜相同?；谒鼈兊拿盖袌D譜，從不同輪次選擇中選擇克隆。DNA測序表明在大部分所選克隆中存在不同的序列?？寺?0D2、5D3、10E2、1B3、4B3和5E2的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的長度和組成不同。最大的變化見于VH和VL序列的CDR3區(qū)?？寺?D3和1E3來自第三輪選擇。ELISA和流式細(xì)胞儀分析表明它們與EGFR的結(jié)合極強(qiáng)，并具有相同的序列。通過不含抑制基因的大腸桿菌菌株HB2151在IPTG存在下生長，獲得可溶性scFv片段。為了證實(shí)scFv的產(chǎn)生，凝膠電泳分析個體克隆的細(xì)菌培養(yǎng)液。Western印跡分析顯示一條35,000KD左右的清楚的帶。通過ELISA鑒定具有EGFR結(jié)合活性的克隆。為了檢查所選克隆的交叉反應(yīng)性，用不同抗原進(jìn)行ELISA分析。抗原(EGFR，RNase，BSA，KLH，OVA，GD3神經(jīng)節(jié)苷脂、玻連蛋白受體、血小板糖蛋白IIbIIIa，和disalyl—lacto—N—四糖)以最佳濃度包被在ELISA板中(表4)。沒有檢測到與非EGFR抗原的結(jié)合。還測試了scFv與三種含EGFR的腫瘤細(xì)胞系(人表皮樣癌A431，人乳腺癌MDAMB231和人結(jié)腸腺癌HT29)的結(jié)合。不表達(dá)EGFR的人黑素瘤細(xì)胞WM164用作陰性對照。通過用非固定化細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光分析測試與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的克隆，并用FACS分析進(jìn)行定量。使用非固定化細(xì)胞保證了膜受體的天然構(gòu)象。陽性克隆用A431細(xì)胞顯示明顯的熒光。與其它含EGFR的腫瘤細(xì)胞系的熒光弱。沒有檢測到與陰性細(xì)胞系的結(jié)合。流式細(xì)胞計數(shù)分析證實(shí)了這些結(jié)果。用流式細(xì)胞計數(shù)法分析了17個陽性克隆和3個陰性克隆與A431、MDAMB231和HT29細(xì)胞的結(jié)合。WM164用作陰性細(xì)胞系。425scFv(P1克隆)用作陽性對照，克隆載體(HEN)作為陰性對照。結(jié)果綜合在表5中。與ELISA分析相同，4B2和5E2兩個克隆與EGFR結(jié)合呈陽性，但與表達(dá)EGFR的腫瘤細(xì)胞系的結(jié)合呈陰性。表2不同培養(yǎng)基對體外免疫a)的影響實(shí)驗(yàn)1M1加M2，4％FCS(FCS的終濃度2％)實(shí)驗(yàn)2M1加M2，20％FCS(FCS的終濃度10％)實(shí)驗(yàn)3A培養(yǎng)基加MTC，4％FCS(FCS的終濃度2％)a)BALB/c小鼠脾細(xì)胞(107)在六孔板的孔中與A431細(xì)胞的泡囊或PBS在3.5mlM1中孵育。然后加入3.5ml含4％或20％FCS的MTC或M2，并孵育。在第3，4，5或6天，從培養(yǎng)基中取出體外免疫淋巴細(xì)胞，在HBSS中沖洗去除泡囊并種在用固定化A431細(xì)胞包被的96孔板中，再孵育48小時(見方法部分)。b)培養(yǎng)基中FCS的終濃度。c)O.D.是在405nm處的光密度讀數(shù)。它代表16個孔的平均值。d)特異應(yīng)答(泡囊作抗原)/非特異性應(yīng)答(PBS作抗原)的比率。表3體外免疫后應(yīng)答的多特異性a)<a)淋巴細(xì)胞用表達(dá)EGFR的泡囊(EGFR+)或不表達(dá)EGFR的泡囊(EGFR-)體外免疫。孵育6天后，從培養(yǎng)物中去除細(xì)胞并對上述抗原進(jìn)行篩選。b)應(yīng)答用光密度(405nm)表達(dá)。表4所選scFv片段對幾種抗原的交叉反應(yīng)性(a)a)如上所述進(jìn)行ELISA分析。b)玻連蛋白受體(VNR)；血小板糖蛋白IIbIIIa(GPIIbIIIa)；disialyl—lacto—N—四糖(DSLNT)。表5抗EGFR的scFv克隆的反應(yīng)性。使用純化可溶性抗原的ELISA方法與細(xì)胞系的細(xì)胞計數(shù)分析之間的比較結(jié)果。表5(續(xù))</tables>a)三種帶EGFR的細(xì)胞系(A431，MDAAMB231和HT29)和一種不表達(dá)EGFR的細(xì)胞系(WM164)用于所述細(xì)胞計數(shù)分析，檢測scFv與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合能力。b)無片段的載體(HEN)和來自425mAb(P1)的scFv片段分別作作陰性和陽性對照。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱MerckPatentGmbH(B)街道Frankfurterstr255(C)城市Darmstadt(E)國家德國(F)郵編64271(G)電話49—6151—727022(H)傳真49—6151—727191(ii)發(fā)明題目抗表皮生長因子受體的單鏈可變區(qū)片段和抗體(iii)序列數(shù)32(iv)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC—DOS/MS—DOS(D)軟件PatentInRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)長度327個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型CDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(D)生長期成年(F)組織類型；淋巴結(jié)(vii)直接來源(B)克隆L211C(輕鏈)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..327(xi)序列描述SEQIDNO1GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTGTGGGA48AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaAlaSerValGly151015GAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAACATTTACTATAGT96GluThrValThrIleThrCysArgAlaSerGluAsnIleTyrTyrSer202530TTAGCATGGTATCAGCAGAAGCAAGGGAAATCTCCTCAGCTCCTGATC144LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysGlnGlyLysSerProGlnLeuLeuIle354045TATAGTGCAAGCGCCTTGGAAGATGGTGTCCCATCGAGGTTCAGTGGC192TyrSerAlaSerAlaLeuGluAspGlyValProSerArgPheSerGly505560AGTGGATCTGGGACACAGTATTCTTTAAAGATCAACAACATGCAGCCT240SerGlySerGlyThrGlnTyrSerLeuLysIleAsnAsnMetGlnPro65707580GAAGATACCGCTACTTACTTCTGTAAACAGACTTATGACGTTCCGTGG288GluAspThrAlaThrTyrPheCysLysGlnThrTyrAspValProTrp859095ACGTTCGGTGGAGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCG327ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArgAla100105(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特性.(A)長度109個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO2AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaAlaSerValGly151015GluThrValThrIleThrCysArgAlaSerGluAsnIleTyrTyrSer202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysGlnGLyLysSerProGlnLeuLeuIle354045TyrSerAlaSerAlaLeuGluAspGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGlnTyrSerLeuLysIleAsnAsnMetGlnPro65707580GluAspThrAlaThrTyrPheCysLysGlnThrTyrAspValProTrp859095ThrPheG1yGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArgAla100105(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特性(A)長度357個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(C)生長期成年(F)組織類型淋巴結(jié)(vii)直接來源(B)克隆L211C(重鏈)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..357(xi，SEQUENCEDESCRIPTIONSEQIDNO3CAGGTGCAACTGCAGGAGTCAGGGCCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGGCT48GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyProGluLeuValArgProGlyAla110115120125TCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCAGGCTATACCTTCACTACCTAC96SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrTyr130135140TGGATACACTGGATGAAACAGAGGCCTGGACAAGGCCTTCAGTGGATT144TrpIleHisTrpMetLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGlnTrpIle145150155GGCATGATTGATCCTTCCAATAGTGAAACTAGGTTAAATCAGAATTTC192GlyMetIleAspProSerAsnSerGluThrArgLeuAsnGlnAsnPhe160165170AGGGACAAGGCCACATTGAGTGTAGACAAATCCTCCAATAAAGCCTAC240ArgAspLysAlaThrLeuSerValAspLysSerSerAshLysAlaTyr175180185ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAATCTATTACTGT288MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaIleTyrTyrCys190195200205GCAAGATGGGACTACGGTAGTGGCCACTTTGACTACTGGGGCCAAGGG336AlaArgTrpAspTyrGlySerGlyHisPheAspTyrTrpGlyGlnGly210215220ACCACGGTCACCGTCTCCTCA357ThrThrValThrValSerSer225(2)SEQIDNO4的信息(i)序列特性(A)長度119個堿基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO4GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyProGluLeuValArgProGlyAla151015SerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrThrTyr202530TrpIleHisTrpMetLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGlnTrpIle354045GlyMetIleAspProSerAsnSerGluThrArgLeuAsnGlnAsnPhe505560ArgAspLysAlaThrLeuSerValAspLysSerSerAsnLysAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaIleTyrTyrCys859095AlaArgTrpAspTyrGlySerGlyHisPheAspTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrThrValThrValSerSer115SEQIDNO5的信息(i)序列特性(A)長度339個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(C)生長期成年(F)組織類型淋巴結(jié)(vii)直接來源(B)克隆L211B(輕鏈)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..339(xi)序列描述SEQIDNO5GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGG48AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly120125130135CAGAGGGCCACCATCTCCTGCAGAGCCAGCGAAAGTGTTGATAATTTT96GlnArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGluSerValAspAsnPhe140145150GGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCC144GlyIleSerPheMetAsnTrpPheGlnGlnLysProGlyGlnProPro155160165AAACTCCTCATCTATGGTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCC192LysLeuLeuIleTyrGlyAlaSerAsnGlnGlySerGlyValProAla170175180AGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT240ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheSerLeuAsnIleHis185190195CCTCTGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAG288ProLeuGluGluAspAspThrAlaMetTyrPheCysGlnGlnSerLys200205210215GAGGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG336GluValProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluIleLysArg220225230GCG339Ala(2)SEQIDNO6的信息(i)序列特性(A)長度113個堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO6AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GlnArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGluSerValAspAsnPhe202530GlyIleSerPheMetAsnTrpPheGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrGlyAlaSerAsnGlnGlySerGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheSerLeuAsnIleHis65707580ProLeuGluGluAspAspThrAlaMetTyrPheCysGlnGlnSerLys859095GluValProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluIleLysArg100105110Ala(2)SEQIDNO7的信息(i)序列特性(A)長度357個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(C)生長期成年(F)組織類型淋巴結(jié)(vii)直接來源(B)克隆L211B(重鏈)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..357(xi)序列描述SEQIDNO7CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCT48GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla115120125TTAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTCACCAGCTAC96LeuValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr130135140145TGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATC144TrpMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle150155160GGAGAGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTC192GlyGluIleAspProSerAspSerTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPhe165170175AAGGGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCTCCAACACAGCCTAC240LysGlyLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerAsnThrAlaTyr180185190ATGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT288MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys195200205GCAAGATCGGACTACGGTAGTAGCCACTTTGACTACTGGGGCCAAGGG336AlaArgSerAspTyrGlySerSerHisPheAspTyrTrpGlyGlnGly210215220225ACCACGGTCACCGTCTCCTCA357ThrThrValThrValSerSer230(2)SEQIDNO8的信息(i)序列特性(A)長度119個堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO8GlnValGlnLeuGlnGluSerGlyProGluLeuValLysProGlyAla151015LeuValLysIleSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr202530TrpMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluIleAspProSerAspSerTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPhe505560LysGlyLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerAsnThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaArgSerAspTyrGlySerSerHisPheAspTyrTrpGlyGlnGly100105110ThrThrValThrValSerSer115SEQIDNO9的信息(i)序列特性(A)長度339個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(bv片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(C)生長期成年(F)組織類型淋巴結(jié)(vii)直接來源(B)克隆L311D(輕鏈)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..339(xi)序列描述SEQIDNO9GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCAGCTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGG48AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly120125130135CAGAGGGCCACCATCTCCTGCCGAGCCAGCGAAAGTGTTGATAATTTT96GlnArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGluSerValAspAsnPhe140145150GGCATTAGTTTTATGAACTGGTTCCAACAGAAACCAGGACAGCCACCC144GlyIleSerPheMetAsnTrpPheGlnGlnLysProGlyGlnProPro155160165AAACTCCTCATCTATGGTGCATCCAACCAAGGATCCGGGGTCCCTGCC192LysLeuLeuIleTyrGlyAlaSerAsnGlnGlySerGlyValProAla170175180AGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCAGCCTCAACATCCAT240ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheSerLeuAsnIleHis185190195CCTTTGGAGGAGGATGATACTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAAG288ProLeuGluGluAspAspThrAlaMetTyrPheCysGlnGlnSerLys200205210215GAGGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGG336GluValProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLysArg220225230GCG339Ala(2)SEQIDNO10的信息(i)序列特性(A)長度113個堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO10AspIleGluLeuThrGlnSerProAlaSerLeuAlaValSerLeuGly151015GlnArgAlaThrIleSerCysArgAlaSerGluSerValAspAsnPhe202530GlyIleSerPheMetAsnTrpPheGlnGlnLysProGlyGlnProPro354045LysLeuLeuIleTyrGlyAlaSerAsnGlnGlySerGlyValProAla505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheSerLeuAsnIleHis65707580ProLeuGluGluAspAspThrAlaMetTyrPheCysGlnGlnSerLys859095GluValProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLysArg100105110Ala(2)SEQIDNO1I的信息(i)序列特性(A)長度357個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(C)生長期成年(F)組織類型淋巴結(jié)(vii)直接來源(B)克隆L311D(重鏈)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..357(xi)序列描述SEQIDNO11GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAGCTTGTGAAGCCTGGGGCT48GluValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla115120125TCAGTGAAGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTAC96SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerTyr130135140145TGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATC144TrpMetHisTrpValLysGlnArgProGlyGlnGlyLeuGluTrpIle150155160GGAGAGATTGATCCTTCTGATAGTTATACTAACTACAATCAAAAGTTC192GlyGluIleAspProSerAspSerTyrThrAsnTyrAsnGlnLysPhe165170175AAGGGC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)(xi)序列描述SEQIDNO28GluValLysLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerHis202530LeuAspHisTrpValLysGlnArgGlyTrpGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGlnPheAsnProSerAsnGlyArgThrAsnTyrAsnGluLysPhe505560LysSerLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580IleGluLeuSerSerLeuThrSerGluAspCysSerValTyrTyrCys859095AlaSerArgAspTyrAspTyrAspGlyArgTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly115120125GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGluLeuThrGlnSerPro130135140ThrIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSer145150155160AspSerSerSerValSerTyrMetTyrTrpTyrGlnGlnLysThrGly165170175SerSerProArgLeuLeuIleTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGly180185190ValProValArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeu195200205ThrIleSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGln210215220GlnTrpSerSerTyrProLeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGlu225230235240IleLys(2)SEQIDNO29的信息(i)序列特性(A)長度726個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(C)生長期成年(F)組織類型脾細(xì)胞(vii)直接來源(B)克隆11H1(單鏈FV，重鏈，輕鍵加接頭)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..726(xi)序列描述SEQIDNO29GAGGTCAAGCTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCT48GluValLysLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla245250255TCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTCACCAGCCAC96SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerHis260265270TGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGGCTGGACAAGGCTTGGAGTGGATC144TrpMetHisTrpValLysGlnArgAlaGlyGlnGlyLeuGluTrpIle275280285290GGAGAGTTTAATCCCAGCAACGGCCGTACTAACTACAATGAGAAATTC192GlyGluPheAsnProSerAsnGlyArgThrAsnTyrAsnGluLysPhe295300305AAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTAC240LysSerLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr310315320ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT288MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys325330335GCCAGTCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACTGGGGC336AlaSerArgAspTyrAspTyrAspGlyArgTyrPheAspTyrTrpGly340345350CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGT384GlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly355360365370GGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA432GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGluLeuThrGlnSerPro375380385TCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGT480SerIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSer390395400GACAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGACAGGA528AspSerSerSerValSerTyrMetTyrTrpTyrGlnGlnLysThrGly405410415TCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGA576SerSerProArgLeuLeuIleTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGly420425430GTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTC624ValProValArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeu435440445450ACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAG672ThrIleSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGln455460465CAGTGGAGTAGTTACCCACACACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAA720GlnTrpSerSerTyrProHisThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGlu470475480ATAAAA726IleLys(2)SEQIDNO30的信息(i)序列特性(A)長度242個堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO30GluValLysLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerHis202530TrpMetHisTrpValLysGlnArgAlaGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluPheAsnProSerAsnGlyArgThrAsnTyrAsnGluLysPhe505560LysSerLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaSerArgAspTyrAspTyrAspGlyArgTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly115120125GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGluLeuThrGlnSerPro130135140SerIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSer145150155160AspSerSerSerValSerTyrMetTyrTrpTyrGlnGlnLysThrGly165170175SerSerProArgLeuLeuIleTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGly180185190ValProValArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeu195200205ThrIleSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGln210215220GlnTrpSerSerTyrProHisThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGlu225230235240IleLys(2)SEQIDNO31的信息(i)序列特性(A)長度732個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設(shè)無(iv)反義無(v)片段類型N—末端(vi)原始來源(A)生物小鼠(B)品系Balb/c(F)組織類型脾細(xì)胞(vii)直接來源(B)克隆1A1(單鏈FV，重鏈，輕鍵加接頭)(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..732(xi)序列描述SEQIDNO31GAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCT48GluValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla245250255TCAGTGAAGTTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTCACCAGCCAC96SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerHis260265270TGGATGCACTGGGTGAAGCAGAGGGCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATC144TrpMetHisTrpValLysGlnArgAlaGlyGlnGlyLeuGluTrpIle275280285290GGAGAGTTTAATCCCAGCAACGGCCGTACTAACTACAATGAGAAATTC192GlyGluPheAsnProSerAsnGlyArgThrAsnTyrAsnGluLysPhe295300305AAGAGCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCTTAC240LysSerLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr310315320ATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT288MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys325330335GCCAGTCGGGACTATGATTACGACGGACGGTACTTTGACTACTGGGGC336AlaSerArgAspTyrAspTyrAspGlyArgTyrPheAspTyrTrpG1y340345350CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGT384GlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly355360365370GGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA432GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGluLeuThrGlnSerPro375380385ACAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGT480ThrIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSer390395400GACAGCTCAAGTGTAAGTTACATGTACTGGTACCAGCAGAAGACAGGA528AspSerSerSerValSerTyrMetTyrTrpTyrGlnGlnLysThrGly405410415TCCTCCCCCAGACTCCTGATTTATGACACATCCAACCTGGCTTCTGGA576SerSerProArgLeuLeuIleTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGly420425430GTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTC624ValProValArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeu435440445450ACAATCAGCCGAATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAG672ThrIleSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGln455460465CAGTGGAGTAGTTACCCACCCATGTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAG720GlnTrpSerSerTyrProProMetTyrThrPheGlyGlyGlyThrLys470475480TTGGAAATAAAA732LeuGluIleLys485(2)SEQIDNO32的信息(i)序列特性(A)長度244個堿基對(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQIDNO32GluValGlnLeuGlnGlnSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla151015SerValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThrSerHis202530TrpMetHisTrpValLysGlnArgAlaGlyGlnGlyLeuGluTrpIle354045GlyGluPheAsnProSerAsnGlyArgThrAsnTyrAsnGluLysPhe505560LysSerLysAlaThrLeuThrValAspLysSerSerSerThrAlaTyr65707580MetGlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspSerAlaValTyrTyrCys859095AlaSerArgAspTyrAspTyrAspGlyArgTyrPheAspTyrTrpGly100105110GlnGlyThrThrValThrValSerSerGlyGlyGlyGlySerGlyGly115120125GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspIleGluLeuThrGlnSerPro130135140ThrIleMetSerAlaSerProGlyGluLysValThrMetThrCysSer145150155160AspSerSerSerValSerTyrMetTyrTrpTyrGlnGlnLysThrGly165170175SerSerProArgLeuLeuIleTyrAspThrSerAsnLeuAlaSerGly180185190ValProValArgPheSerGlySerGlySerGlyThrSerTyrSerLeu195200205ThrIleSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGln210215220GlnTrpSerSerTyrProProMetTyrThrPheGlyGlyGlyThrLys225230235240LeuGluIleLys權(quán)利要求1.抗表皮生長因子受體的單鏈可變區(qū)片段，其可從由免疫哺乳動物細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體抗體文庫中獲得。2.權(quán)利要求1的抗體片段，其可從免疫小鼠的細(xì)胞獲得。3.權(quán)利要求1或2的抗體片段，其可從下列細(xì)胞獲得(i)淋巴結(jié)細(xì)胞，(ii)脾細(xì)胞，或(iii)體外免疫的細(xì)胞。4.權(quán)利要求1—3之任一的抗體片段，其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)含有選自SEQIDNO1—32中給出的重鏈和輕鏈序列之一的DNA和/或氨基酸序列。5.一種抗EGFR抗體，其是由來自權(quán)利要求1—4的抗體片段的DNA序列和來自人免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA序列構(gòu)建成的。6.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈恒定區(qū)包括人的γ—1鏈的氨基酸序列，輕鏈恒定區(qū)包括人K鏈的氨基酸序列。7.權(quán)利要求1—4之一的抗EGFR單鏈Fv的制備方法，其包括下列步驟(i)從免疫的哺乳動物細(xì)胞，優(yōu)選小鼠細(xì)胞中分離RNA，(ii)合成第一股cDNA，(iii)擴(kuò)增免疫細(xì)胞的cDNA中VH和VK基因，(iv)以適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)將所述基因一起克隆到一噬菌粒載體中，(v)用連接混合物轉(zhuǎn)化原核細(xì)胞，(vi)從噬菌體文庫中用純化EGFR篩選針對EGFR的噬菌體抗體，及(vii)在原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌中產(chǎn)生所要求的單鏈Fv。8.一種制備抗EGFR的完全抗體的方法，包括將編碼按權(quán)利要求7產(chǎn)生的抗EGFR抗體片段可變區(qū)的DNA，克隆到至少一種真核表達(dá)載體中，該真核表達(dá)載體含有編碼人免疫球蛋白恒定區(qū)的基團(tuán)組DNA，用所述載體轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，表達(dá)并分離抗體。9.含有權(quán)利要求1—4之一的抗EGFR抗體片段或權(quán)利要求5或6的抗EGFR完全抗體的藥物組合物。10.權(quán)利要求1—4之一的抗EGFR抗體片段，或權(quán)利要求5或6的抗EGFR完全抗體的用途，其用于制備針對腫瘤或診斷定位和評估腫瘤生長的藥物。全文摘要本發(fā)明涉及新的抗EGFR抗體和抗體片段，其可從由免疫哺乳動物(優(yōu)選小鼠)細(xì)胞構(gòu)建的噬菌體抗體文庫獲得。從噬菌體抗體文庫分離到的兩個單鏈Fv可用基因工程方法產(chǎn)生部分人源化的完全抗體分子。這些嵌合的抗EGFR抗體含有人免疫球蛋白的恒定區(qū)，它們及其片段可用作診斷和治療人腫瘤的試劑。文檔編號C07KGK1124501SQ95190191公開日1996年6月12日申請日期1995年3月16日優(yōu)先權(quán)日1994年3月17日發(fā)明者A·C·科特勒布羅格,M·M·本笛格,K·H·安瑟爾,D·圭叟,J·阿丹,F·密特簡斯,E·盧塞爾,F·布拉斯庫,J·皮拉特斯申請人:默克專利股份有限公司