專利名稱：具有血小板生成素活性的蛋白質(zhì)的制作方法
本申請是現(xiàn)今未決的1995年1月31日提交的美國專利申請(申請?zhí)栁粗?的部分連續(xù)申請，后一申請是現(xiàn)今未決的1994年12月22日提交的美國專利申請No.08/361,811的部分連續(xù)申請，后一申請是現(xiàn)今未決的1994年10月11日提交的美國專利申請No.08/320,300的部分連續(xù)申請，后一申請是現(xiàn)今未決的1994年7月20日提交的美國專利申請No.08/278,083的部分連續(xù)申請，后一申請是現(xiàn)已放棄的1994年4月1日提交的美國專利申請No.08/221,020的部分連續(xù)申請，后一申請是現(xiàn)已放棄的1994年3月14日提交的美國專利申請No.08/212,164的部分連續(xù)申請。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及具有以特定方式在體內(nèi)刺激或增加血小板生成或增強巨核細胞祖細胞增生和分化之活性的新蛋白質(zhì)、編碼所說蛋白質(zhì)的DNA序列及其制備方法。發(fā)明背景巨核細胞是胞體較大、富含胞漿的多核細胞，它能產(chǎn)生血小板，主要見于骨髓中。巨核細胞起源于骨髓中的多能造血干細胞。原始的多能干細胞在某種程序內(nèi)分化成巨核細胞祖細胞，后者定型為巨核細胞系。巨核細胞祖細胞增生和分成成巨核細胞。巨核細胞進一步進行多倍體和細胞質(zhì)成熟，最后將其無核胞質(zhì)碎片(即血小板)釋放到循環(huán)中。一個成熟的巨核細胞平均形成2,000-4,000個血小板。盡管血小板的形成機理在一些細節(jié)上尚不清楚，但據(jù)認為，巨核細胞典型地是位于骨髓竇腔內(nèi)皮的白蛋白(albuminal)表面，它產(chǎn)生延及竇狀隙的胞漿處理過程，籍此巨核細胞進行血小板的碎片化。
有關(guān)產(chǎn)生血小板的機理還存在許多疑點，盡管認為有可能巨核細胞存在于骨髓靜脈竇皮層，胞質(zhì)穿過皮層，在靜脈內(nèi)壁上產(chǎn)生索樣凸起，籍此，血小板被釋放。
據(jù)認為，對于巨核細胞造血血小板產(chǎn)生的生成及調(diào)控中存在一種特定功能。在健康人類和動物中，雖然已知給例如健康動物施用抗血小板抗體后，血小板數(shù)迅速減少，然后開始暫升至高于平常，但最后回復至正常水平，所以有效血小板的數(shù)量被維持在一定水平。同樣，已知在臨床中血小板數(shù)減少(血小板減少癥)或血小板數(shù)增加(血小板增多癥)甚至見于紅細胞和血細胞數(shù)處于正常水平時。
順便提一句，血小板最重要的功能是在止血機理中形成血栓。如果止血機理由于血小板數(shù)減少而不能正常發(fā)揮作用，則將導致出血趨勢。
已證明了有關(guān)巨核細胞生成和血小板生成中存在特定的調(diào)節(jié)機理。血小板在健康人體內(nèi)和正常的動物中維持著有效數(shù)量。然而，已知當抗血小板抗體被施用于動物時，血小板數(shù)只在短期內(nèi)迅速減少，之后開始回升并暫時超過正常水平，最終回復至正常水平。在臨床領(lǐng)域中還了解到，血小板數(shù)減少(血小板減少癥)或血小板數(shù)增加(血小板增多癥)甚至見于紅細胞和白細胞數(shù)正常的情況下。但是，至今尚無成功分離和鑒定涉及血小板產(chǎn)生的特定調(diào)節(jié)因子(例如，象紅細胞形成過程中的促紅細胞生成素)的報道。
血小板最重要的功能是在止血機理中形成血凝塊。當止血機理的正常功能因血小板減少而遭破壞時，則會發(fā)生出血趨勢。在癌癥的放療和化療領(lǐng)域中，由骨髓抑制所致的血小板減少是致死的并發(fā)癥；給這類患者輸注血小板以防止出血趨勢。血小板輸注也應用于骨髓移植后的患者或再生障礙性貧血的患者。
用于這類血小板輸注的血小板可通過血小板除去法由健康血供體的血液中制備，但用于輸注的這類血小板的半衰期短，并有可能產(chǎn)生細菌污染。血小板輸注還可能因輸注用的血小板中污染了淋巴細胞而存在使患者接觸有害病毒(如人類免疫缺陷病毒HIV或各種肝炎病毒)、誘導對輸注血小板的主要組織相容性抗原(HLA)有特異性的抗體或?qū)е乱浦参锟顾拗骷膊?GVHD)的危險。
因此，如果能在血小板減少的患者體內(nèi)刺激固有的血小板形成，并同時減少血小板輸注的依賴性，這將是非常有益的。另外，如果能夠糾正或預防進行放療或化療的癌癥患者的血小板減少，就可以使這類治療更加安全，有可能增加治療的強度并進一步改善所期望的抗癌效果。
由于上述種種原因，人們對分離和鑒定涉及調(diào)節(jié)巨核細胞和血小板生成的特異性調(diào)節(jié)因子進行了大量的研究。根據(jù)體外研究結(jié)果，控制巨核細胞生成的調(diào)節(jié)因子大致分成下面兩種因子(參見Williams etal.，J.Cell.Physiol.，vol.110，p101-104，1982)。巨核細胞集落刺激因子(Meg-CSF)是在半固體培養(yǎng)基中刺激CFU-MK增生和分化以形成巨核細胞集落的調(diào)節(jié)因子。另一種稱為巨核細胞增效因子(Meg-Pot)、巨核細胞刺激因子、血小板生成刺激因子等的調(diào)節(jié)因子主要作用于未成熟或成熟的巨核細胞，籍此增強其分化與成熟。在某些情況下，Meg-Pot可與Meg-CSF一起被檢測到。另外，因為當將由實驗誘導的血小板減少動物收集的血清或血漿施用于另外的正常動物時血小板計數(shù)增高，所以表明存在一種能夠在體內(nèi)促進血小板生成的促進因子，稱為血小板生成素(TPO)。
近年來，檢查了一些其基因已被克隆的細胞因子刺激巨核細胞生成和血小板生成的能力。人IL-3刺激人巨核細胞集落的形成(Brunoet al.，Exp.Hamatol.，vol.16，p371-377，1988)，并至少升高猴的血小板計數(shù)(Donahue et al.，Science，vol.241，p1820，1988)。然而，因為IL-3對所有造血細胞的增生和分化都起作用，所以它不同于控制巨核細胞生成和血小板生成的特異性調(diào)節(jié)因子。人IL-6沒有表現(xiàn)出Meg-CSF活性，但它作用于未成熟的巨核細胞，并促進其分化為成熟的巨核細胞(Williams et al.，Exp.Hamatol.，vol.18，p.69，1990)。體內(nèi)施用IL-6能誘導血小板生成，促進靈長目骨髓巨核細胞的成熟和向更高倍性升遷，但也產(chǎn)生一些副作用，如體重減輕、誘生急性期蛋白質(zhì)(Asano et al.，Blood，vol.75，p1602-1605，1990；Stahl et al.，Blood，vol.78，p1467-1475，1991)。人IL-11無Meg-CSF活性，但有Meg-Pot活性，并促進小鼠的血小板生成(Neben et al.，Blood，vol.81，p901-908，1993)。另外，人LIF顯著地提高靈長目的血小板數(shù)(Mayer et al.，Blood，vol.81，p2226-3233，1993)，但其在體外對巨核細胞的作用很微弱(Burstein et al.，J.Cell.Physiol.，vol.153，p305-312，1992)。
盡管希望將這些細胞因子作為血小板增效因子應用于臨床，但其功能對巨核細胞系并非特異，并且它們能引起副作用。因此，在臨床上需要開發(fā)一種既對巨核細胞-血小板系統(tǒng)具有特異性又能引起較少副作用的血小板增加因子。
已發(fā)現(xiàn)在血小板減少的患者或動物的血清、血漿或尿液中或在某些被培養(yǎng)的人細胞系的培養(yǎng)物上清液中存在Meg-CSF、Meg-Pot或TPO活性。然而，目前仍不清楚這些活性是否因為存在單種因子或幾種因子的共同存在造成，也不清楚這些因子與已知的細胞因子是否不同。
Hoffman等人發(fā)現(xiàn)，再生障礙性貧血和無巨核細胞性血小板減少性紫癜患者的血清含有Meg-CSF活性，它顯著地增加巨核細胞集落的形成(Hoffman et al.，N.Eng.J.Med.，vol.305，p533-538，1981)。此后，Mazur等人又報道，存在于再生障礙性貧血患者血清中的Meg-CSF活性不同于IL-3和GM-CSF(Mazur et al.，Blood，vol.76，p290-297，1990)。類似的Meg-CSF活性已見于接受廣泛的細胞毒性化療的癌癥患者和骨髓移植患者的血清中(Mazuret al.，Exp.Hematol.，vol.12，p624-628，1984；de Alarconand Schinieder，Prog.Clin.Bio.Res.，vol.215，p335-340，1986)。據(jù)Hoffman等人報道，已由低巨核細胞性血小板減少患者的血清中純化了Meg-CSF，其表觀分子量為46,000(Hoffman etal.，J.Clin.Invest.，vol.75，p1174-1182，1985)，但進一步的研究發(fā)現(xiàn)所說物質(zhì)并非以能進行精確氨基酸測序的純度水平存在(Hoffman Blood，vol.74，p1196-1212，1989)。從血小板減少患者的血漿或特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者的尿液中部分純化了具有TPO樣活性的物質(zhì)，它能增強75Se-硒蛋氨酸摻入小鼠新形成的血小板中，所測定的血漿來源因子的表觀分子量為40,000(Grossi et al.，Hematologica，vol.72，p291-295，1987；Vannucchi et al.，Leukemia，vol.2，p236-240，1988)。
Meg-CSF活性和TPO樣活性也已在再生障礙性貧血和重癥ITP患者的尿樣中檢測到(Kawakita et al.，Br.J.Haemtol.，vol.48，p609-615，1981；Kawakita et al.，Blood，vol.556-560，1983)。Kawakita等人進一步報道，在再生障礙貧血患者尿提取物中所見的Meg-CSF活性，于離解條件下經(jīng)凝膠過濾表明其表觀分子量為45,000(Kawakita et al.，Br.J.Haematol.，vol 62，p715-722，1986)。Erikson-Miller等人也報道了從類似的尿樣中純化Meg-CSF，但沒有提供有關(guān)其結(jié)構(gòu)的信息(Erikson-Miller etal.，“Blook Cell Growth Factorstheir Present andfuture use in hematology and oncology”ed.by Murphy，AlphaMed Press，Dayton，Ohio，p204-220，1992)。Turner等人已從骨髓移植患者的尿液中純化了具Meg-CSF活性的巨核細胞刺激因子(MSF)并克隆其基因(Turner et al.，Blood，vol.78，p1106-279a，1991，(abstr.，supple.1))。該MSF的分子量為28,000-35,000。該因子與至今已在血小板減少患者的血清和血漿樣品中檢測到的Meg-CSF的一致性及其血小板增加活性仍然有待于闡明。
人們還從人胚腎來源的細胞系(HEK細胞)的培養(yǎng)物上清液中純化了具TPO樣活性、分子量為32,000的物質(zhì)，并對其生物學及生化學特性作了廣泛的檢測，但其結(jié)構(gòu)尚不清楚(McDonald et al.，J.Lab.Clin.Med.，vol.106，p162-174，1985；McDonald，Int.J.Cell Cloning，vol.7，p139-155，1989)。相反，據(jù)其它的研究人員報道，在HEK細胞的條件培養(yǎng)基中產(chǎn)生的離體增強巨核細胞成熟過程的主要活性，是由于已知的細胞因子，即IL-6和EPO引起的(Withy et al.，J.Cell.Physiol.，vol.15，p362-372，1992)。
Evatt等人報道了有關(guān)動物來源的因子，他們在經(jīng)抗血小板血清注射所誘導的血小板減少兔血漿中發(fā)現(xiàn)了能在兔中促進75Se-硒蛋氨酸摻入新形成的血小板中的TPO樣活性(Evatt et al.，J.Lab.Clin.Med.，vol.83，p364-371，1974)。除此之外，從60年代到70年代報道了大量的類似研究結(jié)果(例如，Odell et al.，Proc.Soc.Biol.Med.，vol.108，P428-431，1961；Evatt andLevin，J.Clin.Invest.，vol.48，p1615-1626，1969；Harker，Am.J.Physiol.，vol.218，p1376-1380，1970；Shreiner andLevin，J.Clin.Invest.，vol.49，p1709-1713，1970；Penington，Br.Med.J.vol.1，p606-608，1970)。Evatl等人及Hill和Levin已從血小板減少兔血漿中部分純化了TPO樣活性(Evatl et al.，Blood，vol.54，p377-388，1979；Hill andLevin，Exp.Hematol.，vol.14，p752-759，1986)。在此之后，繼續(xù)進行了對該因子的純化工作，監(jiān)測其在體外促進巨核細胞分化和成熟之活性(即Meg-Pot活性)表明，當用凝膠過濾進行檢測時，該活性的表觀分子量為40,000-46,000(Keller et al.，Exp.Hematol.，vol.16，p262-267，1988；Hill et al.，Exp.Hematol.，vol.20，p354-360，1992)。既然IL-6活性在經(jīng)施用抗血小板血清而誘發(fā)重癥急性血小板減少兔子的血漿中檢測不到，因而表明該TPO樣活性是產(chǎn)生于IL-6之外的一種因子(Hill et al.，Blood，vol.80，p346-351，1992)。
Tayrien和Rosenberg也已從血小板減少兔血漿和HEK細胞的培養(yǎng)物上清液中純化了一種表觀分子量為15,000的因子，它能刺激大鼠巨核細胞的細胞系產(chǎn)生血小板因子4，但他們未曾提供有關(guān)其結(jié)構(gòu)的信息(Tayrien and Rosenberg.J.Biol.Chem.，vol.262，p3262-3268，1987)。
另外，Nakeff在經(jīng)施用抗血小板血清誘發(fā)的血小板減少小鼠血清中發(fā)現(xiàn)了Meg-CSF活性(Nakeff，“Experimental HematologyToday”ed.by Baum and Ledney，Springer-Verlag，NY，p111-123，1977)。另一方面，血小板減少的兔血清能促進巨核細胞成熟(keller et al.，Exp.Hematol.，vol.16，p262-267，1988；Hill et al.，Exp.Hematol.，vol.17，p903-907，1989)，并刺激巨核細施的形態(tài)變化為血小板(Leven and Yee，Blood，vol.69，p1046-1052，1989)，但未有可測的Meg-CSF活性。
Miura等人在經(jīng)亞致死性整體輻射所提供的血小板減少的兔血漿中檢測到了Meg-CSF活性(Miura et al.，Blood，vol.63，p1060-1066，1984)，這說明在體內(nèi)誘導Meg-CSF活性與巨核細胞減少有關(guān)，而與血小板減少無關(guān)，因為在輸注血小板后并不改變該活性(Miura et al.，Exp.Hemotol.，vol.16，p139-144，1988)。Mazur和South在經(jīng)亞致死性輻射的狗血清中已檢測到Meg-CSF活性，并報道該因子經(jīng)凝膠過濾測得表觀分子量為175,000(Mazur andSouth，Exp.Hematol.，vol.13，p1164-1172，1985)。除此之外，其它的研究人員(如Straneva et al.，Exp.Hematol.，vol.15，p657-663，1987)也已報道了血清、血漿及尿來源的因子。
因此，如上所述，已在取自血小板減少患者和動物的生物樣品中發(fā)現(xiàn)了刺激巨核細胞生成和血小板生成的各種活性，但因為其在天然來源(如血和尿)中含量甚微，故而還未能完成對這些因子的分離、生化和生物學鑒定及特征描述。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是從天然來源分離TPO蛋白質(zhì)并鑒定之，該TPO蛋白質(zhì)具有體內(nèi)刺激或增加血小板生成和/或促進巨核細胞祖細胞的增生和分化的活性(下文稱作“TPO活性”)；本發(fā)明的目的還要分離編碼該TPO蛋白質(zhì)的基因，并提供用重組DNA技術(shù)均質(zhì)和大量生產(chǎn)所說蛋白質(zhì)的方法。成功地達到上述目的將會替代現(xiàn)行的血小板輸注或降低血小板輸注的使用頻率；所說的新蛋白質(zhì)也將用于治療和診斷血小板紊亂。
因此，本發(fā)明涉及(i)純化和分離的編碼具有TPO活性蛋白質(zhì)的DNA序列，它選自下列序列(a)SEQ ID NO 194、195和196所示DNA序列或其互補鏈；和(b)在嚴格條件下與(a)中所定義的DNA序列雜交的DNA序列或其片段；和(c)倘若沒有遺傳密碼的簡并性就將會與(a)和(b)中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。
(ii)生產(chǎn)具有TPO活性蛋白質(zhì)的方法，它包括下列步驟在適宜的營養(yǎng)條件下，培養(yǎng)以能夠表達所說蛋白質(zhì)的方式用所說DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞；分離通過表達所說DNA序列所得的目的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，(iii)在原核或真核宿主細胞中通過表達所說DNA序列所得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
本發(fā)明進一步涉及含有效量具有TPO活性之所說蛋白質(zhì)的藥物組合物和治療血小板紊亂(尤其是血小板減少)的方法，包括給有上述紊亂的患者施用所說的蛋白質(zhì)。附圖的簡要描述

圖1表示來源于XRP的Phenyl Sepharose 6FF/LSF2的Sephacryl S-200HR凝膠過濾層析。
圖2表示YMC-pack CN-AP TPO活性級分的Capcell Pak C1反相層析，所說級分來源于XRP的低分子量TPO樣品(SephacrylS-200HR F3)。
圖3表示來源于XRP低分子量TPO樣品的Capcell Pak C1 TPO活性級分(FA)的SDS-PAGE分析。
圖4表示用SDS-PAGE分離的大鼠的TPO在C18反相HPLC上的肽圖譜。所示肽片段是經(jīng)三種蛋白酶徹底水解而得。
圖5表示大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中來源于XRP的TPO活性。
圖6表示表達載體pEF18S的構(gòu)建。
圖7表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pEF18S-A2X被引入COS1細胞中。
圖8表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pEF18S-HL34被引入COS1細胞中。
圖9表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pHT1-231被引入COS1細胞中。
圖10a表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pHTF1被引入COS1細胞中。
圖10b表示在M-07e測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pHTF1被引入COS1細胞中。
圖11表示λHGT1克隆的限制性圖譜和pHGT1與pEFHGTE的構(gòu)建。
(EEcoRI，HHindIII，SSalI)圖12a表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pEFHGTE被引入COS1細胞中。
圖12b表示在M-07e測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pEFHGTE被引入COS1細胞中。
圖13a表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pHT1-211#1、pHT1-191#1或pHT1-171#2被引入COS1細胞中。
圖13b表示在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pHT1-163#2被引入COS1細胞中。
圖14表示在M-07e測定系統(tǒng)中，COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中的TPO活性，其中pHT1-211#1、pHT1-191#1、pHT1-171#2或pHT1-163#2被引入COS1細胞中。
圖15表示用于從CHO細胞的培養(yǎng)物上清液中純化人TPO的反相色譜(Vydac C4柱)的色譜圖，其中的CHO細胞被導入了pDEF202-hTPO-P1，以使TPO能被表達。
圖16是表明用SDS-PAGE分離由CHO細胞的培養(yǎng)物上清液純化的人TPO的圖片，其中的CHO細胞已被導入了pDEF202-hTPO-P1，以使TPO能被表達。
圖17是用于從E.coli純化人TPO的反相色譜的色譜圖，其中的E.coli已被導入了pCFM536/h6T(1-163)，以使能表達TPO。
圖18是用SDS-PAGE分離從E.coli分離和純化的人TPO變異體h6T(1-163)的圖片，其中的E.coli已被導入了pCFM536/h6T(1-163)，以使能表達TPO。
圖19表示在Superdex 75pg柱上純化得自培養(yǎng)物上清液的hTPO163的洗脫圖型，作為起始物，它由將人TPO表達質(zhì)粒pDEF202-hTPO163轉(zhuǎn)染至CHO細胞而制備。于220nm處檢測蛋白質(zhì)含量。
圖20表示在從培養(yǎng)物上清液純化hTPO163后經(jīng)Superdex 75pg柱洗脫的標準hTPO163的SDS-PAGE分析，作為起始物，它通過將人TPO表達質(zhì)粒pDEF202-hTPO163轉(zhuǎn)染至CHO細胞而制備，hTPO163在凝膠上用銀染。
圖21表示表達載體pSMT201的結(jié)構(gòu)。
圖22表示在COS7細胞的培養(yǎng)物上清液中經(jīng)M-07e測定法檢測的TPO活性，其中的COS7細胞中已被導入了βGL-TPO、N3/TPO或09/TPO，然后表達之。
圖23表示在COS7細胞的培養(yǎng)物上清液中經(jīng)M-07e測定法檢測的TPO活性，其中的COS7細胞已被導入并表達了人TPO的插入或缺失衍生物。
圖24表示經(jīng)靜脈和皮下注射TPO后小鼠的血小板數(shù)升高。
圖25表示皮下注射TPO后，小鼠的血小板數(shù)呈劑量依賴性升高。
圖26表示在用5-FU處理小鼠以誘發(fā)血小板減少之后，TPO能誘導血小板數(shù)升高。
圖27表示用鹽酸嘧啶亞硝脲處理小鼠誘發(fā)血小板減少后，TPO能誘導血小板數(shù)升高。
圖28表示TPO能誘導骨髓移植后血小板減少之小鼠中的血小板數(shù)升高。
圖29表示在用X線照射小鼠致血小板減少后，TPO能誘導血小板數(shù)升高。
圖30表示在施用被截短的TPO(SEQ ID NO6中的氨基酸1-163)后血小板數(shù)呈劑量依賴性升高。
圖31表示在施用鹽酸嘧啶亞硝脲誘導血小板減少后，再用截短的TPO(SEQ ID NO6中的氨基酸1-163)會引起血小板數(shù)升高。
圖32表示提高加入人巨核細胞培養(yǎng)物體系中的Mpl-X濃度將增加對巨核細胞發(fā)育的阻斷。
圖33描繪了在E.coli中表達的TPO衍生物[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)、[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Pro143]TPO(1-163)和[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163)的TPO活性，該活性由M-07e測定法檢測。
圖34描繪了在E.coli中表達的TPO衍生物[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)、[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)、[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)、Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)和[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)的TPO活性，該活性由M-07e測定法檢測。發(fā)明的詳細描述確切地說本發(fā)明提供了具有特異性刺激或增加血小板生成的生物活性、并含有SFQ ID NO6氨基酸序列的1-332血小板生成素(TPO)多肽或其衍生物。舉例說明的多肽包括由下列氨基酸序列組成的那些多肽SEQ ID NO6氨基酸序列的1-163；SEQ ID NO6氨基酸序列的1-232；SEQ ID NO6氨基酸序列的1-151；SEQ IDNO2、4和6的成熟氨基酸序列包括缺失1-6個N-末端氨基酸的那些多肽。本發(fā)明另外舉例說明的多肽包括[Thr33，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO，[Asn25，Lys231，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO，[Asn25]TPO和[Thr33]TPO.本發(fā)明的其它多肽還包括TPO多肽的衍生物[ΔHis33]TPO(1-163)，[ΔArg117]TPO(1-163)，[ΔGly116]TPO(1-163)，[His33，Thr33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Ala33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Gly33′，Pro34，Ser38]TPO(1-163)，[Gly116，Asn116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Ala116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Gly116′，Arg117]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Pro148]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)，and[Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163).
本發(fā)明的TPO多肽還包括那些與聚合物(最好是聚乙二醇)共價相連的。本發(fā)明的TPO多肽進一步可包括氨基酸[Met-2-Lys-1]、[Met-1]或[Gly-1]。本發(fā)明提供的DNA包括那樣編碼上述TPO多肽和衍生物的DNA，并以cDNA、基因組DNA和生產(chǎn)的DNA形式適當?shù)奶峁?br> 本發(fā)明還提供了生產(chǎn)上述TPO多肽的方法，其步驟包括在適宜的宿主中表達由本發(fā)明DNA編碼的多肽，分離所說的TPO多肽。在被表達的TPO多肽是Met-2-Lys-1多肽情況下，所說的方法進一步能包括從所說分離的TPO多肽裂解Met-2-Lys-1的步驟。
本發(fā)明還提供生產(chǎn)如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合多肽的的TPO多肽的方法。將編碼N末端GST多肽、凝血酶識別肽和TPO多肽的DNA導入適宜的宿主，分離融合多肽，并經(jīng)凝血酶處理以除去GST部分。所得TPO多肽具有[G1y-1]結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明另外提供的是用本發(fā)明的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞，其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化是以能夠在所說宿主細胞中表達具有特異性刺激或增加血小板生成的生物活性的多肽之方式進行的。
本發(fā)明的藥物組合物包括有效量的TPO多肽或衍生物和藥用載體，易用于治療血小板紊亂，尤其是治療血小板減少癥，如因化療、放療或骨髓移植所誘發(fā)的血小板減少癥。本發(fā)明提供了相應的治療方法。
最后，本發(fā)明提供與上述TPO多肽及其衍生物有特異性免疫反應的抗體。這類抗體用于本發(fā)明TPO多肽的分析和定量分析方法中。
根據(jù)本發(fā)明，提供了編碼具有TPO活性的蛋白質(zhì)的新DNA序列(下文稱為“本發(fā)明的DNA序列”)。本發(fā)明的DNA序列包括編碼所附序列表中SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列的DNA序列。
本發(fā)明的DNA序列還包括編碼前述SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸的部分修飾(取代、缺失、插入或增加)變異體，前提是這類修飾作用不損害TPO活性。這就是說，編碼TPO衍生物的DNA序列也包括在本發(fā)明中。
換句話說，本發(fā)明的DNA序列包括編碼其氨基酸序列基本上為SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子的DNA序列。此外所用措詞“氨基酸序列基本上為SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列”意指所說的氨基酸序列包括那些由SEQ ID NO2、4或6所表示的，以及那些由其中被部分修飾(如取代、缺失、插入、增加等)的SEQ ID NO2、4或6所表示的，后者的前提是所說的修飾作用不損害TPO活性。
更進一步，本發(fā)明的DNA序列本質(zhì)上包括編碼具有TPO活性蛋白質(zhì)的DNA序列。
措詞“編碼氨基酸序列的DNA序列”包括可在核苷酸序列中存在簡并性的所有DNA序列。
本發(fā)明的DNA序列還包括下列序列(a)SEQ ID NO7、194、195和196所表示的DNA序列或其互補鏈，(b)在嚴格條件下與(a)所定義的DNA序列雜交的DNA序列或其片段，或
(c)倘若沒有遺傳密碼的簡并性就將會與(a)和(b)中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。
換句話說，本發(fā)明的DNA序列還包括下列序列(a)整合到下列載體中并編碼具有TPO活性蛋白質(zhì)的氨基酸序列的DNA序列E.coli DH5菌株攜帶的載體pEF18S-A2α(保藏號為FERM BP-4565)、E.coli DH5菌株攜帶的載體pHT1-231(保藏號為FERM BP-4564)、E.coli DH5菌株攜帶的載體pHTF1(保藏號為FERM BP-4617)和E.coli DH5菌株攜帶的載體pHGT1(保藏號為FEMR BP-4616)；或(b)在嚴格條件下與(a)所定義的DNA序列或其片段雜交并編碼具有TPO活性的氨基酸序列的DNA序列。
本文所描述的“嚴格”雜交條件是指在用變性的和/或單一序列寡核苷酸引物(探針)說明對本發(fā)明的DNA進行PCR擴增的實施例中所應用的條件(也可參見例如Molecular Cloning，Chapter 11 and12，Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Unit 2.10，Ausubel et al.，Eds.，Current Protocols，USA，1993)。
本發(fā)明的DNA序列還包括編碼具TPO活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，包括編碼SEQ ID NO6表示的氨基酸序列的1-163位的核苷酸序列。
這類DNA序列還可以在起始、中止和中間位置添加限制性酶解位點和/或另外的DNA序列，以便于構(gòu)建易于表達的載體。當使用非哺乳動物宿主時，可在宿主中摻入對于基因表達的優(yōu)選密碼子。
本發(fā)明DNA序列的一個例子是通過從哺乳動物(包括人)細胞制備mRNA，然后以常規(guī)途徑從已知方法制備的cDNA文庫中篩選所需cDNA所得的cDNA分子。這種情況下mRNA的來源包括大鼠肝細胞來源的細胞系McA-RH8994、HTC細胞、H4-II-E細胞、大鼠肝臟、腎、腦和小腸、人肝等。
本發(fā)明DNA序列的另外一個例子是一種基因組DNA分子，它通過以常規(guī)途徑從用已知方法由哺乳動物(包括人)細胞制備的基因組文庫中篩選而得。這種情況下基因組DNA的來源包括得自人、大鼠、小鼠等的染色體DNA制備物。
制備編碼TPO衍生物的DNA序列可以通過利用已知的定點誘變來修飾上述的cDNA序列，籍此部分修飾相應氨基酸序列，從而由上述編碼具有TPO活性蛋白質(zhì)的cDNA序列制得。
已推導出本發(fā)明具TPO活性之蛋白質(zhì)的氨基酸序列或DNA序列，因而編碼經(jīng)部分修飾的氨基酸序列的DNA序列很容易用化學合成法制得。
本發(fā)明的DNA序列是利用各種重組DNA技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)具有TPO活性之蛋白質(zhì)的有用物質(zhì)。
同樣，本發(fā)明的DNA序列還用作分離編碼TPO相關(guān)蛋白之基因的標記探針，以及作為編碼其它哺乳動物種類之TPO的cDNA和基因組DNA。它還可用于人和其它種哺乳動物的基因治療。另外，本發(fā)明的DNA序列還用于開發(fā)能用作大規(guī)模生產(chǎn)TPO的真核宿主的轉(zhuǎn)基因哺乳動物(Palmiter et al.，Science，vol.222，p809-814，1983)。
本發(fā)明還提供了被前述編碼具TPO活性蛋白質(zhì)之DNA序列整合的載體、用所說載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞以及生產(chǎn)具有TPO活性之蛋白質(zhì)的方法，所說方法包括培養(yǎng)所說宿主細胞，分離并純化被表達的具TPO活性的蛋白質(zhì)。
用于上述情況的宿主細胞的例子包括原核細胞，如E.coli等，真核細胞，如酵母、昆蟲、哺乳動物細胞等。舉例說明的哺乳動物細胞的例子包括COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、C-127細胞、幼齡倉鼠腎(BHK)細胞等。舉例說明的酵母的例子包括面包酵母(釀酒酵母)、甲醇同化酵母(巴斯德畢赤氏酵母)。舉例說明的昆蟲細胞的例子包括蠶的培養(yǎng)細胞等。
有關(guān)用于轉(zhuǎn)化上述宿主細胞的載體，pKC30(Shimatake H.andM.Rosenberg，Nature，292，128-132，1981)、pTrc99A(AmannE.et al.，Gene，69，301-315，1988)等可用于轉(zhuǎn)化E.coli細胞。pSV2-neo(Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1，327-341，1982)、pCAGGS(Niwa et al.，Gene，108，193-200，1991)、pcDL-SRα296(Takebe.et al.，Mol.Cell.Biol.，8，466-472，1988)等可用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞。pG-1(Schena M.and Yamamoto K.R.，Science，241，965-967，1988)等可用于轉(zhuǎn)化酵母細胞。用于構(gòu)建重組病毒的轉(zhuǎn)移載體如pAc373(Luckow etal.，Bio/Technology，6，47-55，1988)可以轉(zhuǎn)化蠶細胞。
必要時，每一上述載體可以含有制復原點、選擇標記、啟動子等，以及在用于真核細胞的載體中還含有RNA拼接位點、多聚腺苷酸化信號等。
有關(guān)復制原點，來自例如SV40、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒等的序列可用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的載體中。來自ColEI、R因子、F因子等的序列可用于轉(zhuǎn)化E.coli細胞的載體中。來自2μm DNA、ARS1等的序列可用于轉(zhuǎn)化酵母細胞的載體中。
關(guān)于基因表達的啟動子，那些來自例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、SV40等的啟動子可用于轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞的載體。來自噬菌體λ的啟動子，如trp、Ipp、Lac或tac啟動子可用于轉(zhuǎn)化E.coli細胞的載體。ADH、PHO5、GPD、PGK或MAFα啟動子可用于轉(zhuǎn)化面包酵母細胞的載體，而AOX1啟動子等可用于轉(zhuǎn)化甲醇同化酵母細胞的載體。來自核多角體病毒的啟動子可用于轉(zhuǎn)化蠶細胞的載體。
用于哺乳動物細胞載體中的選擇標記的典型例子包括新霉素(neo)抗性基因、胸苷激酶(TK)基因、二氫葉酸還原酶(DHFR)基因、E.coli黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因等。用于E.coli細胞載體中的選擇標記的說明性例子包括卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因等，用于酵母細胞的選擇標記的例子包括Leu2、Trp1、Ura3等基因。
利用將上述宿主-載體系統(tǒng)的適當結(jié)合來生產(chǎn)具有TPO活性的蛋白質(zhì)，可以通過用經(jīng)在上述載體的合適位點插入本發(fā)明基因所得的重組DNA轉(zhuǎn)化適宜的宿主細胞、培養(yǎng)所得的轉(zhuǎn)化體，然后從所得細胞或培養(yǎng)基或濾液中分離并純化所需多肽。通常所用的方式和過程都可以相結(jié)合地用于上述方法中。
當表達目的基因時，可以用來源于另一種蛋白質(zhì)的信號序列修飾或置換原始的信號序列以獲得被表達產(chǎn)物的均一性N末端。N末端均化作用可以通過修飾(替代或增加)N末端或其近鄰位置的氨基酸殘基來進行。例如在用E.coli作宿主細胞進行表達的情況下，Lys殘基可進一步補充加入met殘基。
本發(fā)明具有TPO活性的新蛋白質(zhì)(下文稱為“本發(fā)明的蛋白質(zhì)”)包括各自含有SEQ ID NO2、4或6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)。氨基酸序列被部分修飾(取代、缺失、插入或增加)的TPO衍生物也包括在本發(fā)明中，前提是TPO活性不因修飾作用而破壞。
換句話說，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括其氨基酸序列基本上是SEQ IDNO2、4或6所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子。
本文的措詞“氨基酸序列基本上是SEQ ID NO2、4或6所示(或表示)的氨基酸序列”是指所說的氨基酸序列包括SEQ ID NO2、4或6所示的那些序列，以及其中已經(jīng)部分修飾(如替代、缺失、插入或增加等)的SEQ ID NO2、4或6所示序列，對于后者這種情況前提是所說修飾作用不破壞TPO活性。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括含有SEQ ID NO6所示氨基酸序列7-151位并具有TPO活性的蛋白質(zhì)。同樣包括在本發(fā)明蛋白質(zhì)中的是具有TPO活性并含有SEQ ID NO6所示1-163位氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明其它TPO衍生物的例子包括其體內(nèi)穩(wěn)定性和持久性因氨基酸的修飾作用(替代、缺失、插入或增加)而得以改善的衍生物，其中至少一個潛在的糖基化因氨基酸的缺失或增加而得到改變的衍生物，或其中至少一個Cys殘基缺失或由其它的氨基酸殘基(如Ala或Ser殘基)替代的衍生物。
優(yōu)選的是，本發(fā)明蛋白質(zhì)的特征在于它是從用含cDNA分子、基因組DNA分子或經(jīng)化學合成法得到的DNA片段的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞中分離和純化的。
當用細菌如E.coli作宿主能有效地進行細胞內(nèi)表達時，可得到起始蛋氨酸殘基被加至具有TPO活性之蛋白質(zhì)分子的N末端一側(cè)的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)也包括在本發(fā)明中。根據(jù)所用宿主的不同，所生產(chǎn)的具TPO活性之蛋白質(zhì)能夠或不能被糖基化，這每種情況都包括在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還包括天然存在的TPO活性蛋白質(zhì)，它們從天然來源，如具有TPO活性的細胞培養(yǎng)基中或人尿、血清和血漿中純化并分離得到。
從上述天然來源中純化TPO的方法也包括在本發(fā)明中。完成這類純化方法可以采用一個或聯(lián)合應用下列通常用于蛋白質(zhì)純化的步驟，如離子交換層析、凝集素親和層析、三嗪染料親和層析、疏水作用層析、凝膠過濾層析、反相層析、肝素親和層析、硫酸化凝膠層析、羥基磷灰石層析、等電點聚焦層析、金屬螯合層析、制備性電泳、等電點聚焦凝膠電泳等。利用可從本說明書中實施例中推測出的TPO之理化特性而結(jié)合使用某些技術(shù)的純化方法也包括在本發(fā)明中。另外，還可以應用抗體親和層析，其中使用了能夠識別TPO的抗體。而且，已發(fā)現(xiàn)TPO是Mpl的配體(de Sauvage et al.，Natuce 369533-538(1994)；Bartley et al.，Cell 771117-1124(1994)；Kaushansky et al.，Nature 369565-568(1994))，籍此可以利用Mpl已與樹脂偶聯(lián)的親和凝膠柱純化TPO。更確切地說，所說柱子的例子是一個Mpl-X柱，它是通過將樹脂與Mpl的胞外區(qū)(Mpl-X)偶聯(lián)而制成，所說的MpL-X是經(jīng)用CHO細胞作宿主的重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的(Bartley，et al.(1994)出處同上)。
如本文所公開的，本發(fā)明TPO多肽更進一步的特征在于它能結(jié)合Mpl受體并能特異性地結(jié)合其胞外(可溶性)區(qū)域。
同樣包括在本發(fā)明中的是由與TPO基因的人cDNA或基因組DNA序列的蛋白質(zhì)編碼鏈互補的DNA部分編碼的蛋白質(zhì)，即Tramontano等人(Nucl.Acids.Res.，vol.12，p5049-5059，1984)公開的“互補反向蛋白質(zhì)”。
同樣包括在本發(fā)明中的是用可檢測標記如125I標記或生物素化作用標記的本發(fā)明蛋白質(zhì)，因此提供用于在固體樣品(如組織)和液體樣品(如血液、尿液等)中檢測和定量分析TPO或TPO受體表達細胞的可能的試劑用品。
本發(fā)明的生物素化蛋白質(zhì)用于其與固定化的鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合，以在同種異體骨髓移植時從骨髓中去除成巨核細胞。它還用于其與固定化的鏈霉抗生物素蛋白的結(jié)合，以在自體或同種異體骨髓移植時濃縮自體或同種異體的巨核細胞。TPO與毒素如蓖麻毒蛋白、白喉毒素等或與放射性同位素的結(jié)合物可用于抗腫瘤治療和調(diào)理骨髓移植。
本發(fā)明還提供了核酸物質(zhì)，它用于在用包括放射性或非放射性標記(如生物素)的可檢測標記標記時，或用于雜交過程以檢測人TPO基因和/或其相關(guān)基因家族在染色體圖譜上的位置。這類核酸物質(zhì)還用于在DNA水平證實人TPO基因紊亂，并能用作證實毗鄰基因及其紊亂的遺傳標記。
同樣包括在本發(fā)明中的是藥用組合物，它含有治療有效量的本發(fā)明蛋白質(zhì)和實用有效的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、輔劑和/或載體。本文所用術(shù)語“治療有效量”是指對特定的疾病和施用條件的途徑提供有效作用的量。這類組合物可以液體、凍干或干燥制劑的形式使用，它含有選自具有不同pH值和離子強度的各種緩沖液(例如Tris-HCl、乙酸鹽和磷酸鹽)的稀釋劑，防止表面吸附的添加劑如白蛋白和明膠，表面活性劑如吐溫20、吐溫80、Pluronic F68或膽酸鹽，增溶劑如甘油或聚乙二醇，抗氧化劑如抗壞血酸或焦亞硫酸氫鈉，防腐劑如乙基汞硫代水楊酸鈉、芐基醇或?qū)αu苯甲酸酯，以及載體或張力劑如半乳糖或甘露糖醇。還有被應用的化合物包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)與聚合物如聚乙二醇共價相連，蛋白質(zhì)與金屬離子螯合，蛋白質(zhì)摻入顆粒制劑，或在其表面，含有聚合物化合物如聚乳酸，聚乙醇酸或水凝膠，或者將蛋白質(zhì)摻入脂質(zhì)體、微乳液、微團、單層或多層泡囊、血影或原生質(zhì)體。這類組合物將根據(jù)TPO的物理條件、溶解性、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度和體內(nèi)清除率而起作用。可以根據(jù)所用TPO活性蛋白質(zhì)的理化特性決定對組合物的選擇。同樣包括在本發(fā)明中的是顆粒狀組合物，其中的顆粒用聚合物如poloxamer，poloxamine包被，TPO與組織特異性受體、配體或抗原的抗體或組織特異性受體的配體結(jié)合。本發(fā)明組合物的其它例子是具有保護性包膜并含有蛋白酶抑制劑或滲透增強劑的粒狀形式，用于各種途徑施藥，如胃腸外、經(jīng)肺、經(jīng)鼻腔和口服給藥。
含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的藥物組合物可以每天給藥數(shù)次，根據(jù)病人的狀況、性別、用藥途徑等通常用量為0.05μg-1mg/kg體重(TPO蛋白質(zhì))。
根據(jù)病人的癥狀、性別和用藥途徑的不同，含本發(fā)明蛋白質(zhì)的藥物組合物可以每公斤體重25,000-500,000,000活性成分的量(由下文將給出的M-07e測定法檢測的相對活性)每天施用1至數(shù)次，每周用藥1-7天。
本發(fā)明人已證實，關(guān)于人TPO的C末端位點，既使當SEQ ID NO6所示氨基酸序列缺失至第152位氨基酸殘基仍能維持其活性；對于N末端位點，當氨基酸殘基缺失至第6位時活性仍維持。
據(jù)此，具有TPO活性、含有SEQ ID NO6的7-151氨基酸序列并在其它部分被修飾(取代、缺失、插入或增加)的蛋白質(zhì)也優(yōu)選用作本發(fā)明的有效成分。更優(yōu)選的TPO衍生物具有SEQ ID NO6的1-163氨基酸序列。
同樣包括在本發(fā)明中的組合物除了含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)外，還含有至少一種其它的造血因子，如EPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、LIF和SCF。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)單獨或與其它造血因子聯(lián)合用于治療各種血小板減少性疾病。其它造血因子的例子包括EPO、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、LIF和SCF。
用本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以治療許多以因血小板的生成受損或血小板生存期縮短(血小板的破壞堆積所致)所引起的血小板紊亂(如血小板減少癥)為特征的疾病。例如，它可以用于先天性Fanconi貧血或在骨髓移植后因化療、放療、骨髓發(fā)育不良綜合征、急性髓細胞性白血病、再生障礙性危象所致的再生障礙性貧血的血小板減少癥患者，以促進血小板的恢復。它還可以用于治療因TPO的生成或減少所致的血小板減少癥。血小板或巨核細胞生存期縮短所致的血小板減少癥包括特發(fā)性血小板減少性紫癜、再生不良性貧血、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)、彌散性血管內(nèi)凝血綜合征和血栓性血小板減少癥。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)還用于血小板的自體再注入，其中將TPO在患者進行外科手術(shù)前施用，以增加患者自身的血小板數(shù)，并且因此而增加的血小板在手術(shù)時用作輸注的血小板。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的其它用途是治療因化學或藥學藥物或治療方法所致的血小板暫時缺失或損害引起的疾病。TPO能夠用于促進這類患者體內(nèi)新的“完整”血小板的釋放。
本發(fā)明進一步涉及對TPO有特異性的抗體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用作抗原，相應的抗體包括用常規(guī)方法制備的單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體，即“重組抗體”。為制備這類抗TPO的抗體，人TPO本身可用作抗原，或者可選擇地，人TPO的部分肽可用作抗原。當應用針對這類肽抗原的抗體時，就可用特定的抗原區(qū)定義表位。另一方面，當應用針對抗原蛋白質(zhì)(TPO)本身的抗體時，可以通過分析抗體的表位來明確抗原區(qū)。在這種情況下，這些分別具有如此明確之表位的抗體能夠用于分級分離、檢測、定量分析和純化各種其特性(如所加糖鏈的種類、肽鏈的長度等)不同的TPO。
可以合成含有經(jīng)上述選擇的氨基酸序列之TPO肽，并將之與適宜的載體蛋白，如白蛋白、KLH(鎖孔血蘭蛋白)等通過共價鍵相連，以制備免疫反應性抗原。另外，根據(jù)Tam的方法生產(chǎn)多抗原肽(MAP)型肽作為抗原(Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.855409-5413，1988)。然后，用所制備的抗原和佐劑等免疫哺乳動物、鳥類等，這通常被用來使之產(chǎn)生抗體，如兔、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、雞、倉鼠、馬、豚鼠等。從所免疫的動物回收抗血清和細胞，由此獲得多克隆抗體。當肽用作抗原時，用特定的抗原區(qū)定義表位。在這種情況下，用免疫學工程篩選并鑒定具有不同分子量的各種TPO的抗原區(qū)。例如，可以篩選和鑒定肽缺失區(qū)。另外，從表達所需抗體的細胞克隆抗體基因或其部分，以得到用遺傳工程方法表達的抗體分子。
與通常含有對多種抗原決定簇(表位)有特異性的多種抗體的多克隆抗體相比，單克隆抗體只對抗原上的單一抗原決定簇有特異性。TPO特異性的抗體用于改善抗原-抗體反應輔助性診斷和分析性測定方法的選擇性和穩(wěn)定性，并用于TPO的分離和純化。另外，這類抗體可用于中和或從血清中除去TPO。單克隆抗體也用于檢測和定量分析例如血清或全血中的TPO。
本發(fā)明的抗人TPO抗體可用作純化和分離人TPO的親和層析中的配體。為固定抗體以使之用于親和層析，固定各種酶的任何常規(guī)方法都可以使用。例如，可以使用利用了CNBr活化的Sepharose 4B的載體(Pharmacia Fine Chemicals Co.)等的方法。為了利用固定的抗人TPO抗體實際地純化人TPO，將被固定的抗人TPO抗體填充至柱中，并用含人TPO的液體過柱。經(jīng)此操作過程，大量的人TPO吸附至柱中的載體表面。至于進行洗脫的溶劑，例如可用的是Gly-HCl緩沖液(pH2.5)，NaCl溶液、丙酸、二噁烷、1，2-乙二醇、離液序列高的鹽、鹽酸胍、脲素等。用上述溶劑進行洗脫，可以洗脫出具有高純度的人TPO。
本發(fā)明的抗體可以通過免疫化學定量分析測定用于檢測人TPO，尤其是通過固相夾心法進行的酶聯(lián)免疫測定。
單克隆抗體的優(yōu)點在于它們可以由培養(yǎng)基中不含任何其它免疫球蛋白分子的雜交瘤細胞產(chǎn)生。單克隆抗體可由雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上清液或由經(jīng)腹膜內(nèi)注射雜交瘤所誘發(fā)的小鼠腹水中制備。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol.6511-519，1976)公開的雜交瘤技術(shù)已廣泛地用于形成雜交瘤細胞，后者具有針對特異性抗原的高水平單克隆抗體。
為了從所得的含抗體的物質(zhì)中分離所需的抗體，可以采用一步或聯(lián)合使用多步通常用于純化蛋白質(zhì)的步驟(親和層析如蛋白質(zhì)A親和層析、蛋白質(zhì)G親和層析，Avid凝膠層析，抗免疫球蛋白固定的凝膠層析等，以及陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝集素親和層析、染料吸附層析、疏水作用層析、凝膠滲透層析、反相層析、羥基磷灰石層析、氟代磷灰石層析、金屬螯合層析、等電點層析等)。除此之外，還可以使用抗原親和純化法，其中，制備與含有抗原區(qū)或其部分或即能識別所需抗體的分子的人TPO蛋白本身或肽經(jīng)化學相連的凝膠載體或膜，向其上加入含抗體的物質(zhì)，以使制備的所需抗體吸附至載體或膜表面，然后在適宜條件下洗脫并回收所吸附的抗體。
本發(fā)明還允許使用編碼TPO多肽的內(nèi)源性DNA序列大量地生產(chǎn)多肽產(chǎn)物。例如，利用體外和體內(nèi)的同源性重組過程轉(zhuǎn)化宿主細胞，以提供多肽的表達或增強表達。優(yōu)選的宿主細胞包括其中插入了啟動子或增強子序列的人細胞(如肝、骨髓細胞等)，插入時使用了與細胞基因組的靶區(qū)同源的側(cè)翼序列，籍此完成或增強TPO多肽的表達(參見如U.S.Letters Patent 5,272,071，PCT WO 90/14092，WO91/06666和WO 91/09955)。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)上述TPO多肽的方法，包括在適宜宿主中表達本發(fā)明DNA編碼的多肽，分離所說的TPO多肽。當被表達的TPO多肽為Met-2-Lys-1多肽時，這類方法進一步包括從所說分離的TPO多肽中裂解Met-2-Lys-1的步驟。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)具[Gly-1]結(jié)構(gòu)之TPO多肽的方法，包括將編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)多肽的DNA5′與TPO多肽編碼序列的連接物導入適宜的宿主細胞，其中的GST和TPO多肽由編碼凝血酶識別多肽的DNA分隔開，分離GST-TPO表達產(chǎn)物，用凝血酶處理被表達的多肽以除去GST氨基酸，所得TPO多肽具有[Gly-1]結(jié)構(gòu)。
下面將詳細地描述本發(fā)明。(A)純化大鼠TPO、分析純化的大鼠TPO之部分氨基酸序列并分析純化的大鼠TPO之生物學特征本發(fā)明的發(fā)明人最先嘗試純化具有促進大鼠CFU-MK增生和分化之活性的大鼠TPO蛋白質(zhì)。在該純化研究中，對純化過程如各種天然供給來源的選擇及用于層析的凝膠和分離模式的選擇進行了大量的試驗性和失敗性嘗試。最終，本發(fā)明人成功地從經(jīng)X射線或γ射線照射誘導的血小板減少癥大鼠血漿中純化出具有TPO活性的蛋白質(zhì)，基于下文參考實施例和測定被純化蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列的實施例1和2中描述的大鼠CFU-MK測定法，將利用TPO活性作為標記。
血漿來源的大鼠TPO之生物學特征也在實施例3中檢測。
下面列出從純化大鼠TPO到測定純化蛋白質(zhì)之部分氨基酸序列過程的要點。
(i)從大約1,100只經(jīng)X射線或γ射線照射誘導的血小板減少癥大鼠制備血漿樣品，并依次進行Sephadex G-25層析、陰離子交換層析(Q-Sepharose FF)和凝集素層析(WGA-Agarose)，從而得到WGA-Agarose吸附的TPO活性級分。
(ii)接下來，將如此所得的WGA-Agarose吸附的活性級分再依次進行三嗪染料親和層析(TSK AF-BLUE 650MH)、疏水作用層析(Phenyl Sepharose 6FF/LS)和凝膠過濾層析(Sephacryl S-200HR)。因這通過Sephacryl S-200HR凝膠過濾TPO活性被分成4個峰(F1為最高分子量級分，隨后為F2、F3和F4)，所以分別濃縮TPO活性級分F2和F3，得到分別用于后續(xù)純化步驟中的高分子量TPO樣品F2和低分子量TPO樣品F3。
(iii)將低分子量TPO樣品F3依次進行制備性反相層析(YMC-Pack PROTEIN-RP)、反相層析(YMC-Pack(N-AP)和另一個反相層析(Capcell Pack C1)。當如此所得的TPO活性級分被用于十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并從凝膠中提取TPO活性物質(zhì)后，在非還原條件下從相當于表觀分子量為約17,000-19,000的條帶中證實存在TPO活性。
(iv)接著，所有的TPO活性級分在非還原條件下進行SDS-PAGE，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。PVDF膜上的蛋白質(zhì)經(jīng)完全性限制性酶水解成為肽片段，然后測定大鼠TPO蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列。根據(jù)二個肽片段的氨基酸序列信息克隆大鼠TPO基因。
(v)至此，將經(jīng)Sephacryl S-200HR獲得的高分子量TPO樣品F2以與低分子量TPO樣品F3同樣的方式純化。當經(jīng)最后一步反相層析(Capcell Pack C1)獲得的TPO活性級分應用于SDS-PAGE，并從凝膠中提取TPO活性物質(zhì)時，在非還原條件下從相當于表觀分子量為約17,000-22,000的條帶中證實存在TPO活性。(B)特征化大鼠產(chǎn)生TPO的細胞、制備mRNA和構(gòu)建大鼠cDNA文庫因為上述純化的大鼠TPO來源于血漿，所以有必要篩選作為用于cDNA克隆的mRNA來源的器官或細胞。因此，根據(jù)大鼠血漿來源TPO的生化和生物學特性篩選各種器官和細胞培養(yǎng)物上清液中的TPO活性。結(jié)果，在大鼠肝細胞來源的細胞系McA-RH8994、HTC和H4-11-E的培養(yǎng)物上清液以及大鼠原代肝細胞的培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了幾乎與大鼠血漿來源的TPO相等的TPO活性(實施例4)。
另一方面，從表達載體pME18S和pEFBOS構(gòu)建表達載體pEF18S(實施例5)。該載體的構(gòu)建可以提供可能易于利用高效表達載體克隆cDNA，所說的高效表達載體具有能夠用于整合插入段的多克隆位點。
除上述表達載體外，主要還用以質(zhì)粒載體和λ基礎(chǔ)的噬菌體載體的pUC和pBR構(gòu)建cDNA文庫。
培養(yǎng)McA-RH8994細胞，通過加入硫氰酸胍溶液均質(zhì)化，然后進行CsCl密度梯度離心，得到總RNA(實施例6)。
也可以用熱酚法，一種酸胍鹽酚氯仿法等制備RNA。
在用寡脫氧胸苷酸固定的膠乳顆粒從總RNA中純化poly(A)+RNA后，用寡脫氧胸苷酸作引物，加入限制性酶NotI識別序列，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶的作用合成第一條cDNA鏈，再用RNase H和E.coli DNA聚合酶I合成第二條cDNA鏈。向所得的雙鏈cDNA中加入EcoRI連接物，所得的cDNA與實施例5中所構(gòu)建的哺乳動物細胞表達載體pEF18S(已用NotI和EcoRI消化)連接，然后將所連接的cDNA轉(zhuǎn)化E.coli DH5菌株的感受態(tài)細胞以構(gòu)建cDNA文庫(實施例7)。(C)用PCR制備(克隆)大鼠TPO cDNA片段從經(jīng)大鼠血漿純化的大鼠TPO的部分氨基酸序列推測DNA序列，合成用于聚合酶鏈反應(PCR)的簡并引物。所用引物也可以根據(jù)該處所用引物之位置以外的氨基酸序列獲得。還可以使用未用肌苷的高度簡并引物。另外，可以利用在大鼠中很常用的密碼子設(shè)計降低了簡并性的引物(Wada et al.，Nucleic Acids Res.，vol 18，p2367-2411，1990)。
當從上文所制備的cDNA文庫的完整部分提取質(zhì)粒DNA并用提取的DNA作為模板進行PCR時，檢測到大約330bp的條帶，這在隨后的氨基酸序列分析中測定為編碼大鼠TPO部分的DNA片段(A1片段)(實施例8)。
(D)用PCR篩選大鼠TPO cDNA、大鼠TPO cDNA的序列和證明TPO活性上述制備的cDNA文庫被分成小庫，各含大約10,000克隆，從每100個小庫中提取質(zhì)粒DNA。當用每一質(zhì)粒DNA庫作為模板并用根據(jù)A1片段的核苷酸序列新合成的引物進行PCR時，在3個小庫中檢測到被認為具特異性的條帶。3個小庫的其中之一又被分成亞庫，分別含大約900個克隆，從100個亞庫中純化質(zhì)粒DNA，并以相同的方式進行PCR。結(jié)果，在3個亞庫中檢測到特異性條帶。這些庫的其中之一又被分成亞庫，各含40個克隆，最終以相同方式經(jīng)PCR篩選每一克隆。結(jié)果，分離到看似編碼大鼠TPO cDNA的克隆pEF18S-A2α
(實施例9和10)。
當分析該克隆的核苷酸序列時，結(jié)果表明該克隆編碼由大鼠血漿純化的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列，因此證實了該克隆極可能含有大鼠TPO cDNA(實施例10)。
當由上述所得的克隆pEF18S-A2α純化質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染COS1細胞時，在被轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性。結(jié)果，證實了克隆pEF18S-A2α含有編碼大鼠TPO的cDNA(實施例11)。(E)在各種大鼠組織中檢測TPO mRNA用PCR分析大鼠組織中TPO mRNA的表達，并檢測了大鼠腦、肝、小腸和腎中的特異性表達(實施例12)。(F)構(gòu)建人cDNA文庫基于實施例4和12的結(jié)果，肝臟被選作進行人TPO cDNA克隆的起始組織。因此，用來源于正常人肝臟的市售mRNA構(gòu)建cDNA文庫。如大鼠文庫的情況一樣，以同樣的方法用pEF-18S作載體合成cDNA，利用限制性酶NotI和EcoRI獲得直接克隆的cDNA文庫。通過將載體連接的cDNA導入E.coli DH5所制備的文庫含有大約1,200,000個克隆(實施例13)。(G)用PCR制備(克隆)人TPO cDNA片段根據(jù)編碼大鼠TPO cDNA的克隆pEF18S-A2α之核苷酸序列合成數(shù)種用于PCR的引物。當用來源于正常人肝臟的市售mRNA合成cDNA，并使用上述引物和用cDNA作模板進行PCR時，觀察到大約620bp的條帶。分析其核苷酸序列時證明，該克隆含有與大鼠TPO cDNA具約86％同源性的DNA片段，因此證明這極可能是編碼人TPO的基因部分(實例14)。
(H)用PCR篩選人TPO cDNA、人TPO cDNA的序列和證實TPO活性擴增上述制備的人cDNA文庫，將其分成小庫，各含大約100,000個克隆，從90個小庫中的每一小庫提取質(zhì)粒DNA。當用每個庫的質(zhì)粒分子作模板并應用根據(jù)實施例14所得的人TPO片段之核苷酸序列新合成的引物進行PCR時，在3個小庫中檢測到可能的條帶。這些小庫之一被分成亞庫，各含5,000克隆，從90個亞庫的每一亞庫中純化質(zhì)粒DNA。在以相同方式用每一庫質(zhì)粒DNA作模板進行PCR時，在5個亞庫中檢測到可能的條帶。當這些庫之一被再分成亞庫，各含250個克隆時，從90個亞庫的每一亞庫中純化質(zhì)粒DNA并進行PCR，在3個亞庫中檢測到可能的條帶。而且，從這些亞庫之一分離90個集落，由每一集落純化的質(zhì)粒DNA進行PCR，最終得到名為HL34的克隆(實施例15)。
在分析該克隆中的質(zhì)粒DNA之核苷酸序列時，結(jié)果證明該克隆含有與大鼠TPO cDNA核苷酸序列有大約84％同源性的cDNA(實施例16)。
當純化該克隆的質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染COS1細胞時，在被轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性。結(jié)果，證實了該質(zhì)?？寺『芯幋a人TPO的cDNA(實施例17)。
然而，該cDNA似乎是克隆過程的人工產(chǎn)物，因為在該克隆中未發(fā)現(xiàn)終止密碼子，在其3′末端有poly A尾樣序列。因此，構(gòu)建編碼不含相應于poly A尾樣序列之氨基酸序列的表達載體。當如此構(gòu)建的載體在COS1細胞中表達時，在所得的培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性(實施例18)。
用PCR獲得人TPO 3′末端區(qū)的DNA片段，以便分析全長cDNA的結(jié)構(gòu)。
測定該片段的核苷酸序列表明，它與實施例15所得的克隆HL34攜帶的cDNA部分重疊。還預料全長人TPO cDNA可含有其開放閱讀框架，并編碼353個氨基酸的蛋白質(zhì)。因此，這表明人TPO含有包括21個氨基酸信號序列的353個氨基酸序列(實施例19)。
除了上述克隆方法外，還可以利用以pUC或pBR為基礎(chǔ)的質(zhì)粒載體、以λ噬菌體為基礎(chǔ)的載體等，用大鼠TPO cDNA片段作探針經(jīng)集落雜交或噬菌斑雜交獲得人TPO cDNA的克隆。在設(shè)計簡并探針時，肌苷可用來降低簡異性的程度。當可以有效使用一種以特定方式或高靈敏度檢測TPO活性的測定方法時，則有可能利用如本發(fā)明所用的表達文庫來表達克隆。
然而，因為如下文實施例15所述，正常人肝臟中人TPO編碼RNA的含量似乎非常低(從該實施例15的結(jié)果計算的含量是1∶3×106)，所以，用合成的寡核苷酸或大鼠或人TPO cDNA片段作探針進行雜交篩選很難奏效，因為待處理的集落或噬菌斑數(shù)變得非常龐大，而雜交法的靈敏度和特異性又不及PCR法。事實上，本發(fā)明人已用大鼠TPO cDNA片段作探針對在實施例13所制備的正常人肝臟之cDNA文庫中的2×106克隆進行了雜交，但未能得到人TPO cDNA克隆。(I)重建正常人肝臟來源的cDNA因為實施例15所得的克隆HL34可能含有不完整的cDNA，所以用市售的正常人肝臟來源的poly(A)+RNA制劑重新構(gòu)建cDNA文庫，以獲得完整的人TPO cDNA，通過將載體連接的cDNA導入E.coli DH5中而制備的文庫(hTPO-F1)含有1.0×106轉(zhuǎn)化子(實施例20)。(J)篩選TPO cDNA克隆、測序和表達人TPO cDNA及證實TPO活性根據(jù)實施例14中所得的部分cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO3)和實施例19中預測的人TPO完整cDNA的核苷酸序列(SEQ IDNO196)合成用于PCR的引物。
實施例20中構(gòu)建的人肝臟cDNA文庫(hTPO-F1)被分成3個小庫(庫號1-3#)。用由各小庫制備的質(zhì)粒DNA作為模板并用合成的引物進行PCR。結(jié)果，當使用由3#小庫制備的質(zhì)粒DNA時，擴增了具有預期大小的DNA片段。然后將3#小庫分成亞庫，分別含15,000轉(zhuǎn)化體，如上所述利用PCR進行篩選。結(jié)果，在90個小庫的6個中發(fā)現(xiàn)有具預期大小DNA的擴增。當這些陽性小庫被分成亞庫，分別含1,000個克隆，以相同的方式提取質(zhì)粒DNA并進行PCR時，未觀察到DNA擴增?？紤]這是由于目的克隆的生長較其它克隆更弱而引起的質(zhì)粒DNA回收率低所致。因此，將原始的3#小庫以每個LB平板上生長4,100個集落的接種體積涂布于100個LB平板中，由每一個如些接種的平板制備影印平板。當以上述相同方式用從平板上生長的集落中提取的DNA進行PCR時，在100個亞庫之一中觀察到了所預期條帶的擴增。
由該亞庫的平板制備二復制濾膜，用標記的探針(質(zhì)粒pEF18S-HL34的EcoRI/BamHI片段)完成集落雜交。結(jié)果，觀察到被認為是陽性的單信號，從原始平板中收集集落，并再次接種到LB平板上。從生長于平板上的總共50個集落中制備DNA樣品，并進行PCR，最終得到名為pHTF1的克隆(實施例21)。在篩選cDNA克隆時，主要利用的方法如雜交、PCR和表達克隆及聯(lián)合使用這些方法，以提高篩選的效力和靈敏度，或降低勞動強度。當測定如此獲得的克隆pHTF1的核苷酸序列時，結(jié)果表明克隆pHTF1具有開放閱讀框架，而且被認為由開放閱讀框架編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與所推測的人TPO之氨基酸序列(SEQ ID NO6)完全一致。該核苷酸序列在3個位置上與被推測的一種序列(SEQ ID NO196)不同，但這些差別未引起氨基酸改變。已證實人TPO蛋白質(zhì)含有具21個氨基酸信號序列的353個氨基酸殘基。當由如此獲得的克隆pHTF1制備質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染人COS1細胞時，在培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性(實施例23)。(K)利用噬菌斑雜交篩選人TPO染色體DNA、測序和表達人TPO染色體DNA，證實TPO活性由T.Yamamoto(the Gene Research Center，TohokuUniversity)惠贈的基因組文庫以每個平板含30,000噬菌體顆粒的接種量接種至18個NZYM平板上，從所制的18個平板中的每一個制備二個影印濾膜。用PCR擴增人TPO cDNA片段(SEQ ID NO7中的堿基位數(shù)178-1,025)，并純化之。利用以32P標記的純化片段為探針進行噬菌斑雜交。結(jié)果獲得13個陽性信號。從原始平板中收集噬菌斑，并以每個平板形成1,000個噬菌斑的接種量再次接種至NZYM平板上。從每個所得平板制備二個影印濾膜，在上述相同條件下進行噬菌斑雜交。結(jié)果，在13個組的所有濾膜上都檢測到陽性信號。從每個所得的平板回收單個噬菌斑以制備噬菌體DNA。用PCR核查由13個克隆制備的噬菌體DNA樣品中是否存在cDNA編碼區(qū)。5/13的克隆似乎含有由cDNA預測的完整氨基酸編碼區(qū)。因此，選擇這些克隆之一(克隆λHGT1)，并用Southern印跡(使用上述探針)分析。因為在HindIII消化的情況下觀察到大約1Okb的單一條帶，所以用HindIII消化克隆λHGT1，并進行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠中切除并純化10kb帶，亞克隆入克隆載體pUC13，最終得到名為pHGT1的克隆(實施例24)。
當測定如此獲得的克隆pHGT1的核苷酸序列時，發(fā)現(xiàn)該克隆攜帶的染色體DNA含有實施例19預示的蛋白質(zhì)之完整編碼區(qū)，該編碼區(qū)的核苷酸序列與所預示的核苷酸序列(SEQ ID NO196)完全相符。
另外，對應于編碼氨基酸的外顯子的區(qū)域有4個內(nèi)含子，該核苷酸序列不同于實施例21所得克隆pHTF1攜帶的完整cDNA的序列(SEQ ID NO7)。
當測定通過篩選而分別選擇的5個染色體DNA克隆中的剩余4個克隆的核苷酸序列時，發(fā)現(xiàn)4個克隆中有2個與克隆pHGT1一致，另外2個克隆除了如用克隆pHTF1觀察到的在3′非編碼區(qū)內(nèi)具有不同的核苷酸外也與克隆pHGT1相同(實施例25)。
將如此獲得的質(zhì)?？寺HGT1中的EcoRI片段與表達載體pEF18S相連，得到人TPO表達質(zhì)粒pEFHGTE。當制備質(zhì)粒DNA(pEFHGTE)并轉(zhuǎn)染入COS1細胞時，在培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性(實施例26)。(L)制備人TPO的缺失衍生物，該衍生物在COS1細胞中的表達和證實TPO活性實施例18和22的結(jié)果表明，人TPO蛋白質(zhì)即使在去掉其C末端的3個氨基酸之后仍能表現(xiàn)其生物活性。因此，為了進一步分析具有生物活性的部分而進行了缺失衍生物實驗。利用實施例18所得的質(zhì)?？寺HT1-231的DNA作模板和用合成的寡核苷酸作引物經(jīng)PCR制備一系列的表達質(zhì)粒。
所得的表達質(zhì)粒含有編碼人TPO缺失衍生物的DNA，該DNA缺乏TPO蛋白質(zhì)的C末端區(qū)，即缺失衍生物編碼1-211、1-191、1-171和1-163位的氨基酸序列。當從各個克隆制備質(zhì)粒DNA并轉(zhuǎn)染至COS1細胞中時，在每一培養(yǎng)物上清液中檢測到TPO活性(實施例27)。
設(shè)計一系列缺失C末端氨基酸殘基至151位的衍生物和分別缺失N末端側(cè)氨基酸殘基達6、7和12位的其它衍生物，在其于COS1細胞中表達后檢測活性，以進一步詳細分析具有TPO活性的區(qū)域，當N末端側(cè)的氨基酸缺失至第7位或C末端側(cè)的氨基酸殘基缺失至151位時，檢測不到TPO活性(實施例28和29)。
通過修飾(缺失、替代、插入或增加)編碼蛋白質(zhì)的cDNA可以得到具有TPO生物活性之蛋白質(zhì)的衍生物。用于進行修飾作用的方法如PCR、定位誘變和化學合成法。(M)在CHO細胞中表達人TPO cDNA和純化TPO構(gòu)建表達載體pHTP1，它能在動物細胞中表達編碼如SEQ ID NO6所示之人TPO推測氨基酸序列的DNA(實施例30)。
pHTP1中的TPO cDNA區(qū)被用于構(gòu)建在CHO細胞中進行表達的載體pDEF202-hTPO-P1(實施例31)。
在用上述載體轉(zhuǎn)染CHO細胞繼而選擇轉(zhuǎn)染細胞之后，得到其中攜帶人TPO cDNA的表達載體已整合到CHO細胞染色體中的轉(zhuǎn)染細胞(實施例32)。
在實施例32中，大規(guī)模地培養(yǎng)了生產(chǎn)人TPO的CHO細胞系(CHO28-30細胞，抗25nM MTX)，該細胞系是通過人TPO表達質(zhì)粒pDEF202-hTPO-P1轉(zhuǎn)染CHO細胞制備的(實施例55)。
從100升培養(yǎng)物上清液中純化人TPO(實施例56)。
可以選擇不同的方式從實施例55的培養(yǎng)物上清液中純化人TPO(實施例57)。(N)在X63.6.5.3.細胞中表達人TPO cDNA并證實活性利用實施例30所制備的質(zhì)粒pBLTEN中所編碼的TPO cDNA區(qū)構(gòu)建用于X63.6.5.3.細胞中的表達載體BMCGSneo-hTPO-P1(實施例33)。
當用上述載體轉(zhuǎn)化X63.6.5.3.細胞時，所得的轉(zhuǎn)化體細胞中編碼人cDNA的表達載體已整合到其染色體中。培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細胞，在培養(yǎng)物上清液中檢測到TPO活性(實施例34)。(O)在COS1細胞中大量表達人TPO、純化TPO、測定分子量和描述其生物學特征將實施例30中制備的表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染到COS1細胞中，得到大量(總共約40升)含表達產(chǎn)物的培養(yǎng)物上清液(實施例35)。
從7升實施例35所制備的含表達載體pHTP1來源的TPO之COS1細胞無血清培養(yǎng)物上清液中純化TPO。借助疏水作用層析、陽離子交換柱層析、WGA柱層析和反相柱層析步驟能夠得到高活性的TPO(實施例36)。
將由COS1細胞培養(yǎng)物上清液中如此部分純化的TPO進行分子量檢測和生物學特征分析(實施例37和38)。(P)在E.coli中表達人TPO構(gòu)建用于在E.coli中表達谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶和人TPO(1-174位氨基酸殘基)之融合蛋白質(zhì)(稱為“GST-TPO(1-174)”)的載體pGEX-2T/hT(1-174)。在這種情況下，用E.coli的優(yōu)選密碼子交換人TPO cDNA核苷酸部分(大約5′側(cè)的一半?yún)^(qū)域)(實施例39)。
GST-TPO(1-174)在E.coli中表達，裂解所得的細胞，然后溶解沉淀部分所含的GST-TPO(1-174)。接下來，結(jié)合應用檢查TPO重折疊條件、純化條件(谷胱苷肽親和層析、陽離子交換柱等)和用凝血酶消化GST蛋白質(zhì)部分的各種步驟后，能夠?qū)兴O(shè)計的TPO氨基酸序列的蛋白質(zhì)進行部分純化。在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中已證實該蛋白質(zhì)表現(xiàn)出TPO活性(實施例40和41)。
同樣，構(gòu)建在E.coli中表達突變型人TPO蛋白質(zhì)的載體pCFM536/h6T(1-163)，所說的突變蛋白質(zhì)(稱為“h6T(1-163)”)中，1位的Ser和3位的Ala分別由Ala和Val取代，同時在-1位和-2位分別增加一個Lys和一個Met。上述載體攜帶的人TPO cDNA核苷酸序列的整個部分(相當于1-163氨基酸殘基)與E.coli的優(yōu)選密碼子交換(實施例42)。
h6T(1-163)在E.coli中表達，裂解所得的細胞，然后溶解沉淀部分所含的h6T(1-163)，并檢查該蛋白質(zhì)的重折疊條件。籍此成功地部分純化了含有所設(shè)計的TPO氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中已證實了該蛋白質(zhì)的TPO活性(實施例43和44)。
另外，構(gòu)建了用于在E.coli中表達突變型人TPO蛋白質(zhì)的載體pCFM536/hMKT(1-163)，所說的突變型蛋白質(zhì)(稱為“hMKT(1-163)”)中，在-1和-2位分別增加了Lys和Met。hMKT(1-163)在E.coli中以實施例43所述的相同方式表達，并且將表達蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后進行N末端氨基酸序列分析，繼而證實該蛋白質(zhì)含有所設(shè)計的氨基酸序列(實施例52)。
另外，構(gòu)建用于在E.coli中表達突變型人TPO蛋白質(zhì)的載體pCFM536/hMKT(1-332)，所說的突變型蛋白質(zhì)(稱為“hMKT(1-332)”)中，分別在人TPO(1-332位氨基酸)的-1位增加Lys和在-2位增加Met。hMKT(1-332)在E.coli中以與實施例42中相同的方式表達，并且利用下文給出的實施例45中所制備的抗人TPO肽抗體經(jīng)Western印跡證實了上述表達結(jié)果(實施例66)。(Q)制備抗TPO肽抗體和抗TPO肽抗體柱利用合成肽(相當于實施例10中所測定的大鼠TPO氨基酸序列的三個部分區(qū)域)制備兔多克隆抗TPO肽抗體。已證實這些抗體能夠識別大鼠和人TPO分子。而且，合成相當于SEQ ID NO6(或SEQID NO7)所示人TPO氨基酸序列的6部分區(qū)域的肽，然后用于制備兔多克隆抗TPO肽抗體。已證實所得抗體能識別人TPO(實施例45)。
有可能利用以某些對TPO有結(jié)合親和力的分子(如抗TPO抗體、TPO受體等)填充的柱子經(jīng)親和柱層析來純化TPO。因此，通過結(jié)合實施例45所得的抗TPO肽抗體首先制備抗TPO抗體柱(實施例46)。(R)利用抗TPO肽抗體柱純化COS1細胞中表達的人TPO、測定分子量和描述其生物學特征利用以表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染的COS1細胞之培養(yǎng)物上清液作為起始物得到部分純化的TPO，然后用于抗TPO抗體柱。因為在被吸附級分中發(fā)現(xiàn)了TPO活性，因此該級分被進一步進行反相柱層析，以純化該蛋白質(zhì)并檢測其分子量和生物學特征(實施例47)。(S)證實COS1細胞所表達的人TPO之部分純化樣品的生物活性檢查實施例36中所純化的TPO活性級分的生物活性，以確定它是否在活體內(nèi)起增加血小板數(shù)的功能(實施例48)，所說的活性級分即由以表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染的COS1細胞之培養(yǎng)物上清液純化至Capcell Pak C1 300A柱步驟的TPO樣品。
同樣，檢查由攜帶表達載體pHTP1的轉(zhuǎn)染COS1細胞所制備的33升培養(yǎng)物上清液經(jīng)陽離子交換柱得到之粗制TPO級分的生物活性，以證實它能在體內(nèi)升高血小板數(shù)(實施例49)。(T)在CHO細胞中表達人TPO染色體DNA并證實其活性構(gòu)建用于在CHO細胞中表達人TPO染色體的載體pDEF202-ghTPO(實施例50)。
在該載體導入CHO細胞時，得到其中人TPO染色體的DNA編碼表達載體已整合到其染色體中的轉(zhuǎn)化細胞。當培養(yǎng)該細胞克隆時，在培養(yǎng)物上清液中檢測到TPO活性(實施例51)。(U)部分純化在E.coli中表達的突變型人TPO并證實其活性利用鹽酸胍和谷胱甘肽對來源于編碼人TPO核苷酸序列之克隆pCFM536/h6T(1-163)并在E.coli中表達的突變型人TPO進行再折疊，以確定如此所得的h6T(1-163)在活體內(nèi)起升高血小板數(shù)的作用(實施例53)。
利用N-十二烷酰肌氨酸鈉和硫酸銅對來源于編碼人TPO核苷酸序列之克隆pCFM536/h6T(1-163)并在E.coli中表達的突變型人TPO進行再折疊，然后進行陽離子交換層析，以確定如此所得的h6T(1-163)在活體內(nèi)升高血小板數(shù)(實施例54)。
另外，還可用其它的方法對突變型人TPO h6T(1-163)進行再折疊和純化(實施例60和61)。(V)在昆蟲細胞中表達人TPO cDNA并鑒定TPO活性制備用于在昆蟲細胞中表達人TPO的重組病毒(實施例58)，并在昆蟲細胞Sf21中表達，繼而在培養(yǎng)物上清液中鑒定TPO活性(實施例59)。(W)在CHO細胞中表達人TPO(1-163位氨基酸)并純化該TPO構(gòu)建在CHO細胞中表達人TPO蛋白質(zhì)的表達載體pDEF202-hTPO163，所說的蛋白質(zhì)(稱為“hTPO163”)具有SEQ ID NO7所示人TPO氨基酸序列的1-163位氨基酸。將表達載體轉(zhuǎn)染CHO細胞，并大規(guī)模地培養(yǎng)如此所得的生產(chǎn)hTPO163的CHO細胞系。從培養(yǎng)物上清液中純化hTPO163(實施例62-65)。(X)制備人TPO的替代衍生物制備人TPO中的Arg-25和Glu-231分別被Asn和Lys替代的衍生物(稱為“N3/TPO”)以及His-33被Thr替代的衍生物(稱為“09/TPO”)。
編碼每種衍生物的質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染到COS7細胞中，然后進行培養(yǎng)。在培養(yǎng)物上清液中檢測到TPO活性(實施例67)。
通過利用E.coli表達系統(tǒng)制備h6T(1-163)中的一個氨基酸被其它的氨基酸替代的衍生物。在每種衍生物中都發(fā)現(xiàn)了TPO活性(實施例94)。(Y)制備人TPO的插入或缺失衍生物插入一個氨基酸至hTPO163或從中缺失一個氨基酸以制備其插入或缺失衍生物，然后用編碼所得衍生物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細胞，在COS7細胞培養(yǎng)物上清液中檢測到TPO活性(實施例68)。
本發(fā)明用于檢測TPO活性的方法(體外測定系統(tǒng))在下文以“參考實施例”描述。(2)制備和純化抗人TPO抗體利用人TPO肽片段制備多克隆抗體(實施例69)，繼而用于Western印跡分析(實施例70)和構(gòu)建抗TPO抗體親和柱(實施例71)。(AA)人TPO的體內(nèi)活性將純化的人TPO施用于誘發(fā)了血小板減少癥的小鼠，相對于對照組監(jiān)測血小板數(shù)的改變(實施例72-79)。還描述了藥物組合物在治療血小板減少癥中的有效應用(實施例80-89)。(BB)TPO活性與MLP受體結(jié)合的關(guān)系所提供的測定方法中，TPO活性根據(jù)其與Mpl受體的特異性結(jié)合作用來定義(實施例93)。
參考實施例A.大鼠巨核細胞祖細胞測定(大鼠CFU-MK測定)系統(tǒng)(液體培養(yǎng)系統(tǒng))巨核細胞通過主動的能量依賴過程向胞漿密度顆粒中摻入并貯存5-羥色胺(Fedorko，Lab.Invest.，vol.36，p310-320，1977)。這一現(xiàn)象已在較小的單核乙酰膽堿酯酶陽性細胞中觀察到，所說細胞據(jù)認為定位于CFU-MK和可識別的巨核細胞之間(Bricker andZuckerman，Exp.Hematol.，vol.12，p672，1984)。所摻入的5-羥色胺量隨著巨核細胞體積的增大而增多(Schick and Weinstein，J，Lab.Clin.Med.，vol.98，p607-615，1981)。另外，已知上述現(xiàn)象只特異地出現(xiàn)于骨髓細胞中的巨核細胞中(Schick andWeinstein，J，Lab.Clin.Med.，vol.98，p607-615，1981)。在本文的測定系統(tǒng)中，于待測樣品存在的情況下培養(yǎng)高度富集的大鼠CFU-MK細胞(即下文將描述的GpIIb/IIIa+CFU-MK級分)，并檢測摻入至巨核細胞中的14C-5羥色胺(14C-肌酸硫酸羥基色胺，14C-5HT)。
該測定系統(tǒng)的優(yōu)點是能夠減少被污染細胞的直接影響(例如，形成由目的因子之外的某些物質(zhì)所刺激的污染細胞之Meg-CSF活性，或者由污染的細胞產(chǎn)生某種因子，它與目的因子產(chǎn)生聯(lián)合作用)，因為GpIIb/IIIa+CFU-MK級分細胞中的CFU-MK百分比相當高(參見下文的[測定方法])而污染細胞數(shù)很少。此外，適宜的培養(yǎng)條件可以維持一段相對長的時間，因為每孔中所接種的細胞總數(shù)很少。另一個優(yōu)點在于在相差顯微鏡下可檢查培養(yǎng)期間有活性樣品存在時由CFU-MK生長的許多較大體積的成熟巨核細胞，因此，對所說活性的存在及程度提供了可能的定量判斷。定量判斷的結(jié)果與根據(jù)定量測定14C-5羥色胺的摻入所得結(jié)果非常相符。因此，通過聯(lián)合應用定量判斷可進一步改善定量測定的可靠性。
測定方法對Miyazaki等人的方法(Exp.Hematol.，vol.20，p855-861，1992)進行細微的修改，以制備用于本測定方法中的高度富集的大鼠CFU-MK細胞(GpIIb/IIIa+CFU-MK級分)。
簡單地說，從Wister大鼠(雄性，8-12周齡)中去除股骨和脛骨以制備所述的骨髓細胞懸液。用于制備骨髓細胞懸液的懸浮培養(yǎng)基(該溶液含有13.6mM檸檬酸三鈉，11.1mM葡萄糖，1mM腺苷，1mM茶堿，10mM HEPES(pH7.25)，0.5％牛血清白蛋白(下文稱為“BSA”)(Path-O-Cyte 4；Seikagaku Kogyo Co.，Ltd.)和無Ca2+無Mg2+的Hanks平衡鹽溶液(下文將稱為“HATCH溶液”)在Levine和Fedoroko所報道的巨核細胞分離培養(yǎng)基(Levine andFedoroko，Blood，vol.50，p713-725，1977)基礎(chǔ)上作了細微修改。將如此制備的骨髓細胞懸液鋪在Percoll非連續(xù)密度梯度溶液(密度1.050g/ml/1.063g/ml/1.082g/ml)上，該梯度溶液是通過用HATCH溶液稀釋制得，于20℃以400×g離心20分鐘。離心后，回收1.063g/ml和1.082g/ml密度層之間的細胞。洗滌后，將回收的細胞懸于含10％胎牛血清(下文稱作“FCS”)的Iscove改良的Dulbeceo培養(yǎng)基(下文稱作“IMDM”培養(yǎng)基)，置于100mm組織培養(yǎng)塑料平皿中，在5％CO2溫箱中于37℃培養(yǎng)1小時。保溫后，回收未粘附的細胞，再于塑料平皿中在37℃培養(yǎng)1小時。在HATCH溶液中懸浮未粘附細胞，于其中已吸附了小鼠單克隆抗大鼠血小板GpIIb/IIIa抗體P55抗體(Miyazaki et al.，Thromb.Res.，vol.59，p941-953，1990)的100mm細胞學培養(yǎng)皿中保溫1小時。保溫后，用HATCH溶液徹底沖洗以去除未粘附細胞，通過吸移管吹打分開吸附在固定的P55抗體上的剩余細胞，并收集之。一般來說，由一只大鼠得到3-4×105細胞。如此所得的細胞級分含有高度富集的大鼠CFU-MK(下文稱為“GpIIb/IIIa+CFU-MK級分”)，根據(jù)由在飽和濃度的大鼠IL-3存在情況下的集落測定系統(tǒng)的檢測結(jié)果已知該細胞部分含大約5-10％CFU-MK。能夠產(chǎn)生前述P55抗體的雜交瘤已于1994年2月14號保藏，保藏號為FERM BP-4563(National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry ofIntetnational Trade and Industry)。
接下來，將如此獲得的GpIIb/IIIa+CFU-MK部分懸于含10％FCS的IMDM培養(yǎng)基中，并以104細胞/孔的比例分散于96孔組織培養(yǎng)板中。各孔中再添加標準樣品(下文將詳述)或待測樣品，因此而調(diào)整最終培養(yǎng)基體積至200μl/孔。將如此制備的平板置于CO2溫箱中，于37℃保溫4天。保溫的第4天，在完成培養(yǎng)的前3小時向各孔中加入0.1μCi(3.7kBq)14C-5-羥色胺，于37℃繼續(xù)最后的保溫。保溫3小時之后，平板以1,000rpm離心3分鐘，經(jīng)吸取去除所得上清液。向每孔中加入含有0.05％EDTA的200μl PBS部分，離心平板，去掉所得上清液洗滌平板。重復洗滌步驟一次。將200μl2％Triton X-100加至每孔所得的細胞團丸中，在平板混合儀上振搖平板約5-10分鐘以徹底裂解細胞。將150μl如此所得的細胞裂解液轉(zhuǎn)移至商售的帽形固體閃爍劑(Ready CapBeckman)，隨后再置于烘箱中于50℃過夜以干燥裂解液。第二天，將Ready Cap置入玻璃小瓶中，用液體閃爍計數(shù)器檢測14C的放射性。
在這種情況下，當根據(jù)Ishibashi和Burstein的方法(Blood，vol.67，p1512-1514，1986)檢測前述細胞裂解液中的乙酰膽堿酯酶活性時，能夠得到與14C-5羥色胺摻入測定的幾乎完全相同的結(jié)果。標準樣品首先，以下列方式制備用于制備標準樣品的血小板減少癥大鼠的血漿。
以0.5mg/動物的劑量給正常的雄性Wister大鼠(7-8周齡)靜脈注射上述P55抗體兩次(間隔約24小時)，以誘發(fā)血小板減少癥。在第二次用藥24小時后，于乙醚麻醉條件下經(jīng)腹主動脈采血，所用的10ml注射器中已加入1ml3.8％(v/v)檸檬酸三鈉溶液作為抗凝劑。如此采集的血樣被分散至塑料離心管中，以1,200×g離心10分鐘以回收血漿部分。如此收集的血漿部分再以1,200×g離心10分鐘?；厥账玫难獫{部分，小心操作，防止其中含有細胞、血小板等，合并之(以該方式獲得的血漿在下文被稱為“TRP”)。根據(jù)實施例1方法由TPO獲得的Ca處理TRP(標準樣品C)、WGA-Agarose柱活性級分(標準樣品W)或Phenyl Sepharrose 6FF/LS柱活性級分將對足夠體積的IMDM培養(yǎng)基進行徹底的透析，并用作測定標準物。
在實施例1所述的大鼠TPO純化方法中，標準樣品C用于早期，但在中期之后改用標準樣品W，然后改用標準樣品P。標準樣品C的比活性試驗性地定為1，根據(jù)這一定義計算標準樣品W和P的相對活性。通過比較標準樣品的劑量反應曲線和待測樣品的劑量反應曲線來確定每一待測樣品的相對活性，并且待測樣品的相對活性定義為n，其中n表示其活性比標準樣品C的高n倍。
B.集落測定系統(tǒng)在該測定系統(tǒng)中，于待測樣品存在的情況下在半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)骨髓細胞，并通過計算CFU-MK增生和分化所形成的巨核細胞集落數(shù)來檢測Meg-CSF活性。測定方法(a)利用未分離的大鼠骨髓細胞等的情況將1ml終體積的含未分離的大鼠骨髓細胞之IMDM培養(yǎng)基、得自上述測定系統(tǒng)A的GpIIb/IIIa+CFU-MK之各分離步驟的細胞或GpIIb/IIIa+CFU-MK級分的細胞和10％ FCS、2mM Gln、1mM丙酮酸鈉、50μM 2-巰基乙醇和0.3％瓊脂(AGAR NOBLE，DIFCO)加入35mm組織培養(yǎng)塑料平皿中，于室溫固化后，在CO2溫箱中于37℃培養(yǎng)。一般說來，用來分離的骨髓細胞情況下，每個平皿中的細胞數(shù)調(diào)整為2－4×105；在Percoll密度梯度或粘附細胞耗盡時的情況下，細胞數(shù)為2－5×104；或在GpIIb/IIIa+CFU-MK級分的情況下，細胞數(shù)為0.5－2×103。培養(yǎng)6-7天后，從平皿中分出瓊脂平皿，并置于載玻片上(76mm×52mm)。為了干燥各瓊脂平皿，在凝膠上依次放上一張50篩目的尼龍篩和濾紙。如此干燥的瓊脂玻片在加熱板上于50℃熱固定5分鐘，并在根據(jù)Jackson的方法(Blood，vol.42，p413-421，1973)制備的乙酰膽堿酯酶染液中浸泡2-4小時。當證實巨核細胞被充分染色后，用水洗瓊脂玻片，干燥之，再用Harris蘇木精溶液二次染色30秒，水洗，空氣干燥。巨核細胞集落被定義為具有3個或3個以上緊密聚集的乙酰膽堿酯酶陽性細胞。(b)利用未分離的小鼠骨髓細胞的情況每個平皿用2－4×105細胞，以與上述(a)相同的方式進行集落測定。(c)利用人骨髓細胞或人臍帶血細胞的情況人骨髓細胞或臍帶血細胞可以直接應用，或以下述方式以富集的CFU-MK級分形式使用。
首先，將骨髓液或臍血鋪在Lymphoprep(Daiichi Kagaku Co.，Ltd)上并離心，回收所得的分界面白細胞部分。用親和素連接的磁珠從上述回收的細胞部分去除與對人表面抗原(CD2、CD11c和CD19)有特異性的生物素化單克隆抗體相連的細胞。由磁珠法去除的細胞主要是B細胞、T細胞、巨噬細胞和部分粒細胞。所剩細胞以FITC標記的抗CD34抗體和PE標記的抗HLA-DR抗體染色，然后用細胞分類器(例如COULTER生產(chǎn)的ELITE)回收CD34和HLA-DR陽性部分。CFU-MK細胞在該部分中得以濃縮(下文稱為“CD34+DR+CFU-MK級分”)?？梢杂蒙鲜隼么笫蠊撬杓毎闆r時的相同方式進行人細胞的集落測定，有所改變的是每平皿中用3－5×103的CD34+DR+CFU-MK級分細胞和用12.5％人AB血漿和12.5％FCS的混合物代替10％FCS。形成巨核細胞集落的培養(yǎng)時間是12-14天。為檢測人巨核細胞，利用對巨核細胞表面抗原GpIIb/IIIa有特異性的小鼠單克隆抗體經(jīng)堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶抗體法對巨核細胞進行免疫染色(例如參見Teramura et al.，Exp.Hematol.，vol.16，p843-848，1988)，對各含有3個或3個以上巨核細胞的集落計數(shù)。C.利用人成巨核細胞的細胞系的測定系統(tǒng)(M-07e測定)人成巨核細胞的細胞系M-07e細胞因應答GM-CSF、IL-3、SCF、IL-2等而增生(Avanzi et al.，J.Cell.Physiol.，vol.145，p458-464，1990)。因為這些細胞也對TPO有反應，因此它們用于替代大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)的測定系統(tǒng)。
測定方法回收在GM-CSF存在下維持的M-07e細胞，徹底洗滌，然后懸于含10％FCS的IMDM培養(yǎng)基中。所得的M-07e細胞懸液以每孔104細胞的比例分散于96孔組織培養(yǎng)板中，每孔中再添加標準樣品或待測樣品，因此調(diào)整終體積至200μl/孔。如此制備的平板置于5％CO2溫箱中，于37℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后，于培養(yǎng)完成4小時前每孔加入1μCi(37KBq)3H-胸苷。培養(yǎng)完成后，用細胞收集儀將細胞收集到玻璃纖維濾器上，用液體閃爍計數(shù)儀檢測3H放射性(例如，Pharmacia生產(chǎn)的Beta Plate)。D.利用小鼠原B細胞系的測定系統(tǒng)(Ba/F3測定)小鼠原B細胞系Ba/F3被認為是在應答IL3、I4等時增生的細胞系(Palacios et al.，Cell，vol.41，p727-734)。因其亞株BF-TE22不僅能應答IL3和IL4，而且應答TPO產(chǎn)生細胞增生，所以該細胞可用于作為替代大鼠CFU-MK測定的測定系統(tǒng)，或者說人成巨核細胞的細胞系輔助測定(M-07e測定)如下。簡單地說，回收在含1ng/ml小鼠IL-3的Iscove改良DMF培養(yǎng)基(IMDMGIBCO)中生長的BF-TE22，用IMDM洗3次，再懸于含10％FCS的IMDM培養(yǎng)基中。然后，將細胞懸液以1×104細胞/孔的密度分散于96孔組織培養(yǎng)板的各孔中，每孔中再加入標準TPO溶液或待測樣品，并調(diào)終體積為200μl/孔。所得平板在5％CO2溫箱中保溫2-3天。在第2或第3天，向各孔中加入1μCi(37KBq)3H-胸苷，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。最后，用細胞收集儀將細胞收集到玻璃纖維濾膜上，用液體閃爍計數(shù)器檢測3H放射性，在該測定系統(tǒng)中，在缺乏TPO活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幾乎所有的細胞都死亡，因此無3H-胸苷摻入。然而，在含TPO活性的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出TPO濃度依賴性方式的活性增生和胸苷摻入。另外，該測定結(jié)果與M-07e和CFU-MK測定結(jié)果相符。
下面的實施例進-步舉例說明了本發(fā)明。
實施例1-1純化因施用抗血小板抗體所誘發(fā)的血小板減少癥大鼠血漿中的大鼠TPO制備因施用抗血小板抗體所誘發(fā)的血小板減少癥大鼠的血漿根據(jù)前述參考實施例A大鼠巨核細胞祖細胞(CFU-MK)測定系統(tǒng)所描述的方法，從大約1,000只大鼠制備TRP作為純化來源。從TRP純化大鼠TPO首先，以設(shè)想TRP中TPO的含量最多為1∶3×106為依據(jù)用大約1,000只大鼠的TRP進行純化，結(jié)果得到略少于1pmole的部分純化的大鼠TPO。盡管總的說來純化TPO很困難，但還是嘗試分析其部分氨基酸序列，結(jié)果得到三部分氨基酸序列，但準確度很低。這些序列與肝臟中產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)的氨基酸序列一致或很相近。由這一結(jié)果尚不能明確是否TPO具有與絲氨酸蛋白酶抑制劑相似的結(jié)構(gòu)，或者說該序列來源于除TPO以外的污染細胞。利用這些未明確的序列從大鼠cDNA文庫中克隆TPO基因，但未能得到有效的TPO編碼基因。因此，以設(shè)想這一失敗是因為被分析樣品的純度低和含量不足為基礎(chǔ)又進行了廣泛的研究。為了得到氨基酸分析所需的被純化之終樣品，根據(jù)下面的實施例1-2所述的方法進行純化。令人意外的是，從實施例1-2的結(jié)果估算看，TRP或XRP(將在下文描述)中的TPO含量極少，只是總血漿蛋白質(zhì)的1∶108-109，因此，對TPO進行完全純化是相當困難的。
實施例1-2從經(jīng)全身X線或γ線照射引起血小板減少癥的大鼠血漿中純化大鼠TPO[制備經(jīng)全身X線或γ線照射引起血小板減少癥大鼠的血漿]將正常的雄性Wister大鼠(7至8周齡)全身置于亞致死劑量(6至7Gy)的X線或γ線下照射，使之患有血小板減少癥。在照射的第14天收集大鼠血液并以前文提到的制備TRP方法相同的方式制備血漿級分(本文此后稱之為“XRP”)。
在這種情況下，將由總數(shù)約1,100只大鼠制得的XRP(約8L)用作進行純化的來源。由XRP純化大鼠TPO由于1,100只大鼠的血漿樣品中總蛋白含量達到493,000mg，因此不能將其一次處理。因而，將血漿樣品在下面進行的純化步驟(1)至(4)中分成11份，每份對應于約100只大鼠。在隨后進行的純化步驟(5)至(7)中，將樣品分成6批，在純化步驟(8)及其以后的步驟中，使用了由約1,100只大鼠全部血漿粗制純化的樣品。下文描述了樣品為(XW9)份和(XB6)批情況下每一純化步驟的典型例子。
在所有純化步驟中，TPO活性是用在參考實施例中描述的大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)進行測定的。除非特別注明，所有的純化步驟均在4℃下進行，除了進行反相層析和在表面活性物質(zhì)存在時的Superdex75pg凝膠過濾以外，此時是在室溫下進行的。蛋白測定是用考馬斯染料結(jié)合測定法(一種由PIERCE生產(chǎn)的試劑系統(tǒng)，目錄號23236X)或使用雙辛可寧酸的一種方法(一種由PIERCE生產(chǎn)的試劑系統(tǒng)，目錄號23225)進行的。
純化的概要示于表1。
表1大鼠血漿TPO的純化步驟 總蛋白質(zhì) 相對活性 總活性 活性回收(mg) (％)總血漿 493000 -- -Ca處理后的血漿/G25 480300 2864600100<離子交換>Q-Sepharose FF 314400 9704000313<外源凝集素> WGA-Agarose15030132 1987000 230<三嗪染料>TSK-gel AF-Blue 650MH 4236 905 3834000 443<疏水性的>Phenyl-Sepharose 6FF/LS2762 847 2339000 271<凝膠濾過>S-200HR F3(低分子量TPO)51 200001020000 118S-200HR F2(高分子量TPO)262 7838 2055000 238
低分子量TP0(得自S-200HR F3)步驟總蛋白質(zhì)相對活性總活性活性回收(mg) (％)<凝膠濾過>S-200HR F3(低分子量TPO) 50.3300 20000 1007000 116<反相>YMC Protein-RP制備柱2.8540 130000 37100043<反相>YMC CN-AP 0.3730 800000 29840035<反相>Cepcell Pak Cl 0.0396 4890000 19360022<電泳>15％ SDS-PAGE 0.0017 149000000 25030029(在非還原條件下)
高分子量TPO(得自S-200HR F2)步驟 總蛋白質(zhì)相對活性總活性 活性回收(mg) (％)<凝膠濾過>S-200HR F2(高分子量TPO) 257.000078402015000233<反相>YMC Protein-RP制備柱 11.4000 227000 2588000300<凝膠濾過>Superdex 75pg/CHAPS 1.1660 1750000 2041000236<反相>YMC CN-AP 0.6200 700000 434000 50<反相>Capcell Pak Cl0.0630 200000001260000146<電泳>15％ SDS-PAGE 0.0030 330000000 990000 117(在非還原條件下)(1)大鼠血漿的氯化鈣處理、離心以及蛋白酶抑制劑處理在樣品份號為XW9的情況下將貯存于-80℃，相應于約100只大鼠的XRP(742ml；蛋白質(zhì)濃度，54.8mg/ml；總蛋白質(zhì)，40,686mg)融化并分至聚丙烯管(由Nalgere生產(chǎn))中。向各管中加入氯化鈣粉末至其終濃度為100mM。于4℃下過夜溫育后，將所得混合物以8,000rpm離心60分鐘。將一種蛋白酶抑制劑p-APMSF((對-氨基二苯基)甲磺酰氟鹽酸鹽，Wako Pure Chemical Industries，Lte.生產(chǎn)，目錄號010-10393))加至所得的有TPO活性的上清液(742ml；蛋白質(zhì)濃度，54.9mg/ml；總蛋白質(zhì)，40,740mg)中，使其終濃度為1mM。所獲得的樣品用于下面的Sephadex G-25柱緩沖交換步驟中。
以這種方式，通過將由1,100只大鼠得到的全部XRP分成每份等于約100只大鼠XRP的11份，一份一份地處理，從而完成了對全部XRP的氯化鈣/p-APMSF處理。將所得的11份樣品在隨后的Sephadex G-25柱步驟中分別處理。(2)Sephadex G-25<緩沖交換>在樣品份號為XW9的情況下將由鈣處理步驟(1)之后所得的上清液(742ml；蛋白質(zhì)濃度，54.9mg/ml；總蛋白質(zhì)，40,740mg)以40-70ml/min的流速加至Sephadex G-25柱(由Pharmacia Biotech生產(chǎn)，目錄號17-0033-03；直徑，11.3cm；床高，47cm)上，在此之前該柱已用20mMTris-HCl，pH8平衡。用同樣的緩沖液進行洗脫。將在蛋白洗脫之前的1,300ml洗脫液棄去。當在洗脫液中測出UV吸收時，貯存餾出液直至電導達到500μS/cm，從而找到了以20mM Tris-HCl，pH8交換的TPO活性蛋白質(zhì)餾分(1,377ml；蛋白質(zhì)濃度，27.56mg/ml；總蛋白質(zhì)，37,882mg；蛋白質(zhì)產(chǎn)率，93％)。級分中TPO的相對活性為2.3。
將所有各份樣品進行Sephadex G-25柱處理的結(jié)果是獲得了總量為21,117ml的Sephadex G-25柱含TPO活性的級分(總蛋白質(zhì)，480,300mg；平均相對活性，2；總活性，864,600)。(3)Q-Sepharose FF(強力陰離子交換層析)在樣品份號為XW9的情況下將在上述步驟(2)中通過Sepharose G-25處理得到的TPO活性級分(1,377ml；蛋白質(zhì)濃度，27.5mg/ml；總蛋白質(zhì)，37,841mg；相對活性，2.3)以40ml/min的流速加至Q-SepharoseFF柱(由Pharmacia Biotech生產(chǎn)，目錄號17-0510-01；直徑5cm；床高27cm)上，并以20mM Tris-HCl(pH8)洗脫，將過柱的級分F1貯存(3,949ml；蛋白質(zhì)濃度，0.98mg/ml；總蛋白質(zhì)，3,870mg；相對活性，0)。
下一步將緩沖液換成含175mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH8)以洗脫含TPO活性的級分F2(4,375ml；蛋白質(zhì)濃度，5.36mg/ml)。
最后，以含1,000mM NaCl的20mM Tris-HCl洗脫級分F3(1,221ml；蛋白質(zhì)濃度，3.9mg/ml；總蛋白質(zhì)，4,783mg；相對活性，3.8)。含TPO活性的級分F2中總蛋白質(zhì)為23,440mg，且通過該步驟F2的蛋白質(zhì)產(chǎn)率為61.9％。另外，TPO的相對活性增加至6.8。
將全部各份Sephadex G-25含TPO活性級分加至Q-SepharoseFF的結(jié)果是獲得了35,842ml Q-Sepharose FF含TPO活性的級分F2(總蛋白質(zhì)，314,384mg；平均相對活性，9；總活性，2,704,000)。(4)小麥胚芽凝集素(WGA)-瓊脂糖<外源凝集素親合層析>在樣品份號為XW9的情況下將通過Q-Sepharose FF處理在上述步驟(3)中獲得的含TPO活性級分F2分成三部分，以5ml/min的流速加至WGA-Sepharose柱(由Honen Corp.生產(chǎn)，編號為800273，直徑5cm，床高22.5cm)上。并以Dulbecco′s等張磷酸鹽緩沖液(DPBS)洗脫。將過柱的級分F1(9,336ml；蛋白質(zhì)濃度，2.30mg/ml；總蛋白質(zhì)，21,407mg，相對活性6.9)貯存。
然后，將緩沖液換成含0.2M N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc，由Nacalai tesque生產(chǎn)，編號005-20)、150mM NaCl和0.02％疊氮化鈉的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)，貯存所得洗脫液并用一超濾裝置(Omega Ultrosette，標定截流分子量為8,000；Filtron生產(chǎn))進行濃縮，從而獲得WGA-瓊脂糖吸附的含TPO活性的級分F2(2,993ml；蛋白質(zhì)濃度，0.376mg/ml)。
含TPO活性的級分F2中的總蛋白質(zhì)為1,125mg，且通過該步驟F2的蛋白質(zhì)產(chǎn)率為4.8％。另外，TPO的相對活性增加至101。將如此得到的級分F2貯存于-80℃下。
將全部各份Q-Sepharose FF TPO活性F2級分加至WGA-瓊脂糖的結(jié)果是獲得了總量為33,094ml的WGA-瓊脂糖TPO活性的級分F2(總蛋白質(zhì)，15,030mg；平均相對活性，132；總活性，1,987,000)。(5)TSK凝膠AF-BLUE 650MH<三嗪染料親合層析>在樣品批號為XB6的情況下將份號為XW8的WGA-瓊脂糖吸附的TPO活性的級分與在上述步驟(4)中從等于215只大鼠XRP起始獲得的份號為XW9的WGA-瓊脂糖吸附的含TPO活性級分F2混合形成批號為XB6的樣品(5,947ml；蛋白質(zhì)濃度，0.388mg/ml；總蛋白質(zhì)，2,319mg；相對活性，150)。
將5,974ml已混合的樣品的一部分與1000ml含0.85摩爾的NaCl(總量為296.76g)混合，生成NaCl終濃度為0.822M的6,132ml溶液，并以7ml/min的流速將所得到的溶液加至預先已用含1M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)平衡的TSK凝膠AF-BLUE 650MH柱(TOSOH CORP，目錄號08705；直徑5cm；床高23cm)上。
此過程完成后，用含1M NaCl的20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)以10ml/min的流速洗脫蛋白質(zhì)。將所得洗脫液貯存并用一超濾裝置(Omega Ultrasette，標定截流分子量為8,000)濃縮，從而獲得過柱的級分F1(543ml；蛋白質(zhì)濃度，2.05mg/ml；總蛋白質(zhì)，1,112mg；相對活性，31)。
下一步將洗脫緩沖液換成2M NaSCN以得到洗脫的TSK凝膠AF-BLUE 650MH吸附的含TPO活性的級分F2(1,427ml；蛋白質(zhì)濃度，0.447mg/ml)。
含TPO活性的級分F2中的總蛋白質(zhì)為638mg，借助該步驟F2的蛋白質(zhì)產(chǎn)率為27.5％。另外，TPO的相對活性增至1,500。
將各批WGA-瓊脂糖吸附的含TPO活性級分F2加至TSK凝膠AF-BLUE 650MH的結(jié)果是得到了總量為10,655ml的TSK凝膠AF-BLUE650MH含TPO活性的級分F2(總蛋白質(zhì)，4,236mg；平均相對活性，905；總活性，3,834,000)。(6)Phenyl Sepharose 6FF/LS<疏水性相互作用層析>在樣品為XB6批的情況下將1,424ml TSK凝膠AF-BLUE 650MH含TPO活性級分F2(1,424ml；蛋白質(zhì)濃度，0.447mg/ml；總蛋白質(zhì)，638mg；相對活性，1,500)的一部分與每1000ml中1.5摩爾硫酸銨粉(總量為282.2g)混合，得到硫酸銨終濃度為1.35M的溶液1,581ml。
將所得溶液以7ml/min的流速加至預先已用含1.5M硫酸銨的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)平衡的Phenyl Sepharose 6 FF(LowSub)柱(Pharmacia Biotech，目錄號17-0965-05；直徑5cm；床高10cm)上。該項操作完成后，用含0.8M硫酸銨的36mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)以10ml/min的流速進行洗脫。貯存所得洗脫液(約3,160ml)并用一超濾裝置(Omega Ultrasette，標定截流分子量8,000)進行濃縮，從而得到級分F1(485ml；蛋白質(zhì)濃度，0.194mg/ml；總蛋白質(zhì)，94.2mg；相對活性，0)。
下一步將洗脫緩沖液換成20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)以獲得含TPO活性的級分F2(約3,500ml)。用一超濾裝置(OmegaUltrasette，標定截流分子量8.000)對洗脫的級分進行濃縮并取出一份進行測定的樣品。在該階段，含TPO活性的級分F2的蛋白質(zhì)濃度和總蛋白質(zhì)分別為1.45mg/ml和319mg，經(jīng)此步驟F2的蛋白產(chǎn)率為50.0％。TPO的相對活性為1,230。
將各批TSK凝膠AF-BLUE 650MH含TPO活性的F2級分加至Phenyl Sepharose 6FF/LS的結(jié)果是獲得了總量為1,966ml的Phenyl Sepharose 6FF/LS含TPO活性的級分F2(總蛋白質(zhì)，2,762mg；平均相對活性，847；總活性，2,339,000)。(7)Sephacryl S-200HR<凝膠過濾層析>在樣品為XB6批的情況下(參見圖1)將Phenyl Sepharose 6FF/LS含TPO活性的級分F2(217ml；蛋白質(zhì)濃度，1.45mg/ml；總蛋白質(zhì)，315mg；相對活性，1,230)與144.8ml 5M NaCl溶液混合以獲得362ml NaCl終濃度為2M的溶液，應用使用YM3膜(直徑76mm，Amicon Corp.生產(chǎn))的超濾裝置將所得溶液濃縮至約50ml。
向該溶液中加入相同體積(50ml)的8M尿素，從而獲得100ml含1M NaCl和終濃度為4M尿素的溶液。將該溶液濃縮至約80ml，制成88.78ml的樣品，然后加至Sephacryl S-200HR柱(由Pharmaci Biotech生產(chǎn)，目錄號17-0584-01；直徑7.5cm，床高100cm)上。
此后，用DPBS以3ml/min的流速有效地進行洗脫，將在棄去無用的1,200ml洗脫液后的洗脫液以每份45ml收集在60個聚丙烯試管中。每兩管進行一次測定，其余的貯于-85℃直至由1,100只大鼠得來的所有樣品完成了Sephacryl S-200HR處理?；跍y定結(jié)果，批號XB6的級分分組如下(F1)管數(shù)1-15(處于無用洗脫液邊緣的級分；分子量等于或大于94,000)(F2)管數(shù)16-26(分子量，94,000至33,000)(F3)管數(shù)27-44(分子量，33,000至3,000)(F4)管數(shù)45-55(分子量，小于或等于3,000)以這種方式，分別將所有各批由Phenyl Sepharose 6FF/LS獲得的含TPO活性F2級分加至Sephacryl S-200HR處理、測定和貯于-85℃。在所有各批完成了S-200HR處理之后以及在隨后進行反相層析(YMC-Pack PROTEIN-RP)之前，將這些樣品融化并使用YM3膜(直徑76mm，Amicon Corp.制造)的超濾裝置進行濃縮獲得如下的兩分樣品。由Sephacryl S-200HR處理所獲得的含TPO活性級分F2的濃縮樣品在下文稱為“高分子TPO樣品F2”，經(jīng)同樣處理的F3稱為“低分子TPO樣品F3”。
高分子TPO樣品F2和低分子TPO樣品F3是為了方便對貯存凝膠濾過層析中不同洗脫區(qū)域級分，術(shù)語“高分子”和“低分子”因此并不意味著它們真正的分子量。
高分子TPO樣品F2低分子TPO樣品F3分子量94,000-33,000 33,000-3,000總體積3,420ml6,480ml總體積(濃縮后)293ml 280ml總蛋白262mg 51.3mg平均相對活性 7,838 20,000總活性2,055,000 1,020,000低分子TPO樣品F3和高分子TPO樣品F2分別進行隨后的純化步驟。
低分子TPO樣品F3的純化在以下的步驟(8)-(11)中進行了描述。(8)YMC-Pack PROTEIN-RP<反相層析>
將在上述步驟(7)中得到的低分子TPO樣品F3(總蛋白質(zhì)，50.3mg；蛋白質(zhì)濃度，0.184mg/ml；相對活性，20,000；總活性，1,007,000，總體積，274ml)與溶劑A(0.025％三氟乙酸(TFA))和溶劑B(含0.025％TFA的1-丙醇)混合以獲得總體積為508.63ml，丙醇、TFA和蛋白質(zhì)終濃度分別為20％、0.012％和0.0989mg/ml的溶液。在制備該溶液過程中生成的不溶物質(zhì)通過離心分離出來，將上清液分成兩份254.3ml(25.2mg蛋白質(zhì))并以2ml/min的流速加至裝有YMC-Pack PROTEIN-RP的柱(YMC生產(chǎn)，目錄號A-PRRP-33-03-15；直徑3cm；床高7.5cm)上，該柱預先已用30％ B平衡。離心的沉淀用含有5mM CHAPS(3-[3-膽酰氨基丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸鹽；Dojindo Laboratories生產(chǎn)；目錄號75612-03-3)的20ml 20mM乙酸鈉(pH5.5)溶解并上柱。
樣品上柱后，用約50ml溶劑(溶劑A∶B＝321)過柱以獲得過柱級分。下一步，開始展開過程(在120分鐘內(nèi)用30％B至45％B的線性梯度溶液洗脫)，以每管10ml收集36個聚丙烯試管的洗脫液。對剩余樣品重復此過程，用相同收集管收集，這樣獲得了每份含20ml洗脫液的總數(shù)為36的級分試管。使用用YM3膜(直徑76mm，Amicon Corp.生產(chǎn))的超濾裝置將過柱級分直接濃縮至20ml。
取每份過柱級分和管1至36的20ml級分的各0.1ml與20μl5％BSA混合，蒸發(fā)干燥，溶于0.25ml IMDM測定培養(yǎng)液中，然后測定以找出含TPO活性的級分。結(jié)果在管17至27(36.0至43.0％的丙醇濃度范圍)的級分中發(fā)現(xiàn)了TPO活性，這些級分合起來被作為低分子TPO樣品F3來源的YMC-Pack PROTEIN-RP含TPO活性級分F2使用。該級分貯于-85℃直至用于隨后的YMC-Pack CN-AP步驟。低分子TPO樣品F3來源的YMC-Pack PROTEIN-RP含TP0活性級分F2總體積220ml蛋白質(zhì)濃度0.0130mg/ml總蛋白質(zhì) 2.85mg相對活性 130,000總活性371,000(9)YMC-Pack CN-AP<反相層析>
將上述步驟(8)中獲得的低分子TPO樣品F3來源的YMC-PackPROTEIN-RP含TPO活性級分F2 214.9ml(總蛋白質(zhì)，2.79mg；蛋白質(zhì)濃度，0.0130mg/ml；相對活性，130,000；總活性，36,300)與0.6ml 50％的甘油混合并濃縮至1.8ml。該濃縮物用含小于或等于20％的丙醇以及約6％甘油調(diào)整到5ml體積。
將濃縮物分成5份在下面的柱操作使用(每一操作用1ml和0.555mg蛋白質(zhì))。將所分的樣品(以0.6ml/min速度)加至鋪有YMC-Pack CN-AP的柱(YMC生產(chǎn)，目錄號AP-513；直徑6mm；床高250mm)上，用0.1％TFA作為溶劑A和0.05％含1-丙醇的TFA作為溶劑B，所說的柱預先用15％ B進行平衡。加樣后，將丙醇的濃度由15％B增至25％B，且在65分鐘內(nèi)將B的濃度由25％線性增至50％。在最后一個操作(第5個)完成后，將1ml含有除去蛋白質(zhì)的同樣組分的溶液加至柱上并以同樣的方法處理以獲得仍存在于柱中的TPO活性。由于采用相同的聚丙烯管貯存6個操作的洗脫液，總共獲得了44只每管含7.2ml洗脫液的試管。
將每一上述獲得的級分取30μl(每一級分的1/240)與20μl5％BSA混合，蒸發(fā)干燥，再溶于0.24ml IMDM測定培養(yǎng)基中進行測定以確定含TP0活性的級分。結(jié)果在管28至33(37.0至42.0％丙醇范圍)的級分中發(fā)現(xiàn)了強的TPO活性，這些級分合起來用作低分子TPO樣品F3來源的YMC-Pack CN-AP主要TPO活性級分FA。低分子TPO樣品F3來源的YMC-Pack CN-AP主要TPO活性級分FA總體積43.20ml蛋白質(zhì)濃度0.00863mg/ml總蛋白質(zhì) 0.373mg相對活性 800,000總活性298,400(10)Capcell Pak C1 300<終反相層析>
將在上述步驟(9)中獲得的43.20ml低分子TPO樣品F3來源的含TPO活性級分FA中的43.12ml(總蛋白，0.372mg；蛋白質(zhì)濃度，0.00863mg/ml；相對活性，800,000；總活性，297,500)與0.2ml50％甘油混合并濃縮獲得0.1ml甘油溶液。
將該溶液與2ml溶劑A(0.1％TFA)∶溶劑B(含0.05％TFA的1-丙醇)＝85∶15(15％B)的溶液混合以制備2.1ml含約14％丙醇、約4.8％甘油和0.177mg/ml蛋白質(zhì)的樣品。將該制得的溶液加至預先以15％B平衡的Capcell Pak C1 300A柱(Shiseido Co.，Ltd.生產(chǎn)目錄號C1 TYPESG 300A；直徑4.6mm，床高250mm)上，在65分鐘內(nèi)用線性梯度從27％B增至38％B的溶液以0.4ml/min的流速處理。以0.6ml一份收集洗脫液至72個聚丙烯管中。
將所得每一級分的3μl(每一級分的1/200)與20μl 5％BSA混合，將基質(zhì)轉(zhuǎn)換成225μl IMDM測定培養(yǎng)液，測定稀釋了75倍的級分。
將每一級分取1μl(級分的1/600)用于電泳，將其蒸發(fā)干燥并用10μl非還原樣品緩沖液于95℃處理5分鐘以進行SDS-PAGE。然后將處理后的樣品進行使用15-25％SDS-聚丙烯酰胺預制凝膠(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd生產(chǎn))的SDS-PAGE，并用2D-Silver Stain.II“DAIICHI”(由Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.，生產(chǎn)，目錄號167997；下文稱為“銀染色藥盒”)的銀染色藥盒染色。用[DAIICHI]-III低分子量標記物(由Daiichi PureChemicals Co.，Ltd.生產(chǎn)；目錄號181061；下文稱為“DPCIII”)作為分子量標記物。
上述測定的結(jié)果是在管35至43(30.0至32.5％丙醇濃度范圍)的級分中發(fā)現(xiàn)了顯著的TPO活性。其中的管36至42(30.5至32.0％丙醇濃度范圍)的級分合起來用作主要TPO活性級分FA。結(jié)果示于圖2。
當將由色譜推斷的蛋白質(zhì)含量與測定結(jié)果相比時，發(fā)現(xiàn)所得級分總蛋白質(zhì)為39.6μg，蛋白質(zhì)濃度為9.4μg/ml，相對活性為4,890,000，總活性為193,600。對管36至42的TPO活性級分的SDS-PAGE圖樣的檢測顯示了染色強度與活性強度相關(guān)聯(lián)條帶的存在。此外，發(fā)現(xiàn)該非還原帶的表觀分子量在與于同樣凝膠上的已還原的標準分子量蛋白質(zhì)比較時為17,000至19,000，這表明該帶很可能是TPO。(11)從電泳凝膠<15％SDS-PAGE>提取TPO活性蛋白質(zhì)含TPO活性的級分FA分析的例子在上述步驟(10)中獲得的4,200μl低分子量TPO樣品F3來源TPO活性級分FA(總蛋白質(zhì)，39.6μg；蛋白質(zhì)濃度，9.4μg/ml；相對活性，4,890,000；總活性，193,600)中，將用于活性蛋白質(zhì)提取的5.5μl(級分的1/764)和用于銀染色的2.5μl(級分的1/1680)轉(zhuǎn)入各自的樣品試管中，蒸發(fā)干燥，與10μl用于SDS-PAGE的非還原樣品緩沖液于37℃反應1小時，然后室溫下靜置18小時，由此進行SDS反應。
用預染Low Range Marker(Bio-Rad Laboratories，Inc.，生產(chǎn)，161-0305)和前述DPCIII作為分子量標記物。利用microslab凝膠，按照通常使用的方法(Laemmli，Nature，vol.227，pp.680-685，1970)于4℃進行這些樣品的15％ SDS-PAGE。電泳完成后，用刀將準備進行銀染色的凝膠部分迅速切下置入固定液中，然后用前述的銀染色藥盒進行染色。
另外，將用于檢測活性的所有分子量范圍的凝膠用刀切成34片，各凝膠電寬1.5-2.5mm，將其用稍加改良的Kobayashi法(Kobayashi，M.，Seikagaku(Biochemistry)，vol.59，no.9，1987，published by the Japanese Biochemistay Society)粉碎。粉碎成小碎片的各凝膠片與0.3ml提取緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8，500mM MaCl，0.05％ BSA)混合，于4℃搖動6小時以進行提取。
向其中加入500mM磷酸鉀(pH6.8)以使終濃度為20mM。4℃下?lián)u動1小時后，將所得混合物轉(zhuǎn)至Ultra Free C3GV 0.22μm濾過裝置(Millipore Corp.生產(chǎn)，UFC3 OGV OS)中，在1,000×g(4,000rpm)下離心15分鐘以除去沉淀的SDS，重新獲得產(chǎn)生的上清液。將濾出液轉(zhuǎn)至Ultra Free C3-LGC超濾裝置(標定截流分子量10,000，Millipore Corp.生產(chǎn)，UFC3 LGC00)中，以3,000×g(7,000rpm)離心。當濃縮溶液體積達到約50μl時，加入20mM磷酸鈉緩沖液(pH7.2)300μl，再進行超濾。
重復兩次用300μl 20mM磷酸鈉緩沖液的超濾，以去除殘余的SDS。此后，重復類似的步驟以交換成檢測培養(yǎng)液制備隨后進行滅菌并用于TPO活性測定的樣品(300μl)。
通過銀染色清楚地檢測出三條蛋白帶，所說的銀染色基于DPCIII分子量標記物顯示了表觀分子量為約17,000至19,000、14,000至11,000的蛋白質(zhì)。
在前述步驟(10)中，在Capcell Pak C1柱TPO活性級分的電泳中觀察到了具有活性強度與染色密度相關(guān)且表觀分子量為約17,000至19,000的條帶。在本步驟(11)的實驗中，在表觀分子量約17,000至19,000的條帶中發(fā)現(xiàn)了TPO活性(參見圖3)。
基于上述結(jié)果，已經(jīng)證實了Capcell Pak C1 300A柱中的活性級分中的TPO活性蛋白質(zhì)在電泳凝膠上被純化至可檢測出的水平。基于由15％SDS-PAGE獲得的條帶的銀染色密度，在總TPO活性級分中可能的TPO蛋白質(zhì)(表觀分子量約17,000至19,000)的量測定為約1.7μg。
高分子TPO樣品F2的純化在下述步驟(12)至(15)中得到描述。(12)YMC-Pack PROTEIN-RP<反相層析>
將上述步驟(1)中得到的高分子TPO樣品F2(總蛋白質(zhì)，257mg；蛋白質(zhì)濃度，0.894mg；相對活性，7,840；總活性，2,015,000；總體積，287ml)與95.8ml(樣品的1/3體積)的溶劑B(含0.025％TFA的1-丙醇)混合以得到總體積為383ml，丙醇、TFA和蛋白質(zhì)終濃度分別為約25％、0.006％和0.671mg/ml的溶液。將0.025％TFA的溶液用作溶劑A。在輸入樣品制備過程中形成的不溶物質(zhì)用離心將其分離出來，所產(chǎn)生的上清液分成6個62.3ml(42.8mg蛋白質(zhì))部分以2ml/min的流速加至預先用30％B平衡、鋪有YMC-Pack PROTEIN-RP的柱(YMC生產(chǎn)，目錄號A-PRRP-33-03-15；直徑3cm；床高7.5cm)上。將離心產(chǎn)生的沉淀物溶于10ml含5mM CHAPS的20mM乙酸鈉(pH5.5)，也加至柱上。
加樣完成后，將約50ml的溶劑(溶劑A∶B＝3∶1)過柱以得到過柱級分。下一步，開始一逐步變化的洗脫方法(在120分鐘內(nèi)用30％B呈線性梯度變化的至45％B的溶劑進行洗脫)，以每管15ml將洗脫液收集在24只聚丙烯管中。對6個分開的樣品用相同的收集管重復進行此過程，從而獲得總數(shù)為24管、每管含90ml洗脫液的級分試管。將過柱級分與管1級分合起來，用使用YM3膜(76mm直徑，Amicon Corp.生產(chǎn))的超濾裝置直接濃縮至90ml。
將過柱級分與管1級分混合物以及管2至管24的級分各取0.3ml與10μl 5％BSA混合，蒸發(fā)干燥，溶于0.3ml IMDM測定培養(yǎng)液中，然后測定以找出含TPO活性的級分。結(jié)果在管10至15(34.0至39.5％丙醇濃度范圍)的級分中發(fā)現(xiàn)了TPO活性，這些級分合起來用作高分子TPO樣品F2來源的YMC-Pack PROTEIN-RP TPO活性級分F2。該級分貯于-85℃直至用于隨后的YMC-Pack CN-AP步驟。高分子TPO樣品F2來源的YMC-Pack PROTEIN-RP TPO活性級分F2總體積 540ml蛋白質(zhì)濃度 0.021mg/ml總蛋白質(zhì)11.4mg相對活性227,000總活性 2,588,000(13)Seperdex 75pg<CHAPS存在下的凝膠過濾層析>
將上述步驟(12)中得到的高分子TPO樣品F2來源的YMC-PackPROTEIN-RP TPO活性級分F2(總蛋白質(zhì)，11.3mg；蛋白質(zhì)濃度，0.021mg/ml；相對活性，227,000；總活性，2,565,000)的538.2ml與0.6ml 50％甘油混合并蒸發(fā)濃縮。向其中加入18ml 20mM CHAPS，然后攪拌，隨后于4℃溫育41小時。此后，將第-個樣品加至鋪有HiLoad 26/60 Superdex 75pg的柱(Pharmacia Biotech生產(chǎn)，目錄號17-1070-01；直徑2.6cm，床高60cm)上，用含5mM CHAPS的DPBS以1ml/min的流速洗脫。將每一樣品取4ml(蛋白質(zhì)濃度0.466mg/ml；蛋白質(zhì)，1.86mg)加至柱上。
在這一例子中，通過將整個YMC-Pack PROTEIN-RP TPO活性級分或6個部分而將Superdex75柱操作過程重復6次。每一操作的洗脫液以每份5ml收集于45只試管中，從而在完成了6個柱操作后最終獲得了每份含30ml洗脫液的45份級分。
取所得的每份級分中的0.1ml與5％的BSA 10μl混合，蒸發(fā)干燥，溶于0.25ml IMDM測定培養(yǎng)液中，然后測定以找出含TPO活性的級分。結(jié)果是在管13至31的級分(分子量范圍從78,000至3,000)中發(fā)現(xiàn)了TPO活性，管13至31的級分合起來用作高分子TPO樣品F2來源的Superdex 75pg TPO活性級分F2。高分子TPO樣品F2來源的Superdex 75pg TPO活性級分F2總體積 540ml蛋白質(zhì)濃度 0.00216mg/ml總蛋白質(zhì)1.17mg相對活性1,750,000總活性 2,041,000(14)YMC-Pack CN-AP<反相層析>
將在上述步驟(13)中得到的540ml高分子TPO樣品F2來源的Superdex 75pg TPO活性級分F2(分子量，78,000-3,000)中的513.2ml(總蛋白質(zhì)，1.11mg；蛋白質(zhì)濃度，0.00216mg/ml；相對活性，1,750,000；總活性，1,943,000)與1/10體積的溶劑B(含0.05％TFA的1-丙醇)混合，并以0.6ml/min的流速用溶劑A(0.1％TFA)和溶劑B將其加至預先用15％B平衡的鋪有YMC-Pack CN-AP的柱(YMC生產(chǎn)，目錄號AP-513，直徑6mm，床高250mm)上。這一過程完成后，丙醇濃度由15％B增至25％B，且在65分鐘內(nèi)由25％B線性梯度增至50％B。
在開始YMC-Pack CN-AP柱層析之前，用總加樣樣品的1/20用于試驗操作以證實活性的適當回收。此后，將剩余的19/20分成2份樣品以進行兩次操作。換句話說，柱操作重復進行三次。由于用同樣的44只聚丙烯管貯存三次操作的洗脫液，所以得到了44只每管含3.6ml洗脫液的試管。
將所得每個級分取5μl(每個級分的1/720)與0.25ml IMDM測定培養(yǎng)液混合，然后測定以找出TPO活性級分。結(jié)果是在管24至30(丙醇濃度范圍為36.0至42.0％)的級分中發(fā)現(xiàn)了很強的TPO活性，這些級分合起來用作高分子TPO樣品F2來源的YMC-Pack CN-AP主要TPO活性級分FA。高分子TPO樣品F2來源的YMC-Pack CN-AP TPO活性級分FA總體積 25.20ml蛋白質(zhì)濃度 0.0246mg/ml總蛋白質(zhì)0.620mg相對活性700,000總活性 434,000(15)Capcell Pak C1 300A<終期反相層析>
將在上述步驟(14)中獲得的25.20ml高分子TPO樣品F2來源的YMC-Pack CN-AP TPO活性級分FA中的24.66ml(總蛋白質(zhì)，0.606mg；蛋白質(zhì)濃度，0.0246mg/ml；相對活性，700,000；總活性，424,000)與0.4ml 50％甘油混合，蒸發(fā)濃縮。
以此方式，獲得含百分之n濃度的丙醇、10％的甘油和0.303mg/ml蛋白質(zhì)濃度的2ml濃縮樣品。用溶劑A(0.1％TFA)和溶劑B(含0.05％TFA)將其加至預先用15％B平衡的鋪有Capcell PakC1 300A的柱(Shiseido Co.，Ltd.生產(chǎn)，目錄號C1 TYPE；SG300A；直徑4.6mm；床高250mm)上，以流速0.4ml/min進行此過程，在此過程中在65分鐘內(nèi)線性梯度由27％B增至38％。以每管0.6ml將洗脫液收集在72只聚丙烯試管中。
將每管所得級分取0.75μl(每個級分的1/800)與20μ1 5％BSA混合，基質(zhì)轉(zhuǎn)換成225μl IMDM測定培養(yǎng)液，然后測定稀釋了300倍的級分。
將每一級分取樣2μl(級分的1/300)用于電泳，蒸發(fā)干燥并用10μl非還原性樣品緩沖液于95℃處理5分鐘以進行SDS-PAGE。然后將處理過的樣品用于使用15-25％、SDS-聚丙烯酰胺預制凝膠(Daiichi Pure Chemicals Co.，Ltd.生產(chǎn))的SDS-PAGE，用前文所述的銀染色藥盒進行染色。用前述的DPCIII作為分子量標記物。
上述測定的結(jié)果是在管33至39(丙醇濃度范圍是29.5至31.5％)的級分中發(fā)現(xiàn)了顯著的TPO活性。在這些級分中，將管34至39(丙醇濃度范圍30.0至31.5％)的級分合起來用作主要TPO活性級分FA。對主要TPO活性級分SDS-PAGE圖型的檢查顯示出現(xiàn)了在非還原條件下表觀分子量范圍在17,000至19,000之間、其染色密度與活性強度相關(guān)聯(lián)的一條色帶，這與前文所述步驟(10)中低分子TPO樣品F3來源的TPO活性級分的情況相似。
<實施例2>
分析已純化大鼠TPO部分的氨基酸序列按照Iwamatsu(Iwamatsu et al.，“Shin Kiso SeikagakuJikken-ho(New Basic Biochemical Experiments)”，vol 4，pp.33-84，pub.Maruzeu；Iwamatsu，A.，Seikagaku(Biochemistry)，vol.63，no.2，pp.139-143，1991；Iwamatsu，A.，Electrophoresis，vol.13，pp.142-147，1992)的方法，對由實施例1純化步驟(10)中獲得的、存在于CapcellPak C1 300A柱TPO活性級分FA中的大鼠TPO候選蛋白質(zhì)進行氨基酸序列分析。即將樣品進行SDS-PAGE并電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在該蛋白質(zhì)于PVDF膜上還原和S-烷基化后，以三種蛋白酶對已經(jīng)上述處理的蛋白質(zhì)進行徹底的和有步驟的原位限制性酶解，使之消化或肽片段，在每一消化步驟分離所產(chǎn)生的肽段并用反相層析進行純化，用高敏感度氨基酸序列測定法分析其氨基酸序列。下文詳細描述了這一過程。低分子TPO樣品F3來源的Capcell Pak C1 300A TPO級分FA中的TPO候選蛋白質(zhì)分析的例子(1)濃縮Capcell Pak C1 300A柱TPO級分FA(管號36至42)將4,200μl在實施例1的純化步驟(10)中獲得的低分子TPO樣品F3衍生的Capcell Pak C1 300A柱TPO活性級分FA(管號36至42)(總蛋白質(zhì)，39.6μg；蛋白質(zhì)濃度，9.4μg/ml；相對活性，4,890,000；總活性，193,600)中的4,151μl(總級分的98.8％)用于氨基酸序列分析。由色譜推測的總蛋白質(zhì)為39.1μg，其中約1.6μg是在SDS-PAGE之后被銀染的TPO候選蛋白質(zhì)，表觀分子量約為17,000至19,000。
將該樣品與甘油混合，用蒸發(fā)法濃縮以得到5μl甘油溶液。向其中加入用于SDS-PAGE的非還原緩沖液和1M Tris-HCl(pH8)以調(diào)整其pH，從而獲得約25μl的含200mM Tris-HCl(pH8.0)、50mM Tris-HCl(pH6.8)、1.1％SDS、2mM EDTA、0.02％溴酚藍和30％甘油的樣品。
所得樣品在室溫下維持14小時，然后于60℃處理5分鐘以在無過度加熱的情況下產(chǎn)生有效適當?shù)腟DS反應。(2)電泳制備Micro-Slab凝膠(4.0％丙烯酰胺堆積凝膠和15％丙烯酰胺分離凝膠)，于室溫下先用12.5mA然后是17.5mA的穩(wěn)定電流進行SDS-PAGE 2小時。用預染的Low Range Marker(Bio-Rad，161-0305)和DOCIII作為分子量標記物。電泳完成后立即將獲得的蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(參見下面的步驟)。
在非還原條件下或在用二硫蘇糖醇(DTT)使樣品還原之后將樣品的一部分用于另一使用15-25％聚丙烯酰胺預制凝膠(Multi Gel15/25，Daiichi Pure Chemicals Co.Ltd生產(chǎn)，目錄號211072)的電泳。當將所得凝膠用前文所述的銀染色藥盒染色后，證實了所希望成為TPO蛋白質(zhì)條帶的分子量在還原條件下約為19,000，且CapcellPak C1 300A柱的TPO候選蛋白質(zhì)純度為百分之幾。另外，由于該條帶的移動性在非還原和還原條件下不同，所以提示該候選蛋白質(zhì)含有至少一個二硫鍵。(3)通過電泳印跡法轉(zhuǎn)移PVDF膜上的蛋白質(zhì)并檢測條帶應用半干燥轉(zhuǎn)移裝置(Model KS-8460，Marysol生產(chǎn))在160mA(11至17V)的穩(wěn)定電流下在PVDF膜(ProBlott，AppliedBiosystems生產(chǎn)，目錄號400994)上進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移1小時。用由0.3M Tris和20％甲醇(pH10.4)組成的溶液作為陽性電解液，由25mM Tris和20％甲醇(pH10.4)組成的溶液作為轉(zhuǎn)移膜溶液，由25mM Tris、40mM氨基己酸和20％甲醇(pH10.4)組成的溶液作為陰極電解液。
當用Ponceau S染色溶液(100ml水中含0.1g Ponceau S和1ml乙酸)染色所得轉(zhuǎn)移后的膜時，檢測出多個條帶，證實其中之一為分子量約19,000的候選蛋白質(zhì)的條帶。將該帶切下以用于隨后進行的肽段生成步驟中。(4)肽片段生成、肽的酶譜分析以及氨基酸序列分析為了對在PVDF膜上還原后進行了轉(zhuǎn)移和S-烷基化的TPO候選蛋白質(zhì)進行徹底的片段化，應用了下面的三種蛋白酶有步驟地進行限制性酶性水解。第一次消化賴氨酰內(nèi)肽酶(Achromobacter lyticus m497-1，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn)，目錄號129-02541)。第二次消化內(nèi)蛋白酶Asp-N(Boehringer-Mannheim Corp.生產(chǎn)，目錄號1054589)第三次消化胰蛋白酶-TPCK(Worthington Biochemical生產(chǎn)，目錄號3740)回收每次酶消化獲得的肽片段，加至Wakosil-II 5C18 C18反相柱(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.生產(chǎn)，直徑2.0mm，長度150mm)上，并以0.25ml/min的流速和30℃的柱溫，用溶劑A(0.05％TFA)和溶劑B(異丙醇∶乙腈＝7∶3，0.02％TFA)在30分鐘內(nèi)使B由1％線性梯度增至50％B進行洗脫。以這種方法，作肽的酶譜分析(見圖4)?；厥账秒亩尾⒂靡粴庀喟被釡y序儀(PPSQ-2，Shimadzu Corp.生產(chǎn))進行Edman降解。此后，從測序儀依次回收的每個氨基酸用借助同溶劑洗脫的C18反相柱層析進行鑒定，所說的氨基酸其N末端已被PTH耦聯(lián)。結(jié)果總結(jié)于下文。由賴氨酰內(nèi)肽酶進行第一次消化獲得的肽片段的氨基酸序列片段 氨基酸序列AP3(K)XYYES2(X為A、S、G、M或Q，Z是E或K)(SEQ ID NO184)AP6 (K)XRAAZ(X為E或Q，Z為E或N)(SEQ IDNO185)AP7 (K)AGXCSG(不能被全部鑒定)(SEQ ID NO186)AP8 (K)XPVPPACDPRLL(X為I、T或S)(SEQ IDNO187)AP12(K)DSFLADVK(SEQ ID NO188)AP5 (不能被鑒定)AP20(不能被鑒定)AP21(不能被鑒定)AP23(不能被鑒定)由內(nèi)蛋白酶Asp-N進行第二次消化獲得的肽片段的氨基酸分析片段氨基酸序列ASP1(不能被鑒定)ASP2(不能被鑒定)ASP6(不能被鑒定)ASP11 (不能被鑒定)由胰蛋白酶-TPCK進行第三次消化獲得的肽段的氨基酸分析片段氨基酸序列TP2(K或R)TLPTXAVP(SEQ ID NO189)TP3(K或R)TLPTXAVP在上述序列中，N末端括號內(nèi)顯示的是能從徹底的酶消化推測出的氨基酸殘基。(5)所得氨基酸的同源性分析<同源性檢索>
為了了解是否所得氨基酸序列含于一已知報導過的蛋白質(zhì)中或者是否有一蛋白質(zhì)具有相似的序列，用序列分析軟件Mac Vector(Kodak Intemational Biotechnologies，Inc.)對其進行了分析。就關(guān)于已知蛋白質(zhì)或已知基因的信息方面，應用了Entrez Release 6數(shù)據(jù)庫(National Center for Biotechnology Information，National Library of Medicine，National Institute of Health，USA，published on August 15，1993)。數(shù)據(jù)庫包括以下內(nèi)容Entrez Release 6數(shù)據(jù)庫NCBI-GenBank，August 15，1993(Release 78.0)EMBL，July 15，1993(Release 35.0 plus updates)DDBJ，July 15，1993SWISS-PROT，April，1993(Release 25.0)PIR，June 30，1993(Release 37.0)PDB，April，1993PRF，May，1993dbEST，July 15，1993(Release 1.10)U.S.and European Patents結(jié)果是AP12的序列(K)DSFLADVK與大鼠皮質(zhì)甾類結(jié)合球蛋白(CBG)前體的內(nèi)序列KDSFLDVK[PIR數(shù)據(jù)庫登記號A40066；Smithand Hammond；“Rat corticosteroid-binding globulinprimarystructure and messenger ribonucleic acid levels in the liverunder different physiological conditions.”，Mol.Endocrinol.，(1989)，3,420-426]恰好完全相合。
進一步檢查顯示與AP3的(K)XYYESZ(X為A、S、G、M或Q，Z為E或K)序列具有高度相似性的KQYYESE序列(SEQ ID NO193)包含在大鼠CBG氨基酸序列中。在大鼠CBG中，相應于AP12和AP3的序列互相連接，從而形成了內(nèi)部氨基酸序列KDSFLADVKQYYESE(SEQID NO190)。
至于除AP12和AP3外其它片段的氨基酸序列，沒有發(fā)現(xiàn)其相似性應加以考慮的蛋白質(zhì)或基因。
<實施例3>
分析由血小板減少癥大鼠血漿衍生的TPO的生物特性(1)在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)(液體培養(yǎng)系統(tǒng))中作為典型的例子，圖5顯示了用從血小板減少癥大鼠血漿部分純化的TPO樣品(由在實施例1-2的純化步驟(8)中描述的、來自YMC Pack Protein-RP柱的TPO活性級分F2)的劑量反應曲線。當在顯微鏡下周期性地觀察培養(yǎng)的細胞時，識別出巨核細胞的生成與成熟，也就是細胞大小的增加，這可能與巨核細胞數(shù)目的增加是一起進行的。特別顯著的變化是在第4天也就是培養(yǎng)的最后一天發(fā)現(xiàn)了巨核細胞突起的形成(在第3天時幾乎不能識別出巨核細胞的突起的形成)。這樣的突起形成稱為胞漿突起形成(Leven and Yee，Blood，vol.69，pp.1046-1052，1987)或前血小板突起形成(Topp etal.，Blood，vol.76，pp.912-924，1990)，后者被認為是由成熟巨核細胞進一步分化的血小板前體結(jié)構(gòu)以及被認為處在于體外目前可觀察到的巨核細胞分化的最終階段。由于單獨用TPO樣品以高頻率觀察到如此的形態(tài)學上的變化，可能該因子獨自能夠刺激CFU-MK增殖和分化，產(chǎn)生成熟巨核細胞并最終釋放血小板。(2)在集落測定系統(tǒng)中當采用集落測定系統(tǒng)檢測由血小板減少癥大鼠血漿部分純化的TPO樣品時，大鼠血漿來源的TPO刺激了巨核細胞集落的形成，所說的集落測定系統(tǒng)應用了未分離的大鼠骨髓細胞、每一分離/濃縮步驟的細胞或GpIIb/IIIa+CFU-MK級分。與由其它細胞因子如大鼠IL-3、小鼠GM-SF或人EPO導致的巨核細胞集落進行比較，TPO導致的巨核細胞集落的特征是每個集落由更小數(shù)目的巨核細胞組成，但每個巨核細胞體積更大，這意味著提前成熟。另外，由于TPO不產(chǎn)生或只產(chǎn)生很少的其它細胞系集落，TPO的Meg-CSF活性因而可被認為巨核細胞特異性的。基于這些事實，很明顯TPO具有不同于其它細胞因子如大鼠IL-3、小鼠GM-CSF和人EPO的生物學特性，并有獨特的Meg-CSF活性。
由血小板減少癥大鼠的血漿中部分純化的TPO樣品也對CD34+、來源于人骨髓細胞或人索狀血細胞的DR+細胞級分顯示其Meg-CSF活性并且顯著增加了人巨核細胞集落的數(shù)目，表明該因子無種屬特異性。
<實施例4>
大鼠產(chǎn)生TPO的細胞的特定(1)大鼠產(chǎn)生TPO的器官的篩選為了保證用于大鼠TPO基因克隆的mRNA來源，進行了大鼠TPO生產(chǎn)器官的篩選和特定。首先，定期從由施用P55抗體患有血小板減少的大鼠上獲取骨髓、肺、肝和脾臟，培養(yǎng)其細胞(肺和肝臟為器官的切片)，用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)檢測所產(chǎn)生的培養(yǎng)物上清液。然而這一最初嘗試并未取得明顯結(jié)果。后來進行了進一步嘗試，培養(yǎng)用膠原酶灌注由施用P55抗體導致的血小板減少大鼠的肝臟所制備的肝細胞，這是因為考慮到有一篇報道指出大鼠的肝臟與TPO產(chǎn)生之間有一定關(guān)系(Siemensma et al.，J.Lab.Clin.Med.，vol.86，pp.817-833，1975)。將所得培養(yǎng)物上清液加至WGA-Agarose柱上，然后在Vydac苯基反相柱上分餾已吸附的級分，在大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)中大鼠血裝來源的TPO活性相同的位置處發(fā)現(xiàn)了非常相似的活性。在正常大鼠肝細胞培養(yǎng)物上清液中也發(fā)現(xiàn)了較弱但相同的活性。這些結(jié)果強有力地表明肝臟是產(chǎn)生TPO的器官之一。(2)篩選大鼠產(chǎn)生TPO的細胞系基于上述結(jié)果，進行了大鼠產(chǎn)生TPO之細胞系的篩選。首先，將20種大鼠肝臟來源的細胞系中的每個細胞系在各自的繼代培養(yǎng)液基質(zhì)中培養(yǎng)直至細胞達到幾乎匯合狀態(tài)，用補充了5％FCS的相同的各自培養(yǎng)液基質(zhì)更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天。當按照上面步驟(1)所描述方法部分純化每一種所得培養(yǎng)物上清液以測定存在TPO的產(chǎn)生時，在三個大鼠肝臟實質(zhì)細胞來源的細胞系中發(fā)現(xiàn)了顯著的TPO活性，這三種細胞系叫作McA-RH8994細胞(ATCC保藏號CRL 1602；Beckeret al.，“Oncodevelopmental Gene Expression”ed.by Fishmanand Sell，Academic Press，NY.pp.259-270，1976；購自Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd.)、H4-II-E細胞(ATCC保藏號CRL 1548；Pitot et al.，Nat.Cancer Inst.Monogr.，vol.13，pp 229-245，1964；購自Dainippon Phannaceutical Co.，Ltd.)和HTC細胞(Thompson et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA，vol.56，pp.296-303，1966；購自Dainippon PharmaceuticalCo.，Ltd.)。(3)詳盡分析McA-RH8994細胞、H4-II-E細胞和HTC細胞中的TPO活性將由這三種大鼠細胞系分泌的TPO活性蛋白的生化和生物學特性進行了檢測，并與大鼠血漿來源的TPO進行了比較。
將McA-RH8994細胞懸浮在含10％FCS的α-MEM(-)液體培養(yǎng)基中并移入175cm2的塑料組織培養(yǎng)瓶中，每瓶含1×106個細胞。在5％CO2溫箱中于37℃培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)基換成含5％FCS的IMDM培養(yǎng)基，并繼續(xù)培養(yǎng)3天，回收所得的培養(yǎng)物上清液。將H4-II-E細胞懸浮在含10％FCS的Dulbecco′s改良Eagle液體培養(yǎng)基(葡萄糖4.5g/l，下文稱為“DMEM”)中并移入175cm2的塑料組織培養(yǎng)瓶中，每瓶含5×105個細胞。在5％CO2溫箱中于37℃培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)基換成含5％FCS的IMDM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3天，回收所得培養(yǎng)物上清液。同樣，將HTC細胞懸浮在含5％FCS的DMEM液體培養(yǎng)基中并移入175cm2的塑料組織培養(yǎng)瓶中，每瓶含2.5×105個細胞。在5％CO2溫箱中于37℃培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)基換成含5％FCS的IMDM培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)3天?；厥账门囵B(yǎng)物上清液。
應用分別從該三個細胞系培養(yǎng)所得的2升上清液，按照實施例1-2中所述的由XRP純化TPO的方法對各細胞系來源的TPO進行部分純化。下文描述了其結(jié)果的大致情況。
首先，用超濾裝置使每個培養(yǎng)物上清液濃縮約6倍并用SephadexG-25柱將培養(yǎng)基換成20mM Tris-HCl緩沖液(pH8.0)。所得洗脫液加至Q-Sepharose FF柱上，將該柱用20mM Tris-HCl(pH8.0)沖洗，然后吸附的級分用含175mM NaCl的20mM Tris-HCl(pH8.0)洗脫。所得洗脫的級分加至WGA-瓊脂糖柱上，將該柱用PBS沖洗，所吸附的級分用含0.2M GlcNAc和0.15M NaCl的20mM磷酸鈉(pH7.2)洗脫。所得洗脫液加至TSK-凝膠AF-BLUE 650MH柱上，將該柱用含1M NaCl的20mM磷酸鈉(pH7.2)沖洗，所吸附的級分用2M NaSCN洗脫。所得洗脫液加至Phenyl-Sepharose 6FF/LS柱上，將該柱先用含1.5M硫酸銨的50mM磷酸鈉(pH7.2)沖洗，再用含36mM磷酸鈉的0.8M硫酸銨沖洗，然后所吸附的級分用20mM磷酸鈉(pH7.2)洗脫。將所得吸附級分濃縮并用反相Vydac Protein C4柱(The Separations Group生產(chǎn)，目錄號214TP51015；直徑1cm；床高15cm)進行分餾。即將樣品加至預先用20％B平衡的C4柱上，用展開溶劑A中0.1％TFA和展開溶劑B中含0.05％TFA的1-丙醇，通過90分鐘內(nèi)由20％B線性梯度增至40％B，以1ml/min的流速進行有效的洗脫。結(jié)果在1-丙醇濃度為30-43％時洗脫出每種來源于這些細胞系的TPO活性蛋白質(zhì)。
當用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)檢測每一純化步驟樣品中TPO活性時，結(jié)果顯示這三種細胞系的TPO活性與XRP來源的TPO具有相似的型式(參見實施例1-2)。表2顯示了用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)檢測的每一純化步驟中的相對活性，活性產(chǎn)率等等。另外，當用大鼠CFU-MK系統(tǒng)檢測來源于最終反相柱的洗脫液的TPO活性時，在同一高峰區(qū)域發(fā)現(xiàn)了所說的三個細胞系的TPO活性和XRP來源的TPO。當用大鼠GpIIb/IIIa+CFU-MK分離和濃縮的去粘附步驟中獲得的非粘附細胞進行反相柱TPO活性級分的集落測定時，Meg-CSF活性的洗脫型式與用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)檢測的TPO活性的洗脫型式非常相似(參見表3)。另外，與XRP來源的TPO情況相似，三個細胞系中的每個細胞系的TPO活性未形成或很少形成其它細胞系的集落。
按照實施例1-2中描述的方法，將來自于反相柱的每種貯存的活性級分加至SDS-PAGE柱上。當從所產(chǎn)生的凝膠中提取蛋白質(zhì)且用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)檢測TPO活性時，發(fā)現(xiàn)XRP來源的TPO、McA-RH8994細胞來源的TPO和H4-II-E細胞來源的TPO的表觀分子量分別為17,000至22,000、33,000至39,000和31,000至38,000，且HTC細胞來源的TPO表現(xiàn)出表觀分子量為17,000至22,000和28,000至35,000。
因此，這些結(jié)果顯示了由McA-RH8994細胞、H4-II-E細胞和HTC細胞產(chǎn)生的TPO蛋白質(zhì)在其生物學特性方面等同于XRP來源的TPO，盡管其生化特性在表觀分子量上互相間略有不同。本發(fā)明的一個顯著發(fā)現(xiàn)是血液中含有的TPO活性蛋白分子可能是在其產(chǎn)生的細胞中或在其分泌之后于其上的特殊或非常規(guī)位點部分消化的產(chǎn)物這一可能性。它也提示可能存在具有不同長度的TPO基因(mRNA和cDNA)。
表2大鼠細胞系TPO的純化細胞系 McA-RH8994HTC H4-II-E步驟TP*1 RA*2 TA*3 TP RATATPRATA(mg)(mg) (mg)培養(yǎng)物上清液48068 38450 5760 5 28800 4087 5 20440Sephadex G25482416 77180 6458 1277500 4011 5 20050Q-Sepharose FF 197320 39460 3112 1546680 1821 1527320WGA-Agarose 76.01350102600 132.0 250 33000 80.0 907200TSK-凝膠AF-Blue 5.0 12500 62500 9.2 7500 69000 5.4 150 810650MHPhenyl-Sepharose14.7500 735013.1 2500 32750 11.4 170 19406FF/LSVydac Protein C40.23- - 0.75 - - 0.11 - -*1，總蛋白質(zhì)；*2，相對活性；*3，總活性表3由大鼠TPO(反相C4柱級分)刺激的大鼠巨核細胞集落形成洗脫丙醇 XRP集落 McA-RH8994集落 HTC集落 H4-II-E集落30.0-32.6％ 0 33 41832.6-34.7％ 0 13219 5034.7-36.7％ 67 290291 23036.7-38.8％ 70 214183 10338.8-40.9％ 2 15 52840.9-43.0％ 0 4 04<實施例5>
構(gòu)建用于cDNA文庫的表達載體(pEF18S)構(gòu)建cDNA片段可很容易整合進入的載體，且該載體能建立已克隆的cDNA高表達效率，以用于TPO cDNA的克隆和表達。即通過用已知為一高表達啟動子的延長因子1α(EF1α)啟動子替代SRα啟動子從表達載體pEF18S構(gòu)建表達載體pEF18S(參見圖6)。延長因子1α的啟動子是通過以下方法獲得的，即用限制性酶HindIII和EcoRI部分消化1μg的表達載體pEF-BOS(Mizushima et al.，NucleicAcids Res.，vol.18，p.5322，1990)，將消化物用于進行2％瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts生產(chǎn))電泳以分離出約1,200bp的DNA片段，并用Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.生產(chǎn)；為一用于選擇性純化DNA的試劑盒，它是基于Willis etal.在Bio Techniques，vol.9，pp.92-99，1990中所報導的方法發(fā)展的，它通過多孔硅石助成基質(zhì)DNA吸附有效地進行選擇性純化DNA)純化該DNA片段。將所得DNA片段一部分100ng與預先已用HindIII和EcoRI消化的50ng的表達載體pME18S連接(Liu et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.90，pp.8957-8961，1993)。將市售宿主株——高感受態(tài)(Competent High)E.coli DH5細胞(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn)；一種通過Hanahan et al.，J.Mol.Biol.，vol.166，pp.557-558，1983的改良方法制備的感受態(tài)E.coli株)以所得已構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化細胞之后，隨機選取12個集落并從每個集落中純化質(zhì)粒DNA。用分析這些DNA分子的限制性酶消化圖型獲得了總數(shù)為10個的含所希望質(zhì)粒(pEF18S)的克隆。此后，將所選的一個克隆培養(yǎng)以制備大量的質(zhì)粒DNA。
基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Labordorg Press，1989)中描述的方法進行質(zhì)粒DNA的純化。即將所獲克隆pEF18S于37℃在50ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基(1％Becto-胰胨，0.5％Becto-酵母提取液，0.5％NaCl)中培養(yǎng)過夜，將離心后收集的所得細胞懸浮在4ml TEG-溶菌酶溶液(25mN Tris-HCl，pH8，10mM EDTA，50mN葡萄糖，0.5％溶菌酶)中。向其中先加入8ml 0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后再加入6ml 3M鉀/5M乙酸鹽溶液以徹底懸浮細胞。將懸液離心后，用混有同樣體積異丙醇的苯酚/氯仿(1∶1)處理所得上清液，然后離心。將所得沉淀小團溶解于TE溶液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mM EDTA)中并用RNase處理，然后用苯酚/氯仿(1∶1)處理，再用乙醇沉淀。將所得沉淀小團再溶于TE溶液中，隨后加入NaCl和聚乙二醇3,000至兩者終濃度分別為0.63M和7.5％。離心后，將沉淀小團溶于TE溶液中并用乙醇沉淀。以這種方法得到了約300μg所說質(zhì)粒DNA。將其中100μg用EcoRI和NotI完全消化并進行0.8％瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts生產(chǎn))電泳，將回收的載體片段用Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(Bio-Rad Laboratocies，Inc.生產(chǎn))純化，以獲得在隨后的cDNA文庫構(gòu)建中使用的55μg質(zhì)粒DNA。
<實施例6>
McA-RH8994細胞的mRNA純化選取在實施例4的集落測定中顯示相對較高活性的McA-RH8994細胞作為用于大鼠TPO cDNA克隆的材料并進行下述實驗。
基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法進行全部RNA的分離。即在15個直徑為90mm的培養(yǎng)皿中McA-RH8994細胞生長至融合。移除液體基質(zhì)后，將每個皿中的細胞徹底懸浮在0.8ml5M胍溶液(5M硫氰酸胍，5mM檸檬酸鈉(pH7.0)，0.1Mβ-巰基乙醇，0.5％肌氨酰硫酸鈉(Sodium sarcosylsulfate))中，將所有培養(yǎng)皿中的所得懸液收集在一只試管中，用胍溶液將總體積調(diào)整至20ml。將由于細胞破壞變得粘滯的所得混合物用裝有18G針頭(后換成21G針頭)的一只20ml注射器重復進行約20次吹打直至該混合物變得幾乎不粘滯為止。用18ml 5.7M CsCl-0.1M EDTA(pH7.5)作為一用于Beckman SW28轉(zhuǎn)子的同質(zhì)異晶聚合物離心管中的緩沖層，將前述的約20ml混合物以各層不被破壞的方式輕輕置于緩沖層上，該試管幾乎裝滿。然后所制得的試管在20℃以25,000rpm離心20個小時。所產(chǎn)生的沉淀小團用少量80％乙醇沖洗兩次后溶于TE溶液中，然后用苯酚/氯仿(1∶1)提取，再用1/10體積的3M乙酸鈉和2.5倍體積的乙醇進行乙醇沉淀。以這種方法從約108個細胞中獲得了約2.5mg總RNA。
使用OligotexTM-dT30(Super)從總RNA中純化poly(A)+RNA(所用OligotexTM-dT30(Super)由Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche生產(chǎn)；通過共價結(jié)合使寡dT分子固定在膠乳顆粒上，且poly(A)+RNA的純化可以通過與使用一般用于此目的的寡dT柱相似的方法進行。結(jié)果是從約500μg總RNA中得到了20μg poly(A)+RNA。
<實施例7>
大鼠cDNA文庫的構(gòu)建用Time SaverTMcDNA合成試劑盒(Pharmacia生產(chǎn)；為基于Okayama and Berg，Mol.Cell.Biol.，vol.2，pp.161-170，1982的改良方法的cDNA試劑盒)和DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX，從實施例6中得到的5μg poly(A)+RNA中合成了在其5′末端有EcoRI識別位點且在其3′末端有NotI識別位點的雙鏈cDNA(所用的DIRECTIONAL CLONING TOOLBOX由Pharmacia生產(chǎn)；它是一組由一個用于合成cDNA的含一個NotI識別序列的引物5′-AACTGGAAGAATTCGCGGCCGCAGGAA(T)18-3′(SEQ ID NO15)與用于加入一個EcoRI識別序列的連結(jié)子5′-AATTCGGCACGAG-3′(SEQ ID NO16)和5′-CTCGTGCCG-3′(SEQ ID NO17)組成)。將所合成的cDNA與預先已用EcoRI和NotI消化的1.2μg表達載體pEF18S(參見實施例5)連接，并轉(zhuǎn)化入8.4ml前文所述的高感受態(tài)E.coli DH5(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))中。結(jié)果獲得了5.3×105轉(zhuǎn)化體。
<實施例8>用PCR制備(克隆)大鼠TPO cDNA片段將實施例7中構(gòu)建的530,000個克隆的McA-RH8994 cDNA文庫在含50μg/ml氨芐青霉素的50ml LB基質(zhì)中培養(yǎng)過夜，并用QIAGEN-tip 100(DIAGEN生產(chǎn)，為一用于DNA純化的陰離子交換硅柱)從通過離心收集的細胞中純化McA-RH8994 cDNA文庫質(zhì)粒。得到約200μg的質(zhì)粒DNA。
合成相應于實施例2中描述的肽片段AP 8氨基酸序列的2個反義核苷酸引物AP8-1R和AP8-2R以及相應于用于制備cDNA文庫的質(zhì)粒載體pEF-18S(參見圖6)。人延長因子1α的第一內(nèi)含子的2個有義核苷酸引物EF1α-1和EF1α-2。通過利用394DNA/RNA Synthesizer(Applied Biosystems生產(chǎn)；為一基于β-cyanoethylamdite法的合成儀)有效地進行這些引物的合成，且應用用于合成的DNA純化的OPC柱(Applied Biosystems生產(chǎn)；為一用于純化含有三苯甲游基團的合成DNA的反相硅膠柱)有效地對其進行了純化。將每一個如此合成和純化的DNA分子溶于TE溶液中至終濃度為50μM并貯于-20℃直至應用。合成在下述過程中應用的合成寡核苷酸并以同樣方法加以純化。
引物AP8-1R和AP8-2R為如Takahashi et al報導的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.82，pp.1931-1935，1985)含有17個連續(xù)核苷酸的混合引物，所說的核苷酸中摻入了脫氧肌苷。
基于Uetsuki et al.(J.Biol.Chem.，vol.264，pp.5791-5798，1989)報導的基因組序列第1491至1512位和1513位至1532位的核苷酸序列合成分別含21和20個核苷酸的引物EF1α-1和EF1α-2。AP8Ile Pro val Pro Pro Ala Cys Asp pro Arg Leu Leu(SEQ ID NO18)Thr(SEQ ID NO19)Ser(SEQ ID NO20)AP8-1R3′-ACG CTG GGG GCI GAT GA-5′ (SEQ ID NO21)A A A T A A (SEQ ID NO22)T(SEQ ID NO23)C(SEQ ID NO24)AP8-2R3′-GGG GGG CGG ACG CTG GG-5′ (SEQ ID NO25)A A A A A(SEQ ID NO26)T T T(SEQ ID NO27)C C C(SEQ ID NO28)EFla-15′-GGA TCT TGG TTC ATT CTC AAG-3′(SEQ ID NO29)EFla-25′-CCT CAG ACA GTG GTT CAA AG-3′ (SEQ ID NO30)應用3μg McA-RH8994cDNA文庫質(zhì)粒作為模板，AP8-1R(500pmol)和EF1α-1(100pmol)作為引物以及帶AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn)，為一組用于PCR的熱穩(wěn)定Taq聚合酶、反應緩沖液和dNTP)，通過GeneAmpTMPCR system 9600(Perkin-Elmer生產(chǎn)，為一PCR的熱循環(huán)器)進行PCR(100μl體積；于95℃加熱2分鐘，進行35次循環(huán)，每個循環(huán)由在95℃變性1分鐘、于40℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘組成，最后于72℃溫育7分鐘)。為了改善所擴增DNA片段的專一性，進行了進一步的PCR(100μl體積；于95℃加熱2分鐘，進行35次循環(huán)，每個循環(huán)包括在95℃變性1分鐘，于45℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘)，該PCR用1μl所得的PCR溶液作模板，用EF1α-2(100pmol)和AP8-2R(500pmol)作引物。
將所獲得的反應液進行2％瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts生產(chǎn))電泳以分離作為PCR主要產(chǎn)物的約330bp的DNA片段，所說片段利用前述的Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.生產(chǎn))進一步純化。應用T4 DNA連接酶(Life Technologies生產(chǎn))將所得純化的DNA片段亞克隆至pCRTMII載體(用于PCR產(chǎn)物的TA克隆的載體，Invitrogen生產(chǎn))。由于PCR中使用的熱穩(wěn)定聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移酶的活性，利用該酶的性質(zhì)將一個脫氧腺苷酸加至PCR擴增的DNA的3′末端使已擴增DNA片段直接亞克隆至具有5′-dT粘合末端的PCRTMII載體中。用QIAGEN-tip100(DIAGEN生產(chǎn))從所產(chǎn)生的克隆中隨機選出的28個克隆純化出質(zhì)粒DNA分子，且利用Taq Dye DeoxyTMTerminator Cycle Sequening Kit(AppliedBiosystems生產(chǎn)，為一基于Sanger et al.的雙脫氧方法Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.74，pp.5463-5467，1977，用熒光染料在PCR幫助的核苷酸測序中應用的試劑盒)，通過373A DNA測序儀(一種熒光測序儀，Applied Biosystems生產(chǎn))測定其核苷酸序列。
當從所得DNA片段中選出編碼上文所示AP8氨基酸序列中鄰近AP8-2R引物的三個氨基酸殘基(Ile/Thr/Ser)-Val-Pro的DNA片段且對其全長進行測序時，該片段包含了261bp的cDNA。該cDNA片段的第173位至175位編碼甲硫氨酸，且編碼框架與AP8的氨基酸框架一致。由于插入了所說DNA片段的第173位至175位的序列與Kozak的序列(Kozak，M.，Cell，vol.44，pp.238-292，1986)一致，因此看起來該cDNA片段含有一翻譯啟動區(qū)域，編碼大鼠TPO蛋白的N-末端。排除載體序列的A1片段的核苷酸序列以及由其推算出的氨基酸序列示于附于下文的Sepuence Listing(SEQ IDNO1)。
<實施例9>
用PCR篩選大鼠TPO cDNA將前文所述的cDNA文庫分成約10,000個克隆的小庫中，在1ml含50μg/ml氨芐青霉素的前述LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后用自動質(zhì)粒分離裝置PI-100(VER-3.0，Kurabo Industries，Ltd.生產(chǎn)；為一基于在Molecular Cloning，Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中公開的堿性SDS方法的改良法之上的自動質(zhì)粒DNA提取裝置進行質(zhì)粒DNA提取)。與此步驟分開的是基于cDNA片段A1合成了下面的兩個寡核苷酸并進行了純化。5′CGAGGGTGTACCTGGGTCCTG 3′(SEQ ID NO31)(SEQ ID NO1序列從第1至17位的一段有義序列；CGAG代表一連接物序列)5′CAGAGTTAGTCTTGCGGTGAG 3′(SEQ ID NO32)(SEQ ID NO1序列從第212至232位的一段反義序列)用每一種在上面步驟中獲得的質(zhì)粒DNA樣品的1/30體積作為模板，所合成的寡核苷酸作為引物以及帶AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，通過GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生產(chǎn))進行PCR(進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括于94℃變性30秒，于66℃退火30秒和于72℃合成1分鐘)。結(jié)果是在所檢測的100個小庫中的3個檢測出236bp的特異條帶。當將3個小庫中的一個再分成約900個克隆的亞小庫以提取質(zhì)粒DNA并且以同樣方法進行PCR時，在100個受檢測的亞小庫中的3個檢測出特異條帶。當將3個亞小庫中的一個再分成40個克隆的小庫且進行同樣的篩選過程時，在100個受檢測的小庫中的3個發(fā)現(xiàn)了特異條帶。將這些候選小庫中的一個在補充有50μg/ml氨芐青霉素的LB板(含有15％瓊脂的培養(yǎng)基)上培養(yǎng)，將每個所形成的集落進行質(zhì)粒DNA提取且按同樣的方法進行PCR。結(jié)果是在所檢測的100個克隆中的2個檢測出陽性條帶。
<實施例10>
大鼠TPO cDNA的測序基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的方法進行質(zhì)粒DNA的純化。將實施例9中得到的2個克隆的每一個均在含50μg/ml氨芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，在按實施例6中所述的同樣方法進行純化后得到了約300μg質(zhì)粒DNA。
按照實施例8中所述的同樣方法對所得質(zhì)粒DNA測序以確定含A1片段的全部核苷酸序列，這一過程中應用了Taq Dye DeoxyTMTerminator Cycle Sequening Kit(Applied Biosystems生產(chǎn))。結(jié)果是兩個克隆的核苷酸序列完全相同，這表明它們是同一克隆。選擇其中一個克隆，將其所載的質(zhì)粒稱為pEF18S-A2α。它的核苷酸序列以及以其推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO2)中。
示于Sequence Listing(SEQ ID NO2)中的序列具有顯著的特征。在172bp 5′非翻譯區(qū)下游的序列編碼了富含疏水氨基酸的氨基酸序列，該序列被認為是含有以甲硫氨酸為起始的21個氨基酸的一個蛋白分泌信號序列。該蛋白質(zhì)含有126個氨基酸殘基、一個1,025個核苷酸的3′非翻譯序列以及在終止密碼子(TAA)之后的poly A尾鏈。該蛋白質(zhì)含有相應于實施例2中分析出的氨基酸序列AP8的一段序列(SEQ ID NO2中從第1至12個氨基酸)，但并不含有N-糖基化的一段共有序列。緊緊位于3′非翻譯序列末端旁的第1624-1629核苷酸序列不同于一段共有序列，但似乎是潛在的多腺苷酸化序列。
由E.coli株DH5載有的載體pEF18S-A2α已由本發(fā)明人于1994年2月14日貯藏于日本國國際貿(mào)易與工業(yè)部工業(yè)科學與技術(shù)司生物科學與人類技術(shù)國家研究所中，貯藏號FERM BP-4565。
<實施例11>
COS1細胞中大鼠TPO cDNA的表達與TPO活性的確認按照下述稍加修改的DEAE-葡聚糖方法即包括氯喹處理(Sompayrac et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.78，pp.7575-7578，1981；Luthman et al.，Nucl.Acids Res.，vol.11，pp.1295-1308，1983)將質(zhì)粒pEF18S-A2α轉(zhuǎn)染入COS1細胞中。將COS1細胞(ATCC CRL 1650)懸浮在前文所述的含10％FCS的DMEM培養(yǎng)基中，置入100mm塑料組織培養(yǎng)皿中，在5％CO2溫箱里于37℃培養(yǎng)直至細胞達到約40％融合的階段。與此相獨立地，將溶于30μl HBS(21mM HEPES，145mM NaCl，pH7.1)中的pEF18S-A2α(10μg)加至4ml DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補充有500μg/ml的DEAE-葡聚糖(Pharmacia生產(chǎn))、80μM氯喹(Sigma ChemicalCo.生產(chǎn))、8％(v/v)HBS和9％(v/v)Nu-Serum(Collaborative Research，Inc.生產(chǎn))。將所得混合物加至上述培養(yǎng)的已用DMEM培養(yǎng)基沖洗兩次的COS1細胞，在5％CO2溫箱中于37℃繼續(xù)培養(yǎng)5小時。此后，吸出培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)物上清液，皿中留下的細胞用DMEM培養(yǎng)基沖洗兩次后，再加入15ml含10％ FCS的DMEM培養(yǎng)基在5％CO2溫箱中于37℃培養(yǎng)3至5天，回收所得培養(yǎng)物上清液。
將所得培養(yǎng)物上清液用IMDM培養(yǎng)基進行充分地透析且用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)進行評價。發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒pEF18S-A2α表達了的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中TPO活性是劑量依賴性的(見圖7)。與XRP來源的TPO相似，許多巨核細胞在4天的培養(yǎng)中形成了延長的細胞漿突起。與此相反，在只轉(zhuǎn)染了pEF18S的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中未發(fā)現(xiàn)TPO活性(圖7)。在M-07e測定系統(tǒng)中，也發(fā)現(xiàn)在質(zhì)粒pEF18S-A2α表達了的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中M-07e細胞增殖增強活性為劑量依賴性的，但在只轉(zhuǎn)染了pEF18S的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中卻未發(fā)現(xiàn)。這些結(jié)果表明A2α含有編碼具有TPO活性的蛋白質(zhì)的cDNA。
下一步，為了檢測該TPO活性在體內(nèi)促進血小板生成的能力制備了部分純化的TPO樣品。首先，將轉(zhuǎn)染了質(zhì)粒pEF18S-A2α的COS1細胞在補充有0.2mg BSA的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，從而得到約5.8升無血清培養(yǎng)物上清液。向該無血清培養(yǎng)物上清液中加入蛋白酶抑制劑p-APMSF至終濃度為1mM，并且0.22μm過濾器過濾該混合物。向所得5,793ml濾液(蛋白質(zhì)濃度，0.229mg/ml；總蛋白質(zhì)，1,326mg；相對活性，1,000；總活性，1,326,000)中加入1000ml的0.85moles(總共288g)NaCl，從而得到5,849ml含0.822M NaCl的溶液。將所制備的溶液以7ml/min的流速加至預先已用含1M NaCl的20mM磷酸鈉(pH7.2)平衡過的TSK-凝膠AF-BLUE 650MH柱(Tosoh Corp.生產(chǎn)，目錄號08705；直徑5cm，床高6cm)上。在樣品加樣完畢后，用含1M NaCl的20mM磷酸鈉(pH7.2)7,900ml作為洗脫液過柱。貯存洗脫液并用一超濾裝置(Omega Ultrasette，標定截留分子量8,000，F(xiàn)iltron生產(chǎn))濃縮，獲得過柱級分F1(460ml；蛋白質(zhì)濃度，2.11mg/ml；總蛋白質(zhì)，973mg；相對活性，16.3)。下一步，洗脫溶液改為2M NaSCN，用帶YM3膜的超濾裝置(直徑76mm，Amicon Corp.生產(chǎn))將洗脫的TSK-凝膠AF-BLUE650MH吸附的TPO活性級分F2(2840ml)濃縮至6.81ml。該TPO活性級分F2中的總蛋白為12.5mg，此步驟F2的蛋白產(chǎn)率為0.62％。TPO相對活性計算為240。下一步，將F2加至HiLoad 26/60Superdex 200pg(Pharmacia Biotech生產(chǎn)，目錄號17-1071-01；直徑2.6cm；床高60cm)上并用含50mM NaCl的20mM乙酸鈉(pH5.5)以1ml/min的流速展開。展開開始后，在加樣后的194至260ml范圍的洗脫液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性。將這些洗脫液貯存，得到Superdex200pg TPO活性級分F2(66ml；蛋白質(zhì)濃度，0.112mg/ml；總蛋白質(zhì)，7.41mg；相對活性，142,860；總活性，1,058,600)。下一步，制備緩沖液A(20mM乙酸鈉，pH5.5)和緩沖液B(20mM磷酸鈉，pH7.2，含500mM NaCl)，將該TPO活性級分以1ml/min的流速加至預先用100％A平衡過的強陽離子交換柱RESOURCE S(PharmaciaBiotech生產(chǎn)，目錄號17-1178-01；直徑0.64cm；床高3cm)上。此后，利用在40分鐘內(nèi)由100％A轉(zhuǎn)至100％B的線性梯度以0.3ml/min的流速進行洗脫。在較寬范圍的洗脫液中(從5％B至32％B)檢測出TP0活性。貯存這些洗脫液并用帶YM3膜的超濾裝置(直徑25mm，由Amicon Corp.生產(chǎn))濃縮，得到RESOURCE S TPO活性級分F2(1.65ml；蛋白質(zhì)濃度，4.74mg/ml；總蛋白質(zhì)，7.82mg；相對活性，71,400；總活性，558,600)。
將部分純化的TPO樣品連續(xù)5天皮下給藥(474μg(100μl)/只/天)至在給藥前的當天已測過血小板數(shù)目的1CR雄性小鼠(9周齡)。作為對照，以同樣方法用BSA(200μg(100μl)/只/天)或作為部分純化TPO溶劑的緩沖液(100μl/只/天)給藥。在最后一次給藥后的第二天，從每只小鼠的心臟收集血液，用血球計(F800，Toa Iyo Denshi生產(chǎn))測定血小板數(shù)目。在施用部分純化TPO的小鼠中，與給藥前的血小板數(shù)相比血小板數(shù)增加了約2.14倍。與對照組相比，在施用部分純化TPO的小鼠中血小板數(shù)的增加比給BSA的小鼠高約1.74倍，比給緩沖液的小鼠高約1.9倍。這些結(jié)果顯示TPO促進了體內(nèi)血小板生成。另外，由于在施用部分純化TPO的小鼠中，被稱為小鼠急性期蛋白的免疫抑制酸性蛋白(IAP)的數(shù)量并沒有升高，所以這有力地表明在誘導急性期蛋白方面TPO不同于IL-6和IL-11。
<實施例12>
大鼠組織中TPO mRNA的檢測為了定位大鼠體內(nèi)大鼠TPO mRNA表達的組織，從不同的大鼠組織中提取RNA。用總數(shù)6只的大鼠按實施例1中描述的相同方法進行X線照射，在照射后第11至14天時從大鼠身上切除不同組織(腦、胸腺、肺、肝、心、脾、小腸、腎、睪丸和骨髓細胞)，且立即在液氮中冷凍。通過用RNA分離試劑ISOGEN(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd生產(chǎn))有效地進行總RNA提取。依照每一冷凍組織樣品的重量確定所用ISOGEN的量，將已加入該試劑的組織樣品用均漿器(PhyscotronRNS-60，NITI-ON Medical & PhysicalInstruments MFG.Co.，Ltd生產(chǎn))處理直至得到完全打碎的組織(約在10,000rmp下45至60秒)。利用基于Chomczynski et al.的酸胍苯酚氯仿法(Anal.Biochem.，vol.162，pp.156-159，1987)的方法將組織均漿進行總RNA提取。結(jié)果，從各組織中獲得了1.1至5.6mg的總DNA。
利用OligotexTM-dT30(Supper)(Japan Synthetic Rubber/Nippon Roche生產(chǎn))，從約500μg總RNA中純化出20μg poly(A)+RNA。
用隨機引物，從獲自每一組織的1μg poly(A)+RNA中合成cDNA的第一股鏈。即，將1μg poly(A)+RNA溶于10μl無菌水中，于70℃溫育15分鐘，然后快速冷卻。向其中加入75pmoles隨機引物(Takara Shuzo Co.，Ltd.)、10U RNase抑制劑(Bochringer-Mannheim Corp.)、50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM of KCl、3mM MgCl2和200U Super ScriptTMII(一種由LifeTechnologies生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄酶)。所制備溶液(總體積20μl)于室溫下溫育1小時，且所產(chǎn)生的反應溶液于70℃溫育10分鐘以使酶失活，然后貯于-20℃直至使用。
基于實施例10獲得的大鼠TPO cDNA序列合成用于PCR的新引物。所合成的引物的序列如下rTPO-I5′-CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG-3′(SEQ ID NO33)(SEQ ID NO2中的第347至367位)rTPO-N5′-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3′(SEQ ID NO34)(相應于SEQ ID NO2中第1005至1025位的反義引物)。
用1/10體積的每一種合成的cDNA溶液作為模板、1μM每一種所合成的rTPO-I和rTPO-N作為引物以及帶AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Lte.生產(chǎn))，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生產(chǎn))在100μl體積內(nèi)進行PCR，于95℃加熱2分鐘，重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘、于57℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。當將所得的每一反應溶液用2％瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts生產(chǎn))進行電泳以及檢測擴增條帶時，在來自于腦、肝、小腸和腎臟的凝膠上發(fā)現(xiàn)了似為TPO mRNA特異性的條帶。這些結(jié)果表明大鼠中TPO mRNA的表達發(fā)生于這些器官中，盡管其表達的量不能判定。當將人體內(nèi)可能存在相似的表達方式以及實施例4的結(jié)果結(jié)合起來加以考慮時，似乎肝臟是獲得人TPOcDNA的適宜起始物質(zhì)。
<實施例13>
人正常肝臟來源的cDNA文庫的構(gòu)建基于實施例12的結(jié)果，選擇肝臟作為用于克隆人TPO cDNA的起始物質(zhì)。按照實施例7中描述的同樣的方法，用Time SaverTMcDNA合成試劑盒(Pharmacia生產(chǎn))和DIRECTIONAL CLONINGTOOLBOX(Pharmacia生產(chǎn))從5μg商售的正常人肝臟來源的poly(A)+RNA(由Clontech生產(chǎn)，為一基于Chomczynski et al.的酸胍苯酚氯仿法提取的產(chǎn)物)中合成了在其5′末端有EcoRI識別位點且在其3′末端有NotI識別位點的雙鏈cDNA。將所合成的cDNA與1.2μg預先已用EcoRI和NotI消化的前文所述的表達載體pEF18S連接，并轉(zhuǎn)化至8.4ml前文所述的高感受態(tài)E.coli DH5(ToyoboCo.，Ltd.生產(chǎn))中。結(jié)果得到了1.2×106轉(zhuǎn)化體。
<實施例14>用PCR制備(克隆)人TPO cDNA片段用隨機引物，從1μg市售正常人肝臟來源的poly(A)+RNA(Clontech生產(chǎn))中合成cDNA第一股鏈。即將1μg poly(A)+RNA溶于10μl無菌水中，于70℃溫育15分鐘，然后快速冷卻。向其中加入75pmoles隨機引物(Takara Shuzo Co.，Ltd)、10URNase抑制劑(Boehringer-Mannheim Corp.)、50mM Tris-HCl(pH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2和200U反轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptTMII(Life Technologies)。將所制得的溶液(總體積20μl)于37℃溫育1小時，且將所得反應溶液于70℃溫育10分鐘以使酶失活，然后貯于-20℃直至應用。
按照大鼠TPO cDNA序列(SEQ ID NO2)合成用于PCR的引物。所合成引物的序列如下rTPO-AIN5′-ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC-3′(SEQ IDNO35)(SEQ ID NO2中第173至193位)rTPO-N5′-TGA AGT TCG TCT CCA ACA ATC-3′(SEQ ID NO36)(相應于SEQ ID NO2中第1005至1025位的反義引物)。
用1/10體積的合成cDNA溶液作為模板，1μM每種所合成的rTPO-AIN和rTPO-N作為引物以及帶AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd生產(chǎn))，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-EIMER生產(chǎn))在100μl體積內(nèi)進行PCR，于95℃加熱2分鐘，重復35個循環(huán)，每個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘、于40℃退火1分鐘以及于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。
將所得反應溶液進行2％瓊脂糖凝膠(FMC BioProducts)電泳以分離出作為PCR主要產(chǎn)物的約620bp的DNA片段，它隨后利用前文所述的Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(Bio-Rad Laboratories.Inc.)進行純化。所純化的DNA片段的核苷酸序列利用前文所述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening Kit(AppliedBiosystems生產(chǎn))由373A DNA測序儀(Applied Biosystems生產(chǎn))直接確定。所測定的排除引物部分的核苷酸序列以及由此推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO3)中。
該排除了引物序列的DNA片段長580bp。當進行比較時，人cDNA顯示出與大鼠cDNA核苷酸序列具有80％的同源性，這表明該DNA片段編碼了一部分人TPO cDNA。
<實施例15>
用PCR篩選人TPO cDNA克隆基于SEQ ID NO3合成進行PCR的人TPO相應的引物。所合成的引物序列如下hTPO-I5′-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3′(SEQ ID NO37)(SEQ ID NO3中第60至80位)hTPO-J5′-TGA CGC AGA GGG TGG ACC CTC-3′(SEQ ID NO38)(相應于SEQ ID NO3中第479至499位的反義引物)。
擴增在實施例13中構(gòu)建的人cDNA文庫，且分成多個小庫(每庫含約100,000個克隆)，在1ml含50μg/ml氨芐青霉素的前文所述的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，用自動質(zhì)粒分離裝置PI-100(VER-3.0，Kurabo Industries，Ltd.生產(chǎn))進行質(zhì)粒DNA提取。所提取的DNA溶于TE溶液中。
用5％提取的DNA樣品作為模板、1μM每種合成的寡核苷酸(hTPO-I和hTPO-J)作為引物以及帶AmpliTaqTMDNAPolymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，通過GeneAmpTMPCR系統(tǒng)9600在20μl體積中進行PCR(總共35個循環(huán)，每個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘、于59℃退火1分鐘和在72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘)。結(jié)果是在所用的90個小庫中的3個中檢測出特異的條帶。將3個小庫中的一個分成亞小庫，每個約含約5,000個克隆，從90個亞小庫中純化出質(zhì)粒DNA以用相同的方法進行PCR。結(jié)果是在5個亞小庫中檢測出特異性的條帶。將這5個小庫中的一條再分成小庫，每個含250個克隆，從90個小庫中提取質(zhì)粒DNA。當將這些提取的樣品以同樣方法進行PCR時，在三個小庫中檢測出特異性條帶。將這三個小庫其中之一進一步分成亞小庫，每個含30個克隆，從90個亞小庫中純化質(zhì)粒DNA，按同樣方法進行PCR。結(jié)果是，在3個亞小庫中檢測出特異性條帶。將候選小庫其中之一在含50μg/ml的氨芐青霉素的前述LB板上培養(yǎng)，且將所形成的90個集落的每一個進行質(zhì)粒DNA提取以及以同樣方法進行PCR。結(jié)果最終獲得了克隆HL34。
<實施例16>
人TPO cDNA的測序基本上按照Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法進行質(zhì)粒DNA的純化。在含有50μg/ml氨芐青霉素的50ml LB培養(yǎng)基中將克隆HL34培養(yǎng)過夜，將通過離心所收集的細胞懸浮在4ml前文所述的TEG-溶菌酶溶液中。向其中加入8ml0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后再加入6ml 3M鉀/5M乙酸鹽溶液，完全懸浮細胞。將懸浮液離心后，將所得上清液用苯酚/氯仿(1∶1)處理，與同等體積的異丙醇混合，然后離心。所得沉淀小團溶于TE溶液中并以RNase處理，然后用苯酚/氯仿(1∶1)處理，再用乙醇沉淀。將所得沉淀小團再溶于TE溶液中，隨后加入NaCl和聚乙二醇3,000至其終濃度分別為0.63M和7.5％。離心后，沉淀小團溶于TE溶液中，用乙醇沉淀。以這種方式，獲得了約300μg pEF18S-HL34質(zhì)粒DNA。
將所純化的質(zhì)粒DNA加至前文所述的373A DNA測序儀(AppliedBiosystems生產(chǎn))上，以便用前文所述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening Kit(Applied Biosystems生產(chǎn))測定其完整的核苷酸序列。所測的核苷酸序列以及由其推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO4)中。在此例中，將基于SEQ ID NO3的核苷酸序列合成的寡核苷酸和基于由序列分析獲得的內(nèi)部序列設(shè)計的合成寡核苷酸在核苷酸測序中用作引物。
結(jié)果證實了質(zhì)?？寺EF18S-HL34包含一個861bp的cDNA片段，且含有與實施例2中分析的氨基酸序列AP8(SEQ ID NO4中第l至12位氨基酸)和TP2/TP3(SEQ ID NO4中第157至162位氨基酸)具有高度同源性的序列。該DNA片段似乎在其第25位為起始編碼了一個開放閱讀框，但沒有終止密碼子，它在其3′末端含有76個堿基的多聚A尾狀序列。其含有正在多聚A尾狀序列之前的253個氨基酸殘基的氨基酸序列顯示與大鼠TPO cDNA相應部分(SEQID NO2中顯示的包括147個殘基的氨基酸序列部分)有84％的同源性。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該克隆為編碼相應于大鼠TPO cDNA的人cDNA部分的DNA片段。由于缺少終止密碼子以及在其3′末端存在多聚A尾狀序列，似乎該克隆并不是完整的cDNA，而是在cDNA文庫構(gòu)建過程中產(chǎn)生的人工產(chǎn)物。
<實施例17>
在COS1細胞中表達人TPO cDNA以及證實TPO活性按照實施例11的方法將所得質(zhì)粒克隆pEF18S-HL34轉(zhuǎn)染至COS1細胞中。即借助包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖法用10μg的質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)染。于37℃培養(yǎng)COS1細胞3-5天，然后收集上清液。
用IMDM培養(yǎng)基充分透析所得的培養(yǎng)物上清液，并用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)進行評估。在質(zhì)粒pEF18S-HL34表達的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中，檢測出TPO活性是劑量濃賴性的(圖8)。培養(yǎng)4天后，許多巨核細胞形成了增長的細胞漿突起。與此相反，在只表達pEF18S的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中未發(fā)現(xiàn)TPO活性(圖8)。在M-07e測定系統(tǒng)中，只在通過質(zhì)粒pEF18S-HL34的轉(zhuǎn)染對其進行表達的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了M-07e細胞增殖增強活性。這些結(jié)果表明pEF18S-HL34含有編碼具有TPO活性蛋白質(zhì)的基因。另外，這也表明人TPO作用于大鼠巨核細胞祖細胞(沒有種特異性)。
<實施例18>
人TPO缺失型cDNA的表達以及TPO活性的證實實施例15中得到的克隆HL34含有在其3′末端存在多聚A尾狀連續(xù)序列的cDNA，該序列并不存在于大鼠TPO cDNA中，因此似為實驗的人工產(chǎn)物。結(jié)果制備去除了多聚A尾狀序列的cDNA分子以觀察是否由缺失cDNA表達的蛋白具有TPO活性。利用PCR制備缺失cDNA。用于PCR的引物序列如下，在各引物的5′末端加上了一個限制性酶識別位點(EcoRI加至hTPO5，NotI與兩個終止密碼子TAA和TGA加至hTPO3)。hTPO55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3′(SEQ ID NO170)(SEQ ID NO4中第1至21位)hTPO35′-TTTGCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATC CTG TTCAGG TAT CC-3′(SEQ ID NO171)(相應于SEQ ID NO4中第757至780位的反義引物)。
用實施例16中得到的質(zhì)粒克隆pEF18S-HL34的質(zhì)粒DNA 1μg作為模板、10μM每個所合成的hTPO5和hTPO3作為引物以及帶AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，利用GeneAmpTMPCR System9600(PERKIN-ELMER生產(chǎn))在100μl體積內(nèi)進行PCR，重復15個循環(huán)，每個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘、于65℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后在72℃溫育7分鐘。用限制性酶EcoRI和NotI消化所獲得的約800bp的一條帶，進行純化，然后亞克隆至預先用同樣限制性酶處理過的表達載體pEF18S中。從所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中選出5個含約800bp DNA片段的克隆，按照實施例5中所述方法制備大量質(zhì)粒DNA。將各質(zhì)粒約800bp的已擴增區(qū)的全長進行核苷酸序列分析以發(fā)現(xiàn)其與實施例16中分析的核苷酸序列(SEQ ID NO4中的第1至780位)的完全一致性。
所獲得的質(zhì)粒克隆稱為pHT1-231。由E.coli DH5所載的載體pHT1-231已被本發(fā)明人于1994年2月14日保藏于日本國國際貿(mào)易和工業(yè)部工業(yè)科技司國家生物科學與人類技術(shù)研究所，其保藏號為FERM BP-4564。
按照實施例11的方法將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至COS1細胞中。即借助包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖法用10μg質(zhì)粒DNA進行轉(zhuǎn)染。COS1細胞于37℃培養(yǎng)3-5天，收集上清液。
用IMDM培養(yǎng)基充分透析所得培養(yǎng)物上清液，并用大鼠CFU-MK測定系統(tǒng)進行評價。在質(zhì)粒pHT1-231表達的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性(圖9)。在培養(yǎng)的4天中，許多巨核細胞形成了增長的細胞漿突起。與此相對照，在只有質(zhì)粒pEF18S表達的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中未發(fā)現(xiàn)TPO活性(圖9)。在M-07e測定系統(tǒng)中，只在質(zhì)粒pHT1-231表達的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中發(fā)現(xiàn)了M-07e細胞增殖增強活性。這些結(jié)果顯示pHT1-231含有編碼具有TPO活性的cDNA。
<實施例19>
用PCR制備人TPO cDNA 3′末端區(qū)由于實施例15中制備的克隆HL34含有包含多聚(A)尾狀序列的cDNA，所以這表明其3′末端是不完整的。因此嘗試用PCR獲得全長3′末端區(qū)?；趯嵤├?6中測定的序列，合成了用于PCR的下列4種5′側(cè)的引物hTPO-H5′-AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC-3′(SEQ ID NO39)(SEQ ID NO4的第574-594位)hTPO-K5′-ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC-3′(SEQ ID NO40)(SEQ ID NO4的第595-615位)hTPO-N5′-AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT-3′(SEQ ID NO41)(SEQ ID NO4的第660-680位)hTPO-05′-AGG GAT TCA GAG CCA AGA TTC-3′(SEQ ID NO42)(SEQ ID NO4的第692-712位)合成在3′末端的四個堿基處含混合核苷酸的下列3′側(cè)引物，以從多聚(A)部分開始擴增cDNA。也合成了沒有混合核苷酸的錨引物。hTPO3mix5′-TAG CGG CCG C(T)17G GGG-3′(SEQ ID NO43)A AAA-3′(SEQ ID NO44)C TTT-3′(SEQ ID NO45)CCC-3′(SEQ ID NO46)hTPO3錨5′-TAG CGG CCG C(T)11-3′ (SEQ ID NO47)正如實施例14中所作的，從1μg市售的正常人肝臟來源的多聚(A)+RNA(Clontech生產(chǎn))合成cDNA第一股鏈，但用的是0.5μg寡dT引物(它包括在由Pharmacia生產(chǎn)的TimeSaverTMcDNASynthesis Kit中)。用1/10體積的合成cDNA溶液作為模板，20μM的hTPO-H引物和10μM的hTPO 3mix引物以及帶AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shuzo Co.，Ltd.生產(chǎn))，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER)在50μl體積內(nèi)進行PCR，并于96℃加熱2分鐘，重復10個循環(huán)，每個循環(huán)包括于96℃熱變性1分鐘、于48℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。
用1/10體積的第一次PCR形成的溶液作模板、體積為50μl的20μM的hTPO-K引物和1OμM的hTPO 3mix進行第二次PCR，于96℃加熱2分鐘，重復10個循環(huán)，每個循環(huán)包括于96℃熱變性1分鐘、于63℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。
由1/10體積的第二次PCR形成溶液作模板、體積為50μl的20mM hTPO-N引物和10μM hTPO 3mix引物進行第三次PCR，于96℃加熱2分鐘，重復10個循環(huán)，每個循環(huán)包括于96℃熱變性1分鐘、于63℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。
用1/10體積的第三次PCR形成溶液作模板、體積為50μl的20μM hTPO-○引物和10μM hTPO 3mix引物進行第四次PCR，于96℃加熱2分鐘，重復10個循環(huán)，每個循環(huán)包括于96℃熱變性1分鐘、于63℃退火分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。
用1/10體積的第4次PCR形成溶液作模板、50μl 20μM hTPO-○引物和20μM hTPO3錨引物進行第五次PCR，于96℃加熱2分鐘，重復10個循環(huán)，每個循環(huán)包括于96℃熱變性1分鐘、于58℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，最后于72℃溫育7分鐘。
將所得反應溶液進行2％瓊脂糖凝膠(FMC Bio-Products生產(chǎn))電泳，分離作為PCR主要產(chǎn)物的約600bp的DNA片段，它隨后利用前文所述的Prep-A-Gene DNA純化試劑盒(Bio-Rad Laboratories，Inc.生產(chǎn))進行純化。利用前文所述的Taq Dye DeoxyTMTerminaterCycle Sequening Kit(Applied Biosystems生產(chǎn))，通過373A DNA測序儀(Applied Biosystems生產(chǎn))直接測定所純化的DNA片段的核苷酸序列。將所測定的核苷酸序列和由此推算的氨基酸序列示于Sequence Listing(SEQ ID NO5)。
該DNA片段具有編碼起自引物hTPO-○的130個氨基酸的核苷酸序列，其后跟有在3′末端的多于180個核苷酸的序列(第577位以后的核苷酸不能確定)。起自甘氨酸的30個氨基酸序列與SEQ IDNO4中的第203-232位的氨基酸序列一致。第1-94位的核苷酸序列也與SEQ ID NO4中的第692-785位的核苷酸序列一致。
實施例17中cDNA片段以及本實施例中經(jīng)PCR擴增之片段的序列分析結(jié)果使人們有理由估計人TPO蛋白由含有示于SEQ ID NO6中的21個氨基酸信號序列的353個氨基酸所組成。
<實施例20>
人正常肝臟來源的cDNA文庫的構(gòu)建由于實施例15中所得的克隆HL34直接在其開放閱讀框架的3′末端上含有多聚A尾狀序列而無終止密碼子且似乎因此為cDNA合成的人工產(chǎn)物，所以用5μg商售人肝臟來源多聚(A)+RNA制劑(Clontech生產(chǎn))重新構(gòu)建cDNA文庫。由用于cDNA合成的SuperScriptTMLambda System和λCloning Kit以及SuperScriptTMII RNase H-(兩者均由LIFE TECHNOLOGIES生產(chǎn))進行cDNA合成。將多聚(A)+RNA進行熱變性，然后加至20μl作為引物附于試劑盒的、含NotI序列包括在內(nèi)的寡dT的反應液(50mMTris-HCl，pH8.3，75mM KCl，3mM MgCl2，1mM DTT，1mMdNTP mix，200U SuperScriptTMII RNase H-)中，然后在37℃溫育60分鐘。在cDNA的第二股鏈合成后(在150μl反應液中于16℃溫育2小時，該反應液含有25mM Tris-HCl(pH8.3)、100mM KCl、5mM MgCl2、250μM dNTP mix、5mM DTT、40U E.coli DNA聚合酶I、2U E.coli RNase H和10U E.coli DNA連接酶)，加入10U T4 DNA聚合酶，將所得混合物于16℃溫育5分鐘。將反應液在65℃加熱10分鐘，用相同體積苯酚/氯仿提取并用SizeSepTM400旋轉(zhuǎn)柱(一種附于由Pharmacia生產(chǎn)的TimeSaverTMcDNA Synthesis Kit中的、用于去除低分子量DNA的旋轉(zhuǎn)柱)去除長度小于400bp的cDNA分子。在加入EcoRI連接物(附于Pharmacia生產(chǎn)的Directional Cloning Toolbox)后，用NotI消化所處理的樣品并再加至SizeSepTM400旋轉(zhuǎn)柱上以去除低分子量DNA。將所合成的1.3μg在其5′末端具有EcoRI識別序列且在3′末端具有NotI識別序列的雙股cDNA與已用EcoRI和NotI消化過的表達載體pEF18S連接，然后轉(zhuǎn)化至9.2ml高感受態(tài)E.coliDH5(Toyobo Co.，Ltd.生產(chǎn))中。所得人肝臟cDNA文庫(hTPO-F1)含1.0×106個轉(zhuǎn)化體。
<實施例21>
從人肝臟cDNA文庫hTPO-F1中篩選TPO cDNA克隆基于SEQUENCE LISTING中顯示的Sequence ID Nos3和6合成用于PCR的人TPO cDNA相應的引物。所合成引物的序列如下hTPO-I5′-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3′(SEQ ID NO48)(SEQ ID NO3中第60-80位)hTPO-KU5′-AGG ATG GGT TGG GGA AGG AGA-3′(SEQ IDNO49)(相應于SEQ ID NO6中第901-921位序列的反義引物)。
將實施例20中構(gòu)建的人肝臟cDNA文庫hTPO-F1(1.0×106個轉(zhuǎn)化體)分至3個小庫(庫號1-3)中，將小庫冷凍。用從各小庫制得的質(zhì)粒DNA作模板以及用1μM各合成的寡核苷酸(hTPO-I和hTPO-KU)作引物進行PCR。用帶AmpliTaqTMDNA Polymerase的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(Takara Shzuo Co.，Ltd生產(chǎn))，通過GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生產(chǎn))在100μl體積中進行PCR(總共35個循環(huán)，各個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘、于59℃退火1分鐘以及于72℃合成1分鐘；最后于72℃溫育7分鐘)。結(jié)果當用從3號小庫制得的質(zhì)粒DNA時，擴增了具有所期望大小的DNA片段。然后將3號小庫分成亞小庫，每個亞小庫含15,000個轉(zhuǎn)化體，在含50μg/ml氨芐青霉素的1ml LB培養(yǎng)基中將這些亞小庫培養(yǎng)過夜，然后用自動質(zhì)粒分離裝置P1-100提取質(zhì)粒DNA。將所提取的DNA溶于TE溶液中，用5％的所得溶液作為模板以進行使用如上文所述的相同引物和在相同條件下的PCR。結(jié)果在90個小庫中的6個發(fā)現(xiàn)了具有所期望大小的DNA的擴增。將這些陽性小庫其中之一再分成亞小庫，使每個亞小庫含1,000個克隆時，提取質(zhì)粒DNA并以上文所述的相同方法進行PCR，未觀察到DNA的擴增。在由一系列PCR擴增的DNA片段的電泳凝膠上，條帶的密度在亞小庫被進一步細分時變得越來越薄。這似乎是由于所感興趣的克隆較差的生長引起質(zhì)粒DNA低回收率所導致的。因此，用原來的3號小庫應用集落雜交法進行另一次篩選。
將3號小庫散開于直徑15cm的100LB瓊脂板上，其接種強度為每塊LB瓊脂板上生長4,100個集落。在從每塊所接種的平板制備一復制平板后，將復制平板其中之一于37℃培養(yǎng)6小時以回收在平板上生長的集落并提取質(zhì)粒DNA樣品。當以上文所述相同的方式對這些DNA樣品進行PCR時，在100個亞小庫中的一個觀察到一等同于所期望大小的條帶的擴增。用BIODYNETMA TRANSFER MEMBRANE(PALL生產(chǎn))由該亞小庫的平板制得2塊復制過濾器。這些濾器的變性是通過將其依次浸入10％SDS中10分鐘、0.5N NaOH/1.5M NaCl 10分鐘和0.5M Tris-HCl(pH8.0)/1.5M NaCl 10分鐘而進行的，其后進行30分鐘風吹干燥，再在真空爐中于80℃烘焙1小時。烘焙過的濾器用補充用1％SDS的6×SSC(通過稀釋溶于1升水中的175.3g NaCl和88.2g檸檬酸鈉組成的20×SSC貯存液制備)沖洗。所沖洗濾器的預雜交是通過于42℃溫育30分鐘、同時在30ml反應液中搖動而進行的，所說反應液由50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液(由在500ml水中含5g Ficoll、5g聚乙烯吡咯烷酮和5g牛血清白蛋白級分V的50×Denhardt′s液制得)、1％SDS和20μg/ml鮭魚精子DNA。預雜交后，用含有相同成分的30ml雜交溶液置換反應液，與已際有[α-32P]dCTP(Amersham生產(chǎn))的探針混合，然后于42℃搖動溫育20小時。用于本實驗的標記探針為質(zhì)粒pEF18S-HL34的EcoRI/BamHI片段，它是通過純化SEQ IDNO4的從5′末端至第458位堿基的部分以及標記所純化部分而制得的，而所說的純化部分的標記是通過用Megaprime DNA LabellingSystem(基于Ahal.Biochem.，132，6-13，1983所公開的方法、由Amersham生產(chǎn)的試劑盒)的隨機引物技術(shù)進行的。處理后的濾器在2×SSC/0.1％SDS液中于42℃沖洗30分鐘，然后在0.2×SSC/0.1％SSD液中于42℃沖洗30分鐘。然后用增感屏和X-OMATTMAR5膠片(Eastman Kodak生產(chǎn))將濾器在-70℃進行16小時放射自顯影。結(jié)果，觀察到被認為是陽性的單個信號。從原平板收集大約相應于該信號的集落，并再于10cm LB瓊脂平板上接種。分別培養(yǎng)生長于該平板上的50個集落，在如前文所述的相同條件下用前述引物hTPO-I和hTPO-KU對這些集落的DNA樣品進行PCR。結(jié)果僅在一個克隆中發(fā)現(xiàn)了等同于所期望大小的條帶的擴增，該克隆稱為pHTF1。
<實施例22>
確定ATPO cDNA克隆pHTF1的核苷酸序列基本上按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述的方法純化質(zhì)粒DNA。在含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中將克隆pHTF1培養(yǎng)過夜。離心收集所得的細胞，然后懸于4ml前述的TFG-溶菌酶溶液中。向該溶液中加入8ml 0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后加入6ml 3M鉀/5M乙酸溶液以使細胞完全懸浮。將懸浮液離心后，用酚/氯仿(1∶1)處理所得的上清液，與等體積異丙醇混合，然后離心。將所得的顆粒溶解于TE溶液，然后用RNase和酚/氯仿(1∶1)處理，接著進行乙醇沉淀。將所得沉淀再溶于TE，隨后向其中加入NaCl和聚乙二醇3,000，使其終濃度分別達到0.63M和7.5％。離心后，將顆粒沉淀溶于TE溶液并用乙醇沉淀。用這種方法，得到300μg質(zhì)粒DNA pHTF1。
將由此純化的質(zhì)粒DNA用于上述的373A DNA測序儀(由AppliedBiosystems制造的)以便用上述的Taq Dye DeoxyTMTerminaterCycle Sequening試劑盒(由Applied Biosystems制造的)確定全部核苷酸序列。將由此確定的核苷酸序列和推測的氨基酸序列列于序列表中(SEQ ID NO7)。在核苷酸序列確定中，用以SEQ ID NO6的核苷酸序列和由其序列反應分析得到的內(nèi)部序列為基礎(chǔ)合成的寡核苷酸作為引物用于核苷酸序列確定。
結(jié)果，證實克隆pHTF1含有1.721bp的cDNA片段，并且與實施例2中分析的氨基酸序列AP8(SEQ ID NO7中的氨基酸數(shù)1到12)和TP2/TP3(SEQ ID NO7中的氨基酸數(shù)157到162)有高度的同源性。該DNA片段看起來含有101個堿基的5′非編碼區(qū)、由353個氨基酸殘基組成的開放閱讀框架(從在102到104位核苷酸編碼的Met殘基開始，在1158到1160位核苷酸編碼的Gly殘基終止)、隨后是終止密碼子(TAA)、531個堿基的3′非編碼區(qū)和30個堿基的polyA尾序列，認為由開放閱讀框架編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO6所示的預測的人TPO氨基酸序列完全一致。pHTF1的cDNA序列比SEQ ID NO6所示的推測cDNA序列大，在5′側(cè)含有77個附加的堿基，并在其polyA尾序列前，于3′側(cè)有347個附加的堿基。而且核苷酸序列在3個位置上不同于SEQ ID NO6。即SEQID NO7中的A(位置84)，A(位置740)和G(位置1198)在SEQ ID NO6中分別是C、T和A。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)只包括位置740的突變，但由于A和T均是Thr密碼子的第三個堿基，因此該突變不會引起氨基酸改變。盡管那時并不清楚這些堿基取代的原因，但分析質(zhì)?？寺HTF1證實人TPO蛋白由帶有21個氨基酸信號序列的353個氨基酸殘基組成。估計除去信號序列后，成熟蛋白質(zhì)的分子量為35,466。
由E.coli菌株DH5攜帶的載體pHTF1由本發(fā)明人于1994年3月24日以登記號No.FERM BP-4617寄存于the NationalInstitute of Bioscience and Human-Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry，Japan。
<實施例23>
在COS1細胞中表達人TPO cDNA克隆并確證TPO活性按實施例11的方法，用由此得到的質(zhì)粒克隆pHTF1轉(zhuǎn)染COS1細胞，即經(jīng)包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖方法，用10μg質(zhì)粒DNA完成轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的COS1細胞于37℃培養(yǎng)3天，然后收集培養(yǎng)物上清液。
將培養(yǎng)物上清液對IMDM培養(yǎng)基徹底透析，然后用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)估測。在表達質(zhì)粒pHTF1的COS1細胞上清液中，以劑量依賴形式檢測TPO活性(圖10a)。相反，在僅表達質(zhì)粒pEF18S的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中沒有TPO活性(圖10a)。用M-07e檢測系統(tǒng)得到了相似的結(jié)果。在其中表達質(zhì)粒pHTF1的COS1細胞上清液以劑量依賴方式明顯增大M-07e細胞的增殖(圖10b)。這些結(jié)果說明，pHTF1含有編碼具有TPO活性之蛋白質(zhì)的基因。
<實施例24>
克隆人TPO染色體DNA用人TPO cDNA作為探針克隆人TPO染色體DNA。在克隆中所用的基因組文庫是由來自the Gene Research Center，Tohoku UniversityT.Yamamoto教授的所贈送(Sakai et al在J.Biol.Chem.，269，2173-2182，1994報告了該文庫，通過用限制酶Sau 3AI部分消化人染色體DNA，然后將部分消化產(chǎn)物連至Stratagene制造的噬菌體載體λEMBL 3的BamHI位點而構(gòu)建的)?；景碝olecular Cloning(Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法，用人TPO cDNA為探針篩選該文庫。用E.coli LE392作為宿主，將文庫接種到含NZYM(在1升水中含10g的NZ胺、5gNaCl，5g Bacto Yeast Extract，2g MgSO4·7H2O和15g瓊脂，pH7.0)的15-cm平板上，以這樣的接種大小一個平板含30,000個噬菌體顆粒。用BIODYNETMA TRANSFER MEMBRANE(由PALL制造的)從每個由此制備的18個平板制備兩個復制濾膜。通過將濾膜浸在0.5N NaOH/1.5M NaCl中10分鐘，然后在0.5M Tris-HCl(pH8.0)/1.5M NaCl中10分鐘，接著空氣干燥30分鐘，隨后在真空烤箱中于80℃烤1.5小時而使其變性。將由此處理的濾膜在含50％甲醛、5×SSC，5×Denhardt′s溶液、1％SDS和20μg/ml鮭精DNA的500ml反應溶液中于42℃溫育1小時而完成預雜交。為了用作探針，經(jīng)PCR擴增人TPO cDNA片段(SEQ ID NO7中178到1,025位堿基)，然后提純，用Random Primar DNA Labelling盒(由Takara Shuzo以Anal.Biochem.，132，6-13，1983中公開的隨機引物法制造的DNA標記盒)用32P標記純化的片段。在該PCR中，所用的引物序列如下hTPO-I5′-TTG TGA CCT CCGAGT CCT CAG-3′(SEQ ID NO50)(SEQ ID NO7中的位置178到198)hTPO-N5′-AGG GAA GAG CGT ATA CTG TCC-3′(SEQ ID NO51)(SEQ ID NO7中位置1,005到1,025序列相應的反義引物)。
用同位素標記的探針，在500ml含與預雜交溶液組分相同的反應溶液中于42℃雜交20小時。將所得的濾膜在室溫下用2×SSC/0.1％SDS溶液經(jīng)5分鐘洗3次，然后在68℃用0.1×SSC/0.1％SDS溶液洗一次1小時。然后用增強屏和X-OMATTMAR5膠片(由Eastman Kodak制造的)在-70℃使濾膜經(jīng)16小時的放射自顯影。結(jié)果，得到13個陽性信號。在原平板上收集約相當于每個陽性信號的噬菌斑，然后以在每個平板上形成1,000個噬菌斑的接種大小再接種以15-cm NZYM平板上。從每個所得的平板制備兩個復制膜以便在與上述相同的條件下完成雜交。結(jié)果，在13個組的所有濾膜上均檢測到了陽性信號。從每個所得的平板中回收一個噬菌斑以便用Molecular Cloning中描述的平板溶解產(chǎn)物方法制備噬菌體DNA。通過使用含有下列序列之引物的PCR，檢測從13個克隆中由此制備的噬菌體DNA樣品是否存在cDNA編碼區(qū)。hTPO-L5′-GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3′(SEQ ID NO52)(SEQ ID NO6中的位置1到21)hTPO-F5′-ATG GGA GTC ACG AAG CAG TTT-3′(SEQ ID NO53)(相當于SEQ ID NO6中位置127到147序列的反義引物)hTPO-P5′-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3′(SEQ ID NO54)(SEQ ID NO6中的位置503到523)hTPO-V5′-AAC CTT ACC CTT CCT GAG ACA-3′(SEQ lD NO55)(相當于SEQ ID NO6中位置1,070到1,090序列的反義引物)當用這些引物結(jié)合完成PCR時，13個克隆中的5個似乎含有從cDNA預測的完整氨基酸編碼區(qū)。這5個克隆所含的染色體DNA分子含有一約20kb的相似長度，初步經(jīng)預先的限制酶分析表明結(jié)構(gòu)幾乎相同。因此，篩選一個這樣的克隆(克隆λHGT1)，然后用Southern印跡分析。即，用限制酶EcoRI或HindIII完全消化克隆λHGT1的1μg DNA，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，然后將凝膠上的帶轉(zhuǎn)移到BIODYNETMA TRANSFER MEMBRANE(由PALL制造的)上。所得的濾膜空氣干燥30分鐘，然后在真空烤箱中于80℃烤2小時。通過在50ml含有50％甲醛，5×SSC，5×Denhardt′s溶液，1％SDS和20μg/ml鮭精DNA的反應溶液中，于42℃將由此處理的濾膜溫育1小時而完成預雜交。為了用作探針，經(jīng)PCR擴增人TPO cDNA片段(SEQ ID NO7中178到1,025位的堿基)，然后純化，并用RandomPrimer DNA Labelling盒(由Takara Shuzo制造的)以32P標記純化的片段。使用同位素標記的探針，在50ml含有與預雜交溶液組分相同的反應溶液中，于42℃經(jīng)20小時完成雜交。在室溫下，將所得的濾膜用2×SSC/0.1％SDS溶液經(jīng)5分鐘洗滌3次，然后在68℃，用0.1×SSC/0.1％SDS溶液經(jīng)1小時再洗1次。然后用增強屏和X-OMATTMAR5膠片(Eastman Kodak制造的)于-70℃使濾膜經(jīng)16小時的放射自顯影。結(jié)果，在HindIII消化的情況下，觀察到一個約10kb的單帶。因此，用HindIII消化克隆λHGT1的10μg DNA，然后經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，從凝膠上切下10kb的帶，用Prep-A-Gene DNA純化盒(Bio-Rad制造的)純化，然后亞克隆到預先已用HindIII消化的克隆載體pUC13(Pharmacia制造的)中。在這種情況下，用TOYOBO生產(chǎn)的高感受態(tài)E.coli DH5作為宿主菌株。
在所得到的克隆中，篩選含10kb HindIII片段的克隆，稱為pHGT1。
噬菌體克隆λHGT1的限制圖譜列于圖11中。
<實施例25>
確定人TPO染色體克隆pHGT1的核苷酸序列基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述的方法培養(yǎng)克隆pHGT1并純化質(zhì)粒DNA。將克隆pHGT1在50ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。離心收集所得的細胞，然后懸浮于4ml前述的TEG-溶菌酶溶液中。向該溶液中先加入8ml 0.2N NaOH/1％SDS溶液，然后加入6ml 3M鉀/5M乙酸溶液以完全使細胞懸浮。懸浮液離心后，用酚/氯仿(1∶1)處理所得的上清液與相同體積的異丙醇混合，然后離心。將所得的顆粒溶于TE溶液，并用RNase，然后用酚/氯仿(1∶1)處理，接著乙醇沉淀。將所得的顆粒再溶于TE溶液中，隨后向其中加入NaCl和聚乙二醇3,000以使其終濃度分別達到0.63M和7.5％。離心后，將顆粒溶于TE溶液，然后用乙醇沉淀。用該方法，得到了約300μg的質(zhì)粒DNA pHGT1。
用上述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems生產(chǎn)的)，將由此純化的質(zhì)粒DNA用于上述的373A DNA測序儀(Applied Biosystems生產(chǎn)的)以確定從cDNA核苷酸序列預測的蛋白質(zhì)-編碼區(qū)周圍的核苷酸序列。在序列表中列出了由此確定的核苷酸序列和推測的氨基酸序列(SEQ ID NO8)。在這種情況下，用實施例22中用于cDNA核苷酸序列分析的寡核苷酸以及以經(jīng)其序列反應分析得到的內(nèi)序列為基礎(chǔ)設(shè)計的合成寡核苷酸作為核苷酸序列確定中的引物。
結(jié)果，發(fā)現(xiàn)由質(zhì)?？寺HGT1攜帶的染色體DNA含有從SEQ IDNO6推測的氨基酸序列的完整編碼區(qū)，而且編碼區(qū)的核苷酸序列與SEQ ID NO6的完全一致。另外，相當于氨基酸-編碼外顯子的區(qū)域從5′側(cè)開始計數(shù)，含有4個長度為231bp，286bp，1932bp和236bp的內(nèi)含子(圖11)。還有核苷酸序列在3個位置上不同于SEQ ID NO7的cDNA核苷酸序列，所述的3個位置與實施例22中描述的位置相同(SEQ ID NO6和7之間的不同位置)。即SEQ IDNO7中的A(位置84)，A(位置740)和G(位置1198)在SEQID NO8中分別是C，T和A。因此，揭示出實施例21中得到的人TPO cDNA克隆pHTF1的核苷酸序列在3個位置上不同于人染色體DNA克隆pHGT1的核苷酸序列。因此，為了分析cDNA克隆pHTF1序列中的這些突變是否反映染色體DNA序列，確定經(jīng)篩選而單獨得到的5個染色體克隆中其它4個克隆的核苷酸序列。用根據(jù)MolecularCloning中描述的平板溶菌產(chǎn)物法而制備的噬菌體DNA樣品，經(jīng)直接的核苷酸序列測定法進行序列分析。用實施例22中所用的序列引物(在可以分析核苷酸序列中前述3個突變位置那部分的序列之基礎(chǔ)上合成的)，經(jīng)前述的373A DNA測序儀(由Applied Biosystems制造)和前述的Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(由Applied Biosystems制造)完成每個克隆的測序。發(fā)現(xiàn)所有4個克隆的核苷酸序列均與SEQ ID NO6的相同。在這4個克隆中，相當于SEQ ID N07之位置84和740上的核苷酸分別由C和T取代。但在位置1,198，兩個克隆中是G，另兩個克隆中是A。換句話說，這表明原染色體DNA本來有兩種類型的核苷酸序列。目前，還不清楚核苷酸序列中的這種差異是起因于同源染色體或多基因。另外，這說明核苷酸序列中的差異可能是由種族差異而造成的。因為從Clontech購買的poly(A+)RNA是高加索人的，而染色體DNA是日本人的。
本發(fā)明人已于1994年3月24日以登記號No.FERM BP-4616將由E.coli菌株DH5攜帶的載體pHGT1保藏于日本的國家生物科學和人體技術(shù)研究所，工業(yè)科學和技術(shù)代理部，國際貿(mào)易和工業(yè)部。
<實施例26>
在COS1細胞中表達人TPO染色體DNA并確定TPO的活性由亞克隆得到的質(zhì)粒克隆pHGT1共含有4個EcoRI識別序列，3個在插入部分，1個在載體中。核苷酸序列分析表明，在一約4.3kb的DNA片段中含有完整人TPO蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，該片段在最靠近插入片段5′測的EcoRI識別序列和載體中的EcoRI識別序列之間。因此，將該片段與EcoRI處理的表達載體pEF18S相連，并得到4個人TPO表達質(zhì)粒pEFHGTE#1-4(見圖11)。通過制備這些質(zhì)粒DNA，完成表達實驗?；景碝olecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法純化質(zhì)粒DNA，由此得到約250μg的質(zhì)粒DNA。
按實施例11的方法，用由此得到的克隆pEFHGTE#1-4轉(zhuǎn)染COS1細胞。即，用包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖方法，由10μg質(zhì)粒DNA完成轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的COS1細胞在37℃溫育3天，然后收集培養(yǎng)物上清液。
對IMDM培養(yǎng)基徹底透析培養(yǎng)物上清液，然后用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)估測。在分別表達4個克隆(pEFHGTE#1-4)的COS1細胞上清液中，檢測的TPO活性為劑量依賴方式。相反，在單獨表達質(zhì)粒pEF18S的COS1細胞上清液中沒有TPO活性。在圖12a中給出了用pEFHGTE#1得到的代表性數(shù)據(jù)。在M-07e檢測系統(tǒng)中得到了相似的結(jié)果。分別表達4個克隆(pEFHGTE#1-4)的COS1細胞上清液以劑量依賴方式明顯增加M-07e細胞的生長。圖12b中列出了用pEFHGTE#1得到的代表性數(shù)據(jù)。
這些結(jié)果說明質(zhì)?？寺EFHGTE#1-4帶有功能性的人TPO染色體DNA。
<實施例27>
制備人TPO缺失型DNA并在COS1細胞中表達以及確定TPO活性實施例18中的結(jié)果說明，甚至在除去其第三羧基(its carboxylthird)后，人TPO也可以表現(xiàn)出其生物活性。因此，為了進一步估測生物活性部分，而進行缺失衍生物實驗。在本實施例中，檢測TPO缺失衍生物發(fā)揮體外TPO生物活性的能力，所述衍生物缺少了從pHT1-231編碼之TPO蛋白質(zhì)(氨基酸1-231)的羧基末端數(shù)20，40，60或68個氨基酸。最短的衍生物(氨基酸1-163)仍包含了相當于實施例2中所述大鼠血漿TPO之TP 2/3的氨基酸序列。用實施例18中得到的質(zhì)?？寺HT1-231的DNA作為模板，合成的寡核苷酸作為引物，經(jīng)PCR制備缺失質(zhì)粒。PCR所用的引物之序列如下hTPO-55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACC CCG GCC-3′(SEQ ID NO56)(通過將一EcoRI識別序列加到SEQ ID NO4中的位置1到21的序列上而得到的；它與圖9中所述的序列相同)；hTPO-S5′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACA GCT GTGGTG GGT-3′(SEQ ID NO57)(相當于SEQ ID NO4中位置555到576之序列的反義引物，其制法是通過加入了兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列，以用于制備編碼位置1到163氨基酸殘基的缺失衍生物)；hTPO-45′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGT GTG AGG ACT AGAGAG GTT CTG-3′(SEQ lD NO58)(相當于SEQ ID NO4中位置576到600之序列的反義引物，其制法是通過加入兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列，以用于制備編碼位置1到171氨基酸殘基的缺失衍生物)；hTPO-305′-TTT GCG GCC GCT CAT TAT CTG GCT GAG GCA GTGAAG TTT GTC-3′(SEQ ID NO59)(相當于SEQ ID NO4中位置636到660之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到191的氨基酸殘基)；和hTPO-25′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC AGA CCA GGA ATC TTGGCT CTG AAT-3′(SEQ ID NO60)(相當于SEQ ID NO4中位置696到720之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到211的氨基酸殘基)。
用1μg實施例18中得到的克隆pHT1-231的質(zhì)粒DNA作為模板，各10μM由此合成的hTPO-5(用于5′側(cè))和hTPO-2，-3，-4和-S(用于3′側(cè))作為引物以及帶AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR試劑盒(由Takara Shuzo制造)，用100μl體積，使用GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造的)共重復20個循環(huán)，每個循環(huán)含于95℃變性1分鐘，于65℃退火1分鐘以及在72℃合成1分鐘，然后再于72℃溫育7分鐘，從而完成PCR。用限制酶EcoRI和NotI消化由各PCR得到的所需帶，然后將所得的消化產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts制造的)電泳以分離由各PCR擴增的具有所期望大小的主要DNA片段。用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造的)純化由此分離的DNA片段，然后將其亞克隆到預先經(jīng)相同的限制酶處理的表達載體pEF18S中。在這種情況下，用TOYOBO制造的高感受態(tài)的E.coli DH5作為宿主菌株。從來自各PCR的所得轉(zhuǎn)化體，篩選4到5個含所需大小之插入片段的克隆以基本上按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Prass，1989)中所述的方法制備質(zhì)粒DNA樣品。在一系列的上述操作中，從下列缺失衍生物得到質(zhì)粒DNA樣品編碼位置1到163氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-163#1-5)，編碼位置1到171氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-171#1-4)，編碼位置1到191氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-191#1-4)和編碼位置1到211氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-211#1-4)。對各質(zhì)粒DNA的全長擴增區(qū)進行核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)它與SEQ ID NO4中所示的核苷酸序列有完全的一致性。
按實施例11的方法，用由此得到的克隆轉(zhuǎn)染COS1細胞。即經(jīng)包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖方法，用各10μg的質(zhì)粒DNA樣品進行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染的COS1細胞培養(yǎng)3天，然后回收培養(yǎng)物上清液。
對IMDM培養(yǎng)基徹底透析培養(yǎng)物上清液，然后用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)評估。在分別表達pHT1-211，pHT1-191，pHT1-171或pHT1-163的COS1細胞上清液中，檢測出TPO活性為劑量依賴方式。用pHT1-211#，pHT1-191#和pHT1-171#2得到的代表性數(shù)據(jù)列于圖13a，而在圖13b中列出了由pHT1-163#2得到的數(shù)據(jù)。在M-07e檢測系統(tǒng)中得到了相似的結(jié)果。分別表達pHT1-211，pHT1-191，pHT1-171或pHT1-163的COS1細胞上清液，明顯提高M-07e細胞的增殖。圖14中列出了用pHT1-211#1，pHT1-191#1，pHT1-171#2得到的代表性數(shù)據(jù)。
這些結(jié)果表明即使Ser(第163位)以上的羧基末端那一半缺失人TPO仍能保持其體外活性，而且有力地證明人TPO的生物活性部分位于止于以Ser(位置163)為界的那一半氨基末端內(nèi)。
<實施例28>
C-末端缺失型人TPO的制備及其在COS1細胞中的表達和活性為了分析對于人TPO蛋白質(zhì)表現(xiàn)其活性所必需的區(qū)域，從實施例27中得到的缺失衍生物進一步缺失C-末端氨基酸，然后檢測在COS1細胞中表達的TPO活性。用實施例16中得到的質(zhì)?？寺EF18S-HL34，通過缺失編碼從163位Ser開始的C-末端氨基酸殘基的核苷酸序列而制備表達質(zhì)粒。用PCR有效地進行了這些缺失質(zhì)粒的構(gòu)建。為PCR所用而制備的引物序列如下hTPO-55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACCCCG GCC-3′(SEQ ID NO61)(通過將EcoRI識別序列加到SEQ ID NO4中位置1到21的序列中而制備的；實施例18中列出了相同的序列)；
hTPO-1505′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG AGG GTGGAC CCT CCT ACA AGC AT-3′(SEQ ID NO62)(對應于SEQ ID NO4中位置514到537之序列的反義引物，通過加入制備缺失突變體所用的兩個終止密碼子TAA和TGA和一個NotI識別序列而制備的，所述缺失突變體編碼位置1到150的氨基酸殘基)；hTPO-1515′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CAG AGGGTG GAC CCT CCT ACA A-3′(SEQ ID NO63)(對應于SFQ ID NO4中位置518到540之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到151氨基酸殘基)；hTPO-1535′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CTG ACGCAG AGG GTG GAC CC-3′(SEQ ID NO64)(對應于SEQ ID NO4中位置526到546之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和T6A以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到153氨基酸殘基)；hTPO-1545′-TTT GCG GCC GCT CAT TAC CGC CTGACG CAG AGG GTG GA-3′(SEQ ID NO65)(對應于SEQ ID NO4中位置529到549之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到154氨基酸殘基)；hTPO-1555′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GCC CGCCTG ACG CAG AGG GT-3′(SEQ ID NO66)(對應于SEQ ID NO4中位置532到552之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和T6A以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到155氨基酸殘基)；hTPO-1565′-TTT GCG GCC GGT CAT TAT GGG GCCCGC CTG ACG GAG AG-3′(SEQ ID NO67)(對應于SEQ ID NO4中位置535到555之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到156氨基酸殘基)；hTPO-1575′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG GGT GGGGCC CGC CTG ACG CA-3′(SEQ ID NO68)(對應于SEQ ID NO4中位置538到558之序列的反義引物，通過加入制備缺失衍生物所用的兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的，所述缺失衍生物編碼位置1到157的氨基酸殘基)。
用實施例16中得到的1μg克隆pEF18S-HL34的質(zhì)粒DNA作為模板，用各10μM由此合成的寡核苷酸(hTPO-5用于5′側(cè)，hTPO-150，-151，-153，-154，-155，-156和-157用于3′側(cè))作為引物完成PCR。用含有AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR試劑盒(由Takara Shuzo制造)，利用GeneAmpTMPCR System9600(由PERKIN-ELMER制造的)共重復20個循環(huán)，每循環(huán)于95℃變性1分鐘，于66℃退火1分鐘和在72℃合成1分鐘，然后于72℃最終溫育7分鐘從而在100μl體積中完成PCR反應。用限制酶EcoRI和NotI消化由各PCR得到的所需帶，然后使所得的消化產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts制造的)電泳以分離由各PCR得到的具有所需大小的主要DNA片段。用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造的)純化分離的DNA片段，然后將其亞克隆到預先用相同的限制酶處理的表達載體pEF18S中。在這種情況下，用由TOYOBO生產(chǎn)的高感受態(tài)E.coli DH5作為宿主菌株。從來自各PCR試驗的所得轉(zhuǎn)化體，篩選3到5個含所需大小之插入片段的克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述方法制備質(zhì)粒DNA樣品。經(jīng)一系列所述操作，從下列缺失衍生物中制備質(zhì)粒DNA編碼位置1到150氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-150#21，22和25)，編碼位置1到151氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-151#16，17和18)，編碼位置1到153氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-153#1到5)，編碼位置1到154氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-154#1到5)，編碼位置1到155氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-155#1到5)，編碼位置1到156氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-156#1到5)以及編碼位置1到157氨基酸殘基的缺失衍生物(pHT1-157#1到5)。
在這些純化的質(zhì)粒DNA樣品中，通過利用Taq Dye DeoryTMTerminater Cycle測序盒(Applied Biosystems)用373A DNA測序儀(由Applied Biosystems制造的)檢測pHT1-50#21，22和25以及pHT1-151#16，17和18的序列，由此證實在全長核苷酸序列中，預期的TPO cDNA序列沒有取代。
按實施例11的方法，分別用所得的克隆轉(zhuǎn)染COS1細胞。即通過包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖方法，用各10μg的質(zhì)粒DNA樣品完成轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)3天后回收培養(yǎng)物上清液。用前面所述的IMDM培養(yǎng)并透析所得的培養(yǎng)物上清液，然后用M-07e檢測系統(tǒng)評估。在用編碼C-末端缺失衍生物之相應克隆轉(zhuǎn)染的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中檢測TPO活性，所述缺失衍生物分別由1到151位氨基酸，1到153位氨基酸，1到154位氨基酸，1到155位氨基酸，1到156位氨基酸或1到157位氨基酸組成。所有這些衍生物在位置151均含有Cys殘基。但在用編碼由1-150位氨基酸組成的C-末端測缺失衍生物之克隆轉(zhuǎn)染的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中未檢測到TPO活性，該衍生物151位上的Cys殘基也被缺失了。
<實施例29>
N-末端缺失型人TPO的制備及其在COS1細胞中的表達和活性為了分析TPO蛋白質(zhì)表現(xiàn)其活性所必需的區(qū)域，進一步缺失實施例28中得到的缺失衍生物的N-末端氨基酸，然后檢測所得缺失衍生物之TPO活性的表達。用實施例16中得到的質(zhì)粒克隆pEF18S-HL34和實施例27中得到的質(zhì)?？寺HT1-163，通過缺失編碼信號序列后之N-末端氨基酸殘基的核苷酸序列制備表達質(zhì)粒。用PCR有效地進行這些缺失質(zhì)粒的構(gòu)建。為在PCR中應用所制備的引物序列如下hTPO-55′-TTT GAA TTC GGC CAG CCA GAC ACCCCG GCC-3′(SEQ ID NO69)(通過將EcoRI識別序列加到SEQ ID NO4中位置1到21的序列中而制得；實施例18中所列的相同序列)；hTPO35′-TTT GCG GCC GCT CAT TAT TCG TGT ATCCTG TTC AGG TAT CC-3′(SEQ ID NO70)(對應于SFQ ID NO4中位置757到780之序列的反義引物，通過加入兩個終止密碼子TAA和TGA以及一個NotI識別序列而制備的；合成的相同序列用于制備編碼位置1到231氨基酸殘基的缺失衍生物)；
hTPO-S5′-TTT GCG GCC GCT CAT TAG CTG GGG ACAGCT GTG GTG GGT-3′(SEQ ID NO71)(對應于SEQ ID NO4中位置555到576之序列的反義引物；用于制備編碼位置1到163氨基酸殘基的缺失衍生物)；hTPO-135′-AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CATGTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TG-3′(SEQ ID NO72)(SEQ ID NO4中的位置124到173；用于制備缺失位置1到12之氨基酸殘基的衍生物)；hTPO-13R5′-CAT GGG AGT CAC GAA GCA GTT TACTGG ACA GCG TTA GCC TTG CAG TTA G-3′(SEQ ID NO73)(對應于SEQ ID NO4中位置64到87和124到148之序列的反義引物，用于制備缺失了位置1到12之氨基酸殘基的衍生物)；hTPO-75′-TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAACTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT C-3′(SEQ ID NO74)(SEQ ID NO4中的位置106到154，用于制備缺失位置1到6之氨基酸殘基的衍生物)；hTPO-7R5′-TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTC ACAGGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3′(SEQ ID NO75)(對應于SEQ ID NO4中位置64到87和106到129之序列的反義引物，用于制備缺失了位置1到6之氨基酸的衍生物)；hTPO-85′-GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTGCTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC A-3′(SEQ ID NO76)(SEQ ID NO4中的位置109到157；用于制備缺失了位置1到7之氨基酸殘基的衍生物)；和
hTPO-8R5′-CAG TTT ACT GAG GAC TCG GAG GTCGGA CAG CGT TAG CCT TGC AGT TAG-3′(SEQ ID NO77)(對應于SEQ ID NO4中位置64到87和109到132之序列的反義引物；用于制備缺失了位置1到7之氨基酸殘基的衍生物)。(1)制備缺失了位置1到12之氨基酸殘基的衍生物(pHT13-231)用實施例18中得到的1.4μg克隆pEF18S-HL34的質(zhì)粒DNA作為模板及各5μM由此合成的寡核苷酸(在一個組合中有hTPO-13和hTPO-3，在另-結(jié)合中有hTPO-5和hTPO-13R)作為引物進行PCR。用含有AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造的)的GeneAmpTMPCR試劑盒，GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)，于95℃變性5分鐘后，共重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘和在72℃合成1分鐘，最后72℃再溫育7分鐘，從而在100μl體積中完成PCR反應。使各PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts生產(chǎn))上電泳以分離隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造)純化的具有預期大小的主要DNA片段，然后溶于15μl TE緩沖液中。此后，用各1μl的所得溶液為模板完成第二個PCR。
用各5μM的合成引物(hTPO-5和hTPO3)完成第二個PCR。用含有AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR試劑盒，GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)，于95℃變性5分鐘后，共重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在95℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘和72℃合成1分鐘，最后72℃再溫育7分鐘從而在100μl體積中完成PCR反應。將各PCR產(chǎn)物進行1.2％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts制造)電泳以分離隨后經(jīng)Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造)純化的具有預期大小的主要DNA片段，然后溶于15μl TE緩沖液中。用限制酶EcoRI和NotI消化后，用相同體積的酚/氯仿提取所得的溶液，然后進行乙醇沉淀。離心后，將所得的沉淀溶于15μl TE緩沖液中，然后亞克隆到預先用相同的限制酶處理的表達載體pEF18S中。在這種情況下，用TOYOBO制造的高感受態(tài)E.coli DH5作為宿主菌株。從所得的轉(zhuǎn)化體，篩選含預期大小之插入片段的45個克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的方法，制備質(zhì)粒DNA樣品。用這種方法，可以得到編碼蛋白質(zhì)分子的缺失衍生物(pHT13-231)的質(zhì)粒DNA，在所述蛋白質(zhì)分子中，已經(jīng)從位置1到231的原氨基酸殘基中缺失了位置1到12的氨基酸殘基。用引物hTPO-5和hTPO3對這45個克隆進行PCR，證實在8個克隆中，有具有約預期大小的插入片段。利用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)用373A DNA測序儀(由Applied Bisystems制造)檢測其中3個克隆的序列，由此得到一克隆pHT13-231#3，它含有所設(shè)計的TPO cDNA和所期望的在整個核苷酸序列中沒有取代等的缺失。(2)制備衍生物(pHT7-163)，其中缺失位置1到6的氨基酸殘基由于盡管在上述步驟(1)中，設(shè)計第231位氨基酸作為用于制備缺失衍生物的TPO蛋白質(zhì)的C末端，但發(fā)現(xiàn)甚至進一步缺失C末端氨基酸時，仍可表達TPO活性，因此在這種情況下，由第163位氨基酸作為用于制備缺失衍生物的C末端。出于相同的原因，在隨后的步驟(3)中也用163位氨基酸作為C末端。用實施例27中得到的克隆pHT1-163之1.4μg質(zhì)粒DNA作為模板，各5μM的合成寡核苷酸(hTPO-7和hTPO-S結(jié)合，hTPO-5和hTPO-7R結(jié)合)作為引物進行PCR。用帶有AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR試劑盒，經(jīng)GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)在100μl體積中，于95℃變性5分鐘后，共重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在95℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘并在72℃合成1分鐘，然后在72℃最后溫育7分鐘，從而完成PCR反應。使各PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts制造)電泳以分離具有所期望大小的主要DNA片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造)純化，然后溶于15μl TE緩沖液中。用各1μl由此制備的溶液作為模板完成第二次PCR。
用各5μM的合成引物(hTPO-5和hTPO-S)進行第二次PCR。用帶AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR試劑盒，經(jīng)GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)在100μl體積中，于95℃變性5分鐘后，共重復30個循環(huán)，各循環(huán)包括于95℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘和72℃合成1分鐘，然后在72℃最后溫育7分鐘，從而完成PCR反應。使各PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts制造)電泳以分離具有所期望大小的主要DNA片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造)純化，然后溶于15μl TE緩沖液中。用限制酶EcoRI和NotI消化后，用相同體積的酚/氯仿和隨后的乙醇沉淀提取所得的溶液。離心后，將所得的沉淀溶解于15μl TE緩沖液中，然后將其亞克隆至已預先用相同的限制酶消化的表達載體pEF18S中。在此情況下，用高感受態(tài)E.coli DH5(由TOYOBO制備)作為宿主菌株。從所得的轉(zhuǎn)化體，篩選30個含所需大小之插入片段的克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中描述的方法制備質(zhì)粒DNA樣品。用這種方法，可以得到編碼蛋白質(zhì)分子的缺失衍生物(pHT7-163)的質(zhì)粒DNA，在所述蛋白質(zhì)分子中，已經(jīng)從SEQ ID NO4中位置1到163的原氨基酸殘基中缺失了1到6位的氨基酸殘基。當用引物hTPO-5和hTPO-S，使這些克隆經(jīng)PCR后，證實在所有克隆中均含有約所預期大小的插入片段。對于這些，通過利用用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)的373ADNA測序儀(由Applied Biosystems制造)檢測其中3個克隆的序列，由此得到2個克隆，pHT7-163#4和#29，兩者分別含有所設(shè)計的TPO cDNA序列以及在全部核苷酸序列上沒有取代等的所期望的缺失。(3)制備其中缺失了1-7位氨基酸殘基的衍生物(pHT8-163)按與制備缺失1-6位氨基酸殘基之衍生物(pHT7-163)的上述實例基本相同的方法，制備缺失了1-7位氨基酸殘基的衍生物(pHT8-163)。用實施例27中得到的克隆pHT1-163的1.4μg質(zhì)粒DNA作為模板，各5μM的合成寡核苷酸(hTPO-8和hTPO-S結(jié)合，hTPO-5和hTPO-8R結(jié)合)作為引物進行PCR。用帶AmpliTaqTMDNA聚合酶(由Takara Shuzo制造)的GeneAmpTMPCR試劑盒，經(jīng)GeneAmpTMPCR System 9600(由PERKIN-ELMER制造)在100μl體積中，于95℃變性5分鐘后，共重復30個循環(huán)，各循環(huán)包括95℃變性1分鐘，65℃退火1分鐘和72℃合成1分鐘，然后在72℃最后溫育7分鐘，從而完成PCR反應。使各PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts制造)電泳以分離具有預期大小的主要DNA片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造)純化，然后溶于15μl TE緩沖液中。此后，用1μl各所制得的溶液作模板進行第二次PCR。
用5μM各合成的引物(hTPO-5和hTPO-S)進行第二次PCR。用帶AmpliTaqTMDNA聚合酶的GeneAmpTMPCR Reagent Kit(TakaraShuzo制造)，利用GeneAmpTMPCR System 9600(PERKIN-ELMER生產(chǎn))，在95℃變性5分鐘后，重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括于95℃變性1分鐘，于60℃退火1分鐘和于72℃合成1分鐘，然后在72℃最后溫育7分鐘，從而完成PCR反應。使各PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠(由FMC BioProducts生產(chǎn))電泳以分離具有預期大小的主要DNA片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad生產(chǎn))純化，然后溶于15μl TE緩沖液中。用限制酶EcoRI和NotI消化后，用相同體積的苯酚/氯仿和隨后的乙醇沉淀提取所得的溶液。離心后，將所得沉淀溶于15μl TE緩沖液中，然后將其亞克隆到預先已用相同的限制酶消化的表達載體pEF18S中。在該實例中，用高感受態(tài)的E.coli DH5(由TOYOBO制造)作為宿主菌株。從所得的轉(zhuǎn)化體，篩選30個含所預期大小之插入片段的克隆以便基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，ColdSpring HarborLaboratory Press，1989)中描述的方法制備質(zhì)粒DNA樣品。用這種方法，可以得到編碼蛋白質(zhì)分子的缺失衍生物(pHT8-163)的質(zhì)粒DNA，在所述蛋白質(zhì)分子中，已經(jīng)從SEQ ID NO4的1-163位原氨基酸殘基中缺失了1-7位的氨基酸殘基。用引物hTPO-5和hTPO-S，使這些克隆經(jīng)PCR后，證實在所有克隆中均含有約預期大小的插入片段。通過使用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)的373A DNA測序儀(由AppliedBiosystems制造)檢測其中3個克隆的序列，由此得到2個克隆，pHT8-163#33和#48，分別含有設(shè)計的TPO cDNA序列并在全部核苷酸序列上沒有取代等的預期缺失。(4)在COS1細胞中表達缺失衍生物并證實TPO活性按實施例11的方法，分別用由此得到的缺失克隆轉(zhuǎn)染COS1細胞。即用包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖方法，各10μg的質(zhì)粒DNA樣品完成轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)3天后，回收培養(yǎng)物上清液。將由此得到的培養(yǎng)物上清液對前述的IMDM培養(yǎng)基徹底透析，然后用M-07e檢測系統(tǒng)評估。
結(jié)果，在COS1細胞的培養(yǎng)物上清液中檢測到弱但明顯的TPO活性，所述COS1細胞是用編碼由7-163位氨基酸組成的缺失衍生物的克隆轉(zhuǎn)染的。然而，在用編碼由8-163位氨基酸或13-231位氨基酸組成之衍生物的克隆轉(zhuǎn)化的COS1細胞培養(yǎng)物上清液中未檢測到TPO活性。
<實施例30>
制備全長的人TPO cDNA質(zhì)粒(pHTP1)構(gòu)建含有SEQ ID NO6中所假設(shè)的ATPO cDNA全部氨基酸編碼區(qū)的表達載體以用于在哺乳動物細胞中進行表達。
為了制備覆蓋全部人TPO cDNA編碼區(qū)的DNA片段，用下列方法完成PCR。
所用的引物的核苷酸序列如下
hTPO-15′-TTG TGA CCT CCG AGT CCT CAG-3′(SEQID NO78)(SEQ ID NO6中的位置105到125)；SA5′-CAG GTA TCC GGG GAT TTG GTC-3′(SEQ IDNO79)(相對于SEQ ID NO6中位置745-765之序列的反義引物)；和hTPO-P5′-TGC GTT TCC TGA TGC TTG TAG-3′(SEQID NO80)(SEQ ID NO6中的位置503到523)；和hTPO-KO5′-GAG AGA GCG GCC GCT TAC CCT TCCTGA GAC AGA TT-3′(SEQ ID NO81)(通過將一限制酶NotI識別序列和GAGAGA序列(SEQ ID NO82)加到相對于SEQ ID NO6中位置1066到1086之序列的反義序列中而制備的序列)。
用300ng實施例16中得到的克隆pEF18S-HL34作為模板進行第一次PCR。用各0.5μM的引物hTPO-1和SA以及1單位的Vent RTMDNA聚合酶(由New England BioLabs制造)，完成PCR(共重復30個循環(huán)，各循環(huán)包括在96℃溫育1分鐘，在62℃1分鐘和在72℃1分鐘，然后在72℃最后溫育7分鐘)反應溶液組分的終濃度如下10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-HCl(pH8.8)，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100和200μM dNTP混合物。
將1mg從人正常肝得到的市售poly(A)+RNA制品(由Clontech制備)在70℃加熱10分鐘，迅速在冰上冷卻，然后與10mM DTT，500μM dNTP混合物，25ng隨機引物(由Takara Shuzo制備)，10單位RNase抑制劑(由Boehringer-Mannheim制備)和200單位SuperScriptTMII RNase H-(由LIFE TECHNOLOGIES制造)混合，然后在37℃溫育1小時以合成cDNA。此后，用1/20體積的合成cDNA的反應溶液作為模板，各2.5μM引物hTPO-P和hTPO-KO以及2.5單位AmpliTaqTMDNA聚合酶(Takara Shuzo制造)進行第二次PCR(共重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在96℃溫育1分鐘，在58℃1分鐘和72℃1分鐘)。
分別使所得的第一次和第二次PCR溶液經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳以分離各自的含預期大小的相應主要DNA片段，隨后用Prep-A-GeneDNA純化盒(由Bio-Rad純化)純化。此后，分別用由此得到的溶液作為模板完成第三次PCR。用1單位的Vent RTMDNA聚合酶(由New England BioLabs制造)進行該反應(在96℃加熱2分鐘，然后共重復3個循環(huán)，每循環(huán)包括在96℃溫育2分鐘和72℃溫育2分鐘，然后在72℃再溫育7分鐘)。將所得反應溶液與各1μM的hTPO-1和hTPO-KO混合，在96℃加熱2分鐘，然后經(jīng)25個循環(huán)的反應，每循環(huán)包括在96℃1分鐘，62℃1分鐘和72℃1分鐘的溫育，最后在72℃再溫育7分鐘。用相同體積水飽和的酚-氯仿，然后用相同體積的氯仿提取所得的反應溶液，然后用乙醇沉淀(2.5體積乙醇含0.3M醋酸鈉和0.5μ1由Boehriger-Mannheim制造的糖原)處理提取物，以回收DNA。用限制酶BamHI和NotI消化回收的DNA，然后經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，用Prep-A-Gene DNA純化盒(Bio-Rad制造)純化由此分離的具有預期大小的主帶，與預先已經(jīng)限制酶BamHI和NotI消化的pBluescript II SK+載體(由Stratagene制造)相連，然后轉(zhuǎn)化到高感受態(tài)的E.coli DH5(由TOYOBO制造)中。從所得的克隆中篩選4個克隆以制備質(zhì)粒DNA樣品。通過利用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequening盒(Applied Biosystems)的373A DNA測序儀(由Applied Biosystems制造)檢測純化的質(zhì)粒DNA樣品的序列，由此得到一個克隆，pBLTP，含有設(shè)計的TPO cDNA序列，在BamHI和NotI之間區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列中沒有取代。
用限制酶EcoRI和BamHI消化克隆pBLTP，用1％瓊脂糖凝膠電泳，用Prep-A-Gene DNA純化盒(由Bio-Rad制造)純化由此分離的具有高分子量的帶。用相同的方法，用限制酶處理pEF18S-HL34以純化約450bp的DNA片段。將由此得到的各DNA樣品相連，然后轉(zhuǎn)化到高感受態(tài)的E.coli DH5(由TOYOBO制造)中。從所得的菌落制備質(zhì)粒DNA樣品以得到含有人TPO cDNA插入片段的克隆pBLTEN。用限制酶EcoRI和NotI消化由此得到的pBLTEN，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，用Prep-A-Gene DNA轉(zhuǎn)化盒(由Bio-Rad制造)純化由此分離的約1,200bp的DNA片段，然后與預先經(jīng)相同限制酶消化的表達載體pEP18S相連并轉(zhuǎn)化到高感受態(tài)的E.coli DH5(由TOYOBO制造)中。從所得克隆制備質(zhì)粒DNA樣品以得到含有完整人TPO cDNA編碼區(qū)之插入片段pHTP1的克隆。從該克隆大量制備質(zhì)粒DNA并用于下列實驗?；景碝olecular Cloning(Sambrook et al.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的方法制備質(zhì)粒DNA。
<實施例31>
構(gòu)建哺乳動物表達質(zhì)粒pDEF202-hTPO-P1以便在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表達人TPO用限制酶EcoRI和BamHI消化含有小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)微基因的1mg質(zhì)粒pMG1，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以分離含小鼠DHFR微基因的片段(約2.5kb)。將分離的DNA片段溶于25ml由50mM Tris-HCl(pH7.5)，7mM MgCl2，1mM 2-巰基乙醇和0.2mM dNTR混合物組成的反應溶液中，與2單位klenow片段混合，然后在室溫溫育30分鐘以便在DNA片段的兩個末端均形成平整末端。酚/氯仿處理和乙醇沉淀后，將所得的片段溶于10ml TE溶液(10mMTris-HCl(pH8.0)/1mM EDTA)中。用限制酶Smal消化哺乳動物表達載體pEF18S，用堿性磷酸酶(由Takara Shuzo制造)去磷酸化，然后用T4 DNA連接酶(由Takara Shuzo制造)與含小鼠DHFR微基因的DNA片段相連以得到表達載體pDEF202。
接著，用限制酶EcoRI和SpeI消化構(gòu)建的表達載體pDEF202，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以分離一較大的DNA片段。用T4 DNA連接酶(由Takara Shuzo制造)，將通過用限制酶EcoRI和SpeI消化含人TPO cDNA(克隆P1)的質(zhì)粒pHTP1而得到的人TPO cDNA與該線性化的pDEF202載體相連以得到用于表達人TPO cDNA的質(zhì)粒pDEF202-hTPO-P1。所述的構(gòu)建質(zhì)粒含有SV40復制原點，人延長因子1-α-啟動子，和用于轉(zhuǎn)錄人TPO cDNA的SV40早期多腺苷酸化信號，小鼠DHFR微基因，和pUC18-復制原點以及β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)。
<實施例32>
在CHO細胞中表達人TPO用一直徑6cm的組織培養(yǎng)皿(Falcon)在含10％胎牛血清(FCS)的α-基本必需培養(yǎng)基(α-MEM(-)，由次黃嘌呤和胸苷補充的)中保持CHO細胞(一個DHFR株；Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.77，p4216(1980))。按下述的磷酸鈣方法(CellPhect，由Pharmacia制造)用pDEF202-hTPO-P1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHO細胞。將實施例31中制備的10mg質(zhì)粒pDEF202-hTPO-P1與120ml緩沖液A和120ml水混合，然后將所得的混合物在室溫溫育10分鐘。將該溶液再與120ml緩沖液B混合，并在室溫下再放30分鐘。將該DNA混合物加到培養(yǎng)基中，在CO2保溫箱中溫育6小時。6小時后，用無血清α-MEM(-)將培養(yǎng)物洗滌兩次，用含10％二甲基亞砜的α-MEN(-)處理兩分鐘，然后在含10％已透析FCS的非選擇培養(yǎng)基(用次黃嘌呤和胸苷補充的α-MEM(-))中溫育2天。培養(yǎng)2天后，在含10％已透析FCS的選擇培養(yǎng)基(α-MER(-))中篩選細胞。為了篩選帶DHFR陽性表型的轉(zhuǎn)化細胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液處理細胞，然后用選擇培養(yǎng)基懸浮。將6cm組織培養(yǎng)皿中的細胞分到5個10cm組織培養(yǎng)皿或12個24孔組織培養(yǎng)皿中，然后在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)。以2天的間隔交換培養(yǎng)基。用CFU-MK試驗，M-07e試驗或Ba/F3試驗檢測在帶DHFR-陽性表型的CHO細胞之培養(yǎng)基中的人TPO活性。在用25nM氨甲喋呤補充的選擇培養(yǎng)基中，進一步篩選將人TPO分泌到培養(yǎng)基中的細胞以便分離生產(chǎn)高數(shù)量人TPO的細胞克隆。
在該實例中，通過用pHTP1和pMG1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO細胞也可以轉(zhuǎn)染CHO細胞。
本申請人已在1995年1月31日以保藏號FERM BP-4988將用質(zhì)粒pDEF202-hTPO-P1轉(zhuǎn)染的CHO株(CHO-DUKXB11)寄存于日本生物科學和人體技術(shù)國立研究所，工業(yè)科學和技術(shù)司，國際貿(mào)易和工業(yè)部。
<實施例33>
構(gòu)建用于X63.6.5.3細胞重組載體BMCGSneo-hTPO-P1用限制酶XhoI和NotI消化1mg哺乳動物表達載體pBMCGSneo，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以分離載體DNA部分。用T4 DNA連接酶將該DNA片段與通過用限制酶XhoI和NotI消化含有人TPO cDNA的質(zhì)粒pBLTEN而得到的人TPO cDNA(P1克隆)相連以得到所需的表達載體pBMCGSneo-hTPO-P1。該表達質(zhì)粒含有cytomegalovirus早期啟動子、部分兔β球蛋白基因來源的內(nèi)含子和用于轉(zhuǎn)錄人TPO cDNA轉(zhuǎn)錄的多腺苷酸化區(qū)域、人β球蛋白基因、69％的牛乳頭狀瘤病毒1基因、胸苷激酶啟動子和多腺苷酸區(qū)域、磷酸轉(zhuǎn)移酶I基因(新霉素抗性基因)和pBR322復制原點和β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)，人TPOcDNA被連在細胞巨化病毒啟動子的下游位點。
<實施例34>在X63.6.5.3細胞中表達在含10％胎牛血清的Dulbecco′s基本必需(DME)培養(yǎng)基中培養(yǎng)X63.6.5.3細胞。按下列所述用電穿孔方法由BMCGSneo hTPO質(zhì)粒轉(zhuǎn)染X63.6.5.3細胞。
將20mg實施例33中得到的質(zhì)粒BMCGSneo-hTPO-P1加到含107細胞的750μl DME培養(yǎng)基中，然后將混合物放在缺口為4mm的電穿孔樣品池中，在4℃放10分鐘。然后將樣品池放入電穿孔裝置(BTX 600，由BTX制造)中以便在380V，25mF和24的條件下完成基因轉(zhuǎn)移。基因轉(zhuǎn)移后，將樣品池于4℃再放15分鐘，然后用含10％胎牛血清的DME將細胞洗滌一次。將轉(zhuǎn)染的細胞懸于50ml含10％胎牛血清的DME中，分散到96孔組織培養(yǎng)皿中的各孔中，然后在CO2保溫箱中培養(yǎng)2天。培養(yǎng)2天后，用含10％胎牛血清和1mg/ml G418(由GIBSCO制造)的DME更換培養(yǎng)基，然后每隔3天換一次培養(yǎng)基。用CFU-MK，M-07e或Ba/F3檢驗檢測轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)基中的人TPO活性。用限制稀釋克隆將分泌人TPO到培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化體克隆兩次以建立人TPO生產(chǎn)細胞系。
<實施例35>
在COS1細胞中大規(guī)模表達人TPO按實施例11中的描述，按包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖方法完成COS1細胞的轉(zhuǎn)染。用膠原蛋白包被的175cm2培養(yǎng)瓶，在含10％(v/v)FCS的IMDM中于37℃在5％CO2保溫箱中培養(yǎng)COS1細胞(ATCC CRL1650)直到細胞100％匯合。為了使膠原蛋白包被培養(yǎng)燒瓶，將已用1mM HCl將其濃度調(diào)至0.3mg/ml的25ml膠原蛋白溶液(Cellmatrix型1-C，Lwaki制造)25ml加到各175cm2的培養(yǎng)燒瓶中，在室溫下放1小時，回收膠原蛋白溶液，然后用20到50mlPBS將由此處理的燒瓶洗滌一次。通過將20ml含250μg/ml DEAE-葡聚糖(Pharmacia制造)的IMDM，60μM氯喹(Sigma制造)和10％(v/v)Nu-Serum(Collaborative制造)與已溶于500μlPBS中的質(zhì)?；旌希瑢⑺没旌衔锛拥揭簧鲜?75cm2培養(yǎng)燒瓶所含的COS1細胞中(在轉(zhuǎn)染前，用IMDM已將所述細胞洗滌過一次)，然后在5％CO2保溫箱中，于37℃將細胞培養(yǎng)3小時從而完成轉(zhuǎn)染。此后，抽吸除去培養(yǎng)物上清液，用IMDM將細胞洗滌一次，與50ml無血清培養(yǎng)基混合，然后在5％CO2保溫箱中于37℃培養(yǎng)5天以回收培養(yǎng)物上清液。在一次操作中，使用了175cm2的100-260個培養(yǎng)燒瓶，并回收到5到13升的培養(yǎng)物上清液。通過用補充有5μg/ml胰島素(Sigma制造)，5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma制造)，10μM單乙醇胺(由Wako Pure Chemical Industries制造)，20nM亞硒酸鈉(由Sigma制造)和200μg/ml BSA(無脂肪酸的高純度牛白蛋白，由Nichirei制造)制備無血清培養(yǎng)基。
<實施例36>
純化在COS1細胞中表達的人全長TPO(得自表達質(zhì)粒pHTP1.P1克隆)及其生物活性下面描述在COS1細胞中表達的人全長TPO(得自表達質(zhì)粒pHTP1)的活性和純化。為了檢測血小板增加的活性，先制備部分純化的產(chǎn)物，然后再純化得到高純度產(chǎn)物。在下列制備步驟中，主要用M-07e檢測系統(tǒng)檢測TPO活性。在大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)中，發(fā)現(xiàn)相似的TPO活性。在完成這些檢測時，將人血清白蛋白(HSA)分別加到各樣品中以達到0.02到0.05％的終濃度。
首先，在5％CO2中，用在1000ml中含0.2g BSA，5mg牛胰島素，5mg人轉(zhuǎn)鐵蛋白，0.02mM單乙醇胺和25nM亞硒酸鈉的無血清IMDM培養(yǎng)基中，按Ohashi和Sudo(Hideya Ohashi and TadashiSudo，Biosci.Biotech.Biochem.58(4)，758-759，1994)的方法，將用質(zhì)粒pHTP1轉(zhuǎn)染的COS1細胞于37℃培養(yǎng)5天，由此得到7升無血清培養(yǎng)物上清液。將蛋白水解酶抑制劑p-APMSF和Pefabloc SC(4(2-氨基乙基)-苯磺?；}酸(由Merk制造，商品號24839)加到無血清培養(yǎng)物上清液中達到約1mM的終濃度，接著用0.2μm濾器過濾以回收上清液。用一超濾單位(OmegaUltrasette，正常分子量截斷為8,000，由Filtron制造；或PLGCPellicon Cassetle，正常分子量截斷為10,000，由Millipore制造)將該上清液濃縮約10倍，將723ml的濃縮產(chǎn)物(蛋白質(zhì)濃度3.38mg/ml；總蛋白質(zhì)2,445mg；相對活性43,000；總活性105,100,000)與每1000ml 1.6mol的硫酸銨(總288g)混合以得到804ml含終濃度為1.5M硫酸銨的溶液，然后以10ml/分的流速將所得溶液用于Macro-Prep Methyl HIC柱(直徑5cm，床高9cm，由Bio-Rad制造，商品號156-0080)，該柱已預先用含1.5M硫酸銨的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.2)平衡過。上樣后，用含1.25M硫酸銨的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.2)進行洗脫以得到過柱級分F1(2,384ml蛋白質(zhì)濃度，0.864mg/ml；總蛋白質(zhì)2,061mg；相對活性；6,000)。
接著，將洗脫液換成檸檬酸鈉，pH5.8，以收集級分F2(1,092ml；蛋白質(zhì)濃度0.776mg/ml；總蛋白質(zhì)847mg；相對活性，150,000)。
將由此得到的Macro-Prep Methyl HIC柱的F2(1,081ml)以10ml/分的流速用于SP Sepharose Fast Flow柱(直徑3cm，床高10cm，Pharmacia Biotech制造，商品號17-0729-01)，該柱已預先用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.8)平衡過。上樣后，用含110mMNaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.6)洗脫以得到F1級分(2,262ml；蛋白質(zhì)濃度0.270mg/ml；總蛋白質(zhì)610mg，相對活性30,000)。接著，將洗脫溶液換成含400mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.4)以收集F2級分(856ml；蛋白質(zhì)濃度，0.189mg/ml；總蛋白質(zhì)162mg，相對活性300,000)。然后，再將洗脫液換成含1000mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.2)以收集洗脫的F3級分(370ml；蛋白質(zhì)濃度0.034mg/ml；總蛋白質(zhì)12.6mg；相對活性150,000)。
將SP Sepharose Fast Flow柱步驟的主要TPO活性級分F2(845ml)與終濃度為約10％的1-丙醇混合，然后以3ml/分的流速用于LA-WGA柱(直徑2cm，床高14cm，由Honen制造，商品號WG-007)，該柱已預先用含400mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.4)平衡過。上樣后，用含400mM NaCl的20mM檸檬酸鈉與1-丙醇(9∶1)的混合物洗脫得到F1級分(64.4ml；蛋白質(zhì)濃度0.0178mg/ml；總蛋白質(zhì)1.15mg，相對活性17,220)。接著將洗脫溶液換成含0.4M GlcNAc和10％1-丙醇的20mM檸檬酸鈉緩。沖液(pH6.1)以收集F2級分(45ml；蛋白質(zhì)濃度0.0104mg/ml；總蛋白質(zhì)0.470mg；相對活性675,000)。
將LA-WGA柱操作的主要TPO活性F2級分(340ml)與終濃度約0.005％的TFA混合，然后經(jīng)YMC-Pack CN-AP(直徑6mm，床高250mm，YMC制造，商品號AP-513))柱層析。即，用0.1％TFA作為展開劑A，含0.05％TFA的1-丙醇作為展開劑B，以0.6ml/分的流速使樣品經(jīng)預先用15％B平衡的YMC-Pack CN-AP柱。上樣后，將丙醇濃度從15％B提高到25％B。用25％B到50％B的濃度線性梯度增加經(jīng)65分鐘完成洗脫，同時用聚丙烯試管以每1.5ml(2.5分)收集洗脫液。
將各試管中0.5μl(1/3,000部分)的洗脫物與HSA混合，經(jīng)超濾濃縮以得到含0.05％HSA的0.25ml IMDM檢測培養(yǎng)溶液，以經(jīng)檢測鑒別TPO活性級分。結(jié)果，在24到30號試管(丙醇濃度為35.0和42.0％之間)發(fā)現(xiàn)強TPO活性(相對活性約為630,000到4,800,000)，收集這些試管作為TPO活性級分FA(13.5ml)。
用0.1％TFA作為展開劑A，含0.05％TFA的1-丙醇作為展開劑B，使由YMC-Pack CN-AP柱得到的FA級分經(jīng)Capcell Pak CI300A(直徑4.6mm，床高150mm，Shiseido制造，商品號CI TYPESG 300A)柱層析。將由YMC-Pack CN-AP柱操作得到的級分FA部分(8.9ml)與0.3ml甘油混合，經(jīng)離心蒸發(fā)濃縮，然后與2.5ml10％的B混合，將所得的溶液以0.4ml/分的流速經(jīng)預先用20％B平衡過的Capcell Pak CI 300A柱。上樣后，先用20％B洗脫5分鐘，然后用20％B到40％B的濃度線性梯度增加洗脫50分鐘，同時用聚丙烯試管每1ml(2.5分鐘)收集洗脫液。
將各試管中的1μl(1/1,000部分)洗脫液與HSA混合，超濾濃縮以得到含0.05％HSA的0.25ml IMDM檢測溶液，以通過檢測鑒別TPO活性部分。結(jié)果，在20到23號試管(丙醇濃度為28.5到32.5％之間)中發(fā)現(xiàn)強TPO活性(相對活性約為3,000,000到22,500,000)，收集這些試管作為高活性級分。
<實施例37>
檢測在COS1細胞中表達的人TPO的分子量由于加入了糖鏈，因此推測在COS1細胞中表達的人全長TPO(得自表達質(zhì)粒pHTP1，F(xiàn)1克隆)的分子量應大于從肽鏈的大小推測的分子量。結(jié)果，第一步，用下列方法，從含有在COS1細胞中表達的人全長TPO(得自表達質(zhì)粒pHTP1，F(xiàn)1克隆)的培養(yǎng)物上清液制備部分純化的TPO級分。即，用展開劑A(0.1％三氟乙酸(TFA))和展開劑B(含0.05％TFA的1-丙醇)，將0.3ml的培養(yǎng)物上清液用至預先經(jīng)25％B平衡的YMC-Pack PROTEIN-RP(直徑0.46cm，床高15cm，由YMC制造，商品號A-PRRP-33-46-25)柱，25％的B以0.4ml/分的流速通過柱5分鐘，然后用25％B到50％B的線性密度梯度經(jīng)50分鐘完成分離。在丙醇濃度為34.5％到43.5％范圍內(nèi)的洗脫液中發(fā)現(xiàn)了TPO活性，經(jīng)離心蒸發(fā)蒸發(fā)干燥這些洗脫液以得到部分純化的樣品。
接著，在從以實施例1中所述的非還原條件下完成的SDS-PAGE電泳凝膠中提取蛋白質(zhì)后，用M-07e檢測系統(tǒng)檢測TPO活性，或者按將在下文實施例45中所述的Western分析法，以還原-處理的DPCIII標記為基礎(chǔ)，測量分子量。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了TPO活性在約69,000到94,000的寬分子量范圍內(nèi)，由此證實分子量的變化。另外，在用N-聚糖酶(由Genzyme制造，商品號1472-00)消化其N-配糖鍵型糖鏈后，以還原-處理的DPCIII標記為基礎(chǔ)，測量到TPO的表觀分子量為36,000到40,000，大于從肽鏈的大小推測的約35,000的分子量。因此，也有力地說明存在○-配糖鍵型糖鏈。
用相同的方法，發(fā)現(xiàn)在COS1細胞中表達的人全長TPO(得自表達質(zhì)粒pHTP1，P1克隆)的分子量為63,000到83,000。
<實施例38>
人TPO的生物學特征主要用由pHTF1轉(zhuǎn)染之COS1細胞的培養(yǎng)物上清液檢測人TPO對人和大鼠生血細胞的影響。
在使用從人臍帶血制備的CD34+DR+細胞級分的集落檢測中，人TPO明顯刺激巨核細胞集落的形成。例如，在用pHT1-231轉(zhuǎn)染之COS1細胞的10％(v/v)培養(yǎng)物上清液存在的條件下，由6,000個CD34+DR+細胞形成11.5個巨核細胞集落。為了檢測人TPO對外周血中人巨核細胞祖代細胞的影響，按下列方法從人外周血制備CD34+細胞。從用Ficoll-Paque密度梯度從人外周血得到的白細胞級分中去掉粘附于塑料盤的細胞。隨后，通過使用AIS Microselecter SBA(Asahi Medical)進行淘汰從非粘附細胞中去掉SBA(大豆凝集素)陽性細胞。在AIS Microselecter CD34上培養(yǎng)所得的細胞，當轉(zhuǎn)染的COS1細胞的培養(yǎng)物上清液存在的條件下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)CD3+細胞時收集吸附的細胞，CD34+細胞，觀察到大體積的GpIIb/IIIa+細胞的選擇性增殖，在這些GpIIb/IIIa+細胞中還發(fā)現(xiàn)倍性增加。這些結(jié)果有力地說明人TPO對人巨核細胞譜系的祖代細胞有選擇作用，并且刺激其增殖和分化。
在使用對于CFU-MK高度富集的GpIIb/IVa+的集落檢測中，人TPO誘導形成明顯數(shù)量的巨核細胞集落，所述CFU-MK來自大鼠骨髓細胞和在前面的GpIIb/IIIa+細胞步驟得到的成形的非粘附細胞。例如，在20％(v/v)轉(zhuǎn)染之COS1細胞培養(yǎng)物上清液存在的條件下，由1,000個GpIIb/IIIa+細胞形成34.5個巨核細胞集落，由20,000個成形的非粘附細胞形成28.5個巨核細胞集落。另外，盡管成形的非粘附細胞級分含有各種生血祖代細胞而不是CFU-MK，但只有在存在人TPO的情況下才形成巨核細胞集落，這有力地說明人TPO對巨核細胞譜系的祖代細胞有選擇作用。在20％(v/v)轉(zhuǎn)染COS1細胞之培養(yǎng)物上清液存在的情況下，將得自大鼠骨髓的GpIIb/IIIa+細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3到5天后，在培養(yǎng)的第5天清楚地觀察到倍性的增加。
<實施例39>
構(gòu)建用于在E.coli中表達谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和人TPO(1-174的氨基酸殘基)的融合蛋白質(zhì)(下文稱為“GST-TPO(1-174)”)的載體為了有利于在E.coli中表達人TPO，制備編碼人TPO并含有E.coli優(yōu)選密碼子的人工基因。該DNA的核苷酸序列在-1位含有用于在E.coli中轉(zhuǎn)譯啟動的氨基-末端Met密碼子(ATG)。制備合成寡核苷酸1到1215′-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAGCCCGGCTCCGCCAGCTTGTGACCTTCGTGTTCTGTCT-3′(SEQ ID NO83)；25′-CAGTTTAGACAGAACACGAAGGTCACAAGCTGGCGGAGCCGGGCTCATTATTTATTACCTCCTTGGRTTTTTT-3′(SEQ ID NO84)；35′-AAACTGCTTCGCGACTCTCACGTGCTGCACTCTCGTCTGTCCCAGTGCCCGGAAGTTCACCCGCTGCCG-3′(SEQ ID NO85)；45′-CGGGGTCGGCAGCGGGTGAACTTCCGGGCACTGGGACAGACGAGAGTGCAGCACGTGAGAGTCGCGAAG-3′(SEQ ID NO86)；55′-ACCCCGGTTCTGCTTCCGGCTGTCGACTTCTCCCTGGGTGAATGGAAAACCCAGATGGAAGAGACCAAA-3′(SEQ ID NO87)；65′-CTGAGCTTTGGTCTCTTCCATCTGGGTTTTCCATTCACCCAGGGAGAAGTCGACAGCCGGAAGCAGAAC-3′(SEQ ID NO88)；75′-GCTCAGGACATCCTGGGTGCAGTAACTCTGCTTCTGGAAGGCGTTATGGCTGCACGTGGCCAGCTTGGC-3′(SEQ ID NO89)；85′-GGTCGGGCCAAGCTGGCCACGTGCAGCCATAACGCCTTCCAGAAGCAGAGTTACTGCACCCAGGATGTC-3′(SEQ ID NO90)；95′-CCGACCTGCCTGTCTTCCCTGCTTGGCCAGCTGTCTGGCCAGGTTCGTCTGCTGCTCGGCGCTCTGCAG-3′(SEQ ID NO91)；105′-CAGAGACTGCAGAGCGCCGAGCAGACGAACCTGGCCAGACAGCTGGCCAAGCAGGGAAGACAGGCA-3′(SEQ ID NO92)；115′-TCTCTGCTTGGCACCCAGCTGCCGCCACAGGGCCGTACCACTGCTCACAAGGATCCGAACGCTATCTTCC-3′(SEQ ID NO93)；and125′-AAGACAGGAAGATAGCGTTCGGATCCTTGTGAGCAGTGGTACGGCCCTGTGGCGGCAGCTGGGTGCCAAG-3′(SEQ ID NO94)然后在由1mM ATP、10mM Tris-乙酸鹽，10mM乙酸鎂和50mM乙酸鉀組成的溶液中，用T4激酶(由Pharmacia制造)分別將2-11的合成寡核苷酸磷酸化。為了將這些合成的寡核苷酸制成6個雙鏈DNA片段，將這些合成寡核苷酸以1和2，3和4，5和6，7和8，9和10，及11和12結(jié)合，在由10mM Tris/HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和50mM NaCl組成的溶液中使各組結(jié)合退火。接著，用T4連接酶(Life Technology制造)分別處理1和2，3和4及5和6的3個雙鏈DNA片段，以及7和8，9和10，11和12的另3個雙鏈DNA片段，用相同的方法用T4連接酶再處理這2種反應溶液。用BamHI(由Boehringer-Mannheim制造)消化經(jīng)連接反應得到的DNA片段，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以回收約390到400bp的片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化，然后亞克隆到預先經(jīng)XbaI和BamHI消化的pUC18中(用E.coli DH5α作宿主)。從這些所得克隆中，用核苷酸序列分析篩選出具有編碼人TPO并含有下列E.coli優(yōu)選密碼子之人工基因的克隆，并命名為pUC18(XB)(1-123)。在序列表(SEQ ID NO9)中列出了編碼鏈的DNA序列。
10 1 20 30 40 50 60CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTGACCTTCGTTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTCGGGCCGA GGCGGTCGAA CACTGGAAGCXbaI 270 80390100110120TGTTCTGTCT AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCCACAAGACAGA TTTGACGAAG CGCTGAGAGT GCACGACGTG AGAGCAGACA GGGTCACGGG4130140150 5 160170180GGAAGTTCAC CCGCTGCCGA CCCCGGTTCT GCTTCCGGCT GTCGACTTCT CCCTGGGTGACCTTCAAGTG GGCGACGGCT GGGGCCAAGA CGAAGGCCGA CAGCTGAAGA GGGACCCACT6190200210220 7 230240ATGGAAAACC CAGATGGAAG AGACCAAAGC TCAGGACATC CTGGGTGCAG TAACTCTGCTTACCTTTTGG GTCTACCTTC TCTGGTTTCG AGTCCTGTAG GACCCACGTC ATTGAGACGA8250260270280290 9 300TCTGGAAGGC GTTATGGCTG CACGTGGCCA GCTTGGCCCG ACCTGCCTGT CTTCCCTGCTAGACCTTCCG CAATACCGAC GTGCACCGGT CGAACCGGGC TGGACGGACA GAAGGGACGA10
310320330340350360TGGCCAGCTG TCTGGCCAGG TTCGTCTGCT GCTCGGCGCT CTGCAGTCTC TGCTTGGCACACCGGTCGAC AGACCGGTCC AAGCAGACGA CGAGCCGCGA GACGTCAGAG ACGAACCGTG11 370380390400410420CCAGCTGCCG CCACAGGGCC GTACCACTGC TCACAAGGAT CCGAACGCTA TCTTCCGGTCGACGGC GGTGTCCCGG CATGGTGACG AGTGTTCGTA GGCTTGCGAT AGAAGGACAG AA12 BamHI用oligo dT引物，從1μg人正常肝來源的poly(A)+RNA合成單鏈cDNA，然后用0.1體積的cDNA合成反應溶液為模板進行PCR。用hTPO-C和hTPO-Z(EcoRI)作為引物，在100μl體積中進行PCR反應(在96℃溫育2分鐘，共重復30個循環(huán)，每個循環(huán)包括在95℃溫育1分鐘，58℃1分鐘和72℃1分鐘，在72℃最后再溫育7分鐘)。用BamHI和EcoRI消化用這種方法得到的人TPO cDNA片段，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以回收約600bp的片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化，然后亞克隆到預先用EcoRI和BamHI消化的pUC18中(E.coli DH5α為宿主)。經(jīng)核苷酸序列分析篩選出編碼正確的人TP0核苷酸序列的克隆，并稱為pUC18(BE)(124-332)。在PCR反應中所用的引物的寡核苷酸序列如下hTPO-C5′-GGA GGA GAC CAA GGC ACA GGA-3′(SEQ ID NO95)(pHTF1克隆的位置329到349)；和hTPO-Z(EcoRI)5′-CCG GAA TTC TTA CCC TTC CTG AGACAG ATT-3′(SEQ ID NO96)(通過將一EcoRI識別序列加到相當于pHTF1克隆1,143到1,163位的反義引物中而制備的)。
用BamHI和EcoRI消化克隆pUC18(BE)(124-332)，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以回收約600bp的人TPO cDNA的C-末端側(cè)片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化，然后亞克隆到預先用EcoRI和BamHI消化的pUC18(XB)(1-123)中(用E.coli DH5α作為宿主)。用該方法得到的克隆稱為pUC18(XE)(1-332)。
由于通過制備并表達各種人TPO cDNA的C-末端缺失構(gòu)建體以測量體外人TPO活性的實施例已經(jīng)證實，在1到163位氨基酸殘基的人TPO肽片段中存在人TPO活性，因此構(gòu)建含該肽片段的表達載體。在該實例中，表達編碼GST-TPO(1-174)的DNA序列。
由于限制酶SacI識別對應于pHTF1克隆之681-686位(173和174位的氨基酸殘基)的核苷酸序列，利用該限制酶的識別位點用兩個合成寡核苷酸導入2個末端密碼子。即，在由10mM Tris/HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和50mM NaCl組成的溶液中，利用DNA連接盒(Takara Shuzo制造)，將兩個合成的寡核苷酸SSE1和SSE2退火，將由此得到的雙鏈DNA片段導入經(jīng)SacI和EcoRI消化已從中除去了約480bp人TPO cDNA C-末端片段的pUC18(XE)(1-332)中，由此得到克隆pUC18(XS)(1-174)(用E.coli DH5α作為宿主)。本文所用的合成寡核苷酸的序列如下SSE1 CTAATGAG(SEQ ID NO97)；SSE2 AATTCTCATTAGAGCT(SEQ ID NO98)；SacI SSE1 EcoRI5′-CTAATGAG-3′(SEQ ID NO99)3′-TCGAGATTACTCTTAA-5′(SEQ ID NO100)SSE2用XbaI和EcoRI消化上述得到的克隆pUC18(XS)(1-174)，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以回收編碼人TPO之1-174位氨基酸殘基的約600bp的片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化該片段，然后亞克隆到預先用XbaI和EcoRI消化的pBluescript IISK+(Stratagene制造)(用E.coli DH5α作為宿主)。用該方法得到的克隆稱為pBL(XS)(1-174)。用相同的方法，由XbaI和HindIII消化克隆pBL(XS)(1-174)以回收編碼人TPO之1-174位氨基酸殘基的約550bp片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化所述片段，然后亞克隆到預先用XbaI和HindIII消化的pCFM536(EP-A-136490)中(用E.coli DH5α為宿主)。用該方法所得到的克隆稱為pCFM536/hT(1-174)。
為了有效表達GST-TPO(1-174)，利用PGEX-2T(Pharmacia)進行下列實驗，pGEX-2T是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白質(zhì)的表達載體。用pCFM536/hT(1-174)作為模板，以及兩個PCR引物GEX1和GEX3進行PCR反應(在96℃溫育2分鐘，共重復22個循環(huán)，每個循環(huán)包括在95℃溫育1分鐘，41℃1分鐘和72℃1分鐘，最后在72℃溫育7分鐘)。用NaeI和EcoRI消化用該方法得到的人TPO編碼片段，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以回收約550bp的片段，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化所述片段，將其克隆到預先用EcoRI和SmaI消化的pGEX-2T中(用E.coli DH5α為宿主)，然后用核苷酸序列分析篩選出編碼正確人TPO核苷酸序列的克隆，稱為pGEX-2T/hT(1-174)以制備用于表達GST-TPO(1-174)的轉(zhuǎn)化體。在PCR反應中所用之引物的序列如下GEX15′-ATC GCC GGC TCC GCC AGC TTG TGA C-3′(SEQ IDNO101)(通過將NaeI識別序列加到SEQ ID NO10的21到39位而制備的)；和GEX35′-GCC GAA TTC TCA TTA GAG CTC GTT CAG TGT-3′(SEQ ID NO102)(對應于SEQ ID NO10中523-549位之序列的反義引物)。
該表達質(zhì)粒含有編碼接有凝血酶識別肽和人TPO(1-174位氨基酸)的GST蛋白質(zhì)的DNA序列。在序列表中(SEQ ID NO10)中列出了編碼凝血酶識別肽和人TPO(1-174位氨基酸)的DNA序列。
<實施例40>
在E.coli中表達GST-TPO(1-174)用含50μg/ml的氨芐青霉素的60ml LB培養(yǎng)基在振蕩器上將實施例39中制備的轉(zhuǎn)化體于37℃培養(yǎng)過夜，將25ml所得的培養(yǎng)液加到含50μg/ml氨芐青霉素的1,000ml LB培養(yǎng)基中，在振蕩器上于37℃培養(yǎng)直到在A600的OD達到0.7到0.8。然后，將IPTG加到培養(yǎng)液中達到0.1mM的終濃度，繼續(xù)再振蕩培養(yǎng)3小時以誘導GST-TPO(1-174)的表達。
<實施例41>
純化在E.coli中表達的GST-TPO(1-174)，并證明其生物活性將5.9克重組菌株的凍細胞懸浮在10ml水中，然后用高壓破碎儀破碎，所述菌株生產(chǎn)得自ATPO核苷酸序列-編碼克隆pGEX-2T/hT(1-174)的GST-TPO(1-174)。使懸浮液離心，在沉淀部分回收GST-TPO(1-174)，除去大部分污染蛋白質(zhì)、細胞組分等。接著，將所得的含GST-TPO(1-174)的沉淀部分懸浮在5ml水中，隨后邊攪拌邊向其中加入6ml 1M Tris緩沖液(pH8.5)，120ml10M脲和16ml水。攪拌5分鐘溶解內(nèi)含物后，將所得溶液平均分成4份以完成下列的步驟(1)-(4)。
(1)用20mM Tris緩沖液(pH8.5)將一份樣品稀釋10倍。向其中加入還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其分別達到5mM和0.5mM的濃度，然后于4℃過夜培養(yǎng)。將所得的混合物離心以回收作為上清液的GST-TPO(1-174)，用pH為5.5的20mM檸檬酸鈉稀釋2倍，然后用乙酸將pH調(diào)至5.5，將GST-TPO(1-174)溶液加至預先用20mM檸檬酸鈉(pH5.5)平衡的SP Sepharose Fast Flow(由Pharmaeia Biotech制造，商品號17-0729-01)陽離子交換柱。用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌該柱后，用含500mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗脫GST-TPO(1-174)。將129ml洗脫液與2.6ml 1M Tris緩沖液(pH8.5)混合，將pH為8.1的所得混合物用于Glutathione Sepharose 4B(由Pharmacia Biotech制造，商品號17-0756-01)柱以吸附GST-TPO(1-174)。用PBS洗滌柱后，用含10mM還原型谷胱甘肽的20mM Tris緩沖液洗脫GST-TPO(1-174)。將所得的洗脫液與37NIH單位的凝血酶混合，在室溫放4小時，用PBS稀釋10倍，然后用于Glutathione Sepharose4B柱以吸附消化的GST，并回收在非吸附級分中的TPO(1-174)。將回收的非吸附級分用20mM檸檬酸鈉緩沖液pH5.5稀釋3倍，然后用于預先用相同的緩沖液平衡的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱，用溶于相同緩沖液的線性密度梯度的0-500mM MaCl洗脫所需的物質(zhì)。
(2)存在0.1％多乙氧基醚(polysorbate 80)的條件下完成步驟(1)的所有操作。
(3)用pH值為8.5的20mM Tris緩沖液將一份樣品稀釋10倍。向其中加入還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽，使其終濃度分別為5mM和0.5mM，然后在4℃培養(yǎng)過夜。將所得的混合物離心以收集作為上清液的GST-TPO(1-174)，然后用pH值5.5的20mM檸檬酸鈉緩沖液稀釋2倍，再用乙酸將pH調(diào)至5.5。將GST-TPO(1-174)溶液加至預先經(jīng)20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)平衡的SPSepharose Fast Flow陽離子交換樹脂。用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗滌樹脂后，用含500mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)洗脫GST-TPO(1-174)。用pH8.5的1M Tris緩沖液將洗脫液的pH調(diào)至8，與320NIH單位的凝血酶混合以便在凝血酶識別肽接頭經(jīng)裂解除去GST多肽序列，在室溫放4小時，用pH5.5的20mM檸檬酸鈉緩沖液稀釋5倍，然后加至預先經(jīng)相同緩沖液平衡的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱，用在相同緩沖液中線性密度梯度的0-500mN NaCl洗脫所需的物質(zhì)。
(4)存在0.1％多乙氧基醚的條件下完成步驟(3)的所有操作。
將經(jīng)SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱層析在約200-400mM的NaCl密度洗脫的各級分對IMDM培養(yǎng)基徹底透析，然后用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)評估。在還原劑存在的條件下，用SDS-PAGE分析該級分時，檢測到對應于分子量為19kd的條帶(純度1-20％)為該級分的一個主要蛋白質(zhì)帶。用SDS-PAGF對該帶進行N-末端序列分析并按實施例1中描述的方法經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)移后，證實該帶含有表達為pGEX-2T/hT(1-174)-衍生的融合蛋白的TPO序列。所得TPO之推測的氨基酸序列為[Gly-1]TPO，給予了凝血酶識別肽接頭的序列和接頭上凝血酶的已知活性。
<實施例42>
構(gòu)建用于在E.coli中表達在位置1(Ser-＞Ala)和位置3(Ala-＞Val)有取代的人TPO(1-163位氨基酸)的載體用XbaI和EcoRI消化實施例39中制備的克隆pUC18(XE)(1-332)，經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以回收約1000bp的片段，該片段編碼人TPO的1-332位氨基酸殘基，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化該片段，然后亞克隆到預先經(jīng)XbaI和EcoRI消化的pBluescriptIISK+(由Stratagene制造)中(用E.coli DH5α為宿主)。用這種方法得到的克隆稱為pBL(XE)(1-332)。接著，將克隆pBL(XE)(1-332)從其BamHI識別序列到163位氨基酸(366-489位)的區(qū)域換成E.coli的優(yōu)勢密碼子。制備下列所示的合成寡核苷酸13-20，然后在含溶液的相同試管中將每對合成寡核苷酸13和14，15和16，以及17和18磷酸化，所述溶液由0.1mM ATP，10mMTris-乙酸，1OmM乙酸鎂和50mM乙酸鉀組成。再加入1/10體積由100mM Tris/HCl(pH7.5)，100mM MgCl2和500mM NaCl組成的溶液后，在沸水浴中將所得溶液加熱3分鐘，然后冷卻到室溫以得到雙鏈DNA片段。接著用DNA連接盒(Takara Shuzo制造)連接所得的3對雙鏈DNA片段13和14，15和16，17和18，用由此連接的產(chǎn)物作為模板，合成的寡核苷酸19和20為引物完成PCR。用BamHI和HindIII消化所得的PCR產(chǎn)物，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳以便用Prep-A-Gene DNA純化盒回收約130bp的片段。將所述片段亞克隆到預先用BamHI和HindIII消化的pBL(XE)(1-332)中(用E.coli DH5作為宿主)。用序列分析從所得的克隆中篩選出含有下列核苷酸序列的克隆，并命名為pBL(XH)(1-163)135′-GATCCGAACGCTATCTTCCTGTCTTTCCAGCACCTGCTGCGT-3′(SEQ ID NO103)；145′-TTTGCCACGCAGCAGGTGCTGGAAAGACAGGAAGATAGCGTTCG-3′(SEQ ID NO104)；155′-GGCAAAGTTCGTTTCCTGATGCTGGTTGGCGGTTCTACCCTG-3′(SEQ ID NO105)；165′-ACGCACAGGGTAGAACCGCCAACCAGCATCAGGAAACGAAC-3′(SEQ ID NO106)；175′-TGCGTTCGTCGGGCGCCGCCAACCACTGCTGTTCCGTCTTAATGAA-3′(SEQ ID NO107)；185′-AGCTTTCATTAAGACGGAACAGCAGTGGTTGGCGGCGCCCGACGA-3′(SEQ ID NO108)；195′-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3′(SEQ ID NO109)；和205′-AGAAGCTTTCATTAAGACGGAACA-3′(SEQ ID NO110).
為了提高人TPO(1-163位)的表達數(shù)量并防止蛋白酶水解N-末端，構(gòu)建用于表達突變型人TPO(1-163位)(下文稱為“h6T(1-163)”)的表達載體，所述突變型人TPO在人TPO(1-163位)([Ala1，Val3]TPO(1-163))的位置1(Ser變成Ala)和位置3(Ala變成Val)有取代，同時在-1位編碼Lys，在-2位編碼Met([Met-2，Lys-1，Ala1，Val3]TPO(1-163))。制備下列4種合成的寡核苷酸，在由1mM ATP，10mM Tris-乙酸鹽，10mM乙酸鎂和50mM乙酸鉀組成的溶液中，用T4激酶(Pharmacia制造)將合成的寡核苷酸2-9和3-3磷酸化。為了使這些合成的寡核苷酸形成雙鏈DNA片段，在由10mM Tris/HCl(pH7.5)，10mM MgCl2和50mM NaCl組成的溶液中將各對單鏈DNA片段1-9和2-9和3-3和4-3退火。接著用DNA連接盒(Takara Shuzo制造)處理由1-9和2-9和3-3和4-3組成的所得兩對雙鏈DNA。將經(jīng)連接反應得到的DNA片段亞克隆至預先經(jīng)XbaI和NruI消化的pBL(XH)(1-163)中，用序列分析篩選由下列合成寡核苷酸正確取代的克隆(用E.coli DH5α為宿主)并命名為pBL(XH)h6T(1-163)1-95′-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAAGCACCTGTACCA-3′(SEQ ID NO111)；2-95′-CAGGTGGTACAGGTGCTTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3′(SEQ ID NO112)；3-35′-CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG-3′(SEQ ID NO113)；4-35′-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3′(SEQ ID NO114)；10 1-9 20 30 40CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCTTTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTCGTGGAXbaI2-950 60 3-370 80GTACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCGCATGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC4-3(SEQ ID NO115)用XbaI和HindIII消化克隆pBL(XH)(1-163)以回收約500bp的片段。該片段編碼突變型人TPO的1-163位氨基酸殘基，隨后用Prep-A-Gene DNA純化盒純化該片段，然后克隆到預先用XhaI和HindIII消化的pCFM536(EP-A-136490)(用預先由pMW1(ATCC No.39933)轉(zhuǎn)化的E.coli JM109作為宿主)。用該方法得到的克隆命名為pCFM536/h6T(1-163)。用含有該表達載體的E.coli菌株作為轉(zhuǎn)化體用于表達突變型人TPO，即h6T(1-163)。該表達質(zhì)粒含有序列表中所示的DNA序列(SEQ ID NO11)。
<實施例43>
在E.coli中表達h6T(1-163)由其自身在cI857阻遏物基因控制下的λPL啟動子控制表達質(zhì)粒pCFM536的表達。用含50μg/ml的氨芐青霉素和12.5μg/ml四環(huán)素的60ml LB培養(yǎng)基，在振蕩器上將實施例42中得到的轉(zhuǎn)化體在30℃培養(yǎng)過夜，將所得的25μl培養(yǎng)液加到1000ml含50μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在振蕩器上于37℃培養(yǎng)直到在A600的OD值達到1.0-1.2。此后，將加熱到65℃的約330ml LB培養(yǎng)基加到培養(yǎng)液中以便使培養(yǎng)基的最后溫度為42℃，在42℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3小時以誘導h6T(1-163)的表達。
<實施例44>
純化在E.coli中表達的h6T(1-163)并證實其生物活性將3.69生產(chǎn)h6T(1-163)的重組菌株的凍細胞懸浮在10ml水中，用高壓破碎儀破碎。使懸浮液離心，回收沉淀部分并除去大部分污染蛋白質(zhì)、細胞組分等。將含h6T(1-163)的所回收的沉淀部分懸浮于7ml水中，邊攪拌邊加入3ml Tris緩沖液(pH8.5)，然后再加入脲(終濃度，8M)，鹽酸胍(終濃度，6M)，N-十二烷基肌氨酸鈉(終濃度，2％)。在室溫攪拌5-20分鐘溶解了內(nèi)含物后，用pH值為8.5的20mM Tris緩沖液將所得溶液稀釋10倍，在4℃培養(yǎng)過夜使蛋白質(zhì)重折疊。在該實例中，除空氣氧化外，用谷胱甘肽和硫酸銅作為添加劑。經(jīng)離心，將h6T(1-163)回收在上清液中。在存在還原劑的情況下，經(jīng)SDS-PAGE分析各回收級分時，檢測到一對應于分子量18kd的為各級分的主蛋白質(zhì)帶(純度，30-40％)。用SDS-PAGE對該帶進行N-末端序列分析，然后按實施例1中所述的方法用PVDF膜轉(zhuǎn)移，證明該帶含有表達為pCMF536/h6T(1-163)-衍生突變型TPO的TPO序列。將各級分對TMDM培養(yǎng)基徹底透析，并用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)評估，在所有級分中均發(fā)現(xiàn)劑量依賴形式的TPO活性。
<實施例45>
制備抗-TPO肽抗體并用SDS-PAGE和Western分析檢測TPO成功地制備抗-TPO肽抗體使得有可能經(jīng)免疫學方法檢測TPO蛋白質(zhì)。結(jié)果，從確定的TPO氨基酸序列中篩選了3個作為抗原似乎相對有用的區(qū)域(見下文)，用各篩選的區(qū)域，按Tam(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413，1988)的方法合成四鏈多抗原肽(MAP)型肽，然后用100μg的各種所合成的肽免疫2只兔8次以得到相應的抗血清樣品。在合成的肽抗原中所含的氨基酸序列(a)大鼠TPO(9-28)(肽RT1區(qū))PRLLNKLLRDSYLLHRRLSQ(SEQ ID NO116)(在從基因確定的氨基酸殘基中，24位的R原是S。)(b)大鼠TPO(46-66)(肽RT2區(qū))FSLGEWKTQTEQSKAQDILGA(SEQ ID NO117)(c)大鼠TPO(163-180)(肽RT4區(qū))SRTSQLLTLNKFPNRLLD(SEQ ID NO118)(在從基因確定的氨基酸殘基中，178-180位的LLD原是TSG。)接著，在這些抗血清樣品中，抗-RT1肽和抗-RT2肽首先經(jīng)蛋白質(zhì)A(PROSEP-A；由Bioprocessing Ltd.制造，商品號8427)柱層析以制備IgG級分(分別為2,344mg和1,920mg)，通過其與活性型生物素(NHS-LC-Biotin II；PIERCE制造，商品號21336)偶聯(lián)而使分別為54mg和32mg的各級分生物素化。將含重組TPO的樣品經(jīng)SDS-PAGE，然后用與實施例中所述相同的方法電印跡在PVDF或硝酸纖維素膜上，用這些生物素化的抗體作為第一抗體，用常規(guī)方法完成Western分析。
即，將印跡后的膜用由20mM Tris-HCl和0.5M NaCl(pH7.5)(TBS)組成的溶液洗滌5分鐘，用含TBS的0.1％Tween 20(TTBS)洗2次每次5分鐘，再用阻斷劑(BlockAce；由DainipponPharmaceutical制造，商品號uk-B25)處理60分鐘。接著，用含10μg/ml生物素化的抗-TPO肽抗體、0.05％BSA和10％BlockAce的TTBS溶液將膜處理60分鐘，然后用TTBS洗滌2次每次5分鐘。此后，用通過由含10％BlockAce的TTBS溶液稀釋5,000倍的堿性磷酸酶-標記的親和素(由Leinco Technologies制造，商品號A108)而得到的溶液將膜處理30分鐘，再用TTBS洗滌2次各5分鐘，用TBS洗5分鐘，然后用堿性磷酸酶底物(由Bio-Rad制造，商品號170-6432)顯色。在室溫下完成上述的Western印跡分析。
結(jié)果，它不僅能夠識別在COS1細胞中表達的多種重組大鼠TPO蛋白質(zhì)，而且也識別在COS1細胞和E.coli細胞中表達的各種重組人TPO蛋白質(zhì)(說明性地，如在COS1細胞中表達的質(zhì)粒pHTP1-或質(zhì)粒pHTF1-來源的人TPO，和在E.coli中表達的GST-TPO(1-174)的配糖鍵-裂解的產(chǎn)物和凝血酶消化的產(chǎn)物以及在E.coli中表達的突變型TPOh6T(1-163)，所有這些均已在實施例中作了描述)。另外，這些結(jié)果也使得可能分析各種類型的重組人TPO。
除上述外，也證明了制備抗-人TPO肽抗體的可能性。由這些技術(shù)得到的抗體不僅可用于Western分析，而且可通過抗體柱純化TPO以及常用的以抗體為輔助的免疫學方法。
篩選在SEQ ID NO7中所示的人TPO氨基酸序列中預期具有相對適宜的抗原性的6個區(qū)域(見表4)。合成四聚的多抗原肽(MAP)型肽，每個單體分別與不同的區(qū)域相對應。用每種肽以100mg/次的劑量免疫2只兔8次。
與此不同，也合成了其中Cys殘基已與各肽區(qū)之C-末端鍵合的單體肽。用該肽作為試驗抗原以便用酶免疫檢測確定抗體滴定度。結(jié)果，確定了上述制備的血清其抗體滴定度增加，因此用這些血清作為抗血清。
通過用各抗原肽免疫兩只兔子以生產(chǎn)針對該肽的抗血清從而制備抗體。根據(jù)不同兔個體，分別將所得的兩種抗-HT1肽抗體稱為抗-HT1-1肽抗體和抗-HT1-2肽抗體。
下面將舉例說明抗-HT1-1肽抗體的純化。
首先，將已與Cys殘基鍵合的HT1單體肽與12ml Sulfo-Liak偶聯(lián)凝膠(Pierce，商品號44895)偶聯(lián)。簡而言之，將含抗原的肽溶液與用6體積(相對凝膠體積)的偶聯(lián)緩沖液(50mM Tris，50mMEDTA-Na pH8.5)平衡的凝膠偶聯(lián)15分鐘。然后溫育30分鐘后，用3體積(相對于凝膠體積)的偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠。將含0.05ML-Cys-HCl的偶聯(lián)緩沖液以1ml/ml凝膠的量加到凝膠中經(jīng)15分鐘以上阻斷未反應的基團。溫育30分鐘后，用8體積(相對于凝膠體積)偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠。在室溫下完成所有的偶聯(lián)反應。因此，肽以28.3％的偶聯(lián)率與凝膠共價結(jié)合，然后制備含0.8mg肽/ml凝膠的抗原性。
將76.7ml(蛋白含量3620mg)含抗-HT1-1肽抗體的抗血清(已從一只兔中抽出，總量為78.4ml)加至預先經(jīng)含150mM NaCl和0.05％疊氮化鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8)平衡的抗原柱，然后用相同的緩沖液洗滌以得到105.9ml的流出物級分(蛋白質(zhì)含量3680mg)。然后用0.1M檸檬酸鹽緩沖液(pH3.0)洗脫吸附的級分，緊接著用21.1ml 0.1M的碳酸鹽緩沖液(pH9.9)中和，然后超濾(用Amicon YM30膜)濃縮以得到在含150mM NaCl和0.05％ NaN3的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8)中的純化抗-HT1-1肽抗體。
相似地，制備下列抗體抗-HT1-2肽抗體(60.0mg)；抗-HT2-1肽抗體(18.8mg)；抗-HT2-2肽抗體(8.2mg)；等。用相似的方法也可以制備抗-HT3到-HT6肽抗體。
通過與活化的生物素(Pierce，NHS-LC-Biotin II，商品號21336)偶聯(lián)使3mg親和純化的抗-HT1-1肽抗體，抗-HT1-2肽抗體，抗-HT2-1肽抗體或抗-HT2-2肽抗體生物素化。
將從已將編碼表4所列的氨基酸序列的基因?qū)氩⑹蛊浔磉_的CHO細胞之培養(yǎng)物上清液中部分純化的重組人TPO標準物SDS-PAGE后，用Western印跡(在硝酸纖維素濾膜或PVDF上)，發(fā)現(xiàn)所有上述純化的抗體均可識別并檢測人TPO。表4在四聚MAP型合成肽抗原中所包括的人TPO氨基酸序列人TPO(氨基酸數(shù)8-28)肽HT1區(qū)DLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQ(SEQ ID NO119)人TPO(氨基酸數(shù)47-62)肽HT2區(qū)SLGEWKTQMEETKAQD(SEQ ID NO120)人TPO(氨基酸數(shù)108-126)肽HT3區(qū)LGTQLPPQGRTTAHKDPNA(SEQ ID NO121)人TPO(氨基酸數(shù)172-190)肽HT4區(qū)NELPNRTSGLLETNFTASA(SEQ ID NO122)人TPO(氨基酸數(shù)262-284)肽HT5區(qū)SLPPNLQPGYSPSPTHPPTGQYT(SEQ ID NO123)人TPO(氨基酸數(shù)306-332)肽HT6區(qū)PSAPTPTPTSPLLNTSYTHSQNLSQEG(SEQ ID NO124)<實施例46>
制備抗-TPO肽抗體柱由于實施例45中得到的抗-大鼠TPO肽抗體能識別大鼠和人TPO分子，因此用下列方法將抗-RT1肽抗體和抗-RT2肽抗體的免疫球蛋白(IgG)級分與化學活化的凝膠支持體相連以制備抗-TPO肽抗體柱。分別從兩只兔血清制備用作材料的兩種抗體。即，從兩只兔制備的抗-RT1肽抗體分別命名為抗-RT1-1肽抗體和抗-RT1-2肽抗體，從另2只兔制備的抗-RT2肽抗體分別命名為抗-RT2-1肽抗體和抗-RT2-2肽抗體。由于分別將這些抗體用于抗體柱的制備，因此共得到5個柱，即2個抗-RT1肽抗體柱(下文稱作“抗-RT1-1抗體柱”和“抗-RT1-2抗體柱”)，2個抗-RT2肽抗體柱(下文稱為“抗-RT2-1抗體柱”和“抗-RT2-2抗體柱”)和一個通過將抗-RT1-2肽抗體與抗-RT2-1肽抗體混合，然后將混合物與凝膠偶聯(lián)而制備的抗體柱(抗RT1-2+2-1混合抗體柱)。
將各抗體溶于50mM磷酸鈉和0.15M NaCl(pH8.0)的溶液中，達到5mg/ml的終濃度(或者對于抗-RT1+2混合抗體柱來說，抗-RT1-2肽抗體和抗-RT2-1肽抗體各為2.5mg/ml)，將2.31ml所得的溶液與1.54ml的膨脹的甲酰-活化的凝膠(Formyl-Cellulofine，Chisso制造)混合，于4℃進行2小時的偶聯(lián)反應。向其中加入1.1ml 10mg/ml的還原劑(三甲基胺硼烷(TMAB)溶液，由Seikagaku kogyo制造，商品號680246)溶液，接著再進行6小時的偶聯(lián)反應，隨后離心回收凝膠部分。將10ml純化水加到凝膠中，再次經(jīng)離心回收的凝膠部分，將該步驟重復4次以除去未反應的抗體分子。接著，將所得的凝膠與4.6ml阻斷溶液(0.2M磷酸鈉和1M乙醇胺，pH7.0)和1.1ml還原劑溶液混合，在4℃至少處理2小時以阻斷未反應凝膠的活性基團。此后，用純化水和DPBS洗滌凝膠，用離心機離心，放在小柱形管中，用3M硫氰酸鉀溶液，和0.1MGly-HCl(pH2.5)溶液洗滌，用DPBS平衡，然后貯存。
抗-RT1-1抗體柱，抗-RT1-2抗體柱，抗-RT2-1抗體柱，抗-RT2-2抗體柱和抗-RT1-2-2-1混合抗體柱的5種抗-TPO肽抗體凝膠中，相應IgG級分的偶聯(lián)率分別為97.4％，95.4％，98.4％，98.3％和99.4％。另外，與每凝膠體積偶聯(lián)的IgG級分的數(shù)量分別為5.6mg/ml凝膠，5.8mg/ml凝膠，5.7mg/ml凝膠，5.7mg/ml凝膠和2.9mg/ml凝膠。結(jié)果，隨抗體的來源和抗原差異，偶聯(lián)數(shù)量和效率并沒有明顯的變化，用這些抗體柱完成下列實施例47中所示的實驗。
<實施例47>
用抗-TPO抗體柱和反相柱層析純化得自培養(yǎng)物上清液(通過用表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染COS1細胞而得到的)的TPO，然后確定其生物活性用M-07e檢測系統(tǒng)進行體外檢測以評估下列純化樣品。將從實施例35中通過用表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染COS1細胞所得培養(yǎng)物上清液得到的TPO部分純化樣品(除主要TPO級分以外的級分，即用20mM檸檬酸鈉，pH5.8洗滌Macro-Prep Methyl HIC柱的過柱級分F1和F2以后的級分F3以及SP Sepharose Fast Flow柱的級分F1和F3)混合以制備TPO的亞收集池級分(5,463.79ml；蛋白質(zhì)濃度，0.490mg/ml；總蛋白質(zhì)，2,676mg；相對活性12,100；和總活性32,380,000)，然后用超濾裝置(Omega Ultraset，正常分子量截斷為8,000，由Filtron制造)濃縮，將濃縮級分的溶劑換成DPBS，再用配有YM-10膜的超濾裝置(Amicon制造)處理小體積樣品以使其成為含0.05％NaN3的120.2ml DPBS溶液。接著，將實施例46中得到的所有5種抗-TPO肽抗體凝膠混合，制成一個抗體柱(直徑1.6cm，床高4.8cm，稱為抗-RT1+2混合抗體柱)，將TPO至收集池級分以0.033ml/分的流速加至該柱。完成上樣后，用DPBS洗脫，收集洗脫液直到UV吸收值非常小，然后用配有YM-10膜的超濾裝置(Amicon制造)濃縮由此收集的洗脫液以得到過柱級分F1(82.62ml；蛋白質(zhì)濃度，14.3mg/ml；總蛋白質(zhì)1.184mg；相對活性67,500；總活性79,900,000)。接下來，用酸性洗脫液(0.1M Gly-HCl，pH2.5)洗脫柱吸附的F2級分(92.97ml；蛋白質(zhì)濃度，0.12mg/ml；總蛋白質(zhì)，11.1mg；相對活性，257,100，總活性，2,860,000)。盡管過柱級分F1仍含有TPO活性，但進一步純化抗體柱吸附的TPO其相對活性提高了約20倍。即，用0.1％TFA為展開劑A，含0.05％ TFA的1-丙醇為展開劑B，將從抗體柱得到的F2級分與1/10體積的展開劑B混合，將混合物以0.4ml/分的流速用于預先經(jīng)20％B平衡的Capcell Pak CI 300A柱，從而完成CapcellPak CI 300A(Shiseido制造，商品號CI TYPESG300A，直徑4.6mm，床高150mm，與一直徑4.6mm，床高35mm的前柱連接)柱層析。完全上樣后，用20％B洗脫5分鐘，然后再用線性密度梯度20％B到40％B洗脫50分鐘，以1ml(2.5分鐘)一部分將洗脫液收集在聚丙烯試管中。
將各試管中2μl(級分的1/500)的洗脫液與HSA混合，經(jīng)超濾濃縮，得到含0.02％HSA的0.25ml IMDM檢測培養(yǎng)溶液用于經(jīng)檢測鑒定TPO活性級分。結(jié)果，在20到23號試管的樣品中(丙醇濃度在28.5-32.5％的范圍內(nèi))發(fā)現(xiàn)了強TPO活性。另外，按實施例45中所述的方法經(jīng)Western印跡分析這些樣品后，確定存在TPO，以DPCIII分子量標記為基礎(chǔ)，在還原條件下檢測后，其表觀分子量為60,000-70,000，同時還存在分子量分別為32,000-43,000和20,000-30,000的其它分子。
<實施例48>
確定TPO的生物活性，所述TPO得自通過用表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染COS1細胞而得到的培養(yǎng)物上清液，并經(jīng)Capcell Pak CI 300A柱純化收集實施例36中純化的TPO活性級分，即Capcell Pak CI 300A柱的20-23號試管(丙醇濃度在28.5％和32.5％的范圍內(nèi))，與0.21ml甘油混合，然后經(jīng)離心蒸發(fā)濃縮。將所得濃縮物與0.21ml6M的鹽酸胍溶液混合，用DPBS稀釋到1ml，用Sephadex G25柱(NAP-10，由Pharmacia Biotech制造，商品號17-0854-01)，用含0.01％HSA的DPBS進行緩沖液交換，然后與含0.01％FHSA的1.1ml DPBS，最后得到TPO活性級分FA(2.6ml)。為了檢測該樣品的TPO生物活性，而進行體內(nèi)檢測。即，將該活性級分經(jīng)皮下施用于ICR雄性小鼠(8周齡)，每組包括4只動物，每天每只動物100μl的劑量共5天(經(jīng)M-07e檢測系統(tǒng)測量的總活性為110,000)。作為對照，用相同的方法皮下施用含0.01％HSA的100μl DPBS。施用前和最后施用的第二天，從眼底收集血液以便用微細胞計數(shù)器(F800，Toa Lyo Denshi制造)測量血小板計數(shù)。在TPO處理組中，與施用前相比，施用完后，血小板計數(shù)平均增加了約1.42倍，比對照組高1.23倍，它們之間有顯著性差異(p＜0.05，Studeut t-檢驗)。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上，證實由哺乳動物細胞生產(chǎn)的前述人TPO具有體內(nèi)提高血小板計數(shù)的能力。
<實施例49>
確定粗TPO級分的生物活性，所述TPO級分得自通過用表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染COS1細胞而得到的33升培養(yǎng)物上清液，并由陽離子交換柱部分純化(1)用M-07e檢測系統(tǒng)進行體外檢測以評估下列純化樣品。用與實施例36中所述相同的方法，由表達載體pHTP1轉(zhuǎn)染COS1細胞而得到33升無血清培養(yǎng)物上清液，然后通過一0.22μm濾器過濾以回收上清液。用一超濾裝置(PLGC pellicon Cassette，正常分子量截斷為10,000，由Millipore制造)將其濃縮10倍，然后與1mM終濃度的蛋白酶抑制劑p-APMSF混合以得到2,018ml的樣品(蛋白質(zhì)濃度3.22mg/ml；總蛋白質(zhì)6,502mg，相對活性66,000；總活性，429，100,000)。接著再用超濾裝置(Omega Ultraset，正常分子量截斷為30,000，由Filtron制造)濃縮，得到分子量為30,000或30,000以上的級分(體積，1,190ml；蛋白質(zhì)濃度，2.54mg/ml；總蛋白質(zhì)3,020mg，相對活性82,500；總活性，249,000,000)和分子量為30,000或30,000以下的級分(體積2,947ml；蛋白質(zhì)濃度0.471mg/ml；總蛋白質(zhì)1,402mg；相對活性，4,500，總活性6,310,000)。在分子量為30,000或低于30,000級分中，存在TPO活性，說明培養(yǎng)物上清液可能含有在其從動物細胞中表達或分泌的過程中。已降低了其分子量的TPO。另一方面，用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.1)交換分子量30,000或高于30,000級分的緩沖液，并以5ml/分的流速加至預先經(jīng)20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.1)平衡的SP Sepharose Fast Flow(直徑2.6cm，床高29cm，由PharmaciaBiotech制造，商品號17-0729-01)柱。上樣完畢后，用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.1)對該柱進行洗滌和洗脫。接著，用20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.1)作為展開劑A和由展開劑A和1M NaCl組成的溶液作為展開劑B，以3ml/分的流速，用線性梯度0％B-50％B洗脫215分鐘，再由50％B-100％B洗脫20分鐘，用聚丙烯試管以每30ml(10分鐘)收集一次洗脫液。用M-07e檢測系統(tǒng)檢測各洗脫液以確定活性分布時，發(fā)現(xiàn)在很寬的范圍內(nèi)均能發(fā)現(xiàn)TPO活性。結(jié)果，收集用濃度為50mN或更低的NaCl洗脫的包括過柱級分的級分作為F1級分，用50-1,000mM NaCl洗脫的主要TP0級分為F2級分。F1級分的體積為1,951ml(蛋白質(zhì)濃度，2.05mg/ml；總蛋白質(zhì)，3,994mg，相對活性，13,500；總活性53,900,000)，F(xiàn)2為649.8ml(蛋白質(zhì)濃度1.11mg/ml；總蛋白質(zhì)721mg；相對活性268,000；總活性，193,000,000)。
(2)確定SP Sepharose Fast Flow級分F2的生物活性通過Sephadex G25柱(NAP-25，Pharmacia Biotech制造，商品號17-0852-01)，用含0.01％HSA的3.5ml DPBS緩沖交換上述步驟(1)中分離的2.5mlSP Sepharose Fast Flow級分F2，用體內(nèi)檢測確定該樣品(蛋白質(zhì)濃度，1.46mg/ml)的TPO生物活性。即，將活性級分皮下施用給ICR雄性小鼠(8周齡)，每組包括4只動物，每只動物每天100μl共5天(由M-07e檢測系統(tǒng)測量的總活性為123,000)。作為對照，將含0.01％HSA的100μl DPBS以相同的方法經(jīng)皮下施用。在施用前和施用后的第二天，從眼底收集血液以便用微細胞計數(shù)器(F800，由Toa Lyo Deushi制造)測量血小板計數(shù)。在施用TPO的組中，施用完畢后與施用前的值相比，血小板計數(shù)平均增加約1.29倍，而且比對照組高1.12倍，它們之間有顯著性差異(p＜0.05，Student t-檢驗)。這些結(jié)果說明，由哺乳動物生產(chǎn)的前述人TPO有提高血小板計數(shù)的能力。
<實施例50>
構(gòu)建用于在CHO細胞中表達人TPO染色體DNA的重組載體，pDEF202-ghTPO用限制酶KpnI和SpeI消化載體pDEF202，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以分離含小鼠DHFR小基因和SV40多腺苷酸化信號的片段，然后用T4 DNA連接酶(由Takara Shuzo制造)連接得到表達載體pDEF202-ghTPO，由此得到的片段含有通過用限制酶KpnI和SpeI處理從質(zhì)粒pEFHGTE中除去含SV40多腺苷酸化信號的區(qū)域而得到的載體DNA。該質(zhì)粒含有SV40復制原點、人伸長因子1-α啟動子，用于轉(zhuǎn)錄人TPO基因的SV40早期多腺苷酸化區(qū)域、小鼠DHFR小基因、pUC18復制原點和β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)，而且人TPO染色體DNA連在人伸長因子1-α啟動子的下游位點。
<實施例51>
在CHO細胞中表達人TPO染色體DNA用一直徑6cm的平板(Falcon制造)在含10％胎牛血清的α-基本必需培養(yǎng)基(α-MEM(-)，用胸苷和次黃嘌呤補充)在培養(yǎng)CHO細胞(-種dhfr-菌株；Uvlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，vol.77，p4216，1980)使其生長，然后用磷酸鈣方法(Cellphect，Pharmacia制造)轉(zhuǎn)染所得的細胞。
即，將實施例50中制備的10μg質(zhì)粒pDEF202-ghTPO與120μl緩沖液A和120μl H2O混合，然后于室溫將所得的混合物溫育10分鐘。再將該溶液與120μl緩沖液B混合，于室溫再溫育30分鐘。將所制備的DNA溶液放在平板中，在CO2保溫箱中培養(yǎng)6小時。除去培養(yǎng)基并用α-MEM(-)將所得平板洗滌2次后，將含10％二甲基亞砜的α-MEM(-)加到平板中，在室溫處理2分鐘。接著，加入含10％已透析胎牛血清的非選擇培養(yǎng)基(α-MEM(-)op.cit.，用次黃嘌呤和胸苷補充)，然后培養(yǎng)2天，用含10％已透析胎牛血清的選擇培養(yǎng)基(α-MEM(-)，無次黃嘌呤和胸苷)完成選擇。用胰蛋白酶處理細胞，并將在一個直徑6cm平板中處理的細胞分散到5個直徑1Ocm的平板或20個24孔平板中，將細胞繼續(xù)培養(yǎng)，同時每2天換一次選擇培養(yǎng)基，從而完成選擇。用Ba/F3檢測測量人TPO活性時，在觀察到細胞增殖的平板或孔中上清液中，有人TPO活性。
在此例中，也可以用pEFHGTE和pMG1共轉(zhuǎn)染CHO進行CHO細胞的轉(zhuǎn)染。
<實施例52>
構(gòu)建用于在E.coli中表達人TPO蛋白質(zhì)(1-163位氨基酸殘基)(下文稱為“hMKT(1-163)”)的載體并確定其表達，在所述TPO蛋白質(zhì)中，在-1和-2位分別加入Lys殘基和Met殘基為了表達其1-和3-位氨基酸殘基與人TPO蛋白質(zhì)(1-163位氨基酸殘基)同一位置的氨基酸殘基相同的蛋白質(zhì)，用下列合成的寡核苷酸1-13，2-13，3-3和4-3，按與實施例42中所述相同的方法，構(gòu)建用于在E.coli中表達hMKT(1-163)的載體pCFM536/hMKT(1-163)，也稱[Met-2，Lys-1]TPO(1-163)1-135′-CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAATAATGAAATCTCCTGCACCA-3′(SEQ ID NO125)；2-135′-CAGGTGGTGCAGGAGATTTCATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT-3′(SEQ ID NO126)；3-35′-CCTGCATGTGATTTACGGGTCCTGTCTAAACTGCTGCG-3′(SEQ ID NO127)；4-35′-CGCAGCAGTTTAGACAGGACCCGTAAATCACATG-3(SEQ ID NO128)；101-13 20 30 40CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCTTTTTTT GGTTCCTCCA TTATTTATTA CTTTAGAGGAXbaI 2-1350 60 3-3 70 80GCACCACCTG CATGTGATTT ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCGCGTGGTGGAC GTACACTAAA TGCCCAGGAC AGATTTGACG ACGC4-3(SEQ ID NO129)該表達質(zhì)粒含有序列表中所示的DNA序列(SEQ ID NO12)。此后，用與實施例43中所述相同的方法誘導hMKT(1-163)的表達。
使由此得到的表達蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再通過N-末端氨基酸序列分析，證實該蛋白質(zhì)含有所表達之hMKT(1-163)的氨基酸序列。
<實施例53>
用鹽酸胍和谷胱甘肽重折疊得自在E.coli中表達之人TPO的人TPO，h6T(1-163)，然后純化并確定其生物活性將實施例43中制備的1.2g生產(chǎn)h6T(1-163)之重組株的凍細胞懸于3ml水中，用高壓破碎機破碎。將懸浮液離心，回收沉淀部分，除去大部分污染的蛋白質(zhì)、細胞組分等。將由此回收的含h6T(1-163)的沉淀部分懸浮于終體積為4ml的水中。將1ml 1MTris緩沖液(pH8.5)邊攪拌邊加到懸浮液中，然后再加入20ml8M鹽酸胍，隨后在室溫攪拌5分鐘以溶解內(nèi)含物。用20mM Tris緩沖液(pH8.5)將所得溶液稀釋10倍，將5mM還原型谷胱甘肽和0.5mM氧化型谷胱甘肽邊攪拌邊溶于稀釋的溶液中，將所得溶液在4℃培養(yǎng)過夜。經(jīng)過離心，h6T(1-163)回收在上清液中。用YM10超濾膜(由Amicon制造)濃縮所得的160ml上清液，然后用DPBS換緩沖液以得到終體積為3.4ml的級分(蛋白質(zhì)濃度，2.18mg/ml)。將該級分對IMDM培養(yǎng)基徹底透析并用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)評估后，發(fā)現(xiàn)了強TPO活性(相對活性，58,000)。
將上述制備的TPO活性級分進行體內(nèi)檢測。即，將活性級分經(jīng)皮下施用于ICR雄性小鼠(7周齡)，每組4只動物，每只動物每天170μl連續(xù)5天(由大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)測量的總活性為22,000)。作為對照，用相同的方法，將170μl DPBS皮下施用于對照組的6只動物。在施用前和施用完的第二天和3天后，從眼底收集血液以便用微細胞計數(shù)器(F800，由Toa Lyo Denshi制造)測量血小板計數(shù)。在施用TPO的組中，與施用前的值相比，在施用完的第2天，血小板計數(shù)平均提高約2.15倍，甚至在施用完3天后，所值為2.13倍，仍保持不變。在施用完的第2天和3天后，TPO-處理組中的血小板計數(shù)比對照組高1.73和1.80倍，它們之間有顯著性差異(p＜0.001，Student t-檢驗)。這些結(jié)果表明，由E.coli生產(chǎn)并由上述方法制備的人TPO有體內(nèi)提高血小板計數(shù)的能力。
<實施例54>
用N-十二烷酰肌氨酸鈉和硫酸銅重折疊在E.coli中表達的人TPO，h6T(1-163)，然后純化并確定其生物活性將實施例43中制備的0.6g生產(chǎn)h6T(1-163)之重組株的凍細胞懸浮于3ml水中，用高壓破碎機破碎，然后離心回收沉淀部分。將沉淀部分懸浮于3.1m1水中后，將0.19ml 1M Tris緩沖液(pH9.2)，11.25μl 1M DTT，38μl 0.5M EDTA和0.38ml 10％脫氧膽酸鈉溶液邊攪拌邊加到懸浮液中，將所得的混合物在室溫下攪拌40分鐘。然后將其離心以回收沉淀部分并除去大部分的污染蛋白質(zhì)、細胞組分等。將所得的沉淀懸于4ml水中，離心回收含h6T(1-163)的沉淀部分。將所回收的沉淀懸于3.8ml水中，將0.2ml 1M Tris緩沖液(pH8)和1ml 10％N-十二烷酰肌氨酸鈉邊攪拌邊加到懸浮液中，然后在室溫下攪拌20分鐘以溶解內(nèi)含物。將所得溶液與5μl 1％硫酸銅混合，在室溫下攪拌過夜(約20小時)。將所得的溶液離心以回收含h6T(1-163)的上清液部分，5ml上清液與5ml水和10ml 20mM Tris緩沖液(pH7.7)混合，然后與2.6g 20-50目Dowex 1-X4氯化物形式離子交換樹脂混合，接著攪拌90分鐘。用玻璃濾器除去離子交換樹脂以回收樹脂未吸附的級分，隨后將該級分離心以回收上清液。將所得上清液用于預先經(jīng)20mM Tris緩沖液(pH7.7)平衡的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱，用相同的緩沖液由線性梯度0-500mM的NaCl洗脫。將SP SepharoseFast Flow陽離子交換柱層析洗脫的各級分對IMDM培養(yǎng)基徹底透析，并用大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)評估，在NaCl濃度為約100mM的洗脫級分發(fā)現(xiàn)了強TPO活性(相對活性，19,000,000)。用一超濾裝置(Ultra Free CL，正常分子截斷為5,000，由Millpore制造，商品號UFC4LCC25)將該級分濃縮1.6倍(2.5ml，蛋白質(zhì)濃度，25μg/ml)。在存在還原劑的條件下，用SDS-PAGE分析所濃縮的級分時，檢測到一相當于TPO的主要帶(純度，70-80％)。
用體內(nèi)檢測法檢測用上述方法制備的TPO活性級分。即，將活性部分皮下施用于ICR雄性小鼠(8周齡)，各組包括4只動物，每只動物每天100μl連續(xù)5天(由大鼠CFU-MK檢測系統(tǒng)測量的總活性為47,500)。作為對照，用相同的方法，將含100mM NaCl的100μl20mM Tris緩沖液(pH7.7)皮下施用。在施用前和施用完的第二天，從眼底收集血液以便用微細胞計數(shù)器(F800，由Toa Lyo Denshi制造)測量血小板計數(shù)。在施用TPO的組中，與施用前相比，施用完畢后，血小板計數(shù)平均增加了約1.73倍，而且比對照組高1.59倍，兩者之間有顯著性差異(p＜0.01，Student t-檢驗)。這些結(jié)果說明由E.coli生產(chǎn)的并由上述方法制備的人TPO有體內(nèi)提高血小板計數(shù)的能力。
<實施例55>
CHO細胞的大規(guī)模培養(yǎng)用下列方法大規(guī)模培養(yǎng)通過人TPO表達質(zhì)粒pDEF202-hTPO-P1轉(zhuǎn)染到實施例32中的CHO細胞中而得到的生產(chǎn)人TPO的CHO細胞系(CHO28-30細胞，25nM MTX抗性)。在含25nM MTX和FCS的DMEM/F-12培養(yǎng)基(GIBCO)中培養(yǎng)并增殖CHO細胞。用胰蛋白酶溶液分離細胞后，將1×107個細胞接種在含200ml相同培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)瓶(ex Falcon，F(xiàn)alcon 3000)中，然后以1rpm的轉(zhuǎn)速，于37℃培養(yǎng)3天。培養(yǎng)3天后，抽吸除去培養(yǎng)物上清液，然后用100ml PBS漂洗粘附的CHO細胞。將既不合25nM MTX也不含10％FCS的200mlDMEM/F-12培養(yǎng)基(GIBCO)加到瓶中，以1rpm的轉(zhuǎn)速于37℃將細胞培養(yǎng)7天。培養(yǎng)7天后，回收培養(yǎng)物上清液作為起始材料以用于隨后的純化過程。用500個旋轉(zhuǎn)瓶完成上述過程以得到100L的培養(yǎng)物上清液。
<實施例56>
從生產(chǎn)TPO的CHO細胞系中純化人TPO(1)將約100L實施例55中得到的無血清培養(yǎng)物上清液通過0.22μm的濾器過濾以得到其濾物，然后在超濾裝置(PLTK Pelliconcassette，正常分子量截斷為30,000，ex Millipore)上濃縮。用純水取代濃縮物的溶劑后，將蛋白酶抑制劑p-APMSF(Wako PureChemicals)和Pefabloc SC(Merck)以分別為1mM和0.35mM的終濃度加到所得的水溶液中以得到3628ml分子量30,000或大于30,000的級分(蛋白質(zhì)濃度1.60mg/ml；總蛋白質(zhì)5805mg；相對活性1,230,000；總活性7,149,000,000)。隨后按實施例45中所述，用Western印跡分析該級分。結(jié)果，所含TPO蛋白質(zhì)的分子量在66,000和100,000之間。在更詳細的檢測中，發(fā)現(xiàn)在過柱級分中含有分子量低于上述TPO的TPO種。
用一超濾裝置(PLGC Pellicon cassette，正常分子量截斷10,000，Millipone)單獨濃縮含有分子量不大于30,000之TPO的超濾物，以得到1901ml的低分子量TPO級分(蛋白質(zhì)濃度0.36mg/ml；總蛋白質(zhì)684mg；相對活性245,500；總活性167,900,000)。這表明在細胞培養(yǎng)期間產(chǎn)生了低分子量的TPO種。
接著，將764g硫酸銨和144.5ml 0.5M檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)加到3614ml含有分子量為30,000或大于30,000之TPO的級分以得到4089ml含1.41M(終濃度)硫酸鈉和17.7mM(終濃度)檸檬酸鈉緩沖液的溶液。離心從溶液中除去未溶解的物質(zhì)，得到澄清的溶液。
將澄清溶液以25ml/分的流速加至預先經(jīng)含1.2M硫酸銨的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)平衡的Macro-Prep Methyl HIC柱(Bio-Rad，商品號156-0080；直徑5cm，床高24.5cm)。上樣完畢后，用含1.2M硫酸鈉的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.5)進行洗脫。隨后在超濾裝置(ex Fitron.Omega Ultrasette，正常分子量截斷8,000)上濃縮洗脫的級分以得到過柱級分F1(4455ml；蛋白質(zhì)濃度0.400mg/ml；總蛋白質(zhì)1780mg；相對活性1,831,000)。
接著，用20mM檸檬酸鈉(pH6.0)作為洗脫緩沖液通過該柱以得到洗脫液，然后用相同的超濾裝置(即，Omega Ultrasette，正常分子量截斷8,000)濃縮以收集F2級分(1457ml；蛋白質(zhì)濃度0.969mg/ml；總蛋白質(zhì)1411mg；相對活性1,715,000)。在F2中，用SDS-PAGE證實存在分子量為66,000到100,000的蛋白質(zhì)。經(jīng)Western印跡分析，證明該蛋白質(zhì)是TPO。
然后，將從Macro-Prep Methyl HIC柱上洗脫的F2以15ml/分的流速加至預先經(jīng)20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)平衡的SPSepharose Fast Flow(Pharmaci a Bioteck，商品號17-0729-01；直徑5cm，床高12cm)。上樣完畢后，用含50mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)進行洗脫。收集洗脫液并命名為F1級分(3,007ml；蛋白質(zhì)濃度0.226mg/ml；總蛋白質(zhì)679mg；相對活性88,830)。此后，用含750mM NaCl的20mM檸檬酸鈉緩沖液(pH5.4)取代洗脫緩沖液以收集洗脫的F2級分(931ml蛋白質(zhì)濃度0.763mg/ml；總蛋白質(zhì)710mg；相對活性5,558,000)，然后用超濾裝置(Filtron，Omega(Ultrasette，正常分子量截斷8,000；和Amicon，YN3膜)濃縮到202ml。
接著，將濃縮的含有TPO活性的F2級分(197ml)以3ml/分的流速加至Sephacryl S-200HR凝膠濾柱(Pharmacia Biotech，商品號17-0584-05；直徑7.5cm，床高100cm)。分別收集洗脫體積第1,200-1785ml；1785-2010ml，2010-2280ml和2280-3,000ml以便得到級分F1(585ml；蛋白質(zhì)濃度1.00mg/ml；總蛋白質(zhì)589ml，相對活性4,118,000)，F(xiàn)2(225ml，蛋白質(zhì)濃度0.263mg/ml；總蛋白質(zhì)59.2mg；相對活性2,509,000)，F(xiàn)3(270ml；蛋白質(zhì)濃度0.119mg/ml，總蛋白質(zhì)32.1mg；相對活性2,535,000)和F4(720ml；蛋白質(zhì)濃度0.0467mg/ml；總蛋白質(zhì)33.6mg；相對活性1,155,000)。因此，按凝膠過濾確定的，分餾的TPO活性有很寬的分子量范圍。將分離的各級分經(jīng)SDS-PAGE和Western印跡分析后，發(fā)現(xiàn)F1主要含有分子量為66,000到1,000,000的TPO分子種類；F2的TPO分子種類的分子量為32,000到60,000，F(xiàn)3中TPO分子種類的分子量為32,000到42,000。而且所有TPO分子具有TPO活性。
基于對分子量為66,000到100,000的TPO分子進行N-末端氨基酸序列分析結(jié)果，證實TPO分子具有人TPO基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
另外，用由N-聚糖酶(ex Genzyme，商品號1472-00)，神經(jīng)氨糖酸苷酶(Nakarai-Tesqu，商品號242-29SP)，內(nèi)-α-N-乙酰半乳糖胺酶(Seikagaku Kogyo，商品號100453)和○-糖苷酶(Boehringer Mannheim Biochemica，商品號1347101)單獨或結(jié)合組成的糖苷酶，對分子量為66,000-100,000的TPO分子進行酶消化實驗，然后進行SDS-PAGF分析。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，正如從其理論分子量所預期的，TPO的多肽部分的分子量為約36,000，而且是帶N-和○-連接的糖鏈的糖蛋白。
<實施例57>
從生產(chǎn)人TP0的CHO細胞系純化人TPO(1)將211.4g硫酸銨加到1L用實施例55中的方法得到的CHO細胞的無血清培養(yǎng)物上清液中，然后，使混合物通過0.2μm濾器(ex Gelman Science，商品號12992)。將所得的濾液以15ml/分的流速用于預先經(jīng)含1.2M硫酸銨的20mM乙酸鈉緩沖液(pH5.6)平衡的Macro-Prep Methyl HIC柱(Bi0-Rad，商品號156-0081，直徑50mm，床高90mm)。上樣完畢后，用含1.2M硫酸銨的450ml20mM乙酸緩沖液(pH5.6)進行洗脫。將洗脫的級分以0.75ml/分的流速用于反相Vydac C4柱(The Separatiohs Group，商品號214BTP54，直徑4.6mm，床高250mm)。用含5％乙醇(稱為“展開劑A”)的10mM Tris緩沖液(pH6.4)將柱洗滌15分鐘，用展開劑A到含94％乙醇的10mM Tris緩沖液(pH6.4)(稱為“展開劑B”)的66-分鐘線性梯度完成洗脫。在圖15中列出了得到的層析譜。作為SDS-PAGE分析的結(jié)果，認為是TPO并且對應于加樣后滯留時間為68-72分鐘的級分的分子(分子量為65,000-100,000)在SDS-PAGE凝膠上是一個單帶(見圖16)。進一步的Western分析表明所得蛋白質(zhì)為TPO。
蛋白質(zhì)樣品的N-末端氨基酸分析表明，該蛋白質(zhì)具有人TPO基因編碼之蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
<實施例58>
制備用于在昆蟲細胞內(nèi)表達人TPO的重組病毒用限制酶EcoRI和NotI消化實施例30中制備的質(zhì)粒pHTP1，然后經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳以約1200bp的帶，隨后用Prep-A-GeneDNA純化盒純化。然后將純化的DNA與用相同限制酶預處理的轉(zhuǎn)移載體pVL1393(Invitrogen)相連，然后轉(zhuǎn)化到高感受態(tài)E.coli DH5(Toyo Boseki)中。從所得的集落中篩選含有人TPO cDNA之全長編碼區(qū)的克隆pVL1393/hTPO。按Molecular Cloning(Sambrook etal.，C0ld Spring Harbor Laboratory Press，1989)中描述的方法從該克隆制備質(zhì)粒DNA，然后用BaculoGoldTM轉(zhuǎn)染盒轉(zhuǎn)染到昆蟲細胞Sf21(Invitragen)中，將轉(zhuǎn)染的細胞在27℃于Sf-900培養(yǎng)基(Lifetechnology)中培養(yǎng)4天以回收含病毒的上清液。將上清液以1∶109～1∶105稀釋，在-35mm(直徑)莢(Shale)中，在27℃用1ml稀釋的上清液將約7×105Sf21細胞感染1小時。除去上清液后，將在Sf-900培養(yǎng)基中的1％熱瓊脂糖加到培養(yǎng)中，使其凝固，接著在濕潤的空氣中于27℃培養(yǎng)6天。檢出一個形成的噬菌斑，將病毒從噬菌斑中釋放到200μl Sf-900培養(yǎng)基中。用24-孔平板中得到的病毒克隆感染Sf21細胞以使病毒增殖。用酚/氯仿，然后乙醇沉淀處理從單個噬菌斑得到的含病毒液體以回收病毒DNA，然后用其作為模板，用人TPO cDNA的特異性引物完成PCR。在擴增特異性DNA片段的基礎(chǔ)上篩選含人TP0 cDNA的重組病毒。然后用含有攜帶人TPO cDNA之重組病毒的上清液感染Sf21細胞以增殖病毒。
<實施例59>
在Sf21昆蟲細胞中表達人TPO并鑒別TPO活性在175cm2培養(yǎng)燒瓶中培養(yǎng)Sf21細胞以達到約80％的融合，接著用實施例58中制備的攜帶人TPO cDNA的重組病毒于27℃感染1小時，其后將所得細胞在Sf-900培養(yǎng)基中于27℃培養(yǎng)4天以回收培養(yǎng)物上清液。在NApTM-5柱(Pharmacia)上用IMDM培養(yǎng)基取代所得的培養(yǎng)物上清液。在大鼠CFU-MK檢測和M-07e檢測中，在所得上清液中檢測出明顯的以劑量依賴形式的TPO活性。用實施例45中描述的Western分析也鑒別了Sf21細胞中表達的重組人TPO。
<實施例60>
通過用N-十二烷酰肌氨酸鈉和硫酸銅重折疊得自克隆pCFM536/h6T(1-163)的變異體人TPO，h6T(1-163)并純化h6T(1-163)，所述克隆攜帶在E.coli中表達的人TPO堿基序列。
將30g實施例43中制備的生產(chǎn)h6T(1-163)的凍重組微生物懸浮在300ml水中，用高壓破碎裝置(10,000psi，Rannie HighPressure Laboratory)破碎，然后離心以回收沉淀部分。將沉淀部分懸浮在90ml水中，然后邊攪拌邊再加水直到達到150ml的總量。隨后向混合物中邊攪拌邊加入9ml 1M Tris緩沖液(pH9.2)、540μl 1M DTT，1.8ml 0.5M EDTA和18ml 10％脫氧膽酸鈉，接著在室溫下攪拌30分鐘。離心回收沉淀部分，并除去大部分污染的蛋白質(zhì)和微生物組分。向沉淀中加入180ml 5M DTT以得到-懸浮液，然后離心回收含h6T(1-163)的沉淀部分。向所得的沉淀中加入300ml水以得到懸浮液，再向其中邊攪拌邊加入水以使液體總量為570ml。在室溫下將30ml 1M Tris緩沖液(pH8)，150ml 10％N-十二烷酰肌氨酸鈉加到混合物中，攪拌20分鐘以溶解h6T(1-163)。再向其中加750μl 1％硫酸銅，將混合物在室溫下攪拌過夜(約20小時)。離心回收含h6T(1-163)的上清液級分后，向750ml上清液中加入750ml水和1500ml 20mM Tris緩沖液(pH7.7)，接著邊攪拌邊加入3ml多乙氧基醚(Nikko Chemicals)。將600gDowex 1-X4(20-50目，氯化物形式)離子交換樹脂加到所得溶液中，在室溫下攪拌90分鐘。用玻璃濾器回收非吸附的級分后，用750ml 20mMTris緩沖液(pH7.7)洗滌離子交換樹脂。用2N氫氧化鈉將未吸附和洗滌級分結(jié)合的溶液調(diào)至pH9.2，然后用于預先經(jīng)含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris緩沖液(pH9.2)平衡的Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(ID5cm×10cm)以回收未吸附的級分。用鹽酸將所得未吸附級分的pH調(diào)至7.2，加至預先經(jīng)含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris緩沖液(pH7.2)平衡的SPSepharose Fast Flow柱(ID5cm×10cm)，再用相同緩沖液中線性梯度0M到500mM的NaCl洗脫。用SDS-PAGE分析洗脫的級分以收集TPO級分，向其中加入三氟乙酸達到0.1％的濃度。將所得的溶液加至Capcell Pak 5μm 300A C1柱(ID2.1cm×5cm×2，Shiseido)后，用0.1％三氟乙酸中濃度逐漸增加的1-丙醇線性梯度洗脫法完成反相HPLC。在無還原劑的情況下在SDS-PAGE上分析洗脫液。結(jié)果，根據(jù)在反相HPLC中的洗脫位置分餾出三個級分，用0.1％三氟乙酸將各級分稀釋3倍。以相同的方法，將各洗脫的級分加至上述的反相HPLC柱。在沒有還原劑的情況下，在SDS-PAGE上分析根據(jù)在反相HPLC上的洗脫順序而命名為Fr.S-a，F(xiàn)r.S-b和Fr.S-c的所得三個TPO級分(見圖17)。結(jié)果，在分子量為約18KDa(Fr.S-a)，約19KDa(Fr.S-b)或18KDa(Fr.S-c)檢測到一個單一的帶(見圖18)。經(jīng)氨基酸分析后，確定的各氨基酸組分幾乎與從序列資料估計的相應的理論值相一致。另外，N-末端氨基酸分析的結(jié)果表明，它們是所預期的序列。用氨基酸分析確定的各級分的蛋白質(zhì)數(shù)量為0.64mg(Fr.S-a)，1.81mg(Fr.S-b)或3.49mg(Fr.S-c)。對IMDM培養(yǎng)基將各級分完全透析后，進行M-07e檢測。結(jié)果，各級分的相對活性為約1,620,000(Fr.S-a)，23,500,000(Fr.S-b)或746,000,000(Fr.S-c)。
<實施例61>
用鹽酸胍和Cys-胱氨酸重折疊得自克隆pCFM536/h6T的人TPO，h6T(1-163)并純化h6T(1-163)，所述克隆攜帶在E.coli中表達的人TPO堿基序列將50g實施例43中制備的生產(chǎn)h6T(1-163)的凍重組微生物加到500ml水中并懸浮，用高壓破碎裝置(10,000psi，Rannie HighPressure Laboratory)破碎，然后離心回收沉淀部分。將所得的沉淀懸浮在水中，邊攪拌邊加入水使液體量達到250ml。其后，向其中加入15ml 1M Tris緩沖液(pH9.2)，900μl 1M DTT，3ml0.5M EDTA和30ml 10％脫氧膽酸鈉并在室溫下攪拌30分鐘。離心后，回收沉淀同時除去大部分污染的蛋白質(zhì)，微生物組分等。將300ml 5mM DTT加到沉淀中，使其懸浮，然后離心回收含h6T(1-163)的沉淀部分。將含h6T(1-163)的所回收沉淀部分懸浮在水中，達104ml的總體積。向懸浮液中加入20ml 1M Tris緩沖液(pH8.5)，然后邊攪拌邊加入376ml 8M鹽酸胍，隨后于室溫下攪拌10分鐘以溶解h6T(1-163)。向其中加入含0.1％多乙氧基醚的2500ml 20mM Tris緩沖液(pH8.5)，然后邊攪拌邊加入含1M鹽酸胍的2000ml 20ml Tris緩沖液(pH8.5)，再加5mM Cys和0.5mM胱氨酸(cystin)。將由此得到的溶液于4℃溫育過夜，離心回收上清液中的h6T(1-163)，然后用Prep Scale UF cartridgePLDC超濾膜(Millipore)濃縮。用含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris緩沖液(pH9.2)代替濃縮物的緩沖液直到終體積達1,000m1。將所得溶液加至預先經(jīng)含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris緩沖液(pH9.2)平衡的Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱(ID 5cm×10cm)，然后用在相同緩沖液中線性梯度0M至500mM NaCl洗脫?；厥赵诩s20mM至約150mM NaCl洗脫的級分(240ml)。用20mM Tris緩沖液(pH7.2)將所得的級分稀釋4倍以使總體積達960ml，然后用乙酸將pH調(diào)至7.2，再加至預先經(jīng)含0.1％多乙氧基醚的20mM Tris緩沖液(pH7.2)平衡的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換柱(ID5cm×10cm)，然后用相同緩沖液中線性梯度0M-500mM NaCl洗脫。在SDS-PAGE上分析洗脫液以收集TPO級分。將三氟乙酸加到TP0級分中直到其終濃度達0.1％。將所得的溶液用于Capcell Pak 5μm300A C1柱(ID2.1cm×5cm×2，Shiseido)，隨后用在0.1％三氟乙酸中濃度逐漸增加的1-丙醇，通過線性梯度洗脫法完成反相HPLC。在沒有還原劑的情況下，經(jīng)SDS-PAGE分析洗脫液，然后根據(jù)在反相HPLC中的洗脫位置分餾成2個級分。根據(jù)在反相HPLC中的洗脫順序(見圖17)，分別將兩個TPO級分稱為Fr.G-a和Fr.G-d。在沒有還原劑的情況下，在SDS-PAGE上分析各級分。結(jié)果，在分子量為約18KDa(Fr.G-a)或約32KDa(Fr.G-d)的位置檢測到一個單一帶(見圖18)。此外，在存在還原劑的條件下，上述級分的SDS-PAGE分析表明，在這兩個級分中，在分子量為約20KDa位置處均檢測到一個單帶。各級分氨基酸分析的結(jié)果表明其各氨基酸的組分幾乎與從序列資料估計的相應的理論值一致。另外，N-末端氨基酸分析的結(jié)果表明，它們是預期的序列。從氨基酸分析之結(jié)果確定的各級分的蛋白質(zhì)量為2.56mg(Fr.G-a)或1.16mg(Fr.G-d)。將各級分對IMDM完全透析后，進行M-07e檢測。結(jié)果，TPO級分的相對活性為約3,960,000(Fr.G-a)或約7,760,000(Fr.G-d)。
<實施例62>
構(gòu)建用于在CHO細胞中表達部分長度的人TPO(氨基酸1-163)(下文稱為“hTPO163”)的重組載體pDEF202-hTPO163用限制酶EcoRI和SpeI處理實施例31中構(gòu)建的載體pDEF202，然后用瓊脂糖凝膠電泳回收較大的載體片段。用T4DNA連接酶(Takara-Shuzo)將該片段與通過用限制酶EcoRI和SpeI處理含有編碼氨基酸-21到163(SEQ ID NO13)之hTPO163 cDNA的質(zhì)粒pEF18S-hTPO163而制備的hTPO163 cDNA相連以得到表達載體pDEF202-hTPO163。該質(zhì)粒含SV40的復制原點、人伸長因子1-α啟動子、SV40早期多腺苷酸化位點、鼠DHFR小基因、pUC18的復制原點和β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)，其中，hTPO163 cDNA連在人伸長因子1-α-啟動子的位點下游。
<實施例63>
在CHO細胞中表達hTPO163用6cm平皿(Falcon)，在含10％胎牛血清的α基本必需培養(yǎng)基(α-MEM(-)，含胸苷和次黃嘌呤)中，使CHO細胞系(dhfr-菌株，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，p4216，1980)生長，然后經(jīng)transfectum法(Seikagaku KogyoK.K.)，用pDEF202-hTPO163質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
簡而言之，將實施例62中制備的10μg質(zhì)粒pDEF202-hTPO163與240μl 0.3M NaCl混合，然后與20μl transfectum和220μlH2O的混合物混合。將DNA溶液逐滴加到平皿中，接下來在CO2保溫箱中培養(yǎng)6小時。從平皿中除去培養(yǎng)基，然后用α-MEM(-)洗滌兩次，接著加入含α-MEM(-)的10％DMSO，再在室溫溫育2分鐘。此后，向平皿中加入含10％透析的胎牛血清的非選擇培養(yǎng)基(含次黃嘌呤和胸苷的α-MEM(-))，接著再培養(yǎng)2天，然后在含10％透析的胎牛血清的選擇培養(yǎng)基(不含次黃嘌呤和胸苷的α-MEM(-))上篩選。通過將細胞用胰蛋白酶處理，將每個上述6cm的平皿中的細胞分至5個10cm的平皿或20個24孔平皿中，然后繼續(xù)培養(yǎng)同時每隔2天用新鮮的培養(yǎng)基換一次培養(yǎng)基，從而完成篩選。用Ba/F3檢測檢驗平皿或孔上清液的TPO活性，由此觀察到TPO活性。用含25nM氨甲蝶呤的選擇培養(yǎng)基將細胞分成1∶15的細胞濃度后，將在上清液中觀察到TPO活性的細胞轉(zhuǎn)移到平板或孔中，隨后再培養(yǎng)使其生長并克隆氨甲蝶呤抗性的細胞。
另外，通過將pEF18S-hTPO163和pMG1共轉(zhuǎn)染到CHO細胞中而完成CHO細胞的轉(zhuǎn)化。
用質(zhì)粒pDEF202-hTPO163轉(zhuǎn)染的CHO菌株(CHO-DUKXB11)已由本申請人于1995年1月31日保藏于日本國家生物科學和人類技術(shù)研究所，工業(yè)科學和技術(shù)司，國際貿(mào)易和工業(yè)部，保藏號FERMBP-4989。
<實施例64>
CHO細胞的大規(guī)模培養(yǎng)按如下步驟大規(guī)模培養(yǎng)通過將hTPO163-表達質(zhì)粒pDEF202-hTPO163轉(zhuǎn)染到實施例63中的CHO細胞中而得到的生產(chǎn)hTPO163的CHO細胞系(CHO109細胞，在含10％透析的胎牛血清的選擇培養(yǎng)[不含次黃嘌呤和胸苷的α-MEM-]中經(jīng)上述篩選而得到的)。在含10％FCS的DMEM/F-12培養(yǎng)基(GIBCO)中生長CHO109細胞。用胰蛋白酶溶液收集(或胰蛋白酶化)細胞后，將10×107個細胞接種到含200ml相同培養(yǎng)基的Falcon旋轉(zhuǎn)瓶(Falcon 3000)中，然后以1rpm的轉(zhuǎn)速于37℃培養(yǎng)3天。抽吸除去培養(yǎng)基，用100ml PBS漂洗細胞培養(yǎng)的表面。將不含10％FCS的200ml DMEM/F-12培養(yǎng)基(GIBCO)加到細胞培養(yǎng)中，然后以1rpm于37℃培養(yǎng)7天。用收集的培養(yǎng)物上清液作為起始物質(zhì)用于隨后的純化步驟。在300個旋轉(zhuǎn)瓶中完成相似的過程以得到60L無血清培養(yǎng)物上清液。
<實施例65>
從生產(chǎn)hTPO163的CHO細胞系中純化hTPO163(1)將實施例64中得到的60L無血清培養(yǎng)物上清液通過0.22μm的過濾器過濾以收集濾物，然后用超濾裝置(Filtron，分子量截斷10,000)濃縮，以得到濃縮的級分(600ml，11.2mg蛋白質(zhì)/ml，總蛋白質(zhì)6430mg)。用抗-HT1肽抗體經(jīng)Western分析該級分，顯示存在表觀分子量為20,000到26,000的表達的hTPO163蛋白質(zhì)。
在用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)預平衡的Sephadex G-25Fine柱(Pharmacia-Biotech，商品號17-0032-02；直徑10cm，床高30cm)上處理所得的濃縮培養(yǎng)物上清液(537ml)以得到在10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)中的蛋白質(zhì)級分F1(938ml，蛋白質(zhì)濃度4.9mg/ml，總蛋白質(zhì)4594mg)溶液。
將來自Sephadex G-25 Fine柱的該蛋白質(zhì)級分(929ml)以15ml/分的流速加至預先經(jīng)10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡的SPSepharose Fast Flow柱(Pharmacia-Biotech，商品號17-0729-01；直徑5cm，床高12cm)，然后用10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)洗脫，再用含10％乙醇的相同緩沖液洗脫。將洗脫合為F1級分(1608ml，蛋白質(zhì)濃度2.13mg/ml，總蛋白質(zhì)3426mg)。再用含750mM NaCl和25％乙醇的10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)進行第二次洗脫以得到F2級分的主要hTPO163洗脫液(651ml，蛋白質(zhì)濃度1.67mg/ml，總蛋白質(zhì)1087mg)。
向來自SP Sepharose Fast Flow柱的含TPO活性的F2級分(200ml)加入乙醇和純化水以制備300ml 45％(終濃度)的乙醇溶液。經(jīng)離心除去因加入乙醇而產(chǎn)生的不溶物質(zhì)。將上清液以2ml/分的流速注入經(jīng)50％溶劑A(10mM乙酸鈉緩沖液，pH6.7)加50％溶液B(10mM含90％乙醇的乙酸鈉緩沖液，pH6.7)預平衡的SOURCE15RPC柱(Pharmacia-Biotech，商品號17-0727-02；直徑2cm，床高20cm)。然后用55％溶劑A加45％溶劑B洗滌該柱直到幾乎完全洗脫下未吸附的物質(zhì)，然后以下列洗脫方法以1.5ml/分的流速洗脫55％B5分鐘；線性梯度50％B到100％B140分鐘以上；100％B35分鐘。每隔5分鐘(相當于7.5ml體積)收集各級分。使所有的級分經(jīng)SDS-PAGE，然后Western分析以檢測hTPO163的洗脫范圍。結(jié)果，在66％到87％乙醇的范圍內(nèi)的洗脫液中發(fā)現(xiàn)了表觀分子量為約20,000到26,000的高度純化的hTPO163。在這些hTPO163蛋白質(zhì)中，從反相柱上較早洗脫下的是較高分子量的hTPO163，說明，糖基化的hTPO163分子其親水性提高。
將CHAPS加到88.8ml來自SOURCE 15RPC柱的hTPO163洗脫級分(即，在68％到86.5％乙醇范圍內(nèi)洗脫的hTPO163級分(90ml))，然而將混合物濃縮并洗滌以得到含約5％乙醇和4mM CHAPS的2.5ml濃縮物。隨后，將該濃縮物以1.5ml/分的流速加至經(jīng)10mM磷酸鈉緩沖液(pH6.8)平衡的Superdex 75pg柱(Pharmacia-Biotech，商品號17-1070-01)，直徑2.6cm，床高60cm)。從上樣后60分鐘時開始，以每次6ml的量(即每4分鐘)收集洗脫級分。結(jié)果，按SDS-PAGE確定的，在試管號16到至少31的級分中，洗脫了hTPO163。該洗脫位置對應于按使用標準分子量標記物(Bio-Rad的混合物，Gel Filtration Standard，商品號151-1901，andCalbiochem，insul in，商品號407696)的凝膠過濾確定的約44,000到約6,000的分子量范圍。另外，這些hTPO163分子似乎是以糖基化程度逐漸降低的順序而被洗脫的。收集試管號16到31(洗脫體積180到276ml)的所有hTPO163種類作為AF級分。除FA部分外，分別收集試管號16到18(洗脫體積180到198ml)，19到24(洗脫體積198到234ml)和25到31(洗脫體積234到276ml)的級分，然后分別命名為級分FH，F(xiàn)M和FL。將部分的級分FH、FM和FL結(jié)合也可制備FA級分。圖19對上述內(nèi)容作了描述。
(2)接著，將更詳細地說明來自前述(1)中Superdex 75pg的hTP01 63洗脫級分FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA。通過與實施例1中相同的方法確定上述各hTPO163種類的N-末端氨基酸序列，但大部分N-末端的Ser殘基都不能鑒定出。這說明將○-連接的糖加到了N-末端Ser上。此外，證實N-末端Ser后的序列是從hTPO的基因序列推測的氨基酸序列。經(jīng)氨基酸分析(AccQ.Tag方法，Wasters)確定，在FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA中的hTPO163蛋白質(zhì)的濃度分別為10.2ng/ml，6.2ng/ml，0.84ng/ml和3.2ng/ml，說明該濃度是不含任何糖鏈的肽部分。在非還原條件下，用多凝膠15/25(Dai-ichi Kagaku.Yakuhin，15-25％預制聚丙烯酰胺凝膠)或還原條件下，用DTT使這些級分(各100ng)經(jīng)SDS-PAGE，然后銀-染色(Daiichi PureChemicals)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這些級分的每一級分均含有高純度的hTPO163。在還原條件下，用DPCIII分子量標記(Daiichi Dure.Chemicals)作為標準計算，在FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA中hTPO163的表觀分子量分別為24,000-21,500,23,000-21,000,23,000-20,500和23,500到20,500(見圖20)。另外，在還原條件下Western分析上，用生物素標記的SDS-APGE標準物(Bio-Rad，BiotynylatedSDS-PAGE Standards，Board Range商品號161-0319)計算的FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA中hTPO的表觀分子量分別為26,000到22,000,25,500到22,000,26,000到21,000和26,000到21,000。FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA分子量的不一致性可能是○-連接的糖鏈的不一致性造成的。因此，用神經(jīng)氨糖酸苷酶(Neurami ni dase，Nacalai tesque，商品號242-29SP)消化，用DTT還原，然后在SDS-PAGE上分析各級分FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA。結(jié)果，在所有級分中，表觀分子量為約19,000，說明hTPO分子量的不一致性主要是由于與hTPO163蛋白質(zhì)偶聯(lián)的糖鏈中的唾液酸量的不一致性而造成的，而且在CHO細胞中，得到的hTPO163作為糖蛋白而得到表達。
(3)用M-07e檢測系統(tǒng)檢測(2)中得到的FH，F(xiàn)M，F(xiàn)L和FA級分的體外活性。結(jié)果，相對特異活性為511,000,000，775,000,000，1,150,000,000和715,000,000/mg hTP0163蛋白質(zhì)(不含任何糖重量的肽部分的重量)。
<實施例66>
構(gòu)建用于表達分別在-1位加入Lys并在-2位加入Met之人TPO(氨基酸1-332)(下文稱為“hMKT(1-332)”)的E.coli載體并表達hMKT(1-332)為了在E.coli中表達人TPO的全長氨基酸序列，將氨基酸164到氨基酸332的所用密碼子換成下列所述的E.coli優(yōu)選密碼子。
表5215′-CTCCCGAACCGTACCAGCGGCCTGCTGGAAACCAACTTTACCGCGAG-3′(SEQ ID NO130)225′-GGTAAAGTTGGTTTCCAGCAGGCCGCTGGTACGGTTCGGGAGCTCGT-3′(SEQ ID NO131)235′-CGCGCGTACCACCGGCAGCGGCCTGCTGAAATGGCAGCAGGGCTTTCGT-3′(SEQ ID NO132)245′-AGCCCTGCTGCCATTTCAGCAGGCCGCTGCCGGTGGTACGCGCGCTCGC-3′(SEQ ID NO133)255′-GCGAAAATCCCGGGCCTGCTGAACCAGACCAGCCGTAGCCTGGATCAGAT-3′(SEQ ID NO134)265′-ATCCAGGCTACGGCTGGTCTGGTTCAGCAGGCCCGGGATTTTCGCACGAA-3′(SEQ ID NO135)275′-CCCGGGCTATCTGAACCGTATCCATGAACTGCTGAACGGCACCCGTG-3′(SEQ ID NO136)285′-GTGCCGTTCAGCAGTTCATGGATACGGTTCAGATAGCCCGGGATCTG-3′(SEQ ID NO137)295′-GCCTGTTTCCGGGCCCGAGCCGTCGCACCCTGGGCGCGCCGGATATCAG-3′(SEQ ID NO138)305′-ATCCGGCGCGCCCAGGGTGCGACGGCTCGGGCCCGGAAACAGGCCACGG-3′(SEQ ID NO139)315′-ATCAGCTCTGGCACCAGCGATACCGGCAGCCTGCCGCCGAACCTGCAGCC-3′(SEQ ID NO140)325′-CAGGTTCGGCGGCAGGCTGCCGGTATCGCTGGTGCCAGAGCTGATATCCG-3′(SEQ ID NO141)335′-GGGCTATAGCCCGAGCCCGACCCATCCGCCGACCGGCCAGTATACCCTGTT-3′(SEQ ID NO142)345′-GGTATACTGGCCGGTCGGCGGATGGGTCGGGCTCGGGCTATAGCCCGGCTG-3′(SEQ ID NO143)355′-TCCGCTGCCGCCGACCCTGCCGACCCCGGTGGTTCAGCTGCATCCGCTGC-3′(SEQ ID NO144)365′-GGATGCAGCTGAACCACCGGGGTCGGCAGGGTCGGCGGCAGCGGAAACAG-3′(SEQ ID NO145)375′-TGCCGGATCCGAGCGCGCCGACCCCGACCCCGACCAGCCCGCTGCTGAACA-3′(SEQ ID NO146)385′-AGCAGCGGGCTGGTCGGGGTCGGGGTCGGCGCGCTCGGATCCGGCAGCAGC-3′(SEQ ID NO147)395′-CCAGCTATACCCATAGCCAGAACCTGAGCCAGGAAGGCTAATGAAGCTTGA-3′(SEQ ID NO148)405′-CTTCATTAGCCTTCCTGGCTCAGGTTCTGGCTATGGGTATAGCTGGTGTIC-3′(SEQ ID NO149)415′-ACGAGCTCCCGAACCGTACCA-3′(SEQ ID NO150)425′-CTGATATCCGGCGCGCCCAGG-3′(SEQ ID NO151)435′-CGGATATCAGCTCTGGCACCA-3′(SEQ ID NO152)445′-TCAAGCTTCATTAGCCTTCCT-3′(SEQ ID NO153)在含0.1mM ATP、10mM Tris-乙酸鹽、10mM酸鎂、50mM酸鉀溶液中，用同一試管中的T4連接酶(Pharmacia)將合成的寡核苷酸21和22，23和24；25和26；27和28；29和30；31和32；33和34；35和36；37和38；或39和40磷酸化。然后將1/10體積的含100mM Tris/HCl(pH7.5)、100mM MgCl2、500mM NaCl溶液加到反應混合物中，在水浴中煮3分鐘，然后使其冷卻以形成雙鏈DNA。將四組雙鏈DNA即寡核苷酸21和22/23和24(組合-A)；寡核苷酸25和26/27和28(組合-B)；和寡核苷酸31和32/33和34(組合-C)；及寡核苷酸35和36/37和38/39和40(組合-D)分別用DNA連接盒(Takara-Shuzo)連接，其后，將組合-A與組合-B相連，相似地，將組合-C與組合-D相連以分別得到連接物-1和連接物-2。用連接物-1和-2作為模板，寡核苷酸-41和-42用作引物用于連接物-1，以及寡核苷酸-43和-44用作引物用于連接物-2，進行PCR。分別用SacI和EcoRV以及EcoRV和HindIII消化連接物-1和-2的PCR產(chǎn)物，然后在2％瓊脂糖凝膠上電泳并用Prep-A-Gene DNA純化盒純化以便分別回收約240bp和250bp的片段。將所得的兩個片段亞克隆到經(jīng)SacI和HindIII預消化的pBluescript II KS+(Stratagene)中(用E.coli DH5作為宿主)。在所得的克隆中，通過測序篩選出具有表6所示之堿基序列的克隆并命名為pBL(SH)(174-332)(見SEQ ID NO154)。
表6CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGCLeu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser174 180GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GCC TTT CGTAla Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg190 200GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAGAla Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln210 220ATC CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGTIle Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg230GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATCGly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile240 250AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCGSer Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro260GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTGGly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu270 280TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCGPhe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro290 300CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTGLeu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu310CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAALeu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly320 330 332TGA AGC TTG A接著，以下列合成的寡核苷酸45和46作為引物，實施例42中制備的pBL(XH)h6T(1-163)為模板完成PCR，用BamHI和SacI消化PCR產(chǎn)物，接著在6％聚丙烯酰胺凝膠上電泳以便從凝膠上回收約160bp的片段。455′-AAGGATCCGAACGCTATCTTCCTG-3′(SEQ ID NO155)465′-GGGAGCTCGTTCAGGGTCAGAACCAAGAGAGGTACGAGACGGAACAGCAGTGGTTGG-3′(SEQ ID NO156)用SacI和HindIII消化pBL(SH)(174-222)，然后用Prep-A-GeneDNA純化盒純化消化產(chǎn)物以得到約480bp的片段。將上述制備的兩個片段亞克隆到經(jīng)BamHI和HindIII預消化的pBluescript II KS+(Stratahene)中(E.coli DH5作為宿主。)中。
在所得的克隆中，通過測序篩選出具有表7所示之堿基序列的克隆并命名為pBL(BH)(123-332)(見SEQ ID N0157)。
表7G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGCAsp Pro Ash Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly123 130AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGTLys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg140 150CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTGArg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu160ACC CTG AAC GAG CTCThr Leu Asn Glu Leu170 174用BamHI和HindIII消化實施例42中制備的pBL(XH)h6T(1-163)，相以地消化上述制備的pBL(BH)(123-332)以得到約640bp的片段，其后將兩個片段連在一起以得到克隆pBL(XH)h6T(1-334)。此外，用XbaI和SfiI消化實施例52中制備的pCFM536/hMKT(1-163)以得到一約270bp的片段，隨后，將該片段與經(jīng)相同限制酶消化的pBL(XH)h6T(1-334)相連以得到克隆pBL(XH)hMKT(1-334)。用XbaI和HindIII消化pBL(XH)hMKT(1-334)后，得到一編碼突變型人TPO氨基酸1-332的約1040bp片段，然后純化，并克隆到經(jīng)XbaI和HindIII預消化的pCFM536(EP-A-136490)中(用由pMW(ATCC No.39933)預先轉(zhuǎn)化的E.coli JM109作為宿主。)。將所得的克隆命名為pCFM536/hMKT(1-332)，用攜帶該表達載體的E.coli菌株作為轉(zhuǎn)化體用于表達突變型蛋白質(zhì)hMKT(1-332)蛋白質(zhì)。表達質(zhì)粒pCFM536/hMKT(1-332)含有SEQ ID NOl4所示的DNA序列。
在60ml含50μg/ml氨芐青霉素和12.5μg/ml四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，將上述轉(zhuǎn)化體于30℃過夜培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)物(25ml)加到含50μg/ml氨芐青霉素的1000ml LB培養(yǎng)基中，于36℃振蕩培養(yǎng)直到OD600達到1.0到1.2。將65℃的約330ml LB培養(yǎng)基加到培養(yǎng)物中以便使培養(yǎng)物的終溫度達到42℃，于42℃再繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3小時以誘導表達變異體人TPO；hMKT(1-332)(也稱為[Met-2，Lys-1]TPO(1-332)。
將所得的培養(yǎng)物直接進行SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE分析中，應用Multigel15/25(Dai-ichi Chemical Co.)。電泳以及考馬斯蘭染色后，根據(jù)誘導hMKT(1-332)蛋白質(zhì)表達的轉(zhuǎn)化體，在凝膠上分子量為約35KD處，檢測到具有誘導表達特異性的蛋白質(zhì)。另外，SDS-PAGE和電印跡(用硝酸纖維素膜)后，將上述表達的蛋白質(zhì)與實施例45中制備的抗-HT1肽抗體反應。染色后，在分子量為約35KD處，檢測到一個帶，說明表達了hMKT(1-332)。
<實施例67>
制得人TPO取代衍生物，其在COS7細胞中的表達并鑒別其活性根據(jù)下列方法，研究用其他氨基酸部分取代人TPO氨基酸的幾個衍生物是否有TPO活性。
按如下構(gòu)建本實施例所用的，用于在動物細胞中表達的載體pSMT201。
首先，用限制酶KpnI和EcoRI處理含有鼠促紅細胞生成素受體之cDNA(得自Dana Farbor Cancer Institute的D′Andrea博士Cell57，277-285(1989))的表達質(zhì)粒pXM-mEPORn，然后在瓊脂糖凝膠上電泳以回收除去了鼠促紅細胞生成素受體之cDNA的pXM載體片段。接著，用DNA合成儀(ABI)合成用于將不同的克隆限制位點導入上述表達載體的兩個寡核苷酸。合成的寡核苷酸有下列基本序列引物-15′-CCTCGAGGAATTCCTGCAGCCCGGGACTAGTATCGGCTACCCCTACGACGTCCCCGACTACGCCGGCGTCCATCACCATCACCATCACTGAGCGGCCGCC-3′(SEQ ID NO158)引物-25′-AATTGGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGAGCGCCGGCGTAGTCGGGGACGTCGTAGGGGTAGCCGATACTAGTCCCGGGCTGCAGGAATTCCTCGAGGGTAC-3(SEQ ID NO159)將兩個寡核苷酸混合并退火以形成雙鏈寡核苷酸，然后存在T4DNA連接酶(Takara-Shuzo)的情況下，與上述回收的pXM載體相連以得到表達載體pDMT201。為了從pDMT201中除去pDMT201中所含的鼠DHFR cDNA，分別用NotI和HpaI消化載體pDMT201和pEF18S，然后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以便從pDMT201載體DNA中回收一個較大片段并從pEF18S載體DNA中回收一個較小的片段。然后用T4DNA連接酶(Takara-Shuzo)將這些片段連在一起以得到表達載體pSMT201。如圖21所示，pSMT201含有SV40的復制原點、增強子序列、腺病毒主要晚期啟動子序列、腺病毒三分前導序列、拼接信號序列、SV40早期多腺苷酸化位點序列、腺病毒VA RNA基因序列、pUC18的復制原點和β-內(nèi)酰胺酶基因(Ampr)，以及用于連接所需基因的下列限制位點BgIII，PstI，KpnI，XhoI，EcoRI，SmaI，SpeI和NotI位點。用EcoRI和SpeI消化實施例30中說明的攜帶全長人TPO cDNA的pHTP以得到全長的人TPO cDNA片段，隨后亞克隆到經(jīng)相似預消化的載體pSMT201中以得到質(zhì)粒pSMT201-hTPO。
用由此得到的質(zhì)粒pSMT201-hTPO作為模板，首先按如下方法構(gòu)建質(zhì)粒βGL-TPO/pBlue，用該質(zhì)粒作為用于制備所需衍生物的模板。
在βGL-TPO/pBlue中，用Annweiler′s的方法(Annweileret al.，Nucleic Acids Research，193750，1991)將兔β-球蛋白前導序列加到人TPO的5′-非轉(zhuǎn)譯位點。為了達到該目的，將化學合成的下列雙DNA鏈5′-AATTCCAAGATCTCACACTTGCTTTTGACACAACTGTGTTTACTTGCAATCCCCCAAAACAGACAGACCC-3′(sEQ ID NO160)；和5′-3GGGTCTGTCTGTTTTGGGGGATTGCAAGTAAACACAGTTGTGTCAAAAGCAAGTGTGAGATCTTGG-3′(SEQID NO161)，與經(jīng)EcoRI和SmaI消化載體Bluescript II SK+(Toyo-boseki)而得到的片段相連以得到插入了前導序列的載體βGL/pBLue。
用下列引物序列完成PCRSma-ATG5′-GGCCCGGGATGGAGCTGACTGAATTGCTC-3′(SEQ ID NO162)(即與SmaI序列相連的SEQ ID NO7的102-122序列)；和末端5′-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3′(SEQ ID NO163)(即與SpeI和HindIII序列相連的SEQ ID NO7之1140-1160序列的反義序列)。
用1ng質(zhì)粒pSMT201-hTPO DNA為模板和10μM合成引物完成PCR。用TakaRa PCR擴增盒(Takara-Shuzo)和ProgrammableThermal Controller(MJResearch)，在下列條件下，100μl體積中完成PCR94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃2分/循環(huán)共3個循環(huán)；然后94℃45秒，55℃1分，72℃1分/循環(huán)共20個循環(huán)。用氯仿提取PCR產(chǎn)物，然后乙醇-沉淀兩次，然后懸于100μl TE緩沖液中。
隨后，用SmaI和HindIII限制消化PCR產(chǎn)物，用酚/氯仿提取，并經(jīng)乙醇沉淀。將所得沉淀溶于10μl TE緩沖液中，然后亞克隆到由相同限制酶預消化的載體βGL/pBlue中(用高感受態(tài)的E.coliJM109(Toyo-boseki)為宿主)。在所得的轉(zhuǎn)化體細胞中，篩選出20個克隆，基本按Sambrook等人(Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))中的描述從這些克隆中制備質(zhì)粒DNA。用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cyele Sequencing盒(Applied Biosystems，Inc)和373A DNA測序儀(AppliedBiosystems，Inc.)通過測序鑒定純化的質(zhì)粒DNA。結(jié)果，證實編碼βGL-TPO/pBlue的質(zhì)粒含有預期的TPO cDNA序列而在其全長上沒有任何取代。用BgIII和SpeI消化βGL-TPO/pBlue后，用酚/氯仿提取消化產(chǎn)物然后乙醇-沉淀。將所得沉淀溶于10μl TE緩沖液中，然后亞克隆到經(jīng)相同酶消化的載體pSMT201中(用高感受態(tài)的E.coliJM109(Toyo-boseki)作為宿主。)。按Molecular Cloning(Sambrook et a1.，上文)中描述的方法，從轉(zhuǎn)化體細胞中制備質(zhì)粒DNA。如圖21所示，所得表達載體pSMT/βGL-TPO的結(jié)構(gòu)為在pSMT201載體之拼接信號序列下游的BgIII/SpeI限制位點，β-球蛋白前導序列和人TPO cDNA相連。將該pSMT/βGL-TPO載體轉(zhuǎn)染到COS細胞中。
為了制備人TPO取代衍生物，在PCR中使用了Ito方法(Ito etal.，Gene，10267-70，1991)。具體地說，說明性地制備兩種人TPO衍生物，其中，人TPO的Arg-25和His-33分別由Asn和Thr取代。相應地，這些衍生物可稱為[Asn25]TPO和[Thr33]TPO。在PCR中，使用下列引物T75′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′(SEQ ID NO164)(對應于Bluescript II SK+的T7啟動子區(qū))；ΔBgIII5′-AATTCCAAGATCACACACTTGC-3′(SEQ ID NO165)(用于取代BgIII識別序列)；末端5′-TCAAGCTTACTAGTCCCTTCCTGAGACAGATTCTG-3′(SEQ ID NO166)(與SpeI和HindIII相連的SEQ ID NO7之1140-1160的反義)；N35′-TGGGCACTGGCTCAGGTTGCTGTGAAGGACATGGG-3′(SEQ ID NO167)(SEQ ID NO7的Arg25→Asn)；和O95′-TGTAGGCAAAGGGGTAACCTCTGGGCA-3′(SEQ ID NO168)(SEQ ID NO7的His-33→Thr)。用lng質(zhì)粒βGL-TPO/pBlue DNA為模板和各10μg合成引物完成第一步PCR。引物的組合是[1]ΔBgIII和“末端”引物；[2]T7和N3；和[3]T7和O9。用TakaRa PCR擴增盒(Takara-Shuzo)和Programmable Thrmal Controller(MJ Research)，在下列條件下，100μl體積中完成PCR94℃1分鐘，55℃2分，72℃2分/循環(huán)共3個循環(huán)；然后94℃45秒，55℃1分，72℃1分/循環(huán)共17個循環(huán)。用氯仿提取PCR產(chǎn)物并用乙醇沉淀兩次，然后將沉淀溶于100μl TE緩沖液中。隨后，使所得的PCR產(chǎn)物(各1μl)經(jīng)第二次PCR。模板的組合為PCR產(chǎn)物[1]/[2]和PCR產(chǎn)物[1]/[3]。對于引物，在兩種情況下用T7和末端組合。在95℃溫育10分鐘后，加入TakaRa Taq，在下列條件下完成PCR94℃1分，55℃2分和72℃2分/循環(huán)共3個循環(huán)，然后94℃45秒，55℃1分和72℃1分/循環(huán)共9個循環(huán)。向所得的各PCR產(chǎn)物中加入1μl蛋白酶K(5mg/ml)，2μl 0.5MEDTA和2μl 20％SDS，于37℃溫育30分鐘，以使Taq失活，用酚/氯仿提取，并乙醇-沉淀。此后，用BgIII和SpeI消化溶于20μl無菌水中的沉淀，然后經(jīng)酚/氯仿提取和乙醇-沉淀。將所得沉淀溶于10μl TE緩沖液中，隨后亞克隆到經(jīng)相同限制酶預消化和牛小腸堿性磷酸酶(Boehringer-Mannheim)處理的表達載體pSMT201中(用高感受態(tài)的E.coli JM109為宿主。)。在所得的轉(zhuǎn)化細胞中，每種情況篩選出兩個克隆，基本按Molecular Cloning(Sambrook et al.，上文)中所述的方法，從克隆中制備質(zhì)粒DNA。用373A DNA測序儀和Taq Dye DeoxyTMTerminater CycleSequencing盒(均來自Applied Biosystems，Inc.)測定純化質(zhì)粒DNA的序列。
利用引物[1]和[3]由PCR制備的質(zhì)粒含有編碼TPO取代衍生物(O9/TPO)的cDNA。證實Thr(ACC)氨基酸取代了His33(CAC)，而且通過加入氨基酸序列TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH(SEQ IDNO169)而延伸了原C-末端(Gly332)。將該衍生物稱為[Thr33，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO.
另一方面，利用引物[1]和[2]由PCR制備的質(zhì)粒含有編碼TPO取代衍生物(N3/TPO)的cDNA。證實由Asn(AAC)氨基酸取代了Arg25(AGA)，并由Lys(AAA)取代了Glu231(GAA)并通過加入氨基酸序列TSIGYPYDVPDYAGVHHHHHH而延伸了原C-末端(Gly332)。將該衍生物稱為[Asn25，Lys231，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO.
按實施例35中描述的包括氯喹處理的DEAE-葡聚糖法，將所得的各克隆轉(zhuǎn)染到COS7細胞中。簡而言之，在轉(zhuǎn)染中，用40μg各質(zhì)粒DNA，5天后，回收培養(yǎng)物上清液，隨后用Centricon-30(Amicon)濃縮到1/20體積以便由M-O7e檢測評估其TPO活性。結(jié)果，在分別轉(zhuǎn)染了含有編碼人TPO取代衍生物N3/TPO和O9/TPO之cDNA的質(zhì)粒的COS7細胞培養(yǎng)物上清液中，檢測出TPO活性為劑量依賴方式(見圖22)。
<實施例68>
制備人TPO的插入或缺失衍生物，其在COS7細胞中的表達并鑒定TPO活性本實施例要證實hTPO163的插入或缺失衍生物是否有TPO活性。
制備的衍生物為His33-缺失衍生物([ΔHis33]TPO(1-163)，dH33)Gly116-缺失衍生物([ΔGly116]TPO(1-163)，dG116)；Arg117-缺失衍生物([ΔArg117]TPO(1-163)，dR116)；Thr-插入衍生物([His33，Thr33′，Pro34]TPO(1-163)，T33′)Ala-插入衍生物([His33，Ala33′，Pro34]TPO(1-163)，A33′)和Gly-插入衍生物([His33，Gly33′，Pro34，Ser38]TPO(1-163)，G33′)，其中分別將Thr，Ala和Gly插入His33和Pro34之間；及Asn-插入衍生物([Gly116，Asn116′，Arg117]TPO(1-163)，N116′)，Ala-插入衍生物([Gly116，Ala116，ArgA117]TPO(1-163)，A116′)和Gly-插入衍生物(Gly116，Gly116，Arg117]TPO(1-163)，G116′)，其中分別將Asn，Ala和Gly插入Gly116和Arg117之間，所有序列均以SEQ ID NO13為基礎(chǔ)。
在這些衍生物中，T33′和N 116′分別導入粘蛋白型和Asn-結(jié)合型糖鏈。
用Ito等人(Gene，10267-70，1991)描述的方法用PCR制備上述衍生物。PCR中所用的引物序列如下dH335′-TGTAGGCAAAGGAACCTCTGGGCA-3′(SEQ ID NO172)(用于制備以SEQ ID NO7所示之序列為基礎(chǔ)的His33-缺失衍生物)；T33′5′-TGTAGGCAAAGGAGTGTGAACCTCTGG-3′(SEQ IDNO173)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列的His33和Pro34之間含有插入的Thr的Thr-插入衍生物)；A33′5′-TGTAGGCAAAGGAGCGTGAACCTCTGG-3′(SEQ IDNO174)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列的His33和Pro34之間含有插入的Ala的Ala-插入衍生物)；G33′5′-TGTAGGCAAAGGTCCGTGAACCTCTGG-3′(S EQ IDNO175)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列的His33和Pro34之間含有插入的Gly的Gly-插入衍生物)；dG1165′-AGCTGTGGTCCTCTGTGGAGGAAG-3′(SEQ ID NO176)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列基礎(chǔ)上的Gly116-缺失衍生物)；dR1175′-GTGAGCTGTGGTGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ ID NO177)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列基礎(chǔ)上的Arg117-缺失衍生物)；N116′5′-AGCTGTGGTCCTGTTGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ IDNO178)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列中的Gly116和Arg117之間含有插入的Asn的Asn-插入衍生物)；A116′5′-AGCTGTGGTCCTAGCGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ IDNO179)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列中的Gly116和Arg117之間含有插入的Ala的Ala-插入衍生物)；G116′5′-AGCTGTGGTCCTTCCGCCCTGTGGAGG-3′(SEQ IDNO180)(用于制備在SEQ ID NO7所示之序列中的Gly116和Arg117之間含有插入的Gly的Gly-插入衍生物)dRI5′-CGGGCTGCAGGATATCCAAGATCTCA-3′(SEQ ID NO181)(用于取代限制酶EcoRI-識別序列)；T75′-TAATACGACTCACTATAGGGCG-3′(SEQ ID NO182)(對應于Bluescript II SK+的T7啟動子區(qū))；和末端Notl 5′-GGGCGGCCGCTCAGCTGGGGACAGCTGTGGTGGG-3′(SEQ ID NO183)(SEQ ID NO7之633-653核苷酸序列的反義，其中已加入了終止密碼子和Notl識別序列)。
用實施例67中制備的1ng質(zhì)粒βGL-TPO/pBlue DNA為模板和10μM合成引物完成第一步PCR。引物組合為[1]dRI和末端Notl或[2]T7和突變的引物(dH33，A33′，G33′，T33′，dG116，dR117，A116′，G116′和N116′)。在PCR中，用TakaRa PCR擴增盒(Takara-Shuzo)和Programmable Thermal Controller(MJResearch)，在100μl終體積中完成PCR。在[1]的第一PCR反應中，一個循環(huán)為94℃1分鐘，45℃2分鐘和72℃2分鐘，完成3個循環(huán)；接著進行1循環(huán)為94℃45秒，45℃1分鐘和72℃1分鐘共17個循環(huán)。另一方面，在下列條件下完成[2]的第一PCR反應；94℃1分鐘，55℃2分鐘，72℃2分鐘共3個循環(huán)，然后94℃45秒，55℃1分鐘，72℃1分鐘共17個循環(huán)。在乙醇沉淀2次前，用氯仿提取各PCR產(chǎn)物，然后將所得的沉淀溶于100μl TE緩沖液中。
接著，用1μl的[1]和[2]的各PCR產(chǎn)物完成第二步PCR。所用的引物為T7和末端NotI的組合。在94℃溫育10分鐘后，將TakaRa Taq加到各PCR反應混合物中。在下列條件下完成第二PCR94℃1分鐘，55℃2分鐘和72℃2分鐘共3個循環(huán)；接著94℃45秒，55℃1分鐘和72℃1分鐘共9個循環(huán)。將1μl的5mg/ml蛋白酶K、2μl 0.5M EDTA和2μl 2％SDS加到各PCR產(chǎn)物中，然后將混合物保持于37℃30分鐘以使Taq失活。用酚/氯仿提取PCR產(chǎn)物，接著乙醇沉淀，然后將所得的沉淀溶于20μl無菌水中。用EcoRI和NotI消化后，用酚/氯仿提取沉淀，然后用乙醇沉淀。將所得的沉淀溶于10μl TE緩沖液中，然后亞克隆到用相同限制酶預消化并用堿性磷酸酶(來自牛小腸，Boehringer-Mannheim)處理的表達載體pEF18S中。所用的宿主細胞是高感受態(tài)的E.coli JM109(Toyo-Boseki)。從所得的轉(zhuǎn)化體中，基本按Molecular Cloning(Sambook et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，(1989))中描述的方法制備質(zhì)粒DNA。此后，用Taq Dye DeoxyTMTerminater Cycle Sequencing盒(AppliedBiosystems)和Applied Biosystems 373A DNA測序儀確定純化的質(zhì)粒DNA的核苷酸序列。結(jié)合，證實編碼dH33，A33′，T33′，dG116，dR117，A116′，G116′和N116′的所有質(zhì)粒均含有預期的TPO cDNA序列，而且除在所需的位點外，沒有任何核苷酸序列的取代。此外，在G33′中，觀察到堿基取代[Pro38(CCT)→Ser(TCT)]，但不是在所需的位點上。
按實施例11中的方法，將所得的各克隆轉(zhuǎn)染到COS7細胞中?？傊冒揉幚淼腄EAE-葡聚糖方法，用10μg各質(zhì)粒DNA完成轉(zhuǎn)染，4到5天后，回收培養(yǎng)物上清液，然后用M-07e檢測系統(tǒng)評估。結(jié)果，在用編碼氨基酸插入或缺失衍生物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的各COS7細胞培養(yǎng)物上清液中，檢測到TPO活性為劑量依賴方式(見圖23)。相反，在轉(zhuǎn)染并表達不含有編碼TPO衍生物之cDNA的表達質(zhì)粒pEF18S的COS7細胞培養(yǎng)物上清液中沒有TPO活性。
<實施例69>
制備并純化抗-人TPO肽抗體(1)從SEQ ID NO191的人TPO氨基酸序列中，篩選出認為相對來講適宜于作為抗原的6個區(qū)域(示于表8)，用Tam的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5409-5413，1988)從中合成多抗原肽(MAP)型的四-鏈肽。每次用100μg該肽免疫2次兔，免疫8次。
不考慮上述情況外，將Cys殘基與SEQ ID NO119-124所示之各肽區(qū)(分別稱為肽區(qū)HT1-6區(qū)，它們分別對應于SEQ ID NO191之序列8-28，47-62，108-126，172-190，262-284，和306-332的部分肽)的C-末端結(jié)合而生產(chǎn)單鏈肽。用這些作為檢測抗原，用酶-免疫檢測法檢測從由此免疫的兔的血清中的抗體值，在所有被檢血清中，均發(fā)現(xiàn)了抗體值的增加。因此，這些血清稱為抗-血清。
另外，再用上述單鏈合成肽(在其C-末端結(jié)合有Cys殘基)作為抗原在下列(2)中親和純化抗-血清。
(2)用上述抗原肽之一分別免疫兩只兔，從所免疫的兔中，分別制備抗體。具體地說，對于抗-HT1肽抗體從兩只免疫兔中得到抗-HT1-1肽抗體和抗-HT1-2肽抗體。
作為一個實施例，下文舉例說明抗-HT1-1肽抗體的純化。
首先，將30mg HT1的單鏈肽(其上結(jié)合有Cys殘基)偶聯(lián)到12ml Sulfo Link Coupling Gel(由Pierce Co.，生產(chǎn)，商品號44895)上。具體地說，在l5分鐘的時間內(nèi)，將含抗原的肽溶液偶聯(lián)到經(jīng)6倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液(50mM Tris，5mM EDTA-Na，pH8.5)平衡的凝膠上。然后按原樣使其靜置30分鐘，用3倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠。接著將含0.05M L-cys-HCl的偶聯(lián)緩沖液以1ml/ml-凝膠的速率加凝膠中，這樣在15分鐘的時間內(nèi)使未處理的基團阻斷。按原樣靜置30分鐘后，用8倍凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液洗滌凝膠。在室溫下完成上述偶聯(lián)反應。用這種方法，將含抗原區(qū)的肽以28.3％的偶聯(lián)率通過共價結(jié)合偶聯(lián)到凝膠上，以便在抗原柱中制備1ml凝膠上偶聯(lián)0.8mg肽的抗原肽凝膠。從各免疫兔收集了全部血液后，得到78.4ml含抗-HT1-1肽抗體的抗-血清。將76.7ml抗-血清(蛋白質(zhì)含量3620mg)加到預先經(jīng)含150mMNaCl和0.05％疊氮鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8)平衡的抗原柱上，然后用相同的緩沖液洗滌。因此得到105.9ml流出級分(蛋白質(zhì)含量3680mg)。接著用0.1M檸檬酸(pH3.0)洗脫吸附的級分，隨后通過加入21.1ml 0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.9)使其立即中和，用超濾(用由Amicon Co.生產(chǎn)的YM30膜)濃縮，并在含150mMNaCl和0.05％疊氮鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(pH8)純化。因此，在緩沖液中得到11.2ml純化的抗-HT1-1肽抗體(蛋白質(zhì)含量77.7mg)。用與上述相同的方法，得到抗-HT1-2肽抗體(60.Omg)，抗HT 2-1肽抗體(18.8mg)，抗-HT2-2肽抗體(8.2mg)等。
用與上述相同的方法，得到抗-HT3到抗-HT6肽抗體。
<實施例70>
TPO Western分析的檢測(1)為了評估實施例69中所得的抗-血清，用下列方法檢測它們。
按常規(guī)方法將從CHO細胞之培養(yǎng)物上清液部分純化的標準重組人TPO樣品進行SDS-聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)，然后在PVDF或硝酸纖維素膜上電印跡，在所述CHO細胞中已導入并表達了編碼SEQ IDNO6之氨基酸-21到332的基因。印跡后，用20mM Tris-HCl和0.5M NaCl(pH7.5)(TBS)將該膜洗滌5分鐘，然后用含0.1％Tween20的TBS(TTBS)洗5分鐘，洗2次，再用阻斷劑(BlockAce；由Dai-Nippon Pharmaceutical Co.生產(chǎn)的，商品號UK-B25)處理60分鐘。用含0.05％BSA和10％Block Ace的TTBS溶液將含抗-HT1-1肽抗體、抗-HT2-1肽抗體、抗-HT3-2肽抗體、抗-HT4-1肽抗體、抗-HT5-2肽抗體和抗-HT6-1肽抗體之一的各抗-血清稀釋到1/1000的稀釋度。用由此稀釋的抗體作為第一抗體進行Western檢測。準確地說，用含抗-TPO肽抗體、0.05％BSA和10％Block Acl的TTBS溶液將按上述加工的重組人TPO樣品處理60分鐘，然后TTBS洗滌5分鐘。接著用含抗-兔(ab′)山羊生物素化的抗體(由Caltag Co.生產(chǎn)，商品號L43015)作為第二抗體，以及0.05％BSA和10％Block Ace的TTBS處理60分鐘，然后用TTBS洗兩次每次5分鐘。接著，用由含10％Block Ace的TTBS溶液以1/5000稀釋的堿性磷酸酶-標記的抗生物素蛋白(由Leinco Technologies Co.生產(chǎn)的，商品號A108)處理30分鐘，其后用TTBS洗滌2次，每次5分鐘，然后用TBS洗5分鐘。接著用堿性磷酸酶底物(由Bio-Rad Co.，生產(chǎn)的，商品號170-6432)顯色。于室溫下完成上述的Western檢測，從而證實抗-血清可以識別并檢測人TPO。
(2)將經(jīng)實施例69中的親合層析純化的各3mg的抗-HT1-1肽抗體，抗-HT1-2肽抗體，抗-HT2-1肽抗體和抗-HT2-2肽抗體稱重并通過使其偶聯(lián)到活化的生物素(NHS-LC-BiotinII，由Pierce Co.，生產(chǎn)的，商品號21336)上使其生物素化。將與上述(1)所用的相同的標準重組人TPO樣品進行SDS-PAGE，然后在PVDF或硝酸纖維素膜上電印跡，用生物素化的各抗體作為第一抗體，進行常規(guī)的Western檢測。印跡后，馬上用TBS將膜洗5分鐘，再用TTBS洗2次，每次5分鐘，接著用阻斷劑(Block Ace)處理60分鐘。然后，用含1μg/ml生物素化的抗-TPO肽抗體、0.05％ BSA和10％Block Ace的TTBS溶液處理60分鐘，然后用TTBS洗滌2次，每次5分鐘。接著再用由含10％Block Ace之TTBS溶液以1/5000稀釋的堿性磷酸酶-標記的抗生物素蛋白(由LeincoTechnologies Co.生產(chǎn)的，商品號A108)處理30分鐘，其后用TTBS洗滌2次，每次5分鐘，再用TBS洗滌5分鐘。用堿性磷酸酶底物(由Bio-Rad Co.生產(chǎn)的，商品號170-6432)顯色。在室溫下完成上述的Western檢測，確證，由純化的抗體可識別并檢測人TPO。
<實施例71>
制備抗-TPO肽抗體柱并檢測人TPO確證在實施例69中得到的抗-人TPO肽抗體識別人TPO。將這些抗體分別偶聯(lián)到層析載體上以制備抗-TPO肽抗體柱。作為一個實例，下面說明抗-HT1-2肽抗體柱的制備。
(1)制備含50mM磷酸鈉和0.15M NaCl(pH8.0)以及5mg/ml抗體的溶液。將0.8ml該溶液然后將1.54ml腫脹的甲?；罨哪z(Formyl-Gellulofine，由Chisso Co.生產(chǎn))于4℃混合并偶聯(lián)2小時。接著，向其中加入1.1ml含10mg/升還原劑(三甲胺甲硼烷(TMAB)，由Seikagaku Kogyo K.K.生產(chǎn)的，商品號為680246)溶液，使其與之再偶聯(lián)4小時。然后離心從反應混合物中只回收凝膠部分。向其中加入10ml純水，經(jīng)離心只回收凝膠部分。將該過程重復4次以除去未反應的抗體。然后用2.1ml阻斷緩沖劑(0.2M磷酸鈉，1M乙醇胺，pH7.0)和已加入其中的1.1ml還原劑溶液于4℃將由此回收的凝膠處理2小時，以阻斷未反應凝膠中的活性基團。最后，用一離心機，由水、20mM Tris-HCl和0.15M NaCl(pH8.0)洗滌所得的凝膠。將所得凝膠填于小柱試管中，用3M硫氰酸鈉和0.1MGly-HCl(pH2.5)溶液洗滌并用20mM Tris-HCl和0.15M NaCl(pH8.0)平衡。貯存所得的平衡柱。
在抗-HT1-2抗體柱中，抗-TPO肽抗體凝膠對于各IgG級分的偶聯(lián)率高達94.2％。偶聯(lián)到每單位體積凝膠上的IgG級分的量為1.9mg/ml-凝膠。用與上述相同的方法，制備在每ml凝膠上偶聯(lián)有21.8mg IgG的凝膠，所述IgG不含作為抗原的TPO。用其作為前一柱(下文稱為前抗體柱)以便按(2)中所述，從TPO抗體柱中除去非特異性結(jié)合的分子。
(2)下文說明制備抗-MT1-2抗體柱的另一個實例。
將從CHO細胞培養(yǎng)物上清液部分純化的重組人TPO的標準樣品加到(1)中制備的前一抗體柱(含1ml凝膠)，用10倍凝膠體積的20mM Tris-HCl(pH8.0)和0.15M NaCl通過該柱，收集通過該柱的級分，所述CHO細胞中已導入并表達編碼SEQ ID NO119-124之任何氨基酸序列的基因。接著，用10倍于凝膠體積的酸性洗脫劑(0.1M Gly-HCl，pH2.5)洗脫吸附到前一抗體柱上的級分。然后，將已從前一抗體柱流出的級分加到(1)中制備的抗-HT1-2抗體柱(含2ml凝膠)中，用10倍凝膠體積的20mM Tris-HCl(pH8.0)和0.15M NaCl洗滌該柱，同時收集流過抗-HT1-2抗體柱的級分。用8倍凝膠體積的酸性洗脫劑(0.1M Gly-HCl；pH2.5)洗脫吸附到抗-HT1-2抗體柱上的級分。用SDS-PAGE分析這些級分，證明TPO并未吸附到前一抗體柱上，而是與抗-HT1-2抗體柱特異性結(jié)合，而且所加入樣品中的幾乎所有TPO均與后者柱結(jié)合。由此證實，在后一種柱中，至少200到300μg/ml-凝膠的TPO與凝膠結(jié)合。
<實施例72>
TPO對于增加血小板數(shù)的作用將20只8周齡的正常ICR株雄性小鼠，(已從其眼眶靜脈收集血液；且用Toa Iyo Denshi制造的微細胞計數(shù)計F-800已測量血小板數(shù))隨機分成四組。用100μl PBS靜脈內(nèi)注射四組之中的一組(對照-iv組)，每天一次連續(xù)5天。用100μl溶液(通過經(jīng)NAP-25柱[Pharmacia Biotech；商品號17-0852-02]的PBS取代實施例56中得到的SP Sepharose Fast Llow之TPO活性級分F2的濃縮溶液，然后用PBS稀釋而制備的，經(jīng)M-07e檢測相對活性為211，900)靜脈內(nèi)注射另一組(TPO-iv組)，每天注射一次，連續(xù)5天。用100μl PBS皮下注射另一組(對照-SC組)，每天一次連續(xù)5天，同時用與TPO-iv組中相同的方法，用100μl皮下注射剩下的一組(TPO-SC組)，每天一次，連續(xù)5天。從開始施用的6，8，10，13和15天后，從各小鼠的眼眶靜脈收集血液并用微細胞計數(shù)器(F-890，由Toa Iyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。圖24中給出了血小板數(shù)的變化情況。因此，在對照-iv組中，甚至在血小板數(shù)量高的第6天(施用的那天為0天)，與施用前相比，血小板數(shù)增加了44％，在對照-sc組中，即使在數(shù)目最高的第8天，也只增加了47％，另一方面，在TPO-iv組中，在第6天，與施用前的數(shù)目相比，增加了177％，在TPO-sc組中，在第6天已增加了347％，在第8天，最高增加了493％。
從上述結(jié)果看，可以證實人TPO增加血小板數(shù)，不依賴于類型和施用途徑的不同。
<實施例73>
TPO對于增加血小板數(shù)的作用將16只11周齡的正常C3H/HeJ株雄性小鼠(已從其眼眶靜脈收集血液并用Tao Iyo Denshi制造的微細胞計數(shù)器F-800型測量了血小板數(shù))隨機分成4組。用100μl PBS皮下注射1組(對照組)每天一次，連續(xù)5天。用100μl溶液(通過用經(jīng)NAP-25的PBS取代實施例56中得到的Sepha cryl S-200HR的TPO活性級分，再用PBS稀釋而制備的，經(jīng)M-07e檢測，相對活性為83,000)皮下注射另一組(TPO-1組)，每天一次，連續(xù)5天。用100μl溶液(通過用PBS將TPO-1組所用的TPO活性級分稀釋2倍而制備的；經(jīng)M-07e檢測，相對活性為41,500)皮下注射另-組(TPO-2組)，每天一次，連續(xù)5天。用100μl溶液(通過將TPO-2組所用的TPO活性級分稀釋2倍以上而制備的；經(jīng)M-07e檢測，相對活性，20,750)皮下注射最后一組(TPO-3組)，每天一次，連續(xù)5天。
在注射后的第6，8，10和12天，從小鼠的眼眶靜脈收集血液并用微細胞計數(shù)器(F-800型，由Toa Iyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。
圖25中給出了血小板數(shù)的變化情況。因此，在對照組中，血小板數(shù)幾乎沒有變化，在注射TPO的組中，在注射后的第8天，所有組中的血小板數(shù)均增加到數(shù)目最高的程度。另外，在各組之間，存在劑量反應的差異。因此，在TPO-1組中，在第6天，已有約200％的增加，在第8天，增加達到約270％，然后既使在第12天有所降低，但仍有約65-％的增加，因此與對照組有顯著的差異(p＜0.01；由Dunnet多比較檢驗得出)。在TPO-2組中，盡管增加作用小于TPO-1組，但仍發(fā)現(xiàn)了相同的增加，在第6和8天，分別增加了約140％和約160％。在第12天，數(shù)目降低到與對照組幾乎相同的水平。TPO-3組的增加作用弱于TPO-2組，在數(shù)目最高的第8天，約有11O-％的增加，與對照組仍有顯著性差異(p＜0.01)。
從上述結(jié)果看，可以確定人TPO獨立于小鼠的種系而增加小鼠的血小板數(shù)，而且其作用有劑量反應特性。
<實施例74>
TPO對因施用抗癌劑而導致的血小板減少癥的抑制作用用200mg/kg 5-FU靜脈內(nèi)注射30只8周齡的雄性ICR小鼠，然后隨機分成2組(每組15只小鼠)。下一天開始(第1天)，一組(對照組)用100μl PBS皮下注射，每天一次，連續(xù)5天，而另一組(TPO組)用100μl實施例72中所用的TPO活性級分(經(jīng)M-07e檢測相對活性為211,900)皮下注射，每天一次，連續(xù)5天。在第4、6和8天，從每組中隨機選5只小鼠，然后從眼眶靜脈收集血液并用微細胞計數(shù)器(E-2500型，由Toa Iyo Denshi制造)對血小板計數(shù)。圖26中列出了血小板數(shù)的變化情況。因此，在對照組中，施用5-FU后，隨著時間的推移，血小板數(shù)而降低，在第6天，血小板數(shù)值最低(為施用5-FU之前的值的28％)，而在第8天，因降低反應而增加約1.3倍。甚至在TPO組中，施用5-FU后，隨時間的推移，血小板數(shù)降低，而且在第6天，數(shù)值最低(為施用5-FU之前的值的約52％)。然而，在第4和6天，血小板數(shù)之間的差異很小，而在第6天與對照組相比，保持了明顯(p＜0.05；因Dunnet Multiple比較檢驗測得)的高值。在第8天，與施用5-FU前的值相比，增加約200％。
從上述結(jié)果可以確定，人TPO抑制由抗癌劑引起的血小板數(shù)降低。
<實施例75>
TPO對血小板減少癥的治療作用將鹽酸嘧啶啞硝脲(ACNU)(50mg/kg)靜脈內(nèi)注射給36只7周齡的ICR雄性小鼠，然后將小鼠隨機分成2組(每組18只小鼠)。從下一天起(第一天)，用200μl PBS皮下注射一組(對照組)，每天兩次，連續(xù)數(shù)天，用200μl實施例73中所用的TPO活性級分(未用PBS稀釋)注射另一組(TPO組)，每天2次，連續(xù)數(shù)天，所述TPO活性級分中加有0.04％的Tween80(經(jīng)M-07e檢測，相對活性為380,000)。
注射后，將各組中的小鼠隨機分成3組-在第5天和12天從一組中收集血液；在第8天和14天，從另一組中收集；在第10天，從剩下的組中收集。從眼眶靜脈收集血液并用微細胞計數(shù)器(F-800型，由Toa Iyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。圖27中列出了血小板數(shù)的變化情況。因此，在對照組中，施用ACNU后，隨時間的推移，血小板數(shù)降低，而在第8-10天，數(shù)值最低(為施用ACNU前之值的約29％)，但在第12和14天，只分別恢復到約49％和約74％。另一方面，在TPO組中，在第5天，降低到施用ACNU前之值的約38％，然后開始逐漸增加。因此，在第8天，恢復到ACNU施用前之值的約63％，而在第10天，血小板數(shù)大于施用ACNU前的值。在第12和14天，分別增加了約300％和約400％。
正如上述所述，在對照組中觀察到降低的第8-10天，在TPO組中已觀察到增加，而在第10天，血小板數(shù)就高于施用ACNU前的值。因此，可以確定，人TPO可以促使因抗癌劑引起的血小板減少癥的恢復。
在同樣考慮實施例74中的結(jié)果后，現(xiàn)在可以期望，人TPO可獨立于抗癌劑的類型抑制血小板數(shù)的降低并促進血小板減少癥的恢復。
<實施例76>
在BMT后，TPO對血小板減少癥的治療作用用10Gy的放射性輻射對48只7周齡的C3H/HeN株雄性小鼠進行全身照射，接著立即用來自相同株之小鼠的1×106骨髓細胞靜脈內(nèi)注射。然后將小鼠隨機分成2組，從下一天(第1天)起，用PBS注射一組(對照組)，而用實施例73中所用的TPO活性級分(經(jīng)M-07e檢測，相對活性為44,000)注射另一組(TPO組)，兩組均是經(jīng)皮下注射，劑量100ml，每天一次，連續(xù)20天。
注射開始后，在第5，10，14和21天，每次隨機選6只小鼠，從其眼眶靜脈收集血液，用微細胞計數(shù)器(E-2500型，由ToaIyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。
圖28中列出了血小板數(shù)的變化情況。因此，在所有組中，在應用BMT后，隨時間的推移，血小板數(shù)降低，而在第10天，數(shù)目最低(為應用BMT前數(shù)的約3％)。此后，逐漸恢復，第14天時，對照組和TPO組中的數(shù)目分別為約11％和約13％。在第21天，對照組中只恢復到約37％，而在TPO組中，恢復到約65％，因此，觀察到顯著的恢復促進作用。從上述結(jié)果可以得出實施例56中制備的人TPO促進應用BMT后血小板數(shù)的恢復。
<實施例77>
用射線照射后，TPO對血小板減少癥的治療作用用5Gy的X-射線對36只8周齡的ICR株雄性小鼠進行全身照射，然后隨機分成2組。從下一天(第一天)開始，用PBS注射一組(對照組)，用實施例73中所用的TPO活性級分(經(jīng)M-07e檢測，相對活性為1,440,000)注射另一組(TPO組)，兩組均是皮下注射，每天一次，連續(xù)3天，然后，從下一天開始，皮下注射(由M-07e檢測，相對活性為360,000)，每天一次連續(xù)7天。注射開始后，將每組再隨機分成3組-在第4，11和12天從一組中收集血液，在第7和13天，從另一組中收集；在第9和15天從剩下的一組中收集。從眼眶靜脈收集血液并用微細胞計數(shù)器(F-800型；由Toa Iyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。在圖29中列出了血小板數(shù)的變化情況。在對照組中，用X射線照射后，隨時間的推移，血小板數(shù)降低，在第9天，數(shù)目最小(是用X射線照射前之數(shù)目的約25％)。在第11和13天，數(shù)目分別恢復到約38％和約67％，在第15天，恢復到用X射線照射前的值。在TPO組中，在第7天，數(shù)目降低到用X射線照射前之數(shù)目的約24％。此后，開始增加，第9天數(shù)目恢復到約82％。在第11天和以后的時間里，血小板數(shù)超出了用X射線照射前的數(shù)，而且到第21天，均保持了這種趨勢。如上所述，在對照組中，其數(shù)目仍趨于降低的第9天，在TPO組中的血小板數(shù)已開始增加，并且在第11天，血小板數(shù)目超過了用X射線照射前的數(shù)目，而且在此后均保持增加。另一方面，在對照組中，恢復到用X射線照射前的數(shù)目需15天。從這些結(jié)果可以得出在實施例56中生產(chǎn)的人TPO縮短了用X射線照射后，從血小板數(shù)目減少開始恢復所需的時間，而且對于用X射線照射后的血小板減少癥有治療作用。
<實施例78>
hTPO163增加血小板數(shù)的作用將15只已從其眼眶靜脈收集過血液并用微細胞計數(shù)器(F-800型；由Toa Iyo Denshi制造)測量過血小板數(shù)的15只C3H/HeN株健康雄性小鼠隨機分成四組-一組為對照組，剩下的為A、B和C組。用含0.1％來自小鼠的血清的PBS皮下注射第一組(對照組)，每天一次，連續(xù)5天。以約40,000,000，約8,000,000和約1,600,000/kg體重/天(以經(jīng)M-07e檢測的hTPO163的相對活性計)的劑量，用實施例65中得到的SP Sepharose Fast Flow的TPO活性級分皮下注射A、B和C組，連續(xù)5天，所述TPO活性級分用含0.1％小鼠血清的PBS稀釋。
在注射后的第6，8，10和12天，從各小鼠的眼眶靜脈收集血液，用微細胞計數(shù)器(F-800型由Toa Iyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。在圖30中列出了血小板數(shù)的變化情況。
因此，在對照組中，血小板數(shù)目幾乎沒有變化，而在TPO組中，注射后第8天所有小鼠血小板數(shù)目增加達到最高值。在每個TPO組中，均觀察到劑量反應關(guān)系。在A組中，在第6和8天，分別有約88％和約100％的增加，甚至在第10天，仍有約97％的增加，因此，所有數(shù)據(jù)均與對照組有顯著差異(p＜0.01，經(jīng)Dunnet多比較檢驗)。在B組中也觀察到相似的增加，但增加的程度低于A組，在第6和8天，分別增加約65％和約84％，表明與對照組有顯著差異(p＜0.01或0.05，經(jīng)Dunnet多比較檢驗得到)。在C組中的增加低于B組中的。在數(shù)目最高的第8天仍有約31％的增加。從上述結(jié)果可以證實實施例65中制備的hTP0163可增加血小板數(shù)，而且其作用表現(xiàn)為劑量反應關(guān)系。
<實施例79>
hTPO163對血小板減少癥的治療作用用50mg/kg的鹽酸嘧啶啞硝脲(ACNU)靜脈內(nèi)注射100只8周齡的C3H/HeN株雄性小鼠，然后隨機分成四組-一個對照組，和A、B、C組，每組25只小鼠。從下一天(第1天)，用5ml/kgPBS皮下注射對照組，每天一次，連續(xù)幾天，以約16,000,000，約48,000,000和160,000,000/kg體重/天(以經(jīng)M-07e檢測的hTPO163的相對活性計)的劑量，用實施例65中得到的用PBS稀釋之SP Sepharose Fast Flow的TPO活性級分皮下注射A、B、C組，每天一次，連續(xù)幾天。注射開始前，將每組小鼠再分成5組，然后在第5，8，10，12和14天收集血液。從其眼眶靜脈收集血液，用微細胞計數(shù)器(E-2500型；由Toa Iyo Denshi制造)計數(shù)血小板數(shù)。在圖31中列出了血小板數(shù)的變化情況。在對照組中，施用ACNU后，隨時間的推移，血小板數(shù)減少，在第8-10天，達到最低值(是ACNU施用前之值的約15-16％)，在12和14天，只有很小的恢復，分別為約28％一約51％。另一方面，在A組中，第8天時，數(shù)目減少到施用ACNU前的約25％。但此后，逐漸增加并在第10天和12天分別恢復到約34％和約89％。在第14的數(shù)目大于施用ACNU前的數(shù)目。
如上所述，盡管在所有組中，第8天觀察到最少的血小板數(shù)目，而在施用了人TPO的組中，在血小板數(shù)最低時，降低的程度低于對照組。在對照組中，甚至在第10天，血小板數(shù)也幾乎沒有恢復，而在施用TPO的組中，盡管程度不同，但在所有組中均有血小板數(shù)的恢復。在施用50μg/kg的組中，均有恢復，在第12天，已經(jīng)比施用ACNU前的數(shù)目高了。經(jīng)過比較，在對照組中，甚至在第14天，只恢復到ACNU施用前的約51％，因此清楚地表明，實施例65中產(chǎn)生的hTPO163有利促進從血小板數(shù)的減少的恢復。這樣，也證明hTPO163對因抗癌劑引起的血小板減少癥有治療作用。
下面是藥物制劑的實施例。
<實施例80>
將實施例56中得到的人TPO級分濃縮，經(jīng)滅菌處理并在-20℃冷凍以得到用作注射制劑的冷凍產(chǎn)物。
<實施例81>
將實施例56中得到的人TPO級分濃縮，將其5ml用無菌操作裝在10ml小瓶中，于-20℃凍干，用橡膠塞子塞上小瓶以得到用作注射制劑的凍干物質(zhì)。
<實施例82>
將實施例56中得到的人TPO級分濃縮，經(jīng)無菌過濾并裝在10ml小瓶中以得到可用作注射制劑的產(chǎn)品。
<實施例83>
濃縮實施例65中得到的hTPO163級分，經(jīng)無菌處理并于-20℃凍干以得到可用作注射制劑的冷凍產(chǎn)品。
<實施例84>
濃縮實施例65中得到的hTPO163級分，用無菌操作將其5ml裝在10ml小瓶中，于-20℃凍干，然后用橡膠塞密封小瓶以得到可用作注射制劑的凍干產(chǎn)品。
<實施例85>
濃縮實施例65中得到的hTPO163級分，經(jīng)無菌過濾并裝在10ml小瓶中以得到可用作注射制劑的產(chǎn)品。
<實施例86>
濃縮實施例57中得到的人TPO級分，經(jīng)無菌處理并于-20℃冷凍以得到可用作注射制劑的冷凍產(chǎn)品。
<實施例87>
濃縮實施例57中得到的人TPO級分，用無菌操作，將其5ml裝在10ml小瓶中，于-20℃凍干并用橡膠塞密封以得到可用作注射制劑的凍干產(chǎn)品。
<實施例88>
濃縮實施例57中得到的人TPO級分，經(jīng)無菌過濾并裝在10ml小瓶中以得到可用作注射制劑的產(chǎn)品。
<實施例89>
再生障礙的犬血漿除對受者進行450拉德的全身放射外，按[Mazur，E.andSouth，K.Exp.Hematol.131164-1172(1985)；Arriaga，M.，South K.，Cohen J.L.and Mazur，E.M.Blood69486-492(1987)；Mazur，E.，Basilico，D.，Newton，J.L.，Cohen，J.L.，Charland，C.，Sohl，P.A.，and Narendran，A.Blood761771-1782(1990)]所述生產(chǎn)肝素化的再生障礙的犬血漿(“APK9”)或正常的犬血漿(“NK9”)。
<實施例90>
人巨核細胞檢測在廣為人知的分子生物學手冊，如Sambrook等人(Eds)的Molecular Cloning，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1987)和Ausubel等人(編)的Current Protocols inMolecular Biology，Green associates/Wiley Interscience，New York(1990)中提供了在下列實施例中描述的許多過程的標準方法或其它適宜的方法。
檢測APK9和分離的APK9刺激從CD34+祖代細胞發(fā)育成人巨核細胞的能力。按(Hokom，M.H.，Choi，E.Nichol，J.L.，Hornkohl，A.，Arakawa，T.and Hunt，P.Molecular Biologyof Haematopiesis315-31，1994)所述從外周血細胞得到的CD34篩選細胞并在下列培養(yǎng)基中培養(yǎng)用1％Glutamine Pen-strep(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)和10％肝素化的少血小板的人AB血漿補充的Iscove′s改良的Dulbecco′s培養(yǎng)基(IMDM；GIBCO，Grand Island，NY)。還包含2-巰基乙醇(10-4M)、丙酮酸(110μg/ml)、膽固醇(7.8μg/ml)、腺苷、鳥嘌呤、胞苷、尿苷、胸苷、2-脫氧胞嘧啶、2-脫氧腺苷、2-脫氧鳥苷(各10μg/ml，Sigma)、人重組胰島素(10μg/m1)、人轉(zhuǎn)鐵蛋白(300μg/ml)、大豆脂(1％，Boehringer Mannheim Indianapolis，IN)、人重組堿性纖維細胞生長因子((2ng/ml)、Genzyme，Cambridge，MA)、人重組表皮生長因子(15ng/ml)、血小板衍生的生長因子(10ng/ml，Amgen，Inc.，Thousand Oaks，CA)。將CD34-篩選細胞以2×105ml鋪在Terasaki-型微滴板(Vanguard，Inc.Neptune，NJ)孔中的培養(yǎng)(終體積15μl)。在37℃，將細胞在潮濕箱中的5％CO2空氣中培養(yǎng)8天，用含1％戊二醛直接固定到培養(yǎng)孔中，然后與單克隆閃爍液(抗-GPIb，抗-GP IIB，(Biodesign)和抗-GpIb(Dako，Carpinteria，CA)一起保溫。用抗生蛋白鏈菌素-β-半乳糖苷酶檢測系統(tǒng)(HistoMark，Kirgegaard and Perry)使免疫反應顯色。用一倒置相顯微鏡以100×放大計數(shù)蘭色的巨核細胞。將結(jié)果表示成每孔巨核細胞的平均值+/-平均值的標準誤(SEM)。在一些情況下，用“巨核細胞單位/ml”表示數(shù)據(jù)，其中，將所給樣品誘導巨核細胞發(fā)育的程度標準化成那個實驗的陽性APK9對照。1單位指使巨核細胞與1μl APK9標準物達到相同數(shù)目巨核細胞的物質(zhì)量。如果可用5-10μg/ml MPL-X阻斷活性，則可由MPL配體而表明其活性(可溶的MPI受體)。
在該系統(tǒng)中，已表明APK9含有刺激人巨核細胞發(fā)育的因子。CD34-篩選細胞與10％NK9一起培養(yǎng)8天，只有可忽視不計的蘭色巨核細胞，而CD34-篩選細胞與10％ APK9一起培養(yǎng)8天有大量的蘭色巨核細胞。
圖32表明將濃度逐漸增加的MpI-X加到人巨核細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，其對巨核細胞發(fā)育的阻斷作用也逐漸增加。在MpI-X的濃度大于5μg/ml時，為完全抑制。在該實驗中，用5％APK9刺激CD34-篩選細胞。這表明，與MpI-X相互作用的活性(推測的MpI配體)對于人巨核細胞發(fā)育是必需的，而且表明在APK9中存在MpI配體。
本文還說明，對于人巨核細胞發(fā)育必需的MpI配體活性存在于APK9中。在Iscove′s培養(yǎng)基中，將APK9(135m1)稀釋6倍，并用于MpI-X親合柱。收集未結(jié)合的物質(zhì)(流出物)并在檢測前濃縮至原體積。用10ml 1M NaCl洗脫結(jié)合的物質(zhì)，透濾20％的收集物并濃縮4倍用于檢測。在培養(yǎng)基中單獨培養(yǎng)CD34-篩選細胞并不能發(fā)育成巨核細胞。在5％APK9(與用于柱的相同的收集物)培養(yǎng)的細胞發(fā)育成48+/-8個巨核細胞/孔。在10％未結(jié)合物質(zhì)中培養(yǎng)的細胞不能發(fā)育成巨核細胞。在10％洗脫收集物中培養(yǎng)的細胞發(fā)育為120+/-44個巨核細胞/孔。在檢測中，用5μg/ml MpI-X就可基本完全抑制裝樣柱和洗脫收集物的活性。
<實施例91>
將鼠或人MpI受體轉(zhuǎn)染到鼠細胞系中A.鼠MpI受體將全長鼠MpI受體cDNA亞克隆到含有得自Moloney鼠肉瘤腫瘤病毒之LTP的轉(zhuǎn)錄啟動子的表達載體中。將5μg該構(gòu)建體和1μg選擇性標記質(zhì)粒pWLNeo(Stratagene)共穿孔到IL-3依賴性小鼠細胞素(32 D，cline23；Greenberger et al，DNAS802931-2936(1983))中。將細胞培養(yǎng)5天后回收，然后在含800μg/mlGeneticin(G418，Sigma)和1ng/ml鼠IL-3的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。將存活的細胞以每個小庫2×105個細胞分成多個小庫，然后繼續(xù)培養(yǎng)直到長出可進行進一步分析的數(shù)量。通過使用多克隆兔抗肽血清的FACS分析檢測了6個細胞群表面表達MpI受體的情況。用與前述相同的抗肽血清，選擇一個FACS分型的細胞群。通過在10％APK9和Geneticin中生長而篩選親本細胞系的一個細胞克隆。在APK9中篩選35天后，將細胞保持在1ng/ml鼠IL-3中。用一個亞克隆1A6.1進行該工作。
B.人MpI受體將全長人MpI受體序列(Vigon，I et al，DNAS 895640-5644(1992))亞克隆到含有Maloney鼠肉瘤腫瘤病毒轉(zhuǎn)錄啟動子的表達載體(與鼠受體的相同的載體)中。用CaPO4哺乳動物轉(zhuǎn)染盒(Stratagene)，將6μg該構(gòu)建體和6μg兩性的反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝構(gòu)建體(Landu N.R.Littman，D.R.，J.Virology 665110-5113(1992))轉(zhuǎn)染到3×106293細胞中。2天后再轉(zhuǎn)染相同的細胞，4天后再進行一次。最后一次轉(zhuǎn)染后的那天，將293細胞與IL-3依賴性鼠細胞系(32D，clone23；Greenberger et al，PNAS802931-2936(1983))一起培養(yǎng)。24小時后，拯救32D細胞并在BSA梯度中(Path-o-cyte；Mills，Inc.)形成條帶。在1ng/ml鼠IL-3中擴展細胞并于20％APK9中篩選生長。通過使用多克隆兔抗肽血清的FACS根據(jù)細胞受體的表面表達而對細胞進行分類。隨后用這些細胞進行檢測。
<實施例92>
MpI配體的1A6.1檢測洗滌1A6.1細胞使之不含IL-3并以1∶1系列稀釋受試樣品將細胞再放在Terasaki-型微滴盤的補充有10％胎牛血清(FCS)、Geneticin(800μg/ml)和1％青霉素/鏈霉素(Gibco)αMEM(Gibco)中(1000細胞/15μl總col/孔)。48小時后，經(jīng)顯微鏡確定每孔中的活細胞數(shù)。1個活性單位指每孔中得到200個活細胞的活性量。如果在檢測中，加入5-10μg/ml MpI-X可完全阻斷所述活性，則活性是指MpI配體的。在APK9中，MpI配體活性平均為4400+/-539單位/ml發(fā)育不全的血漿。除非特別說明，在1A6.1檢測中定義了MpI配體活性的單位。
基本按與用1A6.1細胞相同的方法完成用人MpI受體基因轉(zhuǎn)染的細胞進行的檢測。
<實施例93>
證明MpI-配體存在于小鼠、狗、豬和人源之血清的再生障礙的血漿中MpI配體存在于鼠、犬、豬和人源之血清的再生障礙血漿中(表9)。在照射前和照射(500拉德)后12天從BDF1小鼠中收集血漿。在1A6.1檢測中檢測血漿，結(jié)果表明用MpI-X(10μg/ml)基本上可完全抑制2000單位/ml活性。在人巨核細胞檢測中，照射的小鼠血漿也是陽性的，其活性為1833單位/ml，從照射前和照射(450拉德)10天后的狗中收集血漿。在1A6.1檢測和人巨核細胞檢測中檢測活性。在兩個檢測中均可檢出活性，且用MpI-X(10μg/ml)均可完全抑制活性。照射前和照射(650拉德)后10天從豬中收集血漿。在1A6.1檢測和人巨核細胞檢測中檢測血漿。在這兩個檢測中，顯示出MpI配體活性(由10μg/ml MpI-X可抑制)可與在再生障礙犬的血漿所見的相比。從再生障礙的人中得到其血清。從骨髓移植患者中收集該物質(zhì)。在1A6.1檢測中檢測6個患者的血清，其活性為903單位/ml，其中的88％是由MpI配體(用10μg/mlMpI-X可抑制)造成的。在人巨核細胞檢測中，檢測14個再生障礙患者的血清。作為一組，它們表現(xiàn)出基本活性，為941巨核細胞單位/ml，可用10μg/ml MpI-X完全加以抑制。包括鼠IL-3數(shù)據(jù)以說明1A6.1檢測特異性。盡管該重組細胞激活素誘導細胞的生長，但是10μg/ml MpI-X無法阻斷它。
表9種 1A6.1細胞檢測 人巨核細胞檢測(單位/毫升) (巨核細胞單位/ml)基質(zhì)+MpI-X基質(zhì) +MpI-X正常小鼠 0+/-0 0+/0 0+/-0 -0+/-O再生障礙小鼠 200001833 未作正常犬 0+/-0 0+/-00+/-0 0+/-0再生障礙犬 4400+/-539 0+/-0792+/-128 0+/-0正常豬 0+/-0 0+/-00+/-0 0+/-0再生障礙豬 3866+/-1136 0+/-01284+/-182 10+/-10正常人 0+/-0 0+/-00+/-0 0+/-0再生障礙人 903+/-64114+/-33 941+/-178 0+/-0鼠IL-3 6000+/-565 6000+/-565 未作 未作<實施例94>
制備在E.coli系統(tǒng)中表達的人TPO衍生物為了提高生物活性、穩(wěn)定性和可溶性，設(shè)計幾種TPO衍生物并在E.coli中表達。用前述SEQ ID NO11的氨基酸序列得到的衍生物包括Arg取代129位Leu的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)(也稱為L129R)；Arg取代133位His的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)(也稱為H133R)，Arg取代143位Met的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)(也稱為M143R)，Leu取代82位Gly的[Net-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)(也稱為G82L)，Leu取代146位Gly的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)(也稱為G146L)，Pro取代148位Ser的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Pro148]TPO(1-163)(也稱為S148P)，Arg取代59位Lys的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)(也稱為K59R)，Arg取代115位Gln的[Met-2，Lys-1，Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163)(也稱Q115R)。
為了制備TPO衍生物，用實施例42中描述的h6T(1-163)作為模板，合成有下列序列的oligo核苷酸L129R5′-ATCTTCCGTTCTTTCCAGCACCT-3′(用于制備由Arg取代SEQ ID N011所示之序列中的Leu-129的Arg-取代衍生物)；H133R5′-TCTTTCCAGCGTCTGCTGCGT-3′(用于制備由Arg取代SEQ ID N011所示之序列中的His-133的Arg-取代衍生物)；M143R5′-CGTTTCCTGCGTCTGGTTGGC-3′(用于制備由Arg取代SEQ ID N011所示之序列中的Met-143的Arg-取代衍生物)；G82L5′-GGCCAGCTTCTGCCGACCTGCCT-3′(用于制備由Leu取代SEQ ID NO11所示之序列中的Gly-82的Leu-取代衍生物)；G146L5′-ATGCTGGTTCTGGGTTCTACCCT-3′(用于制備由Leu取代SEQ ID NO11所示之序列中的Gly-146的Leu-取代衍生物)；S148P5′-GTTGGCGGTCCGACCCTGTGCG-3′(用于制備由Pro取代SEQ ID NO11所示之序列中的Ser-148的Pro-取代衍生物)；和K59R5′-GAAGAGACCCGCGCTCAGGACATCC-3′(用于制備由Arg取代SEQ ID NO11所示之序列中的Lys-59的Arg-取代衍生物)；Q115R；5′-CTGCCGCCACGTGGCCGTACCAC-3′(用于制備由Arg取代SEQ ID NO11所示之序列中的Gln-115的Arg取代衍生物)。
用Sculptor體外誘變盒(Amersham)構(gòu)建突變質(zhì)粒。將得自實施例42中所述之pCFM536/h6T(1-163)的XbaI-HindIII片段導入用XbaI和HindIII消化后的Bluescript II SK(-)噬菌粒載體(Stratagene，California USA)以得到質(zhì)粒pSKTPO，然后轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中。用輔助噬菌體M13K07(Takara Shuzo，Japan)從pSKTPO制備用于誘變的單鏈DNA。用上述的oligo核苷酸，按供應商的說明，將突變導入TPO基因。按供應商的說明用DNA測序盒(Applied Biosystems，USA)完全測序分析并確定了TPO的突變。
將從突變的pSKTPO制備的XbaI-HindIII片段導入用XbaI和HindIII消化的pCFM536中。將攜帶突變基因的質(zhì)粒pCFM536轉(zhuǎn)化到E.coli#261中以得到表達TPO衍生物基因的轉(zhuǎn)化體。
按前述實施例43，培養(yǎng)用突變的pCFM536轉(zhuǎn)化的E.coli#261。收集純化體的細胞顆粒并在冷凍器中貯存至少1天。將冷凍的細胞顆粒(3g)懸浮在含10mM EDTA、10mM DTT和1mM PMSF的30ml 20mMTris緩沖液(pH8.5)中。將懸浮液放在冰上并以1分(至少)的間隔聲波處理5次。以15000rpm經(jīng)10分鐘離心收集經(jīng)聲波處理的細胞。
將顆粒懸浮在含8M鹽酸胍、5mM EDTA、1mM PNSF的30ml10mM Tris緩沖液(pH8.7)中，加入50mg DTT面使其還原。攪拌1-1.5小時后，用稀釋的HCl將溶液的pH調(diào)至5.0，然后稀釋前冷卻到4℃。
用含30％甘油、3M脲、3mM胱胺和1mM L-Lys的1.5L 10mMCAPS緩沖液(pH10.5)逐漸稀釋樣品溶液并過夜。將樣品攪拌至少2天后，以8000rpm離心45分鐘除去沉淀。用6M磷酸將溶液的pH調(diào)至6.8，然后稀釋2倍。用2張#2濾紙(φ＝90mm，Toyo濾紙，日本)過濾溶液，然后上樣到CM-Sepharose Fast Flow柱(2.6×10cm)(Pharmacia)上。用含15％甘油和1M脲的400ml 10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.8)洗滌該柱，然后用含15％甘油的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)平衡。用線性梯度從含15％甘油的10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.2)到含0.5M NaCl之相同緩沖液以1.0ml/min的流速從柱上洗脫蛋白質(zhì)。通過280nm的吸收值監(jiān)測蛋白質(zhì)洗脫液；用SDS-PAGE確定含TPO衍生物的級分并收集。
用Centriprep10(Amicon)將TPO級分(約30ml)濃縮到2ml后，通過用μBondasphere C4柱(3.9×150mm)的反相HPLC(Waters)進一步純化突變TPO。用線性梯度從H2O中的0.05％TFA到含30％CH3CN和0.02％TFA的2-丙醇以0.5ml/分的流速經(jīng)40分鐘洗脫蛋白質(zhì)。在該條件下，約30分鐘后，洗脫出TPO衍生物。
為了進行生物檢測，將所純化的TPO樣品對1L 10mM磷酸鹽緩沖液2天透析2次。用Centriprep10(Amicon)濃縮到約0.1mg/ml后，按前述用M-07e檢測系統(tǒng)評估衍生物的生物活性。發(fā)現(xiàn)所有突變體均有等同于h6T(1-163)，TPO的參考樣品的活性(見圖33和34)。保藏清單Escherichia coli(pHT1-231/DH5)FERM BP-4564和CCTCC-M95001Escherichia coli(pEF18S-A2α/DH5)FERM BP-4565和CCTCC-M95002Escherichia coli(pHGT1/DH5)FERM BP-4616和CCTCC-M95003Escherichia coli(pHTF1/DH5)FERM BP-4617 AND CCTCC-M95004小鼠-小鼠雜交瘤P55FERM BP-4563和CCTCC-C95001CHO28/1/1/3-C6FERM BP-4988和CCTCC-C95004CHO163T-63-79-C1FERM BP-4989和CCTCC-C95005
序列表(1)一般信息(i)申請人MIYAZAKI，HiroshiKATO，TakashiOHGAMI，KinyaIWAMATSU，AkihiroAKAHORI，HiromichiKUROKI，RyotaSHIMIZU，ToshiyukiMUTO，Takanori(ii)發(fā)明題目具有TPO活性的蛋白質(zhì)(iii)序列數(shù)197(iv)相應地址(A)收件人Marshall，O′Toole，Gerstein，Murray&
Borun(B)街道6300 Sears Tower，233 South Wacker Drive(C)城市Chicago(D)州Illinois(E)國家美國(F)郵編60606-6402(v)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy disk(B)計算機IBM PC compatible(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，Version#1.25(vi)現(xiàn)申請資料(A)申請?zhí)?B)申請人(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P39090/94(B)申請日14-FEB-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P79842/94(B)申請日25-MAR-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P155126/94(B)申請日01-JUN-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P167328/94(B)申請日15-JUN-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P227159/94(B)申請日17-AUG-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P304167/94(B)申請日01-NOV-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P UNKNOWN(B)申請日28-DEC-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P193169/94(B)申請日17-AUG-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P298669/94(B)申請日01-DEC-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朖P193916/94(B)申請日18-AUG-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/212,164(B)申請日14-MAR-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/221,020(B)申請日01-APR-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/278,083(B)申請日20-JUL-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/320,300(B)申請日11-OCT-1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/361,811(B)申請日22-DEC-1994(viii)代理人/代理資料(A)姓名Borun，Michael F.
(B)登記號25，447(C)文獻/摘要號01017/32425(ix)電訊資料(A)電話312/474-6300(B)電傳312/474-0448(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度261個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(vi)原始來源(A)生物Rattus norvegicus(B)細胞系McA-RH8994(xi)序列描述SEQ ID NO1GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC60CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT 120CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA 172ATG GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GTG GCC ATA CTT CTC CTC ACC GCA 220Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala1 5 10 15AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCA GTT CCT CCC GCC TGT GAC CC 261Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp20 25(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度147個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala-21 -20 -15 -10Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu-5 1 5 10Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Ser Arg Leu Ser15 20 25Gln Cys 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Lys Asp110 115 120Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu160 165 170Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr175 180 l85Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly190 195 200Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu205 210 215Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu220 225 230(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度576個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(vi)原始來源(A)生物Homo Sapiens(F)組織類型肝(xi)序列描述SEQ ID NO5AG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG47Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg1 5 10 15TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG 95Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu20 25 30AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA 143Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly35 40 45GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC 191Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro50 55 60AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA 239Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly65 70 75CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC 287Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val80 85 90 95CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT 335Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro100 105 110ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT 393Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser115 120 125CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA TTGTCTCATG 432Gln Glu Gly130TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT TCCTACTTTC492TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA ATCATTTTTC552ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAA 576(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度353個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala-21 -20 -15 -10Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val-5 1 5 10Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser15 20 25Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala30 35 40Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys45 50 55Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60 65 70 75Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly80 85 90Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu95 100 105Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp110 115 120Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu160 165 170Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr175 180 185Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly190 195 200Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu205 210 215Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly220 225 230 235Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro240 245 250Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu255 260 265Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr270 275 280Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu285 290 295His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser300 305 310 315Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu320 325 330Gly(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度1721個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(vi)原始來源(A)生物Homo Sapiens(F)組織類型肝(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGGCACGAG GGGGGTGTCT GGCTGGCGTG GCTCCCTGTT TGGGGCCTCT CCCCTGAATC60CTTCCTGGGG CCATGGAGGC CAGACAGACA CCCCGGCCAG A ATG GAG CTG ACT 113Met Glu Leu Thr-21 -20GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG 161Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu-15 -10 -5TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG 209Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu1 5 10 15CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG 257Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu20 25 30GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC 305Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser35 40 45TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT 353Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile50 55 60CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA 401Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly65 70 75CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA 449Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly80 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205ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC 833Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro210 215 220GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC 881Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu225 230 235TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA 929Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser240 245 250 255GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT 977Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr260 265 270TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT 1025Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro275 280 285CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT 1073Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu290 295 300CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC 1121Pro Asp Pro Ser A1a Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn305 310 315ACA 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TTCCTAGAAA CTTGGTTAAA TGTTCACTCT TCTTGCTACT120TTCAGGATAG ATTCCTCACC CTTGGCCCGC CTTTGCCCCA CCCTACTCTG CCCAGAAGTG180CAAGAGCCTA AGCCGCCTCC ATGGCCCCAG GAAGGATTCA GGGGAGAGGC CCCAAACAGG240GAGCCACGCC AGCCAGACAC CCCGGCCAGA ATG GAG CTG ACT G GTGAGAACAC 293Met Glu Leu Thr-21 -20ACCTGAGGGG CTAGGGCCAT ATGGAAACAT GACAGAAGGG GAGAGAGAAA GGAGACACGC353TGCAGGGGGC AGGAAGCTGG GGGAACCCAT TCTCCCAAAA ATAAGGGGTC TGAGGGGTGG413ATTCCCTGGG TTTCAGGTCT GGGTCCTGAA TGGGAATTCC TGGAATACCA GCTGACAATG473ATTTCCTCCT CATCTTTCAA CCTCACCTCT CCTCATCTAA G AA TTG CTC CTC525Glu Leu Leu Leu-15GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT 573Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala-10 -5 1CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC 621Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser5 10 15CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG GTGAGAACTC CCAACATTAT CCCCTTTATC 672His Val Leu His 5er Arg Leu20 25CGCGTAACTG GTAAGACACC CATACTCCCA GGAAGACACC ATCACTTCCT CTAACTCCTT732GACCCAATGA CTATTCTTCC CATATTGTCC CCACCTACTG ATCACACTCT CTGACAAGGA792TTATTCTTCA CAATACAGCC CGCATTTAAA AGCTCTCGTC TAGAGATAGT ACTCATGGAG852GACTAGCCTG CTTATTAGGC TACCATAGCT CTCTCTATTT CAGCTCCCTT CTCCCCCCAC912CAATCTTTTT CAACAG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA961Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr30 35CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC 1009Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr40 45 50CAG ATG GTAAGAAAGC CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT 1065Gln Met55CCCACTGCTT CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA 1125GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG ATAAGATGAT 1185GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC ACCATGAAAA GCTGGAGAGA 1245AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT CCTGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG 1305AAGCAAGACT CATATGTCAT CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC 1365AAAAGACTGA ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC 1425AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA GCACTTTGGG 1485AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG AGCAGCCTGG CCAACATGGC 1545GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAAAAT TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT 1605CCCAGCTACT TGGAAGGCTG AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA 1665GTGAGCTGAG ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 1725AAAAGAAAAA AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC CAGCTTTCAG 1785GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT AGCACTTCCT ACGAAAAGGA 1845TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA CCATGTAACA TTACTGAAGC TGCTATTCTT 1905AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT GTTTGATGTT TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA 1965GAACTCTATT CCGAGTGGAC TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 2025GAAGACATAT GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT CTAGAAAGCA 2085GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG CAATAGTTTA AAAAACTAAA 2145ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC TTCCTTCAGG ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG 2205CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC TAGTCCTTTC TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT 2255CTCATACCTA CATTTAGTTT ATTTATTATT ATTATTTGAG 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Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu95 100 105CTT GGA ACC GAG CTT CCT CCA GAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT 432Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp110 115 120CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC TGA 555Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser160(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度1043個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(vi)原始來源(A)生物Homo Sapiens(xi)序列描述SEQ ID NO14CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATA ATG AAA AGT CCT GCA CCA CCT GCA52Met Lys Ser Pro Ala Pro Pro Ala-2 1 5TGT GAT TTA CGG GTC CTG TCT AAA CTG CTG CGC GAC TCT CAC GTG CTG 100Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu10 15 20CAC TCT CGT CTG TCC CAG TGC CCG GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG 148His Ser Arg Leu Ser Gln Cys 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NO17的資料(i)序列特征(A)長度9個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO17CTCGTGCCG 9(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO18Ile Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度12個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQID NO19Thr Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度12個氨基酸
(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO20Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID N021的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的_堿基(B)位置12&15(D)其它資料/修飾的_堿基＝i(xi)序列描述SEQ ID N021ACGCTGGGGG CNGANGA 17(2)SEQID N022的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的_堿基(B)位置12&15(D)其它資料/修飾的_堿基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO22ACACTAGGAT CNAANAA 17(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的_堿基(B)位置12&15(D)其它資料/修飾的_堿基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO23ACGCTGGGTG CNGANGA17(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞修飾的_堿基(B)位置12&15(D)其它資料/修飾的_堿基＝i(xi)序列描述SEQ ID NO24ACGCTGGGCG CNGANGA 17(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO25GGGGGGCGGA CGCTGGG 17(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO26GGAGGACGAA CACTAGG 17(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO27GGTGGTCGTA CGCTGGG 17(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO28GGCGGCCGCA CGCTGGG17(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO29GGATCTTGGT TCATTCTCAA G 21(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO30CCTCAGACAG TGGTTCAAAG 20(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO31CGAGGGTGTA CCTGGGTCCT G21(2)SEQ ID NO32的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO32CAGAGTTAGT CTTGCGGTGA G 21(2)SEQ ID NO33的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO33CCTGTCCTGC TGCCTGCTGT G 21(2)SEQ ID NO34的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO34TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21(2)SEQ ID NO35的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO35ATGGAGCTGA CTGATTTGCT C 21(2)SEQ ID NO36的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO36TGAAGTTCGT CTCCAACAAT C 21(2)SEQ ID NO37的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO37TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO38的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO38TGACGCAGAG GGTGGACCCT C 21(2)SEQ ID NO39的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO39AGCAGAACCT CTCTAGTCCT C 21(2)SEQ ID NO40的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO40ACACTGAACG AGCTCCCAAA C 21(2)SEQ ID NO41的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO41AACTACTGGC TCTGGGCTTC T 21(2)SEQ ID NO42的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO42AGGGATTCAG AGCCAAGATT C 21(2)SEQ ID NO43的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO43TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTGGG G31(2)SEQ ID NO44的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO44TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTAAA A31(2)SEQ ID NO45的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO45TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTCTT T31(2)SEQ ID NO46的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO46TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT TTTTTTTGCC C31(2)SEQ ID NO47的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO47TAGCGGCCGC TTTTTTTTTT T 21(2)SEQ ID NO48的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO48TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO49的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO49AGGATGGGTT GGGGAAGGAG A 21(2)SEQ ID NO50的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO50TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO51的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO51AGGGAAGAGC GTATACTGTC C 21(2)SEQ ID NO52的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO52GGCCAGCCAG ACACCCCGGC C 21(2)SEQ ID NO53的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO53ATGGGAGTCA CGAAGCAGTT T 21(2)SEQ ID NO54的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO54TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21(2)SEQ ID NO55的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO55AACCTTACCC TTCCTGAGAC A 21(2)SEQ ID NO56的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO56TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC30(2)SEQ ID NO57的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO57TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39(2)SEQ ID NO58的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO58TTTGCGGCCG CTCATTACAG TGTGAGGACT AGAGAGGTTC TG 42(2)SEQ ID NO59的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID N059TTTGCGGCCG CTCATTATCT GGCTGAGGCA GTGAAGTTTG TC 42(2)SEQ ID N060的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID N060TTTGCGGCCG CTCATTACAG ACCAGGAATC TTGGCTCTGAA T 42(2)SEQ ID NO61的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO61TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC30(2)SEQ ID NO62的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO62TTTGCGGCCG CTCATTAGAG GGTGGACCCT CCTACAAGCA T41(2)SEQ ID NO63的資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO63TTTGCGGCCG CTCATTAGCA GAGGGTGGAC CCTCCTACAA 40(2)SEQ ID NO64的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO64TTTGCGGCCG CTCATTACCT GACGCAGAGG GTGGACCC38(2)SEQ ID NO65的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO65TTTGCGGCCG CTCATTACCG CCTGACGCAG AGGGTGGA 38(2)SEQ ID NO66的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO66TTTGCGGCCG CTCATTAGGC CCGCCTGACG CAGAGGGT 38(2)SEQ ID NO67的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO67TTTGCGGCCG CTCATTATGG GGCCCGCCTG ACGCAGAG 38(2)SEQ ID NO68的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO68TTTGCGGCCG CTCATTAGGG TGGGGCCCGC CTGACGCA 38(2)SEQ ID NO69的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO69TTTGAATTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30(2)SEQ ID NO70的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO70TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41(2)SEQ ID NO71的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO71TTTGCGGCCG CTCATTAGCT GGGGACAGCT GTGGTGGGT 39(2)SEQ ID NO72的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO72AGTAAACTGC TTCGTGACTC CCATGTCCTT CACAGCAGAC TGAGCCAGTG 50(2)SEQ ID NO73的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO73CATGGGAGTC ACGAAGCAGT TTACTGGACA GCGTTAGCCT TGCAGTTAG49(2)SEQ ID NO74的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ IDNO74TGTGACCTCC GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGTGACTCCC ATGTCCTTC 49(2)SEQ ID NO75的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO75TTTACTGAGG ACTCGGAGGT CACAGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG48(2)SEQ ID NO76的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO76GACCTCCGAG TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG TCCTTCACA49(2)SEQ ID NO77的資料(i)序列特征(A)長度48個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO77CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCGGACAG CGTTAGCCTT GCAGTTAG 48(2)SEQ ID NO78的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO78TTGTGACCTC CGAGTCCTCA G 21(2)SEQ ID NO79的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO79CAGGTATCCG GGGATTTGGT C 21(2)SEQ ID NO80的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO80TGCGTTTCCT GATGCTTGTA G 21(2)SEQ ID NO81的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO81GAGAGAGCGG CCGCTTACCC TTCCTGAGAC AGATT35(2)SEQ ID NO82的資料(i)序列特征(A)長度6個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO82GAGAGA 6(2)SEQ ID NO83的資料(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO83CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAGCCCGGCT CCGCCAGCTT GTGACCTTCG60TGTTCTGTCT 70(2)SEQ ID NO84的資料(i)序列特征(A)長度72個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO84CAGTTTAGAC AGAACACGAA GGTCACAAGC TGGCGGAGCC GGGCTCATTA TTTATTACCT60CCTTGGTTTT TT72(2)SEQ ID NO85的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO85AAACTGCTTC GCGACTCTCA CGTGCTGCAC TCTCGTCTGT CCCAGTGCCC GGAAGTTCAC60CCGCTGCCG69(2)SEQ ID NO86的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO86CGGGGTCGGC AGCGGGTGAA CTTCCGGGCA CTGGGACAGA CGAGAGTGCA GCACGTGAGA 60GTCGCGAAG 69(2)SEQ ID NO87的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO87ACCCCGGTTC TGCTTCCGGC TGTCGACTTC TCCCTGGGTG AATGGAAAAC CCAGATGGAA 60GAGACCAAA 69(2)SEQ ID NO88的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO88CTGAGCTTTG GTCTCTTCCA TCTGGGTTTT CCATTCACCC AGGGAGAAGT CGACAGCCCG 60AAGCAGAAC 69(2)SEQ ID NO89的資料(i)序列特征
(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO89GCTCAGGACA TCCTGGGTGC AGTAACTCTG CTTCTGGAAG GCGTTATGGC TGCACGTGGC 60CAGCTTGGC 69(2)SEQ ID NO90的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO90GGTCGGGCCA AGCTGGCCAC GTGCAGCCAT AACGCCTTCC AGAAGCAGAG TTACTGCACC 60CAGGATGTC 69(2)SEQ ID NO91的資料(i)序列特征(A)長度69個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO91CCGACCTGCC TGTCTTCCCT GCTTGGCCAG CTGTCTGGCC AGGTTCGTCT GCTGCTCGGC 60GCTCTGCAG 69(2)SEQ ID NO92的資料(i)序列特征(A)長度66個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO92CAGAGACTGC AGAGCGCCGA GCAGACGAAC CTGGCCAGAC AGCTGGCCAA GCAGGGAAGA 60CAGGCA66(2)SEQ ID NO93的資料(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO93TCTCTGCTTG GCACCCAGCT GCCGCCACAG GGCCGTACCA CTGCTCACAA GGATCCGAAC 60GCTATCTTCC70(2)SEQ ID NO94的資料(i)序列特征
(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO94AAGACAGGAA GATAGCGTTC GGATCCTTGT GAGCAGTGGT ACGGCCCTGT GGCGGCAGCT 60GGGTGCCAAG70(2)SEQ ID NO95的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO95GGAGGAGACC AAGGCACAGG A 21(2)SEQ ID NO96的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO96CCGGAATTCT TACCCTTCCT GAGACAGATT 30(2)SEQ ID NO97的資料(i)序列特征(A)長度8個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO97CTAATGAG 8(2)SEQ ID NO98的資料(i)序列特征(A)長度16個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO98AATTCTCATT AGAGCT 16(2)SEQ ID NO99的資料(i)序列特征(A)長度8個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO99CTAATGAG 8(2)SEQ ID NO100的資料(i)序列特征(A)長度16個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO100AATTCTCATT AGAGCT 16(2)SEQ ID NO101的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO101ATCGCCGGCT CCGCCAGCTT GTGAC 25(2)SEQ ID NO102的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO102GCCGAATTCT CATTAGAGCT CGTTCAGTGT 30(2)SEQ ID NO103的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO103GATCCGAACG CTATCTTCCT GTCTTTCCAG CACCTGCTGC GT42(2)SEQ ID NO104的資料(i)序列特征(A)長度44個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO104TTTGCCACGC AGCAGGTGCT GGAAAGACAG GAAGATAGCG TTCG 44(2)SEQ ID NO105的資料(i)序列特征(A)長度42個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO105GGCAAAGTTC GTTTCCTGAT GCTGGTTGGC GGTTCTACCC TG 42(2)SEQ ID NO106的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO106ACGCACAGGG TAGAACCGCC AACCAGCATC AGGAAACGAA C 41(2)SEQ ID NO107的資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO107TGCGTTCGTC GGGCGCCGCC AACCACTGCT GTTCCGTCTT AATGAA 46(2)SEQ ID NO108的資料(i)序列特征(A)長度45個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO108ACCTTTCATT AAGACGGAAC AGCAGTGGTT GGCGGCGCCC GACGA 45(2)SEQ ID NO109的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO109AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG 24(2)SEQ ID NO110的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO110AGAAGCTTTC ATTAAGACGG AACA 24(2)SEQ ID NO111的資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEO ID NO111CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCA46(2)SEQ ID NO112的資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO112CAGGTGGTAC AGGTGCTTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT 46(2)SEQ ID NO113的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO113CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG38(2)SEQ ID NO114的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQID NO114CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG 34(2)SEQ ID NO115的資料(i)序列特征(A)長度84個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO115CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAAGCACCT GTACCACCTG CATGTGATTT60ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84(2)SEQ ID NO116的資料(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO116Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Arg1 5 10 15Arg Leu Ser Gln20(2)SEQ ID NO117的資料(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQID NO117Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala Gln1 5 10 15Asp Ile Leu Gly Ala20(2)SEQ ID NO118的資料(i)序列特征
(A)長度18個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO118Ser Arg Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Leu1 5 10 15Leu Asp(2)SEQ ID NO119的資料(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO119Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His1 5 10 15Ser Arg Leu Ser Gln20(2)SEQ ID NO120的資料(i)序列特征(A)長度16個氨基酸(B)類型氨基酸
(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO120Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp1 5 10 15(2)SEQ ID NO121的資料(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO121Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp1 5 10 15Pro Asn Ala(2)SEQ ID NO122的資料(i)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO122Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr1 5 10 15Ala Ser Ala(2)SEQ ID NO123的資料(i)序列特征(A)長度23個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO123Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His1 5 10 15Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr20(2)SEQ ID NO124的資料(i)序列特征(A)長度27個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO124Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser1 5 10 15Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly20 25(2)SEQ ID NO125的資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO125CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCA 46(2)SEQ ID NO126的資料(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO126CAGGTGGTGC AGGAGATTTC ATTATTTATT ACCTCCTTGG TTTTTT 46(2)SEQ ID NO127的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO127CCTGCATGTG ATTTACGGGT CCTGTCTAAA CTGCTGCG38(2)SEQ ID NO128的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO128CGCAGCAGTT TAGACAGGAC CCGTAAATCA CATG34(2)SEQ ID NO129的資料(i)序列特征(A)長度84個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO129CTAGAAAAAA CCAAGGAGGT AATAAATAAT GAAATCTCCT GCACCACCTG CATGTGATTT60ACGGGTCCTG TCTAAACTGC TGCG 84(2)SEQ ID NO130的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO130CTCCCGAACC GTACCAGCGG CCTGCTGGAA ACCAACTTTA CCGCGAG47(2)SEQ ID NO131的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO131GGTAAAGTTG GTTTCCAGCA GGCCGCTGGT ACGGTTCGGG AGCTCGT47(2)SEQ ID NO132的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO132CGCGCGTACC ACCGGCAGCG GCCTGCTGAA ATGGCAGCAG GGCTTTCGT 49(2)SEQ ID NO133的資料(i)序列特征
(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO133AGCCCTGCTG CCATTTCAGC AGGCCGCTGC CGGTGGTACG CGCGCTCGC49(2)SEQ ID NO134的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO134GCGAAAATCC CGGGCCTGCT GAACCAGACC AGCCGTAGCC TGGATCAGAT50(2)SEQ ID NO135的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO135ATCCAGGCTA CGGCTGGTCT GGTTCAGCAG GCCCGGGATT TTCGCACGAA50(2)SEQ ID NO136的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO136CCCGGGCTAT CTGAACCGTA TCCATGAACT GCTGAACGGC ACCCGTG 47(2)SEQ ID NO137的資料(i)序列特征(A)長度47個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO137GTGCCGTTCA GCAGTTCATG GATACGGTTC AGATAGCCCG GGATCTG 47(2)SEQ ID NO138的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO138GCCTGTTTCC GGGCCCGAGC CGTCGCACCC TGGGCGCGCC GGATATCAG49(2)SEQ ID NO139的資料(i)序列特征(A)長度49個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO139ATCCGGCGCG CCCAGGGTGC GACGGCTCGG GCCCGGAAAC AGGCCACGG49(2)SEQ ID NO140的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO140ATCAGCTCTG GCACCAGCGA TACCGGCAGC CTGCCGCCGA ACCTGCAGCC50(2)SEQ ID NO141的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO141CAGGTTCGGC GGCAGGCTGC CGGTATCGCT GGTGCCAGAG CTGATATCCG50(2)SEQ ID NO142的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO142GGGCTATAGC CCGAGCCCGA CCCATCCGCC GACCGGCCAG TATACCCTGT T51(2)SEQ ID NO143的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO143GGTATACTGG CCGGTCGGCG GATGGGTCGG GCTCGGGCTA TAGCCCGGCT G51(2)SEQ ID NO144的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO144TCCGCTGCCG CCGACCCTGC CGACCCCGGT GGTTCAGCTG CATCCGCTGC50(2)SEQ ID NO145的資料(i)序列特征(A)長度50個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO145GGATGCAGCT GAACCACCGG GGTCGGCAGG GTCGGCGGCA GCGGAAACAG50(2)SEQ ID NO146的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO146TGCCGGATCC GAGCGCGCCG ACCCCGACCC CGACCAGCCC GCTGCTGAAC A51(2)SEQ ID NO147的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO147AGCAGCGGGC TGGTCGGGGT CGGGGTCGGC GCGCTCGGAT CCGGCAGCAG C51(2)SEQ ID NO148的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO148CCAGCTATAC CCATAGCCAG AACCTGAGCC AGGAAGGCTA ATGAAGCTTG A51(2)SEQ ID NO149的資料(i)序列特征(A)長度51個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO149CTTCATTAGC CTTCCTGGCT CAGGTTCTGG CTATGGGTAT AGCTGGTGTT C51(2)SEQ ID NO150的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO150ACGAGCTCCC GAACCGTACC A21(2)SEQ ID NO151的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO151CTGATATCCG GCGCGCCCAG G21(2)SEQ ID NO152的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO152CGGATATCAG CTCTGGCACC A 21(2)SEQ ID NO153的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO153TCAAGCTTCA TTAGCCTTCC T 21(2)SEQ ID NO154的資料(i)序列特征(A)長度490個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO154CTC CCG AAC CGT ACC AGC GGC CTG CTG GAA ACC AAC TTT ACC GCG AGC48Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser1 5 10 15GCG CGT ACC ACC GGC AGC GGC CTG CTG AAA TGG CAG CAG GGC TTT CGT96Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg20 25 30GCG AAA ATC CCG GGC CTG CTG AAC CAG ACC AGC CGT AGC CTG GAT CAG 144Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln35 40 45ATC CCG GGC TAT CTG AAC CGT ATC CAT GAA CTG CTG AAC GGC ACC CGT 192Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg50 55 60GGC CTG TTT CCG GGC CCG AGC CGT CGC ACC CTG GGC GCG CCG GAT ATC 240Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile65 70 75 80AGC TCT GGC ACC AGC GAT ACC GGC AGC CTG CCG CCG AAC CTG CAG CCG 288Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro85 90 95GGC TAT AGC CCG AGC CCG ACC CAT CCG CCG ACC GGC CAG TAT ACC CTG 336Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu100 105 110TTT CCG CTG CCG CCG ACC CTG CCG ACC CCG GTG GTT CAG CTG CAT CCG 384Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro115 120 125CTG CTG CCG GAT CCG AGC GCG CCG ACC CCG ACC CCG ACC AGC CCG CTG 432Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu130 135 140CTG AAC ACC AGC TAT ACC CAT AGC CAG AAC CTG AGC CAG GAA GGC TAA 480Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser GLn Glu Gly145 145 150TGAAGCTTGA490(2)SEQ ID NO155的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO155AAGGATCCGA ACGCTATCTT CCTG24(2)SEQ ID NO156的資料(i)序列特征(A)長度56個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO156GGGAGCTCGT TCAGGGTCAG AACCAGAGAG GTACGAGACG GAACAGCAGT GGTTGG56(2)SEQ ID NO157的資料(i)序列特征(A)長度157個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO157G GAT CCG AAC GCT ATC TTC CTG TCT TTC CAG CAC CTG CTG CGT GGC 46Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly1 5 10 15AAA GTT CGT TTC CTG ATG CTG GTT GGC GGT TCT ACC CTG TGC GTT CGT94Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg20 25 30CGG GCG CCG CCA ACC ACT GCT GTT CCG TCT CGT ACC TCT CTG GTT CTG 142Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu35 40 45ACC CTG AAC GAG CTC 157Thr Leu Asn Glu Leu50(2)SEQ ID NO158的資料(i)序列特征(A)長度100個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO158CCTCGAGGAA TTCCTGCAGC CCGGGACTAG TATCGGCTAC CCCTACGACG TCCCCGACTA 60CGCCGGCGTC CATCACCATC ACCATCACTG AGCGGCCGCC 100(2)SEQ ID NO159的資料(i)序列特征(A)長度108個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO159AATTGGCGGC CGCTCAGTGA TGGTGATGGT GATGAGCGCC GGCGTAGTCG GGGACGTCGT 60AGGGGTAGCC GATACTAGTC CCGGGCTGCA GGAATTCCTC GAGGGTAC 108(2)SEQ ID NO160的資料(i)序列特征(A)長度70個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO160AATTCCAAGA TCTCACACTT GCTTTTGACA CAACTGTGTT TACTTGCAAT CCCCCAAAAC60AGACAGACCC 70(2)SEQ ID NO161的資料(i)序列特征(A)長度66個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO161GGGTCrGTCT GTTTTGGGGG ATTGCAAGTA AACACAGTTG TGTCAAAAGC AAGTGTGAGA60TCTTGG 66(2)SEQ ID NO162的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO162GGCCCGGGAT GGAGCTGACT GAATTGCTC 29(2)SEQ ID NO183的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO163TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG35(2)SEQ ID NO164的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO164TAATACGACT CACTATAGGG CG 22(2)SEQ ID NO165的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO165AATTCCAAGA TCACACACTT GC22(2)SEQ ID NO166的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO166TCAAGCTTAC TAGTCCCTTC CTGAGACAGA TTCTG35(2)SEQ ID NO167的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO167TGGGCACTGG CTCAGGTTGC TGTGAAGGAC ATGGG35(2)SEQ ID NO168的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO168TGTAGGCAAA GGGGTAACCT CTGGGCA 27(2)SEQ ID NO169的資料(i)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO169Thr Ser Ile Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Val His1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20(2)SEQ ID NO170的資料(i)序列特征(A)長度30個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO170TTTGAArTCG GCCAGCCAGA CACCCCGGCC 30(2)SEQ ID NO171的資料(i)序列特征(A)長度41個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO171TTTGCGGCCG CTCATTATTC GTGTATCCTG TTCAGGTATC C 41(2)SEQ ID NO172的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO172TGTAGGCAAA GGAACCTCTG GGCA24(2)SEQ ID NO173的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO173TGTAGGCAAA GGAGTGTGAA CCTCTGG27(2)SEQ ID NO174的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO174TGrAGGCAAA GGAGCGTGAA CCTCTGG 27(2)SEQ ID NO175的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO175TGTAGGCAAA GGTCCGTGAA CCTCTGG27(2)SEQ ID NO176的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO176AGCTGTGGTC CTCTGTGGAG GAAG24(2)SEQ ID NO177的資料(i)序列特征(A)長度24個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO177GTGAGCTGTG GTGCCCTGTG GAGG 24(2)SEQID NO178的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO178AGCTGTGGTC CTGTTGCCCT GTGGAGG 27(2)SEQ ID NO179的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO179AGCTGTGGTC CTAGCGCCCT GTGGAGG27(2)SEQ ID NO180的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO180AGCTGTGGTC CTTCCGCCCT GTGGAGG 27(2)SEQ ID NO181的資料(i)序列特征(A)長度26個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO181CGGGCTGCAG GATATCCAAG ATCTCA 26(2)SEQ ID NO182的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO182TAATACGACT CACTATACGG CG 22(2)SEQ ID NO183的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型其它核酸(xi)序列描述SEQ ID NO183GGGCGGCCGC TCAGCTGGGG ACAGCTGTGG TGGG34(2)SEQ ID NO184的資料(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_特征(D)其它資料/注釋＝“2位的氨基酸是Ala、Ser、Gly、Met或Gln”(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_特征(D)其它資料/注釋＝“7位的氨基酸是Glu或Lys”(xi)序列描述SEQ ID NO184Lys Xaa Tyr Tyr Glu Ser Xaa1 5(2)SEQ ID NO185的資料(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_特征(D)其它資料/注釋＝“6位上的氨基酸是Glu或Asp”(xi)序列描述SEQ ID NO185Lys Glx Arg Ala Ala Xaa1 5(2)SEQ ID NO186的資料(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO186Lys Ala Gly Xaa Cys Ser Gly1 5(2)SEQ ID NO187的資料(i)序列特征(A)長度13個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_特征(D)其它資料/注釋＝“2位上的氨基酸是Ile、Thr或Ser”(xi)序列描述SEQ ID NO187Lys Xaa Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10(2)SEQ ID NO188的資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO188Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys1 5(2)SEQ ID NO189的資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞misc_特征(D)其它資料/注釋＝“1位上的氨基酸為Lys或Arg”(xi)序列描述SEQ ID NO189Xaa Thr Leu Pro Thr Xaa Ala Val Pro1 5(2)SEQ ID NO190的資料(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO190Lys Asp Ser Phe Leu Ala Asp Val Lys Gln Tyr Tyr Glu Ser Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO191的資料(i)序列特征(A)長度332個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)來源(A)生物體Homo Sapiens(xi)序列描述SEQ ID NO191Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu1 5 10 15Arg Asp Ser His Val Leu Mis Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val20 25 30His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu35 40 45Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu50 55 60Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln65 70 75 80Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln85 90 95Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu100 105 110Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys AsP Pro Asn Ala Ile Phe115 120 125Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu130 135 140Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala145 150 155 160Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn165 170 175Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr180 185 190Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile195 200 205Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly210 215 220Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe225 230 235 240Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly245 250 255Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser260 265 270Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu275 280 285Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro290 295 300Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr305 310 315 320Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325330(2)SEQ ID NO192的資料(i)序列特征(A)長度1086個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA→mRNA(vi)來源(A)生物體Homo Sapiens(xi)序列描述SEQ ID NO192GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG51Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val-21 -20 -15GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT 99Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro-10 -5 1CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT 147Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His5 10 15 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT 195Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro25 30 35ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA 243Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys40 45 50ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC 291Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr55 60 65CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT 339Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr70 75 80TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 387Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu85 90 95 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC 435Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly105 110 115AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA 483Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln120 125 130CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC 531His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser135 140 145ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA 579Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg150 155 l60ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 627Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly165 170 175 180TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly185 190 195CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 723Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu200 205 210AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Ash Arg215 220 225ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA 819Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser230 235 240CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA 867Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr245 250 255 260GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC 915Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr265 270 275CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG 963His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu280 285 290CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT1011Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala295 300 305CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC1059Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His310 315 320TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAA1086Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330(2)SEQ ID NO193的資料(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO193Lys Gln Tyr Tyr Glu Ser Glu1 5(2)SEQ ID NO194的資料(i)序列特征(A)長度1663個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA→mRNA(vi)來源(A)生物體Rattus norvegicuS(H)細胞系McA-RH8994(xi)序列描述SEQ ID NO194GGTGTACCTG GGTCCTGAAG CCCTTCTTCA CCTGGATAGA TTCCTTGGCC CACCTGTCCC 60CACCCCACTC TGTGCAGAGG TACAAAAGCT CAAGCCGTCT CCATGGCCCC AGGAAAGATT120CAGGGGAGAG GCCCCACACA GGGAGCCACT GCAGTCAGAC ACCCTGGGCA GA ATG175Met-21GAG CTG ACT GAT TTG CTC CTG GTG GCC ATA CTT CTC CTC ACC GCA AGA 223Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Val Ala Ile Leu Leu Leu Thr Ala Arg-20 -15 -10 -5CTA ACT CTG TCC AGC CCA GTT CCT CCC GCC TGT GAC CCC AGA CTC CTA 271Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu1 5 10AAT AAA CTG CTT CGT GAC TCC TAC CTC CrT CAC AGC CGA CTG AGT CAG 319Ash Lys Leu Leu Arg Asp Ser Tyr Leu Leu His Ser Arg Leu Ser Gln15 20 25TGT CCT GAC GTC AAC CCT TTG TCT ATC CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG 367Cys Pro Asp Val Ash Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala Val30 35 40GAC TTT AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ACG GAA CAG AGC AAG GCA 415Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys Ala45 50 55 60CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTG TCC CTT CTA CTG GAG GGG GTG ATG GCA 463Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala65 70 75GCA CGA GGA CAG TTG GAA CCC TCC TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGA CAG 511Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Sar Leu Leu Gly Gln80 85 90CTT TCT GGT CAG GTT CGC CTC CTC TTG GGA GCC CTG CAG GGC CTC CTA 559Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu Leu95 100 105GGA ACC CAG GTA AGT CCC CAG ACC TAT AGA AAC TAC CCT CTT ACT CAG 607Gly Thr Gln Val Ser Pro Gln Thr Tyr Arg Asn Tyr Pro Leu Thr Gln110 115 120TTC CTC TAAGGACCTG GGAAAAGACA AGGGATTCTA GATTCTAGGT GTCTTCAGTG 663Phe Leu125TATGAAAGCT GGTCTATACG GAGTGATGCT TCTCAGCCAC AATACCTGGG TGCTGGCAGT 723AAATCTTTCC ACCTTAGTGA GAAGAGGCCT GATATGTGGG CCAACTCACT GGCCTCAGGC 783CCATCCTCTG CCTTCAGCTT CCTCCACAGG GCAGGACCAC AGCTCACAAG GACCCCAGTG 843CCCTCTTCTT GAGCTTGCAA CAACTGCTTC GGGGAAAGGT GCGCTTCCTG CTGCTGGTAG 903AAGGTCCCGC CCTCTGTGTC AGACGGACCC TTCCCACCAC AGCTGTCCCA AGCAGAACCT 963CTCAACTCCT CACACTAAAC AAGTTCCCAA ACAGACTTCT GGATTGTTGG AGACGAACTT 1023CAGTGTTGTA GCCAGAACTG CTGGCCCTGG ACTTCTGAAC AGGCTTCAAG GATTCAGAGC 1083CAAGATTATT CCTGGTCAGC TAAATCAAAC CTCCGGGTCC TTAGACCAAA TCCCTGGATA 1143CCTGAACGGG ACACACGAAC CTGTGAATGG AACTCATGGG CTCTTTGCTG GGACCTCACT 1203ACAGACCCTG GAAGCCCCAG ACGTTGTGCC AGGAGCTTTC AACAAAGGCT CCTTGCCACT 1263CAACCTCCAG AGTGGACTTC CTCCTATCCC AAGCCTTGCT GCTGATGGAT ACACACTTTT 1323CCCTCCTTCA CCTACCTTCC CCACCCCTGG GTCTCCACCC CAGCTCCCCC CCGTTTCCTG 1383ACCCCTCCAC CACCATACCT AACTCTACCA ACCCTCATCC AGGACTTGGT CTCAGTAAGC 1443GTCCCGTGCA CTGGCACGGA GCGCGATCGT CTGCAACATC TCTCAGGGGC AAGCTTCCTC 1503AGGAAGGCTC TGAGGCAGCT CACTAGACAT CCTGCTCTCG CCTAACGGGC CCTGGGAAAG 1563GGATACACAG GCCAGGACAC TGTACAACCT TAGGAGCGAT TTTTTTCTTA ACCTATCAAC 1623AATATTCATC AGAGCAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1663(2)SEQ ID NO195的資料(i)序列特征(A)長度861個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA→mRNA(vi)來源(A)生物體Homo Sapiens(H)組織類型肝臟(xi)序列描述SEQ ID NO195GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG51Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val-21 -20 -15GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT 99Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro-10 -5 1CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT 147Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His5 10 15 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT 195Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro25 30 35ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA 243Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys40 45 50ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC 291Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr55 60 65CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT 339Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr70 75 80TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 387Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu85 90 95 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC 435Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly105 110 115AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA 483Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln120 125 130CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC 531His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser135 140 145ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA 579Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg150 155 160ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 627Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly165 170 175 180TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly185 190 195CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 723Leu Leu Lys Trp Gln Gln G1y Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu200 205 210AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg215 220 225ATA CAC GAA CTC TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 823Ile His Glu Leu230AAAAAAAAAA AAAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA861(2)SEQ ID NO196的資料(i)序列特征(A)長度1267個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA→mRNA(vi)來源(A)生物體Homo Sapiens(H)組織類型肝臟(xi)序列描述SEQ ID NO196GGCCAGCCAG ACACCCCGGC CAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG 51Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val-21 -20 -15GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT99Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro-10 -5 1CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT 147Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His5 10 15 20GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT 195Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro25 30 35ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA 243Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys40 45 50ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC 291Thr Gln Men Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr55 60 65CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT 339Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr70 75 80TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC 387Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu85 90 95 100CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC 435Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly105 110 115AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA 483Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln120 125 130CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC 531His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser
135 140 145ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA 579Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg150 155 160ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 627Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Glyl65 170 175 180TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG 675Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly185 190 195CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG 723Leu Leu Lys Trg Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu200 205 210AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG 771Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asg Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg215 220 225ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA 819Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser230 235 240CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA 867Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr245 250 255 260GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC 915Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr265 270 275CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG 963His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu280 285 290CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT 1011Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala295 300 305CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC 1059Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His310 315 320TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA 1113Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly325 330TTGTCTCATG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGACAAGATT1173TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC TGAAAAGGGA1233ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAA1267(2)SEQ ID NO197的資料(i)序列特征
(A)長度549個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型合成DNA(xi)序列描述SEQ ID NO197CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GCT CCG CCA GCT TGT GAC CTT CGT GTT 48Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val-5 1 5 10CTG TCT AAA CTG CTT CCC GAC TCT CAC GTG CTG CAC TCT CGT CTG TCC 96Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser15 20 25CAG TGC CCG GAA GTT CAC CCG CTG CCG ACC CCG GTT CTG CTT CCG GCT 144Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala30 35 40GTC GAC TTC TCC CTG GGT GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAA GAG ACC AAA 192Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys45 50 55GCT CAG GAC ATC CTG GGT GCA GTA ACT CTG CTT CTG GAA GGC GTT ATG 240Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met60 65 70 75GCT GCA CGT GGC CAG CTT GGC CCG ACC TGC CTG TCT TCC CTG CTT GGC 288Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly80 85 90CAG CTG TCT GGC CAG GTT CGT CTG CTG CTC GGC GCT CTG CAG TCT CTG 336Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu95 100 105CTT GGC ACC CAG CTG CCG CCA CAG GGC CGT ACC ACT GCT CAC AAG GAT 384Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp110 115 120CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG 432Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val125 130 135CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 480Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala140 145 150 155CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG 528Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu160 165 170AAC GAG CTC TAATGAGAAT TC549Asn Glu Leu
權(quán)利要求
1.一種具有特異性刺激或增加血小板生成之生物活性并含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-332的血小板生成素(TPO)多肽或其衍生物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的TPO多肽衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-163。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的TPO多肽衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-232。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的TPO多肽衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-151。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的TPO多肽衍生物，缺失1-6個N末端氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的TPO多肽衍生物，選自[ΔHis33]TPO(1-163)，[ΔArg117]TPO(1-163)和[ΔGly116]TPO(1-163).
7.根據(jù)權(quán)利要求2的TPO多肽衍生物，選自[His33，Thr33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Ala33′，Pro34]TPO(1-163)，[His33，Gly33′，Pro34，Ser38]TPO(1-163)，[Gly116，Asn116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Ala116′，Arg117]TPO(1-163)，[Gly116，Gly116′，Arg117]TPO(1-163)和[Ala1，Val3]TPO(1-163).
8.根據(jù)權(quán)利要求1的TPO多肽衍生物，選自[Thr33，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO和[Asn25，Lys231，Thr333，Ser334，Ile335，Gly336，Tyr337，Pro338，Tyr339，Asp340，Val341，Pro342，Asp343，Tyr344，Ala345，Gly346，Val347，His348，His349，His350，His351，His352，His353]TPO.
9.根據(jù)權(quán)利要求1的TPO多肽衍生物，選自[Asn25]TPO和[Thr33]TPO。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的TPO多肽衍生物，選自[Ala1，Val3，Arg129]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg133]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg143]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu82]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Leu146]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Pro148]TPO(1-163)，[Ala1，Val3，Arg59]TPO(1-163)和[Ala1，Val3，Arg115]TPO(1-163).
11.根據(jù)權(quán)利要求2的TPO多肽衍生物，選自[Arg129]TPO(1-163)，[Arg133]TPO(1-163)，[Arg143]TPO(1-163)，[Leu82]TPO(1-163)，[Leu146]TPO(1-163)，[Pro148]TPO(1-163)，[Arg59]TPO(1-163)和[Arg115]TPO(1-163).
12.根據(jù)權(quán)利要求1的TPO多肽，它與聚合物共價相連。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的TPO多肽，其中所說的聚合物是聚乙二醇。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13的任一權(quán)項的TPO多肽，進一步含有氨基酸Met-2-Lys-1。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-13的任一權(quán)項的TPO多肽，進一步含有Met-1。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-13的任一權(quán)項的TPO多肽，進一步含有Gly-1。
17.含有SEQ ID NO2、4或6的成熟氨基酸序列的多肽。
18.編碼權(quán)利要求1-11、14、15和17的任一權(quán)項的TPO多肽的DNA。
19.用于保證TPO多肽表達的DNA序列，所說的TPO多肽具有特異性刺激或增加血小板生成的生物活性，所說的DNA序列選自(a)SEQ ID NO194、195或196所示的DNA序列或其互補鏈；(b)在嚴格條件下與(a)中所定義的DNA序列雜交的DNA序列或其片段；(c)倘若沒有遺傳密碼的簡并性就將會與(a)和(b)中所定義的DNA序列雜交的DNA序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的cDNA序列。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的基因組DNA序列。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的制備的DNA序列。
23.生產(chǎn)TPO多肽的方法，包括下列步驟(a)在適宜宿主中表達由權(quán)利要求18、19、20、21或22中任一權(quán)項的DNA編碼的多肽，(b)分離所說的TPO多肽。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中被表達的TPO多肽是Met-2-Lys-1多肽，并且進一步包括從所說的分離的TPO多肽中裂解Met-2-Lys-1的步驟。
25.用于保證TPO多肽表達的DNA序列，所說的TPO多肽具有特異性刺激或增加血小板生成的生物活性，所說的DNA進一步編碼凝血酶識別肽5′至TPO多肽編碼序列，并且編碼谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)5′至凝血酶識別肽。
26.權(quán)利要求25的DNA序列，用于保證TPO多肽表達，所述TPO多肽含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-174。
27.生產(chǎn)具有特異性刺激或增加血小板生成之生物活性的TPO多肽的方法，包括下列步驟a)在適宜的宿主中表達由權(quán)利要求25或26的DNA編碼的多肽，b)分離所說的GST-(凝血酶識別肽)-TPO多肽，c)用凝血酶處理所說的被分離的GST-(凝血酶識別肽)-TPO多肽，d)分離Gly-1-TPO多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中Gly-1-TPO多肽是[Gly-1]TPO(1-174)。
29.根據(jù)權(quán)利要求27或28的方法，其中所分離的Gly-1-TPO多肽是TPO衍生物，含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-174。
30.由權(quán)利要求23、24、27、28或29的方法所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
31.用根據(jù)權(quán)利要求18、19、20、21、22、25或26的任一權(quán)項的DNA序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的原核或真核宿主細胞，所說的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染是以能使所說的宿主細胞表達一種具有特異性刺激或增加血小板生成之生物活性的多肽的方式進行的。
32.一種藥物組合物，含有效量的權(quán)利要求1-16和30中的任一權(quán)項的多肽和藥用載體。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的藥物組合物，用于治療血小板紊亂。
34.根據(jù)權(quán)利要求32的藥物組合物，用于治療血小板減少癥。
35.根據(jù)權(quán)利要求34的藥物組合物，用于治療由化療、放療或骨髓移植誘發(fā)的血小板減少癥。
36.治療血小板紊亂的方法，包括給患有所說紊亂的患者施用有效量的權(quán)利要求1-16和30中的任一權(quán)項的多肽。
37.治療血小板減少癥的方法，包括給血小板減少癥患者施用有效量的權(quán)利要求1-16和30中的任一權(quán)項的多肽。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，治療由化療、放療或骨髓移植所誘發(fā)的血小板減少癥。
39.與權(quán)利要求1-16和30中的任一權(quán)項的多肽有特異性免疫反應的抗體。
40.權(quán)利要求39的抗體用于分離權(quán)利要求1-16和30中的任一權(quán)項的多肽的應用。
41.權(quán)利要求39的抗體用于定量分析權(quán)利要求1-16和30中的任一權(quán)項的多肽的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有特異性刺激或增加血小板生成之生物活性并含有SEQ ID NO6氨基酸序列的1-332的血小板生成素(TPO)多肽或其衍生物，涉及編碼TPO多肽的DNA分子、生成所說多肽的方法、與所說多肽有特異性免疫反應的抗體以及用所說多肽治療血小板紊亂如血小板減少癥的方法。
文檔編號C07K14/435GK1131438SQ95190305
公開日1996年9月18日 申請日期1995年2月14日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月14日
發(fā)明者宮崎洋, 加藤尚志, 大上欽也, 巖松明彥, 赤堀弘典, 黑木良太, 清水敏之, 武藤隆則 申請人:麒麟麥酒株式會社