專利名稱：多腫瘤抑制因子基因種系突變及檢測該基因癌腫傾向性的方法
與相關申請的關系本發(fā)明是專利申請No.08/251,938(1994年6月1日申請)、08/215,087(1994年3月18日申請)和08/215,086(1994年3月18日申請)的部分續(xù)展申請，上述專利申請在此引用作為參考。專利申請No.08/251,938又是專利申請No.08/227,369(1994年4月14日申請)的部分續(xù)展申請，而專利申請No.08/227,369又是專利申請No.08/214,582(1994年3月18日申請)的部分續(xù)展申請，這些專利申請也在此引用作為參考。發(fā)明背景本發(fā)明涉及人癌腫中多腫瘤抑制因子(Multiple Tumor Sup-pressor，簡稱MTS)基因的體細胞突變及其在人癌腫的診斷和預后方面的應用。本發(fā)明還涉及MTS基因的種系(germline)突變及其在診斷癌腫發(fā)生的傾向方面的應用，這些癌腫包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫。本發(fā)明還涉及MTS基因突變的人癌腫的治療，其中包括基因治療、蛋白質置換治療和蛋白質模擬物(mimetics)。最后，本發(fā)明還涉及篩選用于癌腫治療的藥物。
此處用來說明本發(fā)明的背景、尤其用來對實施提供額外的細節(jié)出版物和其他材料，在本申請中結合引用作為參考，并且為了方便起見，在下面的文章中指出而且分別歸類在所附的文獻清單中。
癌腫遺傳學非常復雜，涉及多個顯性的、轉化狀態(tài)的正調(diào)節(jié)物(癌基因)以及多個隱性的、負調(diào)節(jié)物(腫瘤抑制基因)。已經(jīng)確定了超過100種的癌基因。被鑒定的腫瘤抑制基因還不到12種，但是據(jù)估計該數(shù)目會增加至超過50種(Knudson，1993)。
牽涉這么多基因強調(diào)了在細胞中為了維持正常組織的完整性而發(fā)揮作用的生長調(diào)控機制的復雜性。這種復雜性還通過另一種方式體現(xiàn)。迄今為止，還沒有單個基因參與所有的、或者絕大多數(shù)的人癌腫的進程。最常見的癌基因突變是在H-ras基因中，在所有實體瘤的10—15％中有此種突變發(fā)現(xiàn)(Anderson et al.，1992)。突變頻率最高的腫瘤抑制基因是p53基因，在約50％的所有腫瘤中發(fā)生突變。沒有一個共同的針對所有轉化細胞的靶目標，就不可能尋找到能夠摧毀或逆轉癌細胞而又不損害正常細胞的“魔彈”。新一代特異性導向式抗腫瘤藥物的希望便寄托在能夠鑒定出在細胞分裂調(diào)控中起普遍作用的腫瘤抑制基因或癌基因。
已經(jīng)克隆和確定的腫瘤抑制基因影響下列癌腫的易感性1)成視網(wǎng)膜細胞瘤(RB1)；2)Wilm氏瘤(WT1)；3)Li-Fraumeni(TP53)；4)家族性腺瘤息肉癥(APC)；5)I型神經(jīng)纖維瘤病(NF1)；6)II型神經(jīng)纖維瘤(NF2)；7)von Hippel-Lindau綜合征(VHL)和8)2A型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病(MEN2A)。
已經(jīng)確定遺傳圖譜但還沒有被分離的腫瘤抑制因子的基因座包括下列基因I型多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤病(MEN1)；II型Lynch癌家族性綜合征(LCFS2)；家族性乳房癌(BRCA1)；神經(jīng)母細胞瘤(NB)；基底細胞痣綜合征(BCNS)；Beckwith-Wiedemann綜合征(BWS)；腎細胞癌(RCC)；I型結節(jié)性硬化(TSC1)和II型結節(jié)性硬化(TSC2)。目前已經(jīng)定性的腫瘤抑制基因編碼產(chǎn)物與多種蛋白質類型具有相似性，其中包括DNA結合蛋白(WT1)、輔助性轉錄調(diào)節(jié)蛋白(RB1)、GTP酶活化蛋白(又稱為GAP)(NF1)、細胞骨架組份(NF2)、膜結合受體激酶(MEN2A)，其他的編碼產(chǎn)物與已知的蛋白質沒有明顯的相似性(APC和VHL)。
在大多數(shù)情況下，最初通過遺傳研究而鑒別的腫瘤抑制基因已表明在某些偶發(fā)的腫瘤中是缺失的或突變的。該結果暗示，染色體異常的區(qū)域可以表明在癌腫的遺傳傾向和偶發(fā)癌腫中所涉及重要的腫瘤抑制基因的位置。
迄今為止確定的數(shù)種腫瘤抑制基因的特征之一是它們在某些腫瘤類型中高頻率地缺失。缺失常常涉及失去一個等位基因，即所謂的雜合性丟失(loss of heterozygosity，簡稱LOH)，但是也涉及兩個等位基因的純合缺失(homozygous deletion)。對于LOH，余下的等位基因被認為不起作用，其原因或者是因為已有的遺傳突變，或者是因為第二次的偶發(fā)突變。
黑素瘤是一種常見的癌腫，每100個美國人中有1人得此病(American Cancer Society，1992)。環(huán)境影響如暴露于紫外線對于黑素瘤的發(fā)生起重要作用，但是遺傳也是決定因素。家族性黑素瘤的一個基因即MLM，已經(jīng)被定位于染色體9p21(Cannon-Albright etal.，1992；Nancarrow et al.，1993；Gruis et al.，1993；goldsteinet al.，1994)。如果MLM基因座具有一個傾向性的等位基因，則患黑素瘤的可能性增加約50倍。MLM是數(shù)目日益增長的腫瘤抑制基因家族中的一員。黑素瘤的傾向性按顯性孟德爾性狀進行遺傳，但是傾向性的MLM突變被認為按最初由Knudson(1971)提出的方式呈現(xiàn)為體細胞的隱性等位基因。在攜帶一個野生型和一個突變型MLM等位基因的傾向性個體中，分裂的細胞經(jīng)過了第二次的突變事件，該事件涉及MLM野生型拷貝的丟失或失活，從而暴露出可遺傳的突變型MLM等位基因。相反，單一的野生型拷貝基因可以防止發(fā)生惡性腫瘤。
在9p21處MLM附近的染色體異常已經(jīng)廣泛地在幾種不同的腫瘤類型中被確定，包括神經(jīng)膠質瘤細胞系、非小細胞肺細胞系和急性成淋巴細胞白血病細胞系(Olopade et al.，1992；Olopade et al.，1993；Lukeis et al.，1990；Diaz et al.，1991；Middleton et al.，1991；Fountain et al.，1992；Cheng et al.，1993；James et al.，1993)。因此，依據(jù)在非黑素瘤腫瘤細胞中9p21染色體異常的頻率，MLM區(qū)域可能含有一個(或多個)參與至少幾種不同腫瘤類型進展的基因。這些事件涉及LOH以及高頻率的純合缺失。
組織中的細胞在一生中只有三種重要的選擇生長并分裂，不生長但維持活著，或者細胞程序死亡。不適當?shù)纳L和分裂或者細胞在該死亡的時候而不死亡都會導致腫瘤。一種控制腫瘤生長的機制是直接調(diào)控細胞周期。例如，那些控制決定引發(fā)DNA復制的基因是癌基因或腫瘤抑制基因的有力候選者，其取決于它們在該過程中起刺激還是抑制作用。在細胞周期(G1，S，G2和M期)中，真核細胞的進程被一系列細胞周期蛋白(cyclin)/依賴細胞周期蛋白的激酶(cyclin-dependent kinase，簡稱Cdk)復合物的依次地形成、激活和隨后失活所控制。已表明，細胞周期蛋白D′s/Cdk2，4，5、細胞周期蛋白E/Cdk2、細胞周期蛋白A/Cdk2和細胞周期蛋白B/A/Cdk2涉及該過程。細胞周期蛋白D′s和Cdk2、Cdk4和Cdk5涉及從G1向S的轉變，即當細胞生長并決定是否開始DNA復制的時候。最近還發(fā)現(xiàn)了其他的細胞周期調(diào)控因子。這些因子是Cdk抑制劑(Cdkinhibitors，簡稱CkI)，其中包括Farl、p21、p40、p20和p16(Marx，1994；Nasmyth & Hunt，1993)。
最近發(fā)現(xiàn)，幾種癌基因和腫瘤抑制基因直接參與細胞周期。例如，細胞周期蛋白(促進DNA復制的蛋白質)中的一種是作為癌基因參與的(Motokura et al.，1991；Lammie et al.，1991；Witherset al.，1991；Rosenberg et al，1991)，而腫瘤抑制因子Rb與主要的細胞周期蛋白配偶體即Cdk發(fā)生作用(Ewen et al.，1993)。鑒別黑素瘤的易感性基因座將打開個體遺傳篩選的路徑，從而可以評估例如由于暴露于陽光下而導致癌腫的高危險率。MTS還使人傾向于發(fā)生大量其他癌腫，這些癌腫包括但并不限于白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫。此外，因為MTS影響幾種不同的腫瘤類型的進展，因此它能用于確定癌腫病人的預后。因此，MTS可以作為發(fā)展非常重要的診斷測試的基礎，人們可以預測發(fā)生癌腫(如黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫)的傾向，而且人們還能預測癌腫的預后。此外，因為MTS涉及多腫瘤類型的進程，因此MTS可以因其抑制腫瘤生長能力而直接或間接地提供通用的抗癌腫治療的手段。例如將腫瘤細胞恢復成具有正常的MTS功能，可以將其改變成非惡性。發(fā)明概述本發(fā)明涉及人癌腫中的多腫瘤抑制因子(Multiple TumorSuppressor，簡稱MTS)基因的體細胞突變及其在人癌腫的診斷和預后方面的應用。本發(fā)明還涉及MTS基因的種系突變及其在診斷許多種癌腫發(fā)生的傾向方面的應用，這些癌腫包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫。本發(fā)明還涉及MTS基因突變的人癌腫的治療，其中包括基因治療、蛋白質置換治療和蛋白質模擬物。最后，本發(fā)明涉及篩選用于癌腫治療的藥物。附圖的簡述

圖1A顯示親緣族3137。所有的黑素瘤患者都攜帶易感單倍型(haplotype)。還標明了攜帶易感單倍型的個體中的其他癌腫。說明符號如下實心圓圈或正方形表示黑素瘤；部分實心圓圈或正方形表示其他癌腫；“/”表示已去世；“*”表示不知道該個體是否攜帶易感單倍型；“**”表示該個體似乎攜帶易感單倍型和“35”表示若患病情況下檢查或診斷時的年齡。
圖1B顯示親緣族3161。所有的黑素瘤患者都攜帶易感單倍型。對其他癌腫沒有確定單倍型。說明符號如下實心圓圈或正方形表示黑素瘤；部分實心圓圈或正方形表示其他癌腫；“/”表示已去世；“＝”表示在親緣族中的其他地方出現(xiàn)；五邊形中的“3”表示有多次婚姻和“35”表示若患病情況下檢查或診斷時的年齡。
圖1C顯示了親緣族3355。所有的黑素瘤患者都攜帶易感單倍型。對其他癌腫沒有確定單倍型。說明符號如下實心圓圈或正方形表示黑素瘤；部分實心圓圈或正方形表示其他癌腫；“/”表示已去世和“35”表示若患病情況下檢查或診斷時的年齡。
圖1D顯示了親緣族1771以及黑素瘤和其他癌腫的發(fā)生情況。在該親緣族中，在MTS上鑒別到一個突變。說明符號如下“*”表示確認的突變攜帶者；實心圓圈或正方形表示黑素瘤；部分實心圓圈或正方形表示其他癌腫(在該親緣族中為結腸癌)；“/”表示已去世和“35”表示若患病情況下檢查或診斷時的年齡。
圖2為酵母人工染色體(YAC)和P1克隆兩側鄰接IFNA-s和D9S171的區(qū)域。著絲點在右側。對于P1克隆，箭頭指出了在該載體中T7啟動子序列的方向。組合一起的YAC表示，根據(jù)在區(qū)域中對序列標志位點(STS)的定位，這些克隆是相似的。這些YAC被假定是不完全相同的。YACA5、B11、C6和F9含有IFN-1和IFN-s。YACD1、F5和E3含有D9S126和D9S171。沒有顯示出含有D9S171的YAC的近端和含有IFNA-s的YAC的遠端。距離沒有嚴格地按比例繪制。在圖2中標出了位于IFNA-s和D9S171內(nèi)部的標記。以“c”開始的標記從粘性質粒(cosmid)末端序列衍生而得。沒有標出粘性質粒。在c1.b和c5.3之間以及760-L和D9S171之間的距離不詳。
圖3為在黑素瘤細胞系中觀察到的缺失圖。根據(jù)一系列缺失的標記，缺失被分成12類。十一個細胞系缺失了圖中所繪的全部標記，這種類型沒有標出。其他12類中每一類的代表數(shù)目被列在“#系”欄目中。1-10類的缺失斷點位置被描繪在落于與缺失的DNA相鄰的標記處，即為延伸至缺失處的一系列標記中的最后的陽性標記。對于第11類和第12類，缺失的位置用實心的三角形標出。
圖4A為粘性質粒c5圖。用于缺失分析的相關STS和粘性質粒及其P1一起被標出。c1.b標記位于P1-1062的近端并且沒有標出。MTS1和MTS2的轉錄方向用箭頭標出。
圖4B為粘性質粒c5的限制性圖譜和STS圖。用粗線標出MTS1和MTS2的編碼外顯子的位置?！癊1”和“E2”分別表示“編碼外顯子1”和“編碼外顯子2”?！癇”是BamHI，“S”是SalI，“R1”是EcoRI和“R5”是EcoRV。
圖5A和5B是含有5′不翻譯區(qū)域、外顯子1和部分內(nèi)含子1的MTS1基因組序列和已公布p16序列(Serrano et al.，1993)之間的比較。起始密碼子(帶下劃線)位于891位，而拼接位置(箭頭)位于1016位。在圖5A-B中所示的MTS1序列為SEQ ID NO3。在圖5B中所示的p16序列為SEQ ID NO24。
圖6A和6B是含有部分內(nèi)含子1、外顯子2和部分內(nèi)含子2的MTS1基因組序列和已公布的p16序列(Serrano et al.，1993)之間的比較。拼接位置(箭頭)在192位之前和498位之后。在圖6A-B中所示的MTS1序列為SEQ ID NO4。在圖6A中所示的p16序列與SEQ ID NO4的核苷酸192-498位相同。
圖7A和7B是含有部分內(nèi)含子1、“外顯子2”及隨后序列的MTS2基因組序列和已公布的p16序列之間的比較?！巴怙@子2”序列與MTS1的外顯子2在核苷酸273-580位之間很相似。MTS2和p16中的拼接位置用箭頭標出。開始趨異(divergence)的位點用“°”表示。MTS2的終止密碼子位于外顯子2的532位并用“*”表示。在圖7A-B中所示的MTS2序列為SEQ ID NO5。在圖7A中所示的p16序列與SEQ ID NO4的核苷酸192-498位相同。
圖8是MTS1和MTS2之間DNA序列的比較，包括外顯子2和部分周圍的內(nèi)含子。對于MTS1，內(nèi)含子1的3′拼接位置和內(nèi)含子2的5′拼接位置用三角形標出。靠近編碼外顯子2的3′端的趨異點用箭頭標出。所示的MTS1序列對應于SEQ ID NO4的核苷酸92-548位。所示的MTS2序列對應于SEQ ID NO5的核苷酸174-630位。
圖9顯示了在不同的STS的腫瘤細胞系中的缺失情況。每次PCR實驗包括陽性對照和陰性對照，而且僅有一個或二個STS缺失的細胞系(例如第21類)至少重復測試兩次。
圖10A-C為MTS2 mRNA的表達。圖10A顯示了在得自不同的人組織RNA(Clonetech)中的MTS2轉錄物的相對水平道1-腦；道2-乳房；道3-腎；道4-肺；道5-淋巴細胞；道6-卵巢；道7-胰腺；道8-前列腺；道9-脾；道10-胃；道11-胸腺。具有不同于預期分子量的產(chǎn)物的起因不明(見道1)。圖10B顯示了在誘導分裂之后的時間函數(shù)方面人淋巴細胞中相對的MTS2的轉錄物水平道1-0小時；道2-1小時；道3-2小時；道4-4小時；道5-8小時；道6-16小時；道7-24小時；道8-32小時；道9-40小時；道10-48小時；道11-56小時；道12-64小時。在誘導后40-50小時之間，絕大多數(shù)的細胞處于S期。圖10C顯示了以Rb狀態(tài)作為函數(shù)時MTS2的轉錄物水平。Rb+細胞系是道1-KIT(Hori et al.，1987)；道2-二倍體人成纖維細胞MRC5，通道28；道3-UMSCC2；道4-Bristol8；道5-ZR75；道6-HaCaT；道7-T24。Rb-細胞系是道8-MDA MB 468；道9-5637；道10-C33A；道11-SiHa；道12-CaSki；道13-WERI。
圖11為包括5′不翻譯區(qū)域在內(nèi)的MTS2的cDNA序列(以及編碼的多肽)。外顯子2的起始位于491位，并且用箭頭表示。cDNA序列為SEQ ID NO15，而氨基酸序列為SEQ ID NO16。
圖12A和12B顯示了MTS1E1β的cDNA序列(以及編碼的多肽)。拼接位點用箭頭表示。外顯子2的起始位于335位，外顯子3從642位開始。cDNA序列為SEQ ID NO13，而氨基酸序列示于SEQID NO14。
圖13是p16區(qū)域的物理圖。外顯子1α(E1α)、外顯子1β(E1β)、外顯子3(E2)和外顯子3(E3)用實心盒表示。還標出了Eco RI(RI)、Eco RV(RV)和Sal I(S)的限制性酶切位點。在限制性圖譜上方的是基因組克隆粘性質粒c5和P11063。在下方的是細胞系A375和SK-mel93中的缺失。虛線表示缺失的DNA。
圖14是小鼠和人的p16β轉錄物序列的排列情況。大寫字母表示相同的核苷酸。p16閱讀框中的終止密碼子用下劃線標出。E1β和E2之間的拼接用脫字號(v)表示。小鼠β序列為SEQ ID NO25。人β序列與SEQ ID NO13中的核苷酸193-461位相同。
圖1 5是在含有E1β缺失的細胞系中α轉錄物的表達情況。用從所示樣品中分離得的總RNA而衍生得到cDNA。在反應中加入放射性標記的引物以擴增p16轉錄物?；旌系攘康摩梁挺聰U增產(chǎn)物，產(chǎn)物在5％變性聚丙烯酰胺凝膠中分離道1-靜止的T細胞；道2-細胞系SK-mel93；道3-細胞系A375。
圖16A-D為p16轉錄物的表達。在反應中加入放射性標記的引物以擴增p16轉錄物，而且產(chǎn)物在5％變性聚丙烯酰胺凝膠中分離。在圖16A和16D中，在電泳之前將來自共同樣品的α和β反應物混合。圖16A顯示了來自不同的人組織RNA中的p16轉錄物的相對水平道1腦；道2乳房；道3腎；道4肺；道5淋巴細胞；道6卵巢；道7胰腺；道8前列腺；道9脾；道10胃；道11胸腺。圖16B顯示了在誘導分裂之后的時間函數(shù)方面人淋巴細胞中β轉錄物的相對量道10小時；道21小時；道32小時；道44小時；道58小時；道616小時；道724小時；道832小時；道940小時；道1048小時；道1156小時；道1264小時。圖16C顯示了在誘導分裂之后的時間函數(shù)方面人淋巴細胞中α轉錄物的相對量，各道與圖16B相同，但是縮短了1小時。還分析了其他分子的表達，這些分子或者可能影響細胞周期的進程，或者在細胞周期中的轉錄水平被調(diào)節(jié)。與以前的結果一致，一旦誘導T細胞，Cdk4和GoS2(一種功能不明的分子，但是當靜止T細胞進入細胞周期時，其轉錄被誘導。)的水平就增加(Russell and Forsdyke，1991；Matsushime et al，1992；Gengand Weinberg，1993)。相反，在實驗過程中p27的RNA水平似乎沒有變化(Toyoshima and Hunter，1994；Kato et al.，1994)。圖16D顯示了以Rb狀態(tài)作為函數(shù)時p16的轉錄物。Rb-細胞系是道1WERI；道2CaSki；道3SiHa；道4C33A；道55637；道6MDAMB468。Rb+細胞系是道7T24；道8HaCaT；道9Zr75；道10Bristol8；道11UMSCC2；道12二倍體人成纖維細胞MRC5；道13，KIT(Hori et al.，1987)。
圖17為包括cDNA的非編碼部分在內(nèi)的MTS1的cDNA序列。三角形表示拼接處。在第二個拼接處的序列中虛線僅僅是強調(diào)該拼接處，并不表示缺失堿基。該序列是SEQ ID NO36。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及人癌腫中的多腫瘤抑制因子(MTS)基因的體細胞突變及其在人癌腫的診斷和預后方面的應用。本發(fā)明還涉及MTS基因的種系突變及其在診斷各種不同的癌腫發(fā)生的傾向方面的應用，這些癌腫包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞瘤、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫。本發(fā)明還涉及MTS基因突變的人癌腫的治療，其中包括基因治療、蛋白質置換治療和蛋白質模擬物。最后，本發(fā)明涉及篩選用于癌腫治療的藥物。
本發(fā)明提供一種分離的多聚核苷酸，它含有全部或部分MTS基因座或突變的MTS基因座，其長度較佳地為至少8個堿基并且不超過約100個千堿基對。該多聚核苷酸可以是反義多聚核苷酸。本發(fā)明還提供一種含有這種分離的多聚核苷酸的重組構建物，例如適用于在轉化的宿主細胞中表達的重組構建物。
本發(fā)明還提供了在分析物中檢測含有部分MTS基因座的多聚核苷酸或其表達產(chǎn)物的方法。該方法還可包括擴增部分MTS基因座的步驟，也可以再包括提供一套作為擴增該部分MTS基因座的引物。該方法可以用于診斷患癌腫的傾向或用于癌腫的診斷或預后。
本發(fā)明還提供分離的抗體，較佳地為單克隆抗體，它們能特異性地與分離的、含有至少5個由MTS基因座編碼的氨基酸殘基的多肽結合。
本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測含有部分MTS基因座的多聚核苷酸的試劑盒，該試劑盒包括包裝在適當容器中的與部分MTS基因座互補的多聚核苷酸以及使用說明。
本發(fā)明還提供了制備含有聚合核苷酸的多聚核苷酸方法，從而產(chǎn)生含有至少8個連續(xù)的MTS基因座的核苷酸序列；還提供了含有聚合氨基酸的多肽的制法，從而產(chǎn)生含有至少5個由MTS基因座編碼的氨基酸。
此外，本發(fā)明提供了篩選用于癌腫治療的藥物的方法，以便鑒別出合適的、能恢復MTS基因產(chǎn)物功能的藥物。
最后，本發(fā)明提供了針對癌腫細胞的基因治療法所需的手段。這些治療試劑可以利用含有全部或部分MTS基因座的多聚核苷酸，將其置于合適的載體或用更直接的方法將其送遞入該靶細胞，從而恢復MTS蛋白質的功能。治療試劑也可以利用基于部分或全部MTS蛋白質序列的多肽。從而使其在體內(nèi)在功能上替代MTS的活性。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，使個體傾向患黑素瘤和其他癌腫的MTS基因座(在已有技術中稱為黑素瘤(MLM)基因座)是編碼MTS1的基因，已發(fā)現(xiàn)它是Cdk尤其是Cdk4的抑制劑。此處該基因被稱為MTS1。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，MTS基因座含有被稱為MTS2的第二編碼序列，它與MTS1在部分序列上非常相似。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，MTS1基因有兩個啟動子-α和β。當使用α啟動子時，得到的mRNA由外顯子1α、外顯子2和外顯子3構成。這被稱為MTS1。當使用β啟動子時，得到的mRNA由外顯子1β、外顯子2和外顯子3構成。這被稱為MTS1E1β。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在種系中MTS基因座的突變表示存在患黑素瘤和其他癌腫的傾向。最后，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，MTS基因座的體細胞突變與大多數(shù)(如果不是全部的話)腫瘤類型有關，因此是癌腫或癌腫預后的一般性標記。MTS基因座的突變事件涉及編碼序列和非編碼序列中的缺失、插入和點突變。
MLM基因座最早是用遺傳學方法，通過幾個猶他州的親緣族和一個德克薩斯州的親緣族在遺傳標記和黑素瘤傾向之間的顯著連鎖而定位的(Cannon Albright，1992)。在親緣族中通過重組子所界定的區(qū)域的兩側為D9S736和D9S171。隨后，這些及其他的遺傳標記被用于基因定位，即通過分析含有缺失的黑素瘤和非黑素瘤細胞系中純合缺失情況。最小的缺失重疊區(qū)域的兩側為IFNA-s和D9S171。篩選YAC文庫以鑒別在這些標記周圍的基因組克隆。P1克隆由染色體步移(chromosomal walk)的部分而分離，并且除了有兩個間隔外，鄰接IFNA-s至D9S171。制備特異序列標志位點(specific sequence-tagged site，STS)以構建更詳細的分子圖譜。使用這些標記和缺失分析，在粘性質粒5(c5)中發(fā)現(xiàn)以標記c5.1和c5.3為兩側的中心缺失重疊區(qū)域。缺失頻率最高的標記是c5.3，它非?？拷麺TS。
對c5是否存在“CpG”島進行分析表明，它含有至少一個MTS的候選基因。確定了c5的EcoRI片段的DNA序列并且與GenBank的序列進行比較。鑒別出兩個獨特的c5區(qū)域，它們與以前鑒別的編碼人Cdk4抑制劑的基因即p16(Serrano et al.，1993)的區(qū)域相似。這兩個候選基因被稱為MTS1和MTS2。用來自MTS1外顯子2的探針篩選淋巴細胞、胎兒腦及正常乳房的cDNA文庫，鑒別出另一候選基因MTS1E1β。
c5基因組序列和p16mRNA序列的詳細比較揭示，MTS1含有一307bp片段，該片段與部分p16編碼序列相同。MTS1中的該核苷酸片段的兩側為可識別的拼接序列。對MTS1的進一步研究表明，它包括p16的全部編碼序列和兩個內(nèi)含子。內(nèi)含子1位于翻譯起始位置下游126bp處；內(nèi)含子2位于翻譯終止位置下游11bp處。這兩個內(nèi)含子將p16的編碼序列分成3個區(qū)域126bp的5′區(qū)域(編碼外顯子1)、307bp的中間區(qū)域(編碼外顯子2)和11bp的3′區(qū)域(編碼外顯子3)。
MTS2含有一個與p16幾乎相同的DNA序列，它從編碼外顯子2的5′端向內(nèi)含子2延伸約200bp。然而，序列的相似性在MTS1的內(nèi)含子2上游51bp處減弱，此處兩種序列完全趨異。這對應于MTS2的最終密碼子的位置。MTS1和MTS2的序列比較表明，兩種基因之間的序列相似性還從內(nèi)含子1的3′拼接處的上游延伸近50個核苷酸。因此，非編碼DNA比假定的編碼DNA的某些區(qū)域更保守。為了排除編碼DNA中的序列趨異是由于克隆假象的可能性，設計特異性地擴增跨越MTS2的序列趨異點的PCR引物。這些引物從粘性質粒P1和基因組DNA中擴增出預定大小的片段。因此，位于靠近MTS2外顯子2的3′端的趨異序列的確是基因組序列。
MTS1E1β含有外顯子1，該外顯子稱為外顯子1β或E1β，它具有不同于MTS1和MTS2的外顯子1的序列。MTS1E1β還含有與MTS1的外顯子2和外顯子3相同的外顯子2(E2)和外顯子3(E3)。外顯子1β位于MTS1的外顯子1的上游并且不含有任何編碼序列。結果，MTS1E1β編碼翻譯起始位置位于外顯子2的第一個ATG處的p10。
利用外顯子2，通過分析假定攜帶MLM傾向性等位基因的個體基因組DNA而來測試MTS1和MTS2與遺傳易感性基因座MTS的相關性。8個個體中有一個個體的MTS1外顯子2中鑒別出DNA多態(tài)性。該突變是單一的核苷酸置換，造成一個氨基酸變化。該多態(tài)性和MLM傾向性等位基因一起分離。
MTS1中的損傷(缺失和核苷酸置換)優(yōu)勢表明，MTS1或某個緊密連鎖的基因座導致腫瘤表型。受到這些損傷的細胞比沒有受到損傷的細胞具有選擇優(yōu)勢。另一種解釋認為這些損傷是與細胞生長無關的隨機事件，該解釋是不可能的。原因在于，首先，在腫瘤表型和MTS1突變之間的高相關性暗示在MTS1突變和腫瘤形成之間存在因果關系。其次，MTS1影響黑素瘤的易感性，因此它具有獨立地作為腫瘤抑制基因的意義。再者，作為Cdk的強抑制劑p16的生物化學功能與MTS1在體內(nèi)作為DNA復制起始的通用抑制劑而發(fā)揮作用的模式很好地相符。
根據(jù)本發(fā)明的診斷和預后方法，可以檢測野生型MTS基因座的變化。此外，該方法還可以通過檢測野生型MTS基因座和證實缺乏傾向性或瘤形成而進行。“野生型基因的改變”包含所有形式的突變，包括在編碼區(qū)域和非編碼區(qū)域的缺失、插入和點突變。缺失可以是整個基因或只是部分基因的缺失。點突變可以造成終止密碼子、移碼突變或氨基酸置換。體細胞突變是僅發(fā)生在某些組織如腫瘤組織中的突變，不會在種系中遺傳。種系突變可以在任一身體組織中找到而且是遺傳的。若僅有一個單一的等位基因呈體細胞突變，那么說明是處于早期瘤形成狀態(tài)。然而，若兩個等位基因都突變，那么說明是處于晚期瘤形成狀態(tài)。因此，MTS突變的發(fā)現(xiàn)可以提供診斷和預后信息。可以對沒有缺失的MTS等位基因(即在作為攜帶MTS缺失染色體的姐妹染色體上的MTS等位基因)進行篩選，以確定是否有其他的突變?nèi)绮迦搿⑿∪笔Ш忘c突變。據(jù)信，在腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的許多突變導致MTS基因產(chǎn)物表達下降。但是，導致無功能的基因產(chǎn)物的突變也會產(chǎn)生癌腫。點突變事件可以發(fā)生在調(diào)控區(qū)域如在基因的啟動子中，從而導致mRNA表達的消失或下降。點突變還會破壞適當?shù)腞NA加工，從而導致MTS基因產(chǎn)物表達的消失或者導致mRNA穩(wěn)定性或翻譯效率的下降。
有用的診斷技術包括，但并不限于熒光原位雜交(FISH)、直接DNA測序、脈沖電場凝膠電泳(PFGE)分析、Southern印跡分析、單鏈構象分析(SSCA)、核糖核酸酶(RNase)保護測定、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)、點雜交分析和聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)，下文將更詳細地描述。
患癌腫如黑素瘤和其他此處指出的癌腫的傾向，可以通過測試任何人組織的MTS基因的突變而確定。例如，一個遺傳有種系MTS突變的人將易患癌腫。這一點可以通過測試來自該個體的任何身體組織中的DNA而確定。最簡單地，可以抽取血液并且從血細胞中抽提出DNA。此外，通過檢測胎兒細胞、胎盤細胞或羊水是否有MTS基因的突變可以進行產(chǎn)前診斷。例如由點突變或缺失而造成的野生型MTS等位基因的改變可以用此處所述的任一手段檢測出。
為了在組織中檢測野生型MTS基因的改變，須將該組織分離出而不含周圍正常組織。富集含腫瘤細胞的組織制品的方法是本領域中公知的。例如，可以從石蠟或低溫恒溫器的切段中分離組織。還可以用流式細胞計量術將癌腫細胞與正常細胞分開。這些技術以及其他將腫瘤細胞和正常細胞分開的技術是本領域中公知的。如果腫瘤組織被正常細胞嚴重污染，那么突變的檢測將變得更困難。
一種檢測DNA序列多態(tài)性的快速的初步分析法是觀察一系列用一個或多個限制性內(nèi)切酶、更佳地是用大量限制性內(nèi)切酶消化的DNA的Southern印跡。每張印跡片含有一系列的正常個體和一系列的癌腫病例。顯示出雜交片段的Southern印跡(當用靠近或含有MTS基因座的序列作為探針雜交時，在長度上會與對照DNA有差別。)表明可能存在一個突變。如果使用會產(chǎn)生非常大的限制性片段的限制性內(nèi)切酶時，那么可以使用脈沖電場凝膠電泳(PFGE)。
點突變的檢測可以用本領域中公知的技術進行MTS等位基因的分子克隆并對該等位基因測序而實現(xiàn)?；蛘?，可以用已有技術對來自腫瘤組織的基因組DNA制品直接擴增基因序列。然后再確定擴增序列的DNA序列。
有6種已知的、比較完整的但仍不是直接的測試方法可以確定易感性等位基因的存在1)單鏈構象分析(SSCA)(Orita et al.，1989)；2)變性梯度凝膠電泳(DGGE)(Wartell et al.，1990)；3)RNase保護測定(Finkelstein et al.，1990；Kinszler et al.，1991)；4)等位基因特異的寡核苷酸(ASO)(Conner el al.，1983)；5)使用識別核苷酸錯配的蛋白質如大腸桿菌mutS蛋白質(Modrich，1991)和6)等位基因特異的PCR(Rano&Kidd，1989)。對于等位基因特異的PCR，使用在其3′端會與特定的MTS突變雜交的引物。如果特定的MTS突變不存在，則觀察不到擴增產(chǎn)物。還可以使用如在歐洲專利申請No.0332435和Newton等人(1989)的文章中公開的擴增不應突變體系(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)。基因的插入和缺失還可以通過克隆、測序和擴增而檢測。此外，還可以使用針對該基因或周圍標記基因的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)探針，以便以多態(tài)性片段形式評估等位基因的改變或插入。該方法對于篩選患病個體的親屬是否具有相同的MTS突變特別有用。也可以使用本領域中公知的檢測插入和缺失的其他方法。
在前三種方法(即SSCA，DGGE和RNase保護測定)中，出現(xiàn)一條新的電泳條帶。SSCA檢測遷移有所不同的條帶，因為序列變化造成單鏈分子內(nèi)堿基配對的差別。RNase保護涉及將突變型多聚核苷酸切成兩個或多個更小的片段。DGGE是用變性梯度凝膠，檢測與野生型序列不同的突變型序列的遷移率。在等位基因特異的寡核苷酸測定中，設計出可以檢測特異性序列的寡核苷酸，然后通過檢測雜交信號的存在與否而進行分析。在mutS測定中，蛋白質只與由突變型和野生型序列形成的含有核苷酸錯配的異源雙鏈序列結合。
根據(jù)本發(fā)明，錯配物是雜合的核酸，雙鏈之間不是100％互補。缺失、插入、倒位或置換還造成整體同源性的缺失。錯配檢測可以用于檢測基因或其mRNA產(chǎn)物中的點突變。雖然這些技術比測序的靈敏度低，但是對于大量的腫瘤樣本而言，其操作更為簡便。錯配切斷技術的一個例子是RNase保護法。在本發(fā)明的實踐中，該方法涉及使用與人野生型MTS基因編碼序列互補的標記核糖核酸探針。該核糖核酸探針和從腫瘤組織中分離出的mRNA或DNA一起退火(雜交)，隨后用能夠檢測雙鏈RNA結構中某些錯配的酶核糖核酸酶A(RNase A)消化。如果RNase A檢測到錯配，它就在錯配位置將其切斷。因此，退火的RNA產(chǎn)物在電泳凝膠基質中分離，如果錯配被RNase A檢測到并切斷，那么會觀察到一個RNA產(chǎn)物，它比全長的、由核糖核酸探針與mRNA或DNA形成的雙鏈RNA更小。核糖核酸探針不必是全長的MTS mRNA或基因，它可以是它們的一個片段。如果核糖核酸探針僅含有MTS mRNA或基因的片段，那么需要用大量的這些探針來篩選整個mRNA序列是否存在錯配。
按類似的方式，通過酶法或化學方法的切斷，可以使用DNA探針來檢測錯配。如參見Cotton et al.，1988；Shenk et al.，1975；Novack et al.，1986。或者，通過錯配雙鏈相對于正確配對雙鏈的電泳遷移率的改變而檢測錯配。如參見Cariello，1988。用核糖核酸探針或DNA探針，在雜交之前用PCR(見下文)擴增含有突變的細胞mRNA或DNA，用Southern雜交法檢測MTS基因DNA的變化，尤其當變化是大的重排如缺失和插入時。
也可以用等位基因特異的探針篩選用PCR擴增的MTS基因DNA序列。這些探針是核酸寡聚物，每種含有一個攜帶已知突變的MTS基因序列的區(qū)域。例如，一個寡聚物可以長約30核苷酸，并且對應于一部分MTS基因序列。通過使用一組這種等位基因特異的探針，便可以用PCR擴增產(chǎn)物來篩選，從而確定在MTS基因中是否存在已確定的突變類型。例如可以在尼龍濾膜上用擴增的MTS序列和等位基因特異的探針進行雜交。在嚴緊雜交條件下與特定的探針發(fā)生雜交表示在這種腫瘤組織中存在與等位基因特異性探針相同類型的突變。
對于候選基因座中突變的最明確的測試方法是直接比較癌腫病人和對照人群的基因組MTS序列。或者，人們可以用PCR方法擴增后對信使RNA進行測序，從而不必確定候選基因的外顯子結構。
癌腫病人在MTS編碼區(qū)域之外的突變可以通過檢測MTS基因附近或內(nèi)部的非編碼區(qū)域如內(nèi)含子和調(diào)控序列而檢測出。非編碼區(qū)域的突變是至關重要的早期指明來自Northern印跡實驗，該實驗揭示出與對照個體相比，在癌腫病人中有分子大小異?；蚋哓S度的信使RNA分子。
MTS mRNA表達的改變可以用本領域中公知的技術進行檢測。其中包括Northern印跡分析、PCR擴增和RNase保護法。mRNA表達的減少表明野生型MTS基因發(fā)生了改變。還可以通過篩選野生型MTS蛋白質的改變而檢測野生型MTS基因的改變。例如，可以使用具有針對MTS的免疫反應性的單克隆抗體來篩選組織。缺乏相應的抗原便表示有MTS突變。也可以使用對突變型等位基因產(chǎn)物特異的抗體來檢測突變型MTS基因產(chǎn)物。這些免疫學測定可以以本領域中公知的方便的方式進行。其中包括Western印跡、免疫組織化學測定和酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。任何檢測MTS蛋白質改變的方法都可以用于檢測野生型MTS基因的改變?？梢允褂霉δ軠y定，如蛋白質結合確定法。例如，已知MTS蛋白質與Cdk尤其是與Cdk4結合。因此可以測定與野生型MTS蛋白質或Cdk4的結合能力。此外，可以測定MTS的生物化學功能，對Cdk如對Cdk4的抑制功能和對細胞周期的調(diào)控作用。尋找到突變型MTS基因產(chǎn)物就表示存在野生型MTS基因的改變。
還可以在其他的人體樣品如血清、糞便、尿液和唾液中檢測突變型MTS基因或基因產(chǎn)物。可以將上述相同的檢測組織中突變型MTS基因或基因產(chǎn)物的技術應用于其他的人體樣品。癌腫細胞會從腫瘤上脫落下來從而出現(xiàn)在這些人體樣品中。此外，MTS基因產(chǎn)物本身會分泌入細胞外空間，從而在原先沒有癌腫細胞的這些人體樣品中被找到。通過對這些人體樣品進行篩選，可以對許多種癌腫進行早期診斷。另外，可以更早期地通過測試人體樣品中是否存在突變型MTS基因或基因產(chǎn)物而監(jiān)測化療或放療的進展。
本發(fā)明的診斷方法還適用于任何一種在腫瘤發(fā)生中MTS發(fā)揮作用的腫瘤。在幾乎所有被檢測的腫瘤中都觀察到在MTS區(qū)域的體細胞突變或染色體臂9p的缺失。本發(fā)明的診斷方法對于醫(yī)療人員很有用，能使他們決定適當?shù)闹委煼桨浮?br> 本發(fā)明的引物對可以通過PCR而用于確定某一特定MTS等位基因的核苷酸序列。單鏈DNA引物對可以與染色體9p上的MTS基因內(nèi)部或周圍的序列進行退火，以便引發(fā)MTS基因本身的DNA合成擴增。整套的這些引物可以合成所有的MTS基因編碼序列(即外顯子)的核苷酸。更佳地，一套引物可以合成內(nèi)含子和外顯子序列。也可以使用等位基因特異的引物。這種引物只與特定的MTS突變型等位基因發(fā)生退火，從而只能擴增出以突變型等位基因作為模板的產(chǎn)物。
為了促進隨后的擴增序列的克隆，引物可以在其5′端含有限制性酶切位點序列。因此除少數(shù)形成限制性酶切位點所需的核苷酸外，所有的引物核苷酸來自MTS序列或靠近MTS的序列。這些酶和酶切位點是本領域中公知的。引物本身可以用本領域中公知的技術合成。一般可以使用市售的寡核苷酸合成儀制備引物。根據(jù)SEQ IDNO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO13、SEQ ID NO15和SEQ ID NO36所示的MTS開放閱讀框架設計特定的引物是本領域中的技術人員所能勝任的。
本發(fā)明提供的核酸探針能用于許多目的。如上所述，它們可以用于與基因組DNA的Southern雜交和用于RNase保護法以檢測點突變。這些探針還可以用于檢測PCR擴增產(chǎn)物。使用其他技術，它們還可以用于檢測MTS基因或mRNA的錯配。定義本發(fā)明使用下列定義“多聚核苷酸的擴增”采用諸如聚合酶鏈反應(PCR)、連接擴增(或稱為連接酶鏈反應，LCR)和基于使用Q-beta復制酶的擴增方法。這些方法是公知的而且在本領域中被廣泛使用。例如參見美國專利4,683,195和4,683,202以及Innis et al.，1990(PCR)和Wuet al.，1989a(LCR)。用于進行PCR的試劑和硬件已商品化。用于擴增MTS基因序列的引物最好互補于并且特異性地與MTS區(qū)域序列或者界定靶區(qū)域的區(qū)域序列雜交。用擴增方法產(chǎn)生的MTS序列可以直接測序?；蛘?，擴增的序列可以在序列分析之前被克隆，但該方法稍不可取。對用酶法擴增的基因組片段的直接克隆和測序分析的方法已由Scharf(1986)描述過。
“被分析的多聚核苷酸”和“被分析的鏈”指單鏈或雙鏈多聚核苷酸，它被可疑包含一段靶序列而且存在于各種不同類型的樣品包括生物樣品中。
“抗體”。本發(fā)明還提供了能夠特異性地與MTS多肽或其片段結合、或者與MTS區(qū)域的多聚核苷酸序列特別是MTS基因座或其部分結合的多克隆和/或單克隆抗體及其片段以及其免疫結合等價物。術語“抗體”指均一的分子統(tǒng)一體或由多種不同的分子統(tǒng)一體組成的混合物如血清產(chǎn)物。多肽可以在肽合成儀上合成并偶聯(lián)于載體分子(如鑰孔血藍蛋白)，然后注入兔子數(shù)月。測試兔血清對MTS多肽或片段的免疫反應性。單克隆抗體可以通過將蛋白質多肽、融合蛋白質或其片段注入小鼠而制備。用ELISA篩選單克隆抗體，然后測試其與MTS多肽或其片段的特異免疫反應性。參見Harlow &Lane，1988。這些抗體可以用于分析和作為藥物。
一旦獲得足夠量的所需多肽，就可以將其用于各種用途。典型的用途是用于生產(chǎn)特異性結合的抗體。這些抗體可以為多克隆或單克隆抗體，而且可以用本領域中公知的技術在體外或體內(nèi)產(chǎn)生。
對于產(chǎn)生多克隆抗體，可以選擇合適的靶免疫體系，典型地是小鼠或兔。按由適用于動物的方法以及免疫學家熟知的其他參數(shù)所限定的方式，將基本純化的抗原供給免疫體系。典型的注射位置是爪墊、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或皮下注射。當然，也可以用其他動物替代小鼠或兔。然后用本領域中公知的技術純化多克隆抗體，再調(diào)節(jié)所需的特異性。
免疫應答通常用免疫測定進行分析。一般地這些免疫測定涉及對一種抗原源進行某種程度的純化，這種抗原源由相同的細胞產(chǎn)生并且該抗原源中的抗原相同。各種免疫測定方法是本領域中公知的。如參見Harlow & Lane，1988或Goding，1986。
典型地，用標準程序如Harlow & Lane(1988)或Goding(1986)所述的程序，可以制得親和力為10-8M-1或更佳地為10-9至10-10M-1或更高的單克隆抗體。簡而言之，可以選用合適的動物，然后采用所需的免疫方案。經(jīng)過適當?shù)臅r間，取出動物的脾臟，然后在合適的選擇條件下，將個體脾細胞與無限增殖化的骨髓瘤細胞融合。隨后，通過克隆分離細胞，并且測試各克隆的上清液以確定是否產(chǎn)生適當?shù)尼槍λ杩乖瓍^(qū)域的特異性抗體。
其他合適的技術涉及在體外將淋巴細胞暴露于抗原性多肽，或者選擇噬菌體或類似載體中的抗體庫。參見Huse et al.，1989。本發(fā)明的多肽和抗體可加以修飾或不加修飾地使用。多肽和抗體常常可以通過共價或非共價地連接一種提供可檢測信號的物質而標記。大量不同的標記物和連接技術是公知的，并且在科學和專利文獻中被廣泛地報道。合適的標記物包括放射性核素、酶、底物、輔助因子、抑制劑、熒光劑、化學發(fā)光劑、磁性顆粒等。有關使用這些標記物的專利包括美國專利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。同樣，還可以產(chǎn)生重組免疫球蛋白(參見美國專利4,816,567)。
“結合配偶體”指一種能夠高特異性地與配體分子結合的分子，如抗原和抗原特異性抗體或者酶和其抑制劑。通常地，特異性結合配偶體必須以足夠的親和力進行結合從而在分離條件下固定被分析物拷貝/互補雙鏈(當進行多聚核苷酸雜交時)。特異性的結合配偶體是本領域中熟知的，例如包括生物素和抗生物素蛋白或鏈球菌抗生物素蛋白(streptavidin)、IgG和蛋白質A、無數(shù)已知的受體-配體偶聯(lián)物和互補的多聚核苷酸鏈。在互補的多聚核苷酸結合配偶體中，配偶體長度通常地至少約15堿基，而且長度至少可以為40堿基。多聚核苷酸可以由DNA、RNA或合成的核酸類似物構成。
“生物樣品”指來自某個體、可疑地含有被分析的多聚核苷酸或多肽的組織或體液樣品，包括但并不限于例如血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚外表、呼吸道、腸道和生殖-泌尿道、眼淚、唾液、血細胞、腫瘤、器官、組織和體外細胞培養(yǎng)成分的樣品。
如此處所用，術語“診斷”或“預后”，當用于有關腫瘤形成的上下文時，被用于表示1)對瘤形成損傷進行分類，2)確定瘤形成的嚴重性或3)在治療之前、之中或之后監(jiān)視疾病的進展。
“編碼”。如果當某多聚核苷酸在其天然狀態(tài)或用本領域中熟練技術人員熟知的方法操作時，可以被轉錄和/或被翻譯從而產(chǎn)生mRNA或多肽或其片段，那么則稱某多聚核苷酸“編碼”多肽。反義鏈是該核酸的互補物，可以從其推導出編碼序列。
“分離的”或“基本純的”?！胺蛛x的”或“基本純的”核酸(如RNA、DNA或混合聚合物)是基本上與在自然狀態(tài)下伴隨其的天然的人序列或蛋白質的其他細胞組份(如核糖體、聚合酶、許多其他人基因組序列及蛋白質)分離的核苷酸。該術語包括從其自然存在的環(huán)境中取出的核酸序列或其蛋白質，并且包括重組的或克隆的DNA分離物和化學合成的類似物或者通過異源體系而生物合成的類似物。
“MTS等位基因”指正常的MTS基因座的等位基因以及攜帶變異的等位基因，這些變異使得個體傾向在許多部位患癌腫。這些癌腫包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫。這種傾向性等位基因還被稱為“MTS易感等位基因”。
“MTS基因座”、“MTS基因”、“MTS核酸”或“MTS多聚核苷酸”都指位于MTS區(qū)域的多聚核苷酸，它們會在正常的組織中表達，其中，某些等位基因會使個體傾向患黑素瘤和其他癌腫，例如眼黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、膽管癌、鱗狀上皮細胞癌、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、腦、前列腺、膀胱、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃、結腸和直腸的癌腫。在本文中，MTS基因座可以和本領域中的名稱MLM基因座互換使用，使用“MTS”是為了包括作為基因座、基因、區(qū)域等而使用的“MLM”。MTS基因座的突變涉及到其他腫瘤的引發(fā)和/或進展。該基因座部分地由導致個體傾向患癌腫的突變所表示。這些突變位于本文下述的MTS區(qū)域中。MTS基因座包括編碼序列、中間序列和控制轉錄和/或翻譯的調(diào)控序列。MTS基因座包括所有等位基因的DNA序列變異。
當這些術語用于核酸時，是指編碼MTS多肽(包括p16)、片段、同系物或變體(例如包括融合蛋白或缺失蛋白)的核酸。本發(fā)明的核酸具有或者衍生自或者類似于天然MTS編碼基因的序列，或者具有基本上與天然MTS編碼基因或其部分同源的序列。MTS多肽(MTS1)的編碼序列顯示于SEQ ID NO1，而MTS多肽(MTS1)的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO2。第二種MTS多肽(MTS1E1β)的編碼序列顯示于SEQ ID NO13，而相應的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO14。第三種MTS多肽(MTS2)的編碼序列顯示于SEQ ID NO15，而相應的氨基酸序列顯示于SEQ ID NO16。術語p16可以和MTS1及MTS1E1β互換使用，用于意指編碼p16的MTS1和編碼p10的MTS1E1β。MTS1和MTS1E1β是一個基因的兩種形式，這兩種形式取決于使用兩種啟動子中的哪一種進行轉錄。MTS2是MTS區(qū)域中的一個單獨部分，它編碼p15。
本發(fā)明的多聚核苷酸包括RNA、cDNA、基因組DNA、合成形式和混合聚合物，可以是有義或反義鏈，而且可以是用化學或生化方法修飾過的或者含有非天然的或衍生的核苷酸堿基，這些對本領域中的熟練技術人員而言是顯而易見的。例如這些修飾包括，標記、甲基化、用類似物置換一個或多個天然核苷酸、核苷酸之間的修飾如不帶電荷的鍵連接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、甲氨酸酯等)、帶電荷的鍵連接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側鏈部分(如多肽)、嵌入劑(intercalator)(如吖啶、補骨脂內(nèi)酯等)、螯合劑、烷基化劑和修飾的鍵連接(如α正位異構化(anomeric)核酸等)。還包括合成的分子，該分子能通過氫鍵和其他化學相互作用模擬與指定序列結合的多聚核苷酸。這種分子是本領域中熟知的，例如包括那些在分子骨架中用肽鍵替換磷酸鍵的分子。
本發(fā)明提供包括全部或部分MTS區(qū)域的重組核酸。重組構建物能在宿主細胞中自我復制?；蛘撸亟M構建物被整合入宿主細胞的染色體DNA中。這種重組的多聚核苷酸包括基因組的、cDNA的半合成的或合成來源的多聚核苷酸，該多聚核苷酸因其來源或操作呈現(xiàn)1)并不與全部或部分在天然狀態(tài)下與其相連的多聚核苷酸相連；2)連接于在天然狀態(tài)下并不與其相連的多聚核苷酸或者3)天然地不存在。
因此，本發(fā)明提供了含有非天然存在序列的重組核酸。盡管可以使用野生型序列，但是野生型序列常常被加以改變，如通過缺失、置換或插入。
可以使用不同類型的cDNA或基因組文庫作為本發(fā)明的天然核酸源進行篩選，也可以通過使用PCR等技術在基因組DNA或其他天然來源中擴增存在的序列而獲得這些核酸。選擇的cDNA庫通常對應于富含所需蛋白質的mRNA的組織源。一般噬菌體文庫較佳，但是也可以使用其他文庫。文庫的克隆被涂布于平板上，轉移至基膜上進行篩選，變性及利用探針檢測是否存在所需的序列。
用于本發(fā)明的DNA序列通常含有至少5個密碼子(15個核苷酸)，更通常地至少7—15個密碼子，最通常地至少35個密碼子?？梢源嬖谝粋€或多個內(nèi)含子。核苷酸的數(shù)目通常是能夠與MTS編碼序列特異性地雜交的成功探針所需的最小長度左右。
有關核酸操作的技術例如在Sambrook et al.，1989或Ausubelet al.，1992中有廣泛的描述。使用這些技術的試劑，如限制性內(nèi)切酶等是本領域中熟知的，而且可以從供應商如New EnglandBioLabs、Boehringer Mannheim、Amersham、Promega Biotec、U.S.Biochemicals、New England Nuclear和大量其他供應商處購得。用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白的重組核酸序列中可以從天然的或人工合成的序列中衍生而得。許多天然的基因序列可以用合適的探針從基因組文庫中或者從不同的cDNA中獲得。參見GenBank，National Institutes of Health。
“MTS區(qū)域”指在P1克隆P1-1062和P1-1063中找到的人染色體9的部分。這些位于大腸桿菌NS3529中的P1克隆已于1994年3月16日被保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MarylandUSA)，其保藏號分別為ATCC No.69589和69590。該區(qū)域含有MTS基因座，包括MTS1、MTS2和MTS1E1β基因。
如本文所用，術語“MTS基因座”、“MTS等位基因”和“MTS區(qū)域”都指含有該基因座、等位基因或區(qū)域的雙鏈DNA以及含有該基因座、等位基因或區(qū)域的單鏈DNA。
如本文所用，“部分”MTS基因座或區(qū)域或等位基因被定義為具有至少約8個核苷酸，或較佳地約15個核苷酸或更佳地至少約25個核苷酸的最小數(shù)目，并且可以是具有至少約40個核苷酸的最小數(shù)目。
“MTS蛋白質”或“MTS多肽”指由MTS基因座編碼的蛋白質或多肽(包括MTS1多肽、MTS2多肽和MTS1E1β多肽)、其變異蛋白或其片段。術語“多肽”指氨基酸的聚合物或其等價物，并不指具有特定長度的產(chǎn)物；因此，肽、寡肽和蛋白質都被包括在多肽這一定義中。該術語并不排除多肽的修飾作用如糖基化、乙?；?、磷?；?。該定義包括含有一個或多個氨基酸類似物(例如包括非天然氨基酸等)的多肽、具有取代鍵以及其他本領域中已知的天然或非天然修飾的多肽。一般地，這種多肽至少具有約50％、較佳地大于約90％、更佳地至少約95％與天然MTS序列的同源性。還包括由在高嚴緊或低嚴緊條件下與MTS編碼核酸雜交的DNA所編碼的蛋白質，以及用針對MTS蛋白質的抗血清而獲得的密切相關的多肽或蛋白質。
用于比較同源性的多肽序列長度通常至少約16個氨基酸，常常至少約20個殘基，更通常地至少約24個殘基，典型地至少約28個氨基酸，而且更佳地大于約35個殘基。
“可操作相連的”是指這樣一種并列關系，其中所述的組份所處的關系使得它們可以按預期的方式發(fā)揮功能。例如，如果啟動子可以引起一段編碼序列轉錄或表達的話，則該啟動子是可操作相連于編碼序列的。
“探針”。與導致易患某些癌腫或者大多數(shù)癌腫的MTS等位基因關聯(lián)的多聚核苷酸多態(tài)性可以通過與某多聚核苷酸探針的雜交反應進行檢測，該探針在嚴緊至中等嚴緊雜交和洗滌條件下能夠與該靶序列形成穩(wěn)定的雜合體。如果預期探針完全與靶序列互補，那么可以使用嚴緊條件。如果預期存在某些錯配，例如預期的變異體與探針不是完全互補的時候，那么可以降低雜交的嚴緊性。選擇的條件應消除非特異的/偶然的結合，即應降低背景。因為這種顯示可確定中性DNA多態(tài)性和突變，所以，還需要進一步分析以表明MTS易感等位基因的缺失。
用于MTS等位基因的探針可以從MTS區(qū)域或其cDNA獲得。探針可以具有任何合適長度，它可以橫跨MTS區(qū)域的全部或部分，而且可以特異性地與MTS區(qū)域雜交。如果靶序列含有與探針相同的序列，那么探針可以短一些，如約為8—30堿基對，因為在嚴緊條件下雜合體也是相對穩(wěn)定的。如果預期與探針之間有某些程度的錯配，即如果懷疑探針會與變異區(qū)域雜交，那么可以采用較長的、會與靶序列產(chǎn)生必要特異性雜交的探針。
探針包括連于標記物或報道分子的分離多聚核苷酸，而且可以使用標準方法用于分離其他的、具有序列相似性的多聚核苷酸序列。對于探針的制備和標記，請參見Sambrook et al.，1989或Ausubelet al.，1992。其他類似的多聚核苷酸可以通過使用同源的多聚核苷酸加以選擇?；蛘撸幋a這些多肽或類似多肽的多聚核苷酸可以通過利用豐余的遺傳密碼子加以合成或選擇。可以引入不同的密碼子置換，例如沉默變化(從而產(chǎn)生不同的限制性酶切位點)或優(yōu)化某特定體系的表達?？梢砸胪蛔円孕揎椂嚯牡男阅埽苍S會改變配體結合的親和力、鏈間的親和力、多肽降解或轉換率(turnover rate)。
本發(fā)明的探針含有合成寡核苷酸或其他多聚核苷酸，它們可以衍生自天然存在的或重組的單鏈或雙鏈多聚核苷酸，或者通過化學方式合成。探針可以通過缺口平移、Klenow填入法或其他本領域中已知的方法進行標記。
最好選用編碼MTS的多聚核苷酸序列作為探針，該探針具有至少約8個核苷酸，通常地至少約15個核苷酸而且小于約6千堿基對，通常地小于約1.0千堿基對的多聚核苷酸序列部分。探針還可以用于在細胞或組織中確定是否存在編碼MTS的mRNA。
對于MTS多肽或其片段，本發(fā)明還提供了“蛋白質修飾形式或片段”，它們一級結構序列基本同源，但是包括例如，體內(nèi)或體外通過化學和生化的修飾形式，以及摻入非常見氨基酸的形式。這些修飾包括乙?；Ⅳ然?、磷?；?、糖基化、遍在蛋白化(ubiquitination)、如用放射性核素進行標記以及各種酶的修飾，這些都是本領域中的熟練技術人員能輕易理解的。大量不同的標記多肽的方法以及大量不同的用于該用途的取代基或標記物是本領域中熟知的，其中包括放射性同位素如32P、可與標記的抗配體(如抗體)結合的配體、熒光團、化學發(fā)光劑、酶和作為標記配體特異性結合配對成員的抗配體。標記物的選擇取決于所需的靈敏度、與引物偶聯(lián)的簡便性、所要求的穩(wěn)定性和所能得到的檢測設備。標記多肽的方法是本領域中熟知的。例如參見Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992。
除了基本上全長的多肽之外，本發(fā)明還提供了具有生物學活性的多肽片段。重要的生物學活性包括配體結合活性、免疫學活性和其他MTS多肽的生物學活性。免疫學活性包括靶免疫體系中的免疫原功能，以及具有供結合的免疫表位以作為MTS蛋白質表位的競爭劑或取代抗原。如本文所用，“表位(又稱抗原決定簇)”指多肽的抗原決定簇。一個表位可以含有三個表位獨有的處于空間構象中的氨基酸。一般地，一個表位由至少5個這樣氨基酸、更常見地由至少8—10個這樣氨基酸構成。確定這些氨基酸的空間構象的方法是本領域中熟知的。
對于免疫學的用途，可以使用串聯(lián)重復的多肽片段作為抗原，從而產(chǎn)生高抗原性的蛋白質?；蛘撸@種多肽抗原作為特異性結合的極有效的競爭劑。下文描述特異地針對MTS多肽或其片段的抗體的生產(chǎn)過程。
本發(fā)明還提供了含有MTS多肽及其片段的融合多肽?？梢栽趦蓚€或多個MTS多肽序列之間或者在MTS序列和相關蛋白質之間使同源的多肽融合。同樣可以構建異源的融合蛋白，它具有衍生蛋白質的復合性能或活性。例如，可以在不同的新融合多肽或片段之間“交換”配體結合域或其他的結構域。這種同源或異源的融合多肽可表現(xiàn)出例如已改變的結合活力和特異性。融合配偶體包括免疫球蛋白、細菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白質A、β-內(nèi)酰胺酶、α-淀粉酶、乙醇脫氫酶和酵母α接合因子。例如參見Godowski et al.，1988。
典型地，融合蛋白可以用重組核酸法(如下文所示)或者用化學合成法制得。用于合成多肽的技術在Merrifield，1963中有描述。
“蛋白質純化”指將MTS多肽從其他生物材料中如從用重組的編碼MTS的核酸轉化的細胞中分離出的各種不同方法，這些方法是本領域中熟知的。例如，可以用如本發(fā)明中提供的抗體，使用免疫親和色譜法來純化多肽。各種不同的蛋白質的純化方法是本領域中熟知的，其中包括在Deutscher，1990和Scopes，1982中所述的方法。
術語“分離的”、“基本純的”、和“基本同質的”可以互換使用，都用于描述已經(jīng)與在天然狀態(tài)下伴隨它的組份分離的蛋白質或多肽。當約60—75％的樣品具有單一的多肽序列時，該單體蛋白質便是基本純的?；炯兊牡鞍踪|典型地含有約60—90％W/W、更通常地約95％而且更佳地超過約99％的蛋白質樣品。蛋白質的純度或同質性可以用多種本領域中熟知的方法表示，如聚丙烯酰胺凝膠電泳或在對凝膠進行染色之后觀察蛋白質樣品中單一的多肽條帶。對于某些情況，可以用高效液相色譜(HPLC)或其他本領域中熟知的手段提供更高的分辨率用于純化。
當MTS蛋白質已經(jīng)與在天然狀態(tài)下伴隨它的天然污染物分離時，則該MTS蛋白質就基本上不含與其天然相關的組份了。因此，用化學方法合成的多肽或者在與天然產(chǎn)生該多肽的細胞不同的細胞體系中合成的多肽基本上不含與其天然相關的組份。還可以使用本領域中熟知的蛋白質純化技術，通過分離使蛋白質基本上不含與其天然相關的組份。
如本文所用，作為分離的和可操作的基因序列表達產(chǎn)物而產(chǎn)生的多肽是“分離的多肽”，即使是在同源的細胞類型中表達。人工合成形式或用異源細胞表達的分子本身就是分離的分子。
“重組核酸”是天然不存在的核酸，或者是將兩個本身分開的序列片段通過人工組合形成的核酸。該人工組合通常是通過化學合成手段，或者通過對分離的核酸片段進行人工操作(例如通過遺傳工程技術)而實現(xiàn)。典型地，當需要引入或去除一個序列識別位點時，通常是用編碼相同的或保守性的氨基酸的豐余密碼子來置換某一密碼子。或者，可以將具有所需功能的核酸片段合并起來產(chǎn)生所需的功能組合。
“調(diào)控序列”指那些通常位于某基因座10Kb編碼區(qū)域之內(nèi)的、影響基因表達(包括基因的轉錄和信使RNA的翻譯、拼接、穩(wěn)定性等)的序列。
“基本同源或類似”。如果與其他核酸(或其互補鏈)最佳地進行排列(具有適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?時，核苷酸序列的相同程度有至少約60％的核苷酸堿基，通常地至少約70％的核苷酸堿基，更通常地至少約80％，較佳地至少約90％，更佳地至少約95—98％的核苷酸堿基時，那么我們稱該核酸或其片段與另一核酸“基本同源”(或“基本類似)。
或者，當核酸或其片段在選擇的雜交條件下能夠與另一核酸(或其互補鏈)或與某一鏈或其互補鏈雜交，那么就存在基本同源或類似性。當發(fā)生比特異性完全缺乏更具選擇性的雜交時，存在著雜交的選擇性。典型地，當在一段至少約14個核苷酸的區(qū)間中有至少約55％的同源性、較佳地至少約65％、更佳地至少約75％、最佳地至少約90％的同源性時，會發(fā)生選擇性的雜交。參見Kanehisa，1984。如本文所述，同源性的比較長度可以在更長的區(qū)段進行。在某些實施例中經(jīng)常是至少約9個核苷酸長度，通常地至少約20個核苷酸，更通常地至少約24個核苷酸，典型地至少約28個核苷酸，更典型地至少約32個核苷酸，并且更佳地至少約36個核苷酸或更多。
除了受堿基組成、互補鏈長度和雜交核酸之間核苷酸堿基錯配的數(shù)目等因素影響之外，核酸雜交還受諸如鹽濃度、溫度或有機溶劑等因素的影響，這一點是本領域中的熟練技術人員所知曉的。嚴緊的溫度條件通常包括超過30℃的溫度，典型地超過37℃，更佳地超過45℃。嚴緊的鹽濃度一般小于1000mM，典型地小于500mM，更佳地小于200mM。然而，這些參數(shù)的組合比任何單一參數(shù)更為重要。例如參見Wetmur & Davidson，1968。
探針序列還可以在特定的條件下與雙鏈DNA特異性地雜交，從而形成三股或其他更高級的DNA復合物。這些探針的制備和合適的雜交條件是本領域中所熟知的。
當用于多肽時，術語“基本同源”或“基本相同”表示感興趣的多肽或蛋白質與完整的天然存在的蛋白質或其部分相比，至少約30％相同，通常地至少約70％相同，更佳地至少約95％相同。
“基本相似的功能”指相對于野生型MTS核酸或野生型MTS多肽而言的修飾核酸或修飾蛋白質的功能。修飾多肽基本上與野生型MTS多肽同源而且基本上具有相同的功能，即抑制Cdk尤其是抑制Cdk4。修飾多肽可以具有不同的氨基酸序列和/或含有修飾氨基酸。除了抑制Cdk功能之外，修飾多肽還可以有其他的性能，比如更長的半衰期。修飾多肽的抑制Cdk的活性基本上與野生型的活性相同?；蛘?，修飾多肽的抑制Cdk的活性比野生型的活性更高。修飾多肽用常規(guī)技術合成，或者用修飾核酸編碼并用常規(guī)技術產(chǎn)生。修飾核酸用常規(guī)技術制備?；旧项愃埔吧蚆TS基因功能的核酸可以產(chǎn)生上述的修飾蛋白質。
典型地，多肽的同源性用序列分析軟件確定。例如參見GeneticsComputer Group(University of Wisconsin Biotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705)的序列分析軟件包(Sequence Analysis Software Package)。蛋白質分析軟件通過測定各種置換、缺失和其他修飾方面指定的同源性來匹配相似的序列。典型地保守性的置換包括列于下組中的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸。
多肽“片段”、“部分”是指至少約5—7個連續(xù)氨基酸、通常地至少約7—9個連續(xù)氨基酸、典型地至少約9—13個連續(xù)氨基酸、最佳地至少約20-30個或更多連續(xù)氨基酸的一段氨基酸殘基。
本發(fā)明的多肽，如果是可溶的，可以偶聯(lián)于固相載體，例如硝基纖維素、尼龍、柱填塞材料(如瓊脂糖凝膠(Sepharose)珠)、磁性珠、玻璃毛、塑料、金屬、聚合物凝膠、細胞或其他的底物。這些載體可以是珠、槽(well)、量尺或膜等形式。
“靶區(qū)域”指被擴增和/或被檢測的核酸區(qū)域。術語“靶序列”所指的序列在所需條件下，將與探針或引物形成穩(wěn)定的雜合體。
除非另外注明，本發(fā)明的實施采用化學、分子生物學、微生物學、重組DNA、遺傳學和免疫學的常規(guī)技術。例如參見Maniatis et al.，1982；Sambrook et al.，1989；Ausubel et al.，1992；Glover，1985；Anand，1992；Guthrie & Fink，1991。用于人基因圖譜包括人染色體9p圖譜的技術和材料的一般性討論，可參見White &Lalouel(1988)的文章。制備重組的或化學合成的核酸；載體、轉化、宿主細胞本發(fā)明的大量多聚核苷酸可以通過在適當宿主細胞中的復制而產(chǎn)生。編碼所需片段的天然或合成的多聚核苷酸片段可以整合入重組多聚核苷酸構建物中，通常為DNA構建物。該構建物可以將其引入原核或真核細胞中并在其中復制。一般地，多聚核苷酸構建物適合在單細胞宿主如酵母或細菌中復制，但是也可以將其引入培養(yǎng)的哺乳動物或植物或其他的真核細胞系中(整合或沒有整合入基因組中)。對用本發(fā)明方法產(chǎn)生的核酸的純化，在Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992中有描述。
本發(fā)明的多聚核苷酸還可以用化學合成的方法產(chǎn)生，例如Beaucage & Caruthers，1981所述的亞磷酰胺法或者Matteucci etal.，1981所述的三酯法，而且可以在商購的、自動寡核苷酸合成儀上進行。從化學合成的單鏈產(chǎn)物基礎上獲得雙鏈片段，即通過合成互補鏈然后在合適的條件下使兩條鏈退火，或者使用DNA聚合酶和合適的引物序列添加互補鏈。
為了引入原核或真核宿主中而制備的多聚核苷酸構建物可以含有一個能被宿主識別的復制系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括編碼所需多肽的多聚核苷酸片段，而且最好含有可操作地相連于多肽編碼片段的轉錄和翻譯起始調(diào)控序列。表達載體含有復制起始點或自我復制序列(autonomously replicating sequence，ARS)和表達控制序列、啟動子、增強子和必要的加工信息位點如核糖體結合位點、RNA拼接位點、多聚腺苷酸化位點、轉錄終止序列和mRNA穩(wěn)定序列。合適的話，可以含有來自天然MTS蛋白質或者來自其他受體或者來自相同或相關物種的分泌多肽的分泌信號，從而使蛋白質能夠通過和/或留在細胞膜，并因此獲得其功能性拓撲結構或者從細胞中分泌出去。這些載體可以用本領域中熟知的標準重組技術制備，例如可以參見Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992。
應選擇合適的啟動子和其他必要的載體序列使其能在宿主中發(fā)揮作用。合適的話，可以選用與MTS基因天然相關的序列。細胞系和表達載體的可操作的組合在Sambrook et al.，1989或Ausubelet al.，1992中有描述，還可以參見Metzger et al.，1988。許多有用的載體是本領域中熟知的，而且可以從供應商如Stratagene、NewEngland Biolabs、Promega Biotech等處獲得。啟動子如trp、lac和噬菌體啟動子、tRNA啟動子和糖酵解酶啟動子可以用于原核宿主。有用的酵母啟動子包括金屬硫蛋白(metallothionein)、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶如烯醇化酶或甘油醛-3-磷酸脫氫酶、擔負利用麥芽糖和半乳糖的酶等的啟動子區(qū)域。適合用于酵母表達的載體和啟動子還在Hitzeman et al.，EP73，675A中有進一步描述。合適的非天然哺乳動物啟動子包括來自SV40早期和晚期啟動子(Fierset al.，1978)或來自Moloney鼠白血病病毒、鼠腫瘤病毒、鳥肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳頭狀瘤病毒或多瘤的啟動子。另外，構建物可以連于可擴增的基因(如二氫葉酸還原酶(DHFR))從而可以產(chǎn)生多拷貝基因。對于合適的增強子和其他的表達控制序列，也可以參見Enhancers and Eukaryotic Gene Expression，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York(1983)。
盡管這些表達載體可以自我復制，但是它們也可以通過使用本領域中熟知的方法插入到宿主細胞的基因組中再復制。
表達和克隆載體將可能含有供選擇的標記基因，該基因編碼的蛋白質是載體轉化的宿主細胞的存活或生長所必需的。該基因保證只有表達該插入子的宿主細胞才能生長。典型的選擇基因編碼下列蛋白質a)提供對抗生素或其他毒性物質如氨芐青霉素、新霉素、氨甲喋呤等抗性的蛋白質；b)互補營養(yǎng)缺陷的蛋白質或c)提供復合培養(yǎng)基中沒有的重要營養(yǎng)成分的蛋白質，例如桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇合適供選擇的標記基因取決于所用的宿主細胞，而各種不同宿主的合適標記基因是本領域中所熟知的。
含有感興趣核酸的載體可以在體外轉錄，然后用熟知的方法例如通過注射(參見T.Kubo et al.，1988)將得到的RNA引入宿主細胞，或者也可以用本領域中熟知的方法將載體直接引入宿主細胞，這取決于宿主細胞的類型。這些方法包括電穿孔；采用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖或其他物質的轉染；微粒轟擊(microprojectile bombardment)；脂質轉染(lipofection)；感染(當載體是感染物時，例如反轉錄病毒基因組)和其他方法。一般地參見Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992?？梢杂萌魏伪绢I域中已知的方法，特別是上述的方法。將多聚核苷酸引入宿主細胞的過程在本文中稱為“轉化”。已經(jīng)引入上述核酸的細胞還包括該細胞的后代。
大量本發(fā)明的核酸和多肽可以在相容的原核或真核宿主細胞中通過載體或其他表達載體表達而得以制備。最常用的原核宿主是大腸桿菌菌株，盡管有其他的原核生物，如枯草桿菌或假單孢菌(屬)。
哺乳動物或其他的真核宿主細胞，如酵母、絲狀真菌、植物、昆蟲或兩棲動物或鳥類的宿主細胞，也可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質。哺乳動物細胞的培養(yǎng)增殖是本領域中每個人都熟知的。參見Jakoby和Pastan(編輯)，1979。常用的哺乳動物宿主細胞系的例子是VERO和Hela細胞中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和W138、BHK和COS細胞系。但是熟練的技術人員知道，其他的細胞系也是合適的，用于提供更高效的表達、所需的糖基化形式或其他特性。
根據(jù)載體構建的方式，通過標記基因選擇克隆。標記基因位于相同或不同的DNA分子上，較佳地在相同的DNA分子上。在原核宿主中，可以通過對諸如氨芐青霉素、四環(huán)素或其他抗生素的抗性而選擇轉化子。根據(jù)溫度敏感性產(chǎn)生的特定產(chǎn)物也可以用作合適的標記物。
用本發(fā)明的多聚核苷酸轉化的原核或真核細胞不僅可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的核酸和多肽，也可以用于研究MTS多肽的性質。
反義多聚核苷酸序列可用于防止或減弱MTS基因座的表達，這一點是本領域中的熟練技術人員所能理解的。例如，可以將含有全部或部分MTS基因座序列、或者其他來自MTS區(qū)域序列(尤其是位于MTS基因座兩側的序列)的多聚核苷酸載體置于反義方向啟動子的控制下，并引入細胞。在細胞中，這種反義構建物的表達會干擾MTS轉錄和/或復制。
細胞周期蛋白(Cycline)和Cdk是真核生物中廣泛存在著的細胞周期調(diào)控因子。這些蛋白質最初在酵母中發(fā)現(xiàn)，并且已經(jīng)在海洋無脊椎動物、兩棲動物和哺乳動物包括鼠、兔和人中發(fā)現(xiàn)。通過使用基于一種物種基因序列的探針和/或引物，可以在其他物種中鑒別出同源的細胞周期調(diào)控基因。因此，本文所公開的MTS基因序列的探針和引物，可以用于在其他物種中鑒別同源的MTS基因序列和蛋白質。針對分離出這些物質的物種，可用這些MTS基因序列和蛋白質進行本文所述的診斷/預后、治療和藥物篩選。使用方法核酸診斷和診斷試劑盒為了檢測是否存在使個體易患癌腫的MTS等位基因，可以制備生物樣品如血液，然后分析是否存在易感性MTS等位基因。為了檢測是否存在瘤形成、或者先前損傷的惡性發(fā)展、或者診斷的征兆，可以制備損傷的生物樣品，然后分析是否存在導致瘤形成的MTS等位基因。這些測試的結果和解釋可以供給衛(wèi)生保健機構，從而告訴受測試的個體。這些診斷可以由診斷實驗室進行，或者可以制造診斷試劑盒并售給衛(wèi)生保健機構或個人以供自我診斷。
起初，篩選方法涉及通過PCR擴增有關的MTS序列，然后進行DNA序列分析。在另一本發(fā)明的優(yōu)選例子中，篩選方法是一種非PCR方案。該篩選方法包括本領域中熟知的兩步標記放大技術。PCR和非PCR的篩選方案都能以很高的靈敏度檢測靶序列。
目前最常用的方法是靶目標的擴增。使用聚合酶擴增靶核酸序列。一種特別優(yōu)選的、聚合酶驅動的擴增反應方法是聚合酶鏈反應(PCR)。處于本發(fā)明范圍之內(nèi)的一種優(yōu)選的PCR方案在實施例1中提供。由于聚合酶驅動擴增循環(huán)，因此聚合酶鏈反應和其他聚合酶驅動的擴增分析方法使拷貝數(shù)目增加一百萬倍以上。一旦被擴增，得到的核酸可以用于測序或者用作DNA探針的底物。
當使用探針來檢測靶序列的存在時(例如在篩選癌腫的易感性時)，可以處理待分析的生物樣品(例如血液和血清)以抽提出核酸。樣品核酸可以用不同的方法進行制備，從而促進靶序列的檢測。例如變性、限制性消化、電泳或點雜交。被分析核酸的靶區(qū)域通常必須至少部分呈單鏈狀態(tài)，以便與探針的靶序列形成雜合體。如果序列本身是單鏈，那么不需要變性。但是，如果序列是雙鏈，那么序列可能需要變性?？梢杂帽绢I域中熟知的各種技術進行變性。
在會促使探針的靶序列和被分析物中假定的靶序列之間形成穩(wěn)定雜合體的條件下，將被分析核酸和探針進行保溫。與被分析物結合的探針區(qū)域可以被制成與人染色體9p的靶區(qū)域完全互補。因此，為了防止假陽性，需要高嚴緊條件。只有當探針與基因組中單一的染色體區(qū)域互補時方使用高嚴緊條件。雜交的嚴緊性由雜交和洗滌過程中的眾多因素所決定，其中包括溫度、離子強度、堿基組成、探針長度和甲酰胺濃度。這些因素在Maniatis et al.，1982和Sambrook etal.，1989中有總結。在某些情況下，更高級雜合體如三聚體、四聚體等的形成也可以作為檢測靶序列的方法。
如果存在雜合體，那么形成的雜合體的檢測通常通過使用標記探針實現(xiàn)?；蛘撸结樖俏礃擞浀?，但是可以與直接或間接標記的配體通過特異性地結合而檢測出。合適的標記物以及用于標記探針和配體的方法是本領域中中熟知的，其中包括用已知方法(如缺口平移、隨機引物法和磷酸根轉移法(kinasing))摻入的放射性標記物、生物素、熒光基團、化學發(fā)光基團(如二氧雜環(huán)丁烷(dioxetane)，尤其是觸發(fā)態(tài)二氧雜環(huán)丁烷)、酶、抗體等。在這一基本技術框架下的改動是本領域中熟知的，其中包括那些促進將待檢測的雜合體從外源材料中分離出來和/或放大來自標記部分的信號的改動。眾多的改動形式總結于Matthews & Kricka，1988；Landegren et al.，1988；Mittlin，1989；美國專利4,868,105和EPO出版物No.225，807中。
如上所述，本發(fā)明合適地提供了非PCR篩選分析方法。在實施例15中提供了代表性的非PCR程序。在該程序中，將核酸探針(或類似物，例如用膦酸甲酯骨架替換普通的磷酸二酯)與低濃度的DNA靶目標雜交。該探針具有與其共價相連的酶，而共價連接不會干擾雜交反應的特異性。接著該酶-探針-偶聯(lián)物-靶核酸復合物可以與游離的探針-酶偶聯(lián)物分離，然后加入底物進行酶檢測?？梢酝ㄟ^顯色變化或者靈敏度增高103—106倍的熒光輸出量而觀察酶活性。對于寡聚脫氧核苷酸-堿性磷酸酶偶聯(lián)物的制備及其作為雜交探針的用途，可以參見Jablonski et al.，1986。
兩步標記放大技術是本領域中中熟知的。這些分析方法基于這樣的原理將小配體(如地高辛配基(digoxigenin)、生物素等)連于能夠特異性地與MTS結合的核酸探針上。針對MTS1的代表性探針對應于SEQ ID NO4中核苷酸448-498的位置。等位基因特異的探針也在該例子的構思范圍之中，代表性的等位基因特異的探針包括含有總結于表3的傾向性突變和總結于表5的腫瘤體細胞突變的探針。
在一個例子中，連于核酸探針上的小配體被抗體-酶偶聯(lián)物特異性識別。在該例子中，將地高辛配基連于核酸探針上。用能夠使化學發(fā)光底物發(fā)生轉換的抗體-堿性磷酸酶偶聯(lián)物檢測雜交。用于標記該例子中核酸探針的方法，可以參見Martin et al.，1990。在另一例子中，小配基被能夠特異性地與其復合的另一個配基-酶偶聯(lián)物所識別。這種情況下的一個眾所周知的例子是生物素-抗生物素的相互作用。標記核酸探針的方法以及它們基于生物素-抗生物素分析的用途，參見Rigby，et al.，1977和Nguyen，et al.(1992)。
同樣在本發(fā)明構思范圍之中的是本發(fā)明的核酸探針分析可以采用能夠檢測出MTS基因的核酸探針的混合物。因此，在一個從細胞樣品中檢測MTS1存在的例子中，采用多種與MTS1互補的探針，尤其是這組不同的探針可以為2、3或5種不同的核酸探針序列。在另一例子中，為了在病人中檢測是否存在MTS基因序列的突變，可以使用一種以上與MTS1互補的探針，該混合物含有能夠與等位基因特異性突變結合的探針，而這些突變是在帶有MTS1突變的病人人群中鑒別出的。在該例子中，可以使用任何數(shù)目的探針，而且最好包括對應于、使個體傾向于患乳房癌的主要的基因突變的探針。一些本發(fā)明范圍之內(nèi)的候選探針包括表3和5中列出的等位基因特異性突變的探針。使用方法肽診斷和診斷試劑盒損傷的瘤形成狀況可以根據(jù)野生型MTS多肽發(fā)生的改變而加以檢測。這種改變可以用常規(guī)的技術通過序列分析確定。更佳地，使用抗體(多克隆或單克隆抗體)來檢測MTS多肽的差異或MTS多肽的缺乏。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，抗體將MTS蛋白質從溶液中免疫沉淀出，以及在聚丙烯酰胺凝膠的Western印跡或免疫印跡中與MTS蛋白質反應。在另一優(yōu)選實施例中，通過使用免疫細胞化學技術，抗體可以從石蠟或冰凍組織切片中檢測出MTS蛋白質。用于獲得和純化抗體的技術是本領域中中眾所周知的，因而可以選用任一這樣的技術來實現(xiàn)本發(fā)明的制備。
檢測MTS或其突變方法的優(yōu)選例子包括酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)、放射免疫測定(RIA)、免疫放射測定(IRMA)和免疫酶測定(IEMA)，包括用于單克隆和/或多克隆抗體的夾心測定。夾心測定例子在David等人的美國專利No.4,376,110和4,486,530中有描述(這些文獻在此引用作為參考)，并且以實施例18為例。使用方法藥物篩選本發(fā)明對于篩選化合物特別有用，即在各種藥物篩選技術中通過使用Cdk多肽或其結合片段而篩選化合物。最好使用Cdk4。在測試中使用的Cdk多肽或其片段可以處于溶液中的游離狀態(tài)，或者被固定于某固相載體，或者位于細胞表面。一種藥物篩選方法最好是在競爭結合測定中，采用已經(jīng)用表達多肽或其片段的重組多聚核苷酸穩(wěn)定地轉化了的原核或真核宿主細胞。這種細胞，或者處于游離狀態(tài)或者處于固定形式，都可以用于標準結合分析中。例如人們可以測量在Cdk多肽或其片段和被測試的試劑之間是否形成復合物，或者檢測在Cdk多肽或其片段和MTS多肽或其片段之間形成的復合物被所測試的試劑干擾的程度。
因此，本發(fā)明提供了篩選藥物的方法，它包括將某種試劑與Cdk多肽或其片段接觸，然后用本領域中熟知的方法測定1)是否存在由該試劑和Cdk多肽或其片段形成的復合物或2)是否存在由Cdk多肽或其片段和配基形成的復合物。還可以測定Cdk的活性，以確定該試劑是否能夠抑制Cdk，即是否能夠調(diào)節(jié)細胞周期。在這種競爭性結合測定中，Cdk多肽或其片段是被標記的。將游離的Cdk多肽或其片段從蛋白質蛋白質復合物中分離，游離(即未復合的)標記物的量便分別是被測試的試劑結合于Cdk的測量值，或者是其干擾CdkMTS多肽結合的測量值?？梢园催@種方法分析MTS多肽的小肽(肽模擬物)以確定哪些具有Cdk抑制活性。
另一種藥物篩選的方法可以為適當?shù)呐cCdk多肽有結合親和力的化合物提供全面的篩選，該方法在Geysen的歐洲專利申請No.84/03664中(1984年9月13日出版)有詳細的描述。簡而言之，在固相基質如塑料針或其他表面上合成大量不同的小肽測試化合物，然后將肽測試化合物與Cdk多肽反應并洗滌。接著用本領域中熟知的方法檢測結合的Cdk多肽。
純化的Cdk可以直接涂在平板上以便用于上述的藥物篩選技術。但是，也可以使用針對多肽的非中和抗體來捕獲固定于固相上Cdk多肽的抗體。
本發(fā)明還提供了競爭性藥物篩選測定法的用途。其中能夠特異性地結合Cdk的中和抗體與測試化合物發(fā)生競爭，爭奪與Cdk多肽或其片段的結合。在這種方法中，可以使用抗體來檢測具有一個或多個Cdk多肽抗原決定簇的任何肽。
另一種藥物篩選的技術涉及使用具有無功能MTS基因的真核宿主細胞或細胞系(例如上述的)。這些宿主細胞系或細胞在細胞周期調(diào)控中的Cdk水平上存在缺陷。在藥物化合物存在條件下，這些宿主細胞系或細胞生長。測量宿主細胞的生長速率以確定化合物是否能夠調(diào)控細胞周期。一種測量生長速率的方法是測定Cdk、最好是Cdk4的生物學活性。使用方法合理的藥物設計合理的藥物設計的目的是生產(chǎn)出感興趣的具有生物學活性多肽的結構類似物，或與其反應的小分子結構類似物(例如促效劑、拮抗劑、抑制劑)，以便設計出的藥物是活性更高或更穩(wěn)定的多肽，或者該藥物可以增強或干擾肽在體內(nèi)的功能。例如參見Hodgson，1991。在一種方法中，人們先要通過X-射線衍射晶體法、通過計算機模型設計或者最典型地通過多種手段的結合而確定感興趣蛋白質(例如，p16或Cdk4)或Cdk16-p16復合物的三維結構。通過基于同源蛋白質結構的模型設計可以獲得有關某肽結構的不常見的有用信息。合理的藥物設計的一個例子是人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制劑的開發(fā)(Erickson et al.，1990)。此外，可以用丙氨酸掃描法(Wells，1991)分析肽(如p16或Cdk4)。在該技術中，用Ala置換氨基酸殘基，然后確定該置換對肽活性的影響。肽的每一個氨基酸殘基都用這種方式進行分析，以確定肽的重要區(qū)域。
通過功能測定的選擇，還可以分離靶目標特異性抗體，然后解開其晶體結構。從理論上講，這種方法會得到一個藥物核心(pharmacore)，而隨后的藥物設計都可以以此為基礎。通過產(chǎn)生針對有功能的、有藥物學活性的抗體的抗個體基因型抗體(anti-id)，就有可能繞過蛋白質晶體分析。作為一個鏡像的鏡像，可以預計抗個體基因型抗體的結合位點是最初受體的類似物。然后，抗個體基因型抗體可以用于從化學或生物學方法產(chǎn)生的肽文庫中鑒別和分離出所需的肽。此時，選出的肽可以作為藥物核心。
因此，人們可以設計出MTS活性更高或更穩(wěn)定的藥物，或者可以設計出作為MTS活性抑制劑、促效劑、拮抗劑等的藥物。因為已有克隆的MTS序列，所以可以產(chǎn)生出足夠量的MTS多肽，以便進行X-射線衍射晶體等分析。另外，此處提供的MTS蛋白質序列的知識對那些采用計算機模型設計取代X-射線衍射晶體的人以及那些使用這兩種方法的人起指導作用。使用方法基因治療根據(jù)本發(fā)明，提供了向攜帶突變型MTS等位基因的細胞提供野生型MTS功能的方法。提供這樣一種功能會抑制受體細胞的腫瘤生長?？梢詫⑽挥谳d體中的野生型MTS基因或部分基因引入細胞，引入的基因處于染色體外。在這種情況中，基因在細胞中的染色體外進行表達。如果部分基因被引入并在攜帶突變型MTS等位基因的細胞中表達，則部分基因應能夠編碼使細胞進行非瘤形成生長所需的部分MTS蛋白質。更優(yōu)選的是這樣一種情況野生型MTS基因或其部分被引入突變型細胞并且和細胞中存在的內(nèi)源突變型MTS基因發(fā)生重組。這種重組需要發(fā)生雙重組事件，從而導致MTS基因突變的校正。用于將基因引入從而進行重組或維持在染色體外的載體，是本領域中熟知的，而且可以使用任何合適的載體。將DNA引入細胞的方法，例如電穿孔、磷酸鈣共沉淀和病毒轉導都是本領域中熟知的，方法的選擇是一般技術人員都能做到的。用野生型MTS基因轉化的細胞可以用作研究癌腫消退以及研究促進這種消退的藥物治療的模型系統(tǒng)。
如上所述，可以在基因治療方法中采用MTS基因或其片段(適用時)，以便增加癌腫細胞中該基因表達產(chǎn)物的數(shù)量。這種基因治療特別適用于癌腫細胞和前癌腫(pre-cancerous)細胞，因為與正常細胞相比，這種細胞中MTS多肽的水平下降或缺乏。這種基因治療還可以用于在另一些腫瘤細胞中增加MTS基因的表達水平，在這些細胞中突變型基因按“正常的”水平進行表達，但是基因產(chǎn)物卻完全沒有功能。
基因治療可以用普遍接受的方法進行，例如Friedman在Therapy For Genetic Disease(T.Friedman，ed.，OxfordUniversity Press(1991)，PP.105—121)中所描述的方法。來自病人的腫瘤細胞可以先用上述的診斷方法進行分析，以確定腫瘤細胞中產(chǎn)生MTS多肽。然后制備含有連于表達調(diào)控元件并且能夠在腫瘤細胞中復制的MTS基因拷貝的病毒或質粒載體。適用的載體是本領域中中熟知的，例如在美國專利5,252,479和PCT出版的申請WO93/07282中所公開的。接著可以將載體注射入病人，或者是局部地在腫瘤位置進行，或者是全身性進行(為了進入可能轉移至其他位置的腫瘤細胞)。如果轉染的基因沒有永久性地整合入各個靶腫瘤細胞的基因組，那么需要定期地進行治療。由于MTS多肽與細胞周期的調(diào)控緊密相關，因此優(yōu)選地將MTS基因和其自身的調(diào)控元件一起引入，從而避免在所有攝入該基因的細胞中MTS多肽的組成型表達。
本領域中已知的基因轉移系統(tǒng)都可以用于作為實施本發(fā)明的基因治療方法。包括病毒和非病毒轉移方法。大量的病毒已用作基因轉移載體，其中包括乳多空病毒(如SV40，Madzak et al.，1992)、腺病毒(Berkner，1992；Berkner et al.，1988；Gorziglia andKapikian，1992；Quantin et al.，1992；Rosenfeld et al.，1992；Wilkinson et al.，1992；Stratford-Perricaudet et al.，1990)、牛痘病毒(Moss，1992)、腺伴隨病毒(Muzyczka，1992；Ohi et al.，1990)、包括單純皰疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)在內(nèi)的皰疹病毒(Margolskee，1992；Johnson et al.，1992；Fink et al.，1992；Breakfield and Geller，1987；Freese et al.，1990)和來自鳥類(Brandyopadhyay and Temin，1984；Petropoulos et al.，1992)、鼠(Miller，1992；Miller et al.，1985；Sorge et al.，1984；Mann andBaltimore，1985；Miller et al.，1988)和人(Shimada et al.，1991；Helseth et al.，1990；Page et al 1990；Buchschacher andPanganiban，1992)的反轉錄病毒。大多數(shù)的人類基因治療方案以減毒的鼠反轉錄病毒為基礎。
本領域中已知的非病毒基因轉移方法包括化學方法，例如磷酸鈣共沉淀(Graham and van der Eb，1973；Pellicer et al.，1980)；機械方法，例如顯微注射(Anderson et al.，1980；Gordon et al.，1980；Brinster et al.，1981；Constantini and Lacy，1981)；通過脂質體進行的膜融合介導轉移(Felgner et al.，1987；Wang andHuang，1989；Kaneda et al.，1989；Stewart et al.，1992；Nabel etal.，1990；Lim et al.，1992)和直接DNA攝入以及受體介導的DNA轉移(Wolff et al.，1990；Wu et al.，1991；Zenke et al.，1990；Wu et a1.，1989b；Wolff et al.，1991；Wagner et al.，1990；Wagner et al.，1991；Cotten et al.，1990；Curiel et al.，1991a；Curiel et al.，1991b)。病毒介導的基因轉移可以與脂質體送遞直接進行體內(nèi)基因轉移一起使用，使得這種轉移指導病毒載體進入腫瘤細胞而不是周圍的不分裂細胞?；蛘?，可以將產(chǎn)生反轉錄病毒載體的細胞系注射入腫瘤(Culver et al.，1992)，這種細胞的注入可以連續(xù)地提供載體顆粒來源。該技術已經(jīng)被批準用于患有不可進行手術的腦腫瘤病人。
結合生物學和物理學基因轉移方法，將任何大小的質粒DNA與對腺病毒六鄰體蛋白特異的聚賴氨酸偶聯(lián)抗體混合，形成的復合物被連于腺病毒載體。然后用這種三分子復合物感染細胞。在雙鏈DNA破壞之前，腺病毒載體能夠有效地結合、內(nèi)化(internalization)和降解核內(nèi)體(endosome)。
已表明，脂質體/DNA復合物能夠介導直接的體內(nèi)基因轉移。盡管對于標準的脂質體，基因轉移過程是非特異性的，但是已經(jīng)有報道，在直接的原位施用方法(Nabel 1992)之后，在腫瘤病灶部位有局部體內(nèi)攝入和表達。使用方法肽治療可以將具有MTS活性的肽提供給攜帶突變型MTS等位基因或缺乏MTS等位基因的細胞。本文公開了MTS蛋白質的序列(SEQ ID NO2，SEQ ID NO14和SEQ ID NO16)。使用已知的表達載體，通過細菌中的cDNA序列的表達而產(chǎn)生蛋白質?；蛘撸琈TS多肽可以從產(chǎn)生MTS的哺乳動物細胞中抽提出。另外，可以使用化學合成技術來合成MTS蛋白質其中任何一種技術都能夠提供含有MTS蛋白質的、本發(fā)明的制劑。該制劑基本上不含其他種類的人蛋白質。通過在微生物內(nèi)或體外合成，可以極方便地實現(xiàn)該目的。
可以通過顯微注射或使用脂質體將活性MTS分子引入細胞。或者，某些活性分子可以被細胞主動地或通過擴散攝入。在細胞外施用MTS基因產(chǎn)物足以影響腫瘤的生長。提供具有MTS活性分子可以部分在逆轉瘤形成狀態(tài)。也可以使用其他具有MTS活性的分子(例如肽、藥物或有機化合物)來實現(xiàn)這種逆轉。還可以使用具有基本類似功能的修飾多肽進行肽治療。使用方法轉化的宿主同樣地，攜帶突變型MTS等位基因的細胞和動物可以用作模型系統(tǒng)，以研究和測試可能成為治療劑的物質。典型地，這些細胞是培養(yǎng)的上皮細胞。這些細胞可以從具有體細胞或種系MTS突變的個體中分離而得?；蛘呷缟纤?，可以對細胞系進行工程改造，使之攜帶MTS等位基因的突變。將測試藥物施用于細胞之后，測定細胞的瘤形成轉化表型。對瘤形成轉化細胞的任何性狀都可以進行評估，其中包括不依賴于貼壁的生長(anchorage-independent growth)、在裸鼠中的致瘤性、對細胞的入侵性和對生長因子的依賴性。其中任何一種性狀的測定是本領域中熟知的。
在對全體動物進行誘變或對種系細胞或合子進行處理之后，可以選擇用于測試治療劑的動物。這些處理包括插入突變型MTS等位基因(通常來自另一種動物)以及插入破壞的同源基因?；蛘撸梢允褂贸Ｒ?guī)技術(Capecchi，1989；Valancius and Smithies，1991；Hasty et al.m 1991；Shinkai et al.，1992；Mombaerts et al.，1992；Philpott et al.，1992；Snouwaert et al.，1992；Donehower et al.，1992)通過插入或缺失突變或者其他的遺傳改變而破壞動物的內(nèi)源MTS基因。在將測試物質施用于動物之后，必須評估腫瘤的生長。如果測試物質防止或抑制腫瘤的生長，那么該測試物質是用于治療本文所述癌腫的候選治療劑。
本發(fā)明結合下列實施例進行闡述。這些實施例僅用于闡述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明。采用的是本領域中中熟知的標準技術或在下文中特別說明的技術。實施例1材料和方法A.MTS譜系圖1A-1D分別顯示了親緣族3137、3161、3355和1771。在圖中顯示了這些親緣族中的癌腫發(fā)生情況。親緣族3137中所有的黑素瘤都攜帶易感性單倍型，而且還標出了該親緣族其他攜帶易感性單倍型的癌腫。在親緣族3161和3355中的所有黑素瘤都攜帶易感性單倍型。在親緣族1771中的癌腫中鑒別出MTS的突變。
B.腫瘤細胞系從Ludwig Institute for Cancer Research、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center得到76個黑素瘤細胞系，從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得8個黑素瘤細胞系和5個非黑素瘤細胞系。
C.腫瘤細胞系DNA的制備和分析從細胞系中分離DNA過程向3毫升裂解緩沖液(0.1MNaCl；0.1M TrisHCl pH8.O；5mM EDTA；0.5％SDS)中加入約1×107細胞，然后渦旋振動并且在65℃保溫30分鐘。加入0.5ml8M KOAc，混合反應物，然后在冰上保溫30分鐘。離心(10,000×g，5分鐘)后，用等體積的95％乙醇沉淀上清液，并且再次離心(10,000×g，15分鐘)。將DNA重新懸浮于50-200毫升水中。
D.PCR反應將50ng模板和30pmol每種寡核苷酸引物加入20ml反應混合物中，該混合物含有0.1mM dNTP、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、0.01％明膠和1單位Amplitaq聚合酶(Perkin-Elmer)。樣品在Perkin-Elmer9600熱循環(huán)儀上，按94℃10秒、55℃10秒和72℃10秒的順序進行35個循環(huán)。隨后通過1.5％瓊脂糖(SeaKem)或3％NuSieve3∶1瓊脂糖(FMC BioProducts)電泳，并用溴化乙錠染色觀察產(chǎn)物。
E.YAC使用上述PCR條件，用IFNA、D9S171和D9S126篩選CEPHYAC文庫，獲得含有MTS區(qū)域標記的酵母人工染色體(Yeastartificial chromosomes，YAC)。含有YAC的酵母菌株在30℃、AHV培養(yǎng)基(10g/l酪蛋白水解產(chǎn)物-酸；1.7g/l酵母含氮堿基；5g/l硫酸銨；20mg/l半硫酸腺嘌呤；2％葡萄糖；pH＝5.8)中通過劇烈搖動生長3天。按Ausubel et al.，1992所述的方法制備酵母DNA。
F.噬菌體文庫的構建含有YAC DNA的酵母基因組DNA用BamHI完全消化，然后用T4 DNA連接酶(Boehringer-Mannheim)將其插入BamHI消化的EMBL3噬菌體臂(Promega)，用GigapackII抽提物(Stratagene)進行體外包裝。噬菌體生長在大腸桿菌菌株C600上。通過與32P標記的人C0t-1DNA(GIBCO-BRL)的雜交鑒別出含有人DNA的重組噬菌體。用含有YAC左臂或右臂序列的PCR片段進行篩選，鑒別出含有連于YAC載體的人序列的噬菌體(末端克隆)。雜交和洗滌在標準條件(Middleton et al.，1991)下進行。挑取陽性噬菌斑，通過平板純化3次。用Qiaex柱(Qiagen)制備噬菌體DNA。
G.粘性質粒文庫構建用Sau3A部分消化含有YAC DNA的酵母基因組DNA，然后在線性(10-40％)蔗糖梯度上按大小分開各組份，如Maniatis et al.，1982所述。按制造商的說明制備SuperCos1粘性質粒載體(Stratagene)，然后和插入子DNA按質量比4∶1(插入子∶載體)進行混合，用連接酶處理，并如上所述在體外進行包裝。將粘性質粒引入DH5α宿主細胞，然后按每個15厘米培養(yǎng)皿培養(yǎng)2000個克隆的密度進行平板培養(yǎng)。如上所述和如Maniatis et al.，1982所述進行菌落雜交。
H.P1克隆通過用本文所述方法制備的STS進行篩選，從GenomeSystems，Inc.(St.Louis，Missouri)獲得橫跨MTS區(qū)域的P1克隆。用堿裂解法，然后用氯化銫梯度離心技術(Maniatis et al.，1982)從這些克隆中分離出DNA(Birnboim and Doly，1979)，I.STS的產(chǎn)生用與P1載體(pSacBII)、SuperCos1載體或EMBL3載體的克隆位點兩側序列互補的寡核苷酸，對1.0mg P1、粘性質?；蚰０錎NA測序，得到STS。測序在ABI 373A DNA測序儀上用PRISM快速反應染料脫氧終止劑循環(huán)測序試劑盒(PRISM Ready ReactionDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(ABI))進行。STS被設計成長度盡可能接近20堿基對，而且Tm盡可能接近60℃。
J.黑素瘤傾向性親緣族中MTS1的種系突變用標準方法從血液中制備攜帶者個體的基因組DNA。引物被設計在內(nèi)含子位置中以便從MTS1中擴增編碼外顯子1或2，或者從MTS2中擴增出編碼外顯子2(對于各樣品使用20ng DNA)。除了加入二甲基亞砜(DMSO)至終濃度為5％外，PCR反應使用標準緩沖液。循環(huán)測序反應使用α-P32-dATP，對用位于序列中不同位置的引物擴增而得的產(chǎn)物進行。測序產(chǎn)物在6％變性聚丙烯酰胺凝膠上分析，將所有的(A)反應一起上樣，然后是C)反應等等。所有的多態(tài)性都可以通過相對鏈的序列分析而確定。實施例2用遺傳連鎖標記確定MTS的位置為了分析腫瘤細胞系在9p21區(qū)域的純合缺失，采用一套已知與MTS連鎖的標記。這些標記最初用于在10個猶他州的親緣族和1個德克薩斯州親緣族(Cannon-Albright et al.，1992)中顯示與黑素瘤傾向的顯著連鎖(LOD值＝12.7)。這些標記包括來自α-干擾素基因簇(IFNA)(Kwiatkowski & Diaz，1992)(它是已測試的最遠端標記)的序列、近端標記(D9S104)和另外4個位于其中的標記(D9S171、D9S126、D9S161和D9S169)(Cannon-Albright et al.，1992)。根據(jù)遺傳研究，這些介于其間的標記的線性順序是D9S171、D9S126、D9S161、D9S169。IFNA標記由能夠從野生型基因組DNA中擴增出兩個片段的寡核苷酸引物對構成，這兩個片段是一個是含有多聚CA區(qū)段的、約138-150堿基對的多態(tài)性片段(IFNA-1)，另一個是約120堿基對的不變片段(IFNA-s)。IFNA-s相對于IFNA-1的位置不明。
先前報道的含有缺失的5個非黑素瘤腫瘤細胞系用遺傳標記進行分析。結果揭示，每個細胞系中至少有一種所測試的標記存在純合缺失(表1)。使用D9S161、D9S169或D9S104時沒有鑒別出純合缺失。這些缺失中重疊的最小區(qū)域被IFNA-1和D9S171所界定。這暗示，這兩個標記基因之間的區(qū)域含有涉及腫瘤抑制的基因，可能是MTS。因此接著詳細研究IFNA-1和D9S171之間的基因組區(qū)域，尤其是IFNA-s附近的區(qū)域。
表1用與MTS連鎖的遺傳標記檢測腫瘤細胞系中的純合缺失標記腫瘤IFNA-1 IFNA-2 D9S171 D9S126 D9S161 D9S169 D9S104細胞系U-138 - - - - + + +U-118 - - - - + + +U-87 - - + + + + +A-172 + - + + + + +H4 - - - - + + +注所有的細胞系得自ATCC，是神經(jīng)膠質瘤或神經(jīng)母細胞瘤。實施例3MTS區(qū)域的基因組克隆為了獲得IFNA-s周圍區(qū)域的基因組克隆，對CEPH YAC文庫進行篩選(Cohen et al.，1993)。鑒別出11個含有D9S171標記的YAC和5個含有IFNA-s的YAC。沒有分離出同時含有D9S171和IFNA-s的YAC(圖2)。將3個YAC克隆(C9、C6、F9)亞克隆入噬菌體，將另一個YAC(C6)亞克隆入粘性質粒載體。這些步驟以及其他粘性質?？寺√峁┝艘环N方便的途徑來產(chǎn)生位于已知遺傳標記內(nèi)部的STS，并且加快了下述的染色體步移。
為了提供用于構建該區(qū)域連續(xù)的基因組圖所需的基因組DNA的獨立來源，以及為了協(xié)助產(chǎn)生STS，可以在P1克隆中從IFNA-s開始向D9S171延伸、從D9S171反方向地向IFNA-s延伸、以及從YAC C6端向兩個方向延伸而開始染色體步移。作為這種染色體步移的部分，一共分離出27個P1克隆(圖2)。這些按次序排列的PI形成了連續(xù)的、從IFNA-s延伸至D9S171、并且具有兩個缺口的組合體(assembly)。P1克隆以及幾個噬菌體和粘性質?？寺∮糜诋a(chǎn)生MTS區(qū)域的精細結構圖。實施例4MTS區(qū)域的精細結構分析為了構建更詳細的MTS區(qū)域分子圖，還需要額外的標記。用來自基因組克隆的DNA序列設計用于STS的PCR引物。這些STS用于協(xié)助對P1和YAC克隆進行次序排列。來自IFNA-s和D9S171之間區(qū)域的總計54個STS是建立詳細的MTS區(qū)域物理圖的主要基礎(圖2)。這些STS引物序列被輸入Genome Database。
從IFNA-s向D9S171延伸的一套新標記被用于測試84個黑素瘤細胞系，以確定在MTS區(qū)域是否有純合缺失?？傆?2個細胞系有純合缺失區(qū)域(圖3)。幾個缺失是大范圍的，例如13細胞系缺失的區(qū)域包括816.7和760-L。
為了對MTS進行定位，最能提供信息的腫瘤細胞系分成兩組(圖3)i)含有單獨的c5.1缺失的細胞系(11類)和ii)含有單獨的c5.3缺失的細胞系(12類)。總計有5個黑素瘤細胞系屬于這兩組。在所有檢測到缺失的情況中，缺失似乎是簡單的缺失即沒有跡象表明在IFNA-s和D9S171之間的區(qū)域發(fā)生多重缺失事件。這些攜帶缺失的細胞系合起來描述了一個以標記c5.1和c5.3為中心的缺失重疊區(qū)域，從而不必對從IFNA-s向D9S171的區(qū)域制作完整的物理圖。實施例5鑒別粘性質粒c5和P1含有MTS的菌落P1062和P1063A.遺傳標記的布局對YAC克隆的分析和對腫瘤細胞系中缺失的分析而得的結果與遺傳標記的布局相一致IFNA、D9S171、D9S126。3個YAC含有D9S171和D9S126，而4個YAC含有IFNA-1和IFNA-s(圖2)。沒有一個YAC同時含有D9S171和IFNA。這暗示i)IFNA-1和IFNA-s緊密連鎖和ii)D9S126和D9S171連鎖。這些結果可以用細胞系的缺失來證實。大多數(shù)缺失D9S171的細胞系也缺失D9S126。相反地，細胞系U-87，盡管對D9S171和D9S126呈陽性，但是缺失IFNA-s和IFNA-1(表1)。一個黑素瘤細胞系即SK-MEL-5缺失IFNA-s、D9S171和D9S126，但是沒有缺失IFNA-1。因此，IFNA-1必然位于IFNA-s的遠端。另一黑素瘤細胞系SK-Mel-Zan缺失IFNA-1、IFNA-s和D9S171，但是不缺失D9S126，因此D9S171位于IFNA-s和D9S126之間?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)支持在表1中給出的標記的次序排列。
人α-干擾素基因家族由位于染色體9p上的超過23個基因和假基因構成。這個基因簇已經(jīng)被克隆并被分成10個連鎖組(Henco etal.，1985)。通過對神經(jīng)膠質瘤細胞系中α-干擾素不同的序列的缺失丟失分析，對這些連鎖組進行了部分排序(Olopade et al.，1992)。神經(jīng)膠質瘤細胞系H14缺失IFNA-1和IFNA-s。它還缺失連鎖組IV(例如α13、α6和α20)的序列。神經(jīng)膠質瘤細胞系A172含有IFNA-1和連鎖組IV，但是缺失連鎖組I(例如α1和α19)、III(例如α8)和IX(例如α2)以及IFNA-s。該分析結果將IFNA-1置于連鎖組I、III和IX以及IFNA-s的遠端。A172缺失的遠端邊界被定在IFNA-s遠端的一個P1長度之內(nèi)。因此，連鎖組I、III和IX必然靠近位于離IFNA-s遠端小于85kb的某一點處。
B.遺傳標記之間的物理距離上述結果還不能對IFNA-s和D9S171之間的距離作出準確的估計，因為不可能分離出含有這兩個標記基因的YAC。另外，根據(jù)用STS制作的圖譜，從IFNA-s向遠端延伸的5個YAC中沒有一個YAC與從D9S171向近端延伸的11個YAC發(fā)生重疊。因CEPHYAC插入子的平均長度在500kb之內(nèi)，所以IFNA-s和D9S171之間的距離至少應有那么大。
IFNA-s和c5.1之間的區(qū)域被P1克隆中的9個步移步段所覆蓋。假定每個步段平均為P1插入子的一半長度，那么c5.1和IFNA-s之間的距離約為400kb。因此，在黑素瘤細胞系中經(jīng)常缺失的、與c5.1緊密連鎖的腫瘤抑制基因必然位于IFNA-s近端約400kb內(nèi)。
C.腫瘤細胞系的缺失在57％測試的黑素瘤腫瘤中發(fā)現(xiàn)了9p21區(qū)域的純合缺失。14個腫瘤細胞系含有在近端一側延伸通過760-L的缺失，16個細胞系含有延伸超過位于遠端一側816.7的缺失。假定缺失是起因，即在該區(qū)域基因的缺失造成腫瘤的表型，那么腫瘤抑制基因必然位于760-L和816.7之間。最小的缺失涉及標記c5.1和c5.3。在所有測試的標記中，很多細胞系(51個)中有c5.3的缺失。因此，腫瘤抑制基因最可能的位置非常靠近C5.3，因為C5.3是缺失最頻繁的標記。4個細胞系含有單獨的C5.3缺失(12類)，一個細胞系單獨缺失C5.1(11類)。這兩個標記都存在于同一粘性質粒c5上。因此，有可能腫瘤抑制基因包括來自粘性質粒c5的序列。P1克隆P1062和P1063含有在c5中發(fā)現(xiàn)并且圍繞粘性質粒的序列。因此，如下進一步所述，P1062和P1063含有完整的MTS區(qū)域。
上述實施例中的結果與以前對MTS的遺傳研究相一致，以前的研究表明，在IFNA-1和D9S126之間的區(qū)域是MTS最可能存在的位置(Cannon-Albright et al.，1992)。最近的遺傳研究已經(jīng)利用位于P1-452上IFNA-2和C5.3之間的多態(tài)性(CA)重復來限定MTS的位置(圖2)。使用該標記進行重組染色體分析，結果將MTS置于P1-453近端。因此，MTS被定位于在黑素瘤細胞系簇中純合缺失的區(qū)域。
這些結果支持這樣的觀點在靠近C5.3的某處存在腫瘤抑制因子基因座MTS。所有含有缺失的細胞系都具有共同的缺失DNA區(qū)域，除了那些缺失被限定于C5.1或C5.3的細胞系(11和12類)。除了那些位于粘性質粒c5中的非重疊缺失外，沒有證據(jù)表明在這組細胞系中存在非重疊的缺失。因此，沒有理由提出更復雜的機制，例如涉及遠離C5.1和C5.3的另一個位于9p21的腫瘤抑制因子基因座的機制。
在多腫瘤類型中存在9p21的純合缺失這一觀察結果暗示，位于那里的腫瘤抑制基因可能在多種不同的組織中表達。因此，在參與多種類型腫瘤的發(fā)展進程這一點上，腫瘤抑制基因可能與p53基因是類似的(參見下面進一步的數(shù)據(jù))。在具有黑素瘤傾向的家族中已報道過其他類型的癌腫(Nancarrow et al.，1993；Bergman et al.，1990)。用C5.1和C5.3對各種不同的癌腫類型進行徹底的缺失分析(見下文)，闡明了該腫瘤抑制基因在除黑素瘤之外的腫瘤中的重要性。
某些觀察到的純合缺失去除了許多遺傳標記。Fountain等人報道，在兩個不同的黑素瘤細胞系中染色體9p21的純合缺失延伸了2-3Mb(Bergman et al.，1990)。在該研究中，至少一個細胞系SK-MEL-5，含有從測試的最遠端標記IFNA-1處開始并且通過D9S126的缺失，該區(qū)域明顯太大以致于不能存在于單個YAC上。大缺失占優(yōu)勢暗示，在MTS周圍區(qū)域缺乏對細胞存活所必需的基因。實施例6MTS候選基因的分離在上面的實施例中，描述了在MTS附近YAC和P1染色體步移分析的結果。用得自c5序列的STS進行精細結構圖譜試驗表明，在5個不同的黑素瘤細胞系中存在小的、非重疊的c5序列的缺失。該結果表明，可能腫瘤抑制基因(可能是MTS)至少部分位于c5中。
進一步的表明c5含有至少一個基因的證據(jù)來自對c5和附近粘性質粒中(CpG)二核苷酸頻率的分析。在哺乳動物中，幾乎所有的日?；蚝徒霐?shù)的所有組織特異性基因與(CpG)二核苷酸異常豐富的區(qū)域相關(Bird，1989；Larsen et al.，1992)。因此，存在這種“CpG島”便表明存在基因。用識別含有兩個(CpG)配對序列的限制性核酸內(nèi)切酶EagI、BssHI和SacII消化粘性質粒c5、c12、c57和c59。只有粘性質粒c5和c12含有這些酶的識別位點。粘性質粒c5含有一個EagI位點、至少10個BssHI位點和至少12個SacII位點。在c5和重疊粘性質粒c12中存在CpG島暗示，事實上c5含有至少一個MTS候選基因。
為了尋找MTS，確定來自粘性質粒c5的EcoRI片段的DNA序列。當將這些序列與GenBank的序列進行比較時，鑒別出兩個與眾不同的c5區(qū)域，它們與以前鑒定的、編碼人依賴細胞周期蛋白的激酶4(cyclin-dependent kinase4，Cdk4)抑制劑或p16基因的區(qū)域相似(Serrano et al.，1993)。這兩個基因是MTS的候選基因，稱為MTS1和MTS2。MTS1位于粘性質粒c5最靠近染色體9p端粒的一端附近，而MTS2位于c5著絲點端附近。見圖4B。圖4A中給出的粘性質粒圖顯示了MTS1和MTS2以及P1克隆P1062、P1063和P1069的位置。
來自c5的MTS1基因組序列和p16 mRNA序列的仔細比較揭示，MTS1含有一段307bp的、與部分p16編碼序列相同的序列。該MTS1核苷酸區(qū)段的兩側為可識別的拼接序列。對MTS1的進一步研究表明，它包括完整的p16編碼序列和兩個內(nèi)含子(圖5A和5B以及圖6A和6B)。內(nèi)含子1位于翻譯起始位置下游126bp處；內(nèi)含子2位于翻譯終止位置上游11bp處。這兩個內(nèi)含子將MTS1編碼序列分成3個區(qū)域126bp的5′區(qū)域(編碼外顯子1)、307bp的中間區(qū)域(編碼外顯子2)和11bp的3′區(qū)域(編碼外顯子3)。SEQ IDNO3為MTS1的5′區(qū)域、外顯子1和部分內(nèi)含子1的核苷酸序列。SEQ ID NO4為MTS1的部分內(nèi)含子1、外顯子2和部分內(nèi)含子2的核苷酸序列。
MTS2含有幾乎與p16相同的DNA序列區(qū)域，它從編碼外顯子2的5′端向內(nèi)含子2延伸約211bp(圖7A)。然而，序列相似性在MTS1內(nèi)含子上游51bp處下降，該處對應于MTS2的最后密碼子所在的位置(圖8)。MTS1和MTS2的序列比較(圖8)表明，兩個基因間的序列相似性從含子1的3′拼接點向上游延伸約40個核苷酸。因此，非編碼DNA部分比某些假定的編碼DNA區(qū)域更保守。為了排除編碼DNA中的序列趨異是由于克隆假象所造成的這一可能性，設計能夠特異性地擴增出跨越MTS2序列趨異點的PCR引物。這些引物從粘性質粒、P1和基因組DNA中擴增出預定大小的片段。因此，靠近MTS2外顯子2的3′端的趨異序列確實是基因組序列。SEQ ID NO5列出了MTS2的部分內(nèi)含子1、“外顯子2”和“內(nèi)含子2”的核苷酸序列。SEQ ID NO15列出了MTS2的cDNA序列。
在粘性質粒c5中存在兩個緊密相關的基因暗示，在該區(qū)域可能存在其他相關基因。為了證實這種可能性，用粘性質粒c5、c12、c59和P1的1063和1060以及人基因組DNA的限制性內(nèi)切酶消化產(chǎn)物進行Southern印跡。用含有大部分MTS1外顯子2(包括與MTS2共有的區(qū)域)的片段探測這些印跡。在克隆DNA和基因組DNA中用探針檢測到兩個EcoRI片段。這個結果與在基因組存在兩個p16類基因，即MTS1和MTS2相一致。還與目前已知存在MTS1E1β相一致，MTS1E1β是MTS1的另一種形式，它含有MTS1的外顯子2和3但是不含外顯子1。實施例7MTS1E1β的分離和結構MTS1E1β的分離用完整的MTS1 cDNA作為探針并且使用常規(guī)的cDNA文庫篩選技術，通過雜交選擇而分離出含有MTS1E1β的克隆。常規(guī)的cDNA文庫篩選是用得自MTS1外顯子2的探針進行的。對來自胎兒腦、正常乳房和淋巴細胞的各個文庫，篩選一百萬個克隆。從淋巴細胞文庫中分離出雜交的cDNA克隆?？寺〗?jīng)測序表明含有含有E1β。它還含有MTS1的外顯子2(E2)和外顯子3(E3)。通過將得自卵巢組織的cDNA和粘性質粒c5一起培育，分離出用雜交選擇法而得的cDNA克隆。該粘性質粒用生物素標記并且制成單鏈形式。讓c5和cDNA之間形成雜合體，然后用包被有鏈球菌抗生物素蛋白的磁性顆粒捕獲生物素標記的粘性質粒。選擇的cDNA被從粘性質粒上洗脫下來，用PCR擴增，克隆化以及被測序。該cDNA克隆與用文庫篩選法分離而得的克隆相似，因為它們含有E1β、E2和E3。其中沒有一個克隆含有以前所述的外顯子1(見SEQ ID NO3)。MTS1E1β cDNA的序列列于SEQ ID NO13。
MTS1E1β的結構MTS1和MTS1E1β是一個基因的兩種形式這兩種形式都使用外顯子2和3，但是具有不同的第一外顯子。MTS1含有α形式(E1α)，它編碼由MTS1編碼的p16蛋白質的前43個氨基酸。MTS1E1β含有外顯子1的β形式(E1β)。通過將復合cDNA克隆序列比作克隆所來自的基因組區(qū)域，確定p16基因的外顯子結構(圖13)。對含有p16的基因組區(qū)域進行基因組Southern印跡、序列分析以及長PCR，以確定p16外顯子的位置(圖13)。p16基因約跨30kb的基因組DNA。E1β是外顯子最靠5′端的部分，次序為E1β、E1α、E2和E3。
E1β在p16閱讀框中的翻譯(從p16的編碼外顯子2和3所用的閱讀框而推知)揭示，有一個閱讀框內(nèi)的終止密碼子位于E1β和E2之間的拼接位置上游僅10個密碼子處。該終止密碼子的位置被基因組和cDNA序列分析所證實。位于該終止密碼子下游的第一個潛在的起始密碼子是在p16的閱讀框內(nèi)，緊靠E1/E2拼接位點的3′端。該潛在起始密碼子的兩側序列與共有Kozak序列(Kozak，1987)并不十分相似。如果在p16閱讀框內(nèi)翻譯，那么p16基因的E1β轉錄物將編碼105個氨基酸的蛋白質。
對βcDNA的其他分析揭示，它具有處于與編碼p16框架不同的框架中的大開放閱讀框(ORF)。該ORF(稱為ORF2)延伸通過E1β并且伸入E2的67個氨基酸處。全長的ORF可編碼180個氨基酸的蛋白質。然而，該閱讀框在E1β5′端是開放式的，因此可能是不完全的。統(tǒng)計分析暗示，這種大小的ORF不可能由隨機序列構成的DNA偶然產(chǎn)生(P＝0.003)。然而，若給出β轉錄物的堿基組成，則可能性將較大(P＝0.16)。預測的多肽與任何以前描述的蛋白質都不相似。
鑒別出E1β的進化保守性部分，可以提供有關哪些序列對它的功能至關重要的線索。用改良的cDNA末端快速擴增法(RACE)技術，稱為雜合體捕獲RACE(Hybrid Capture RACE，HCR)(見實施例12)，分離出小鼠p16cDNA，并且與人p16cDNA進行比較。一種類型的小鼠p16cDNA(β型)具有與人E1β等價的外顯子和E2等價物。第二種類型(α型)含有連于E2的E1α等價物。E1α和E2鼠外顯子與人的對應物具有70％的相同性。鼠和人的E1β外顯子核苷酸序列具有51％的相同性(圖14)，而且鼠E1β外顯子還含有處于編碼p16閱讀框架中的終止密碼子。從終止密碼子5′處的核苷酸序列推導出的人和鼠的多肽是完全趨異的。因此，在p16閱讀框中的終止密碼子不可能是測序假象。
考慮到E1β作用的不確定性，我們分析了在所有三種閱讀框中鼠和人β轉錄物的相似性。在與編碼p16的閱讀框(ORF1)不同的閱讀框中，人和鼠的β轉錄物都含有大ORF(ORF2)。推導出的、由ORF2編碼的多肽具有40％的相同性。但是，如果將ORF2肽的比較限定于E1β所編碼的部分的話，它們僅有28％的相同性。相反，鼠和人的p16序列有67％的相同性。另外，根據(jù)E2中的ORF2所推導出的多肽與根據(jù)E2中的第三閱讀框(ORF3)所推導出的多肽相似(42％)。這些結果暗示，ORF2不是選擇性地維持的，因而可能不編碼蛋白質。還比較了人和鼠βRNA的次級結構，沒有發(fā)現(xiàn)驚人的相似性。總之，這些結果暗示，β轉錄物是p16功能所需要的，因為它在鼠和人中都存在；而且如果它被翻譯，那么編碼的蛋白質可能在外顯子2中的第一個甲硫氨酸處起始。實施例8MTS1中的種系突變?yōu)榱藴y定MTS1或MTS2是否與遺傳易感性基因座MTS相對應，對來自8個假定攜帶MTS傾向性等位基因的個體的基因組DNA(Cannon-Albright et al.，1992)進行分析。用衍生自MTS1或MTS2特異性內(nèi)含子序列的寡核苷酸引物(表2)對每種樣品進行擴增，擴增出外顯子DNA序列。
表2篩選MTS1中外顯子的引物引物 SEQ ID NO外顯子 基因1F6 1 MTS11108R 7 1 MTS142F 8 2 MTS1551R 9 2 MTS121F 102 MTS250R 112 MTS289F 122 MTS2用引物1F和1108R擴增MTS的外顯子1，然后用引物1108R測序。用引物42F和551R擴增MTS的外顯子2，然后用引物42F和551R測序。用21F和50R擴增MTS2的外顯子2，用引物89F和50R再進行擴增，然后用引物89F和50R進行測序。
這些基因組片段的DNA序列揭示出在8個個體中的2個中存在多態(tài)性。多態(tài)性不存在于其他的任何樣品中，這暗示，它們在人群中不是共同的。為了表明多態(tài)性是與MTS染色體而不是與其他的同源染色體連鎖，對來自各親緣族中攜帶傾向性等位基因的其他個體的基因組DNA進行分析。在每種情況下，多態(tài)性都與MTS傾向性等位基因一起分離。在親緣族3012的個體(12821)中發(fā)現(xiàn)了密碼子93的突變(gly→trp)。這也在患病的攜帶者同胞(13183)和未患病的攜帶者表親(14917)中發(fā)現(xiàn)，但是在未患病的非攜帶者同胞(13184)中沒有發(fā)現(xiàn)。在親緣族1771的個體(15635)中發(fā)現(xiàn)密碼子118的突變(val→asp)。這也在患病的攜帶者一級表親(嫡堂(表)兄妹)(10205)、患病的攜帶者一級表親(嫡堂(表)兄妹)(11414)和10205的患病攜帶者一級表親(10146)中發(fā)現(xiàn)，但是在10205的未患病的非攜帶者的舅舅(或叔叔)(10120)中沒有發(fā)現(xiàn)。
多態(tài)性是單一的核苷酸置換，它造成氨基酸的變化(表3)。置換涉及用大的、憎水性的殘基取代小的、親水性的殘基，或者用帶電的氨基酸取代中性氨基酸。
表3傾向性種系MTS突變突變編碼效果位置*G→Tgly→trp277T→Aval→asp353*突變在SEQ ID NO1 DNA序列中的位置。
在分析的8個樣品中沒有發(fā)現(xiàn)MTS2外顯子2的多態(tài)性。這暗示，至少在這些親緣族中，MTS2不會導致易患黑素瘤。由于MTS2類似于MTS1，因此MTS2可能與其他類型的癌腫有關。也有可能MTS2是無功能的基因。
在易患黑素瘤的個體中，在MTS1中而沒有在MTS2中發(fā)現(xiàn)種系突變與黑素瘤純合缺失分析的結果相符合。實施例9腫瘤細胞系中MTS是否存在的分析因為多腫瘤類型中高頻率的9p21缺失，所以對來自12種不同類型的細胞系是否存在MTS1進行分析。使用一套在基因中按一定間隔分布的序列標志位點(STS)來測試腫瘤細胞系的基因組DNA是否存在預期的片段(圖4A、4B和9)。該研究結果暗示，在高百分比的腫瘤細胞系中存在MTS1的缺失(表4)。純合缺失存在于所有測試的腫瘤類型中，除了結腸和神經(jīng)母細胞瘤細胞系。缺失的百分比從低至肺癌和白血病中的25％到高至星形細胞瘤中的94％?？傊?，在290個測試的細胞系中的135個細胞系中檢測到純合缺失。從該數(shù)目可以得到攜帶缺失的腫瘤細胞系百分比的最低估計值，因為用于該分析的STS并沒有覆蓋整個基因。因此某些小缺失可能沒有被檢測出。另外，例如少數(shù)核苷酸的插入或缺失等損傷以及核苷酸置換，這種方法也會漏檢。
表4不同腫瘤類型中的純合缺失腫瘤類型細胞系數(shù)目缺失數(shù)目缺失％黑素瘤9957 58白血病4 1 25肺癌 5915 25成膠質細胞瘤 100 0膀胱癌155 33腎癌 9 5 56星形細胞瘤1716 94結腸癌200 0乳房癌106 60卵巢癌7 2 29神經(jīng)膠質瘤3525 71骨肉瘤5 3 60總計 290 135 47％為了提高對含有MTS1突變的細胞系總數(shù)的估計，對34個沒有表現(xiàn)出明顯的MTS1序列純合缺失的細胞系是否存在MTS1損傷進行更仔細的檢測。含有近97％MTS1編碼序列的序列被擴增并分析多態(tài)性。在34個黑素瘤中的14個中觀察到MTS1外顯子1或外顯子2的18種體細胞突變(表5)。這些突變中的3種是移碼突變，7種是無義突變，4種是錯義突變和4種是沉默突變。含有沉默突變的4個細胞系中的3個還含有其他的突變形式，而且18種突變中的16種位于編碼外顯子2處。除一個細胞系之外，所有細胞系都專門含有半合或純合多態(tài)性，暗示其他的同源染色體也會有缺失。單一的雜合細胞系含有兩個不同的非沉默突變，該發(fā)現(xiàn)表明每條染色體都經(jīng)歷了獨立的突變事件。根據(jù)對MTS1 DNA序列和缺失分析，至少75％的黑素瘤細胞系含有突變型MTS1或者在兩條同源染色體上缺失該基因。
表5腫瘤中的體細胞MTS突變細胞系 突變 編碼效果 位置*SK-M-steG→A 無 240G→A gly→ser 241SK-M-swiC→T arg→終止 148SK-M-risG→A ala→thr 418SK-M-beh 缺失5個堿基移碼 266-270SK-M-178C→T arg→終止 214SK-M-staG→A trp→終止 306SK-M-utiC→T arg→終止 214SK-M-EML131缺失8個堿基 移碼 148-155C→A 無 147SK-M-kozC→T pro→leu 317(het.**) C→T 無 213C→T arg→終止 214SK-M-kraC→T pro→leu 317SK-M-kuuC→T 無 354SK-M-marG→A trp→終止 305SK-M-whiC→T gln→終止 124SK-M-adl 缺失2個堿基移碼 104-105(het.)*在SEQ ID NO1DNA序列中突變的位置**Het.表示“雜合子”，指在樣品中存在野生型和突變型序列。MTS1中的損傷優(yōu)勢(缺失和核苷酸置換)表示是MTS1或某個緊密連鎖的基因座造成腫瘤表型。受到損傷的細胞比沒有受到損傷的細胞具有選擇優(yōu)勢。另一種解釋認為這些損傷是與細胞生長無關的隨機事件，該解釋是不可能的。原因在于，首先，腫瘤表型和MTS1突變之間的高相關性暗示在MTS1突變和腫瘤形成之間存在因果關系。其次，MTS1影響黑素瘤的易感性，因此它具有獨立地作為腫瘤抑制基因的意義。再者，作為Cdk的強抑制p16劑的生物化學功能與p16在體內(nèi)作為DNA復制起始的通用抑制劑而發(fā)揮作用的模式很好地相符。
有可能MTS1的突變或缺失是在培養(yǎng)時細胞生長的結果。然而，高比例的原代白血病細胞也含有α-干擾素基因簇的純合缺失，該基因簇與MTS1相距不足500kb(Diaz et al.，1990)。以前的缺失研究表明，α-干擾素基因的缺失總是涉及那些向著絲點延伸超過MTS1的標記(Weaver-Feldhaus et al.，1994)。由于MTS1區(qū)域的純合缺失存在于原代腫瘤細胞和培養(yǎng)細胞系中，因此在腫瘤細胞系中觀察到的缺失不可能純粹是在培養(yǎng)時細胞生長造成的。然而，在腫瘤的發(fā)展中MTS1突變何時出現(xiàn)這一問題將由對原始腫瘤樣品的分析而給出最佳的回答。MTS1在體內(nèi)的作用在所有的真核細胞中，細胞分裂需要經(jīng)過兩個至關重要的決定點從G1向S的轉變，此時開始DNA合成，以及從G2向M的轉變，此時開始有絲分裂。在哺乳動物中，控制細胞分裂的機制涉及多種組份，其中許多是相關的(參見Sherr，1993)。Cdk可能是控制成分中的核心，因為它們通過使大量關鍵底物磷酸化而進行調(diào)控，這些底物接著引發(fā)從G1向S以及從G2向M的轉變。從G1向S的轉變可能是更為重要的決定點，因為它最先在細胞周期中出現(xiàn)。迄今為止，已經(jīng)鑒別出4種參與控制從G1至S的Cdk(Cdk2-5)和這些Cdk的一套正調(diào)控因子(細胞周期蛋白C、D1-3、E)。最近還鑒別出幾個負調(diào)控因子，包括p16、p15、p18、p20、p21和p27(Xiong et al.，1993；Serrano et al.，1993；Gu et al.，1993；El-Diery et al.，1993；Harper et al.，1993；Hannon and Beach，1994；Polyak etal.，1994b；Toyoshima and Hunter，1994；Guan et al.，1995)。這些負調(diào)控因子似乎是通過抑制Cdk的激酶活性而起作用的。某些細胞周期調(diào)控因子涉及人癌腫(可參考Hunter and Pines，1994)。p20抑制Cdk2以及可能其他的Cdk，而p16(也稱為MTS1、CdkN2或INK4a)抑制Cdk4但是在體外試驗中明顯地不抑制Cdk2(Serranoet al.，1993)?；隗w外研究和其與p53的相互作用，p21被認為是所有Cdk的通用抑制劑(Xiong et al.，1993)。因此在體外，p16比p21更具特異性。這些抑制劑中的每一種都阻止細胞進入S期。同樣，在某些乳房癌中細胞周期蛋白D1或Cdk4過度表達，而在大量細胞系和原代腫瘤中p16基因是突變或缺失的(Buckley et al.，1993；Caldas et al.，1994；Kamb et al.，1994b；Mori et al.，1994；Tam et al.，1994a)。這些結果暗示，某些細胞周期蛋白和Cdk是原癌基因而p16(MTS1)是腫瘤抑制因子基因。p15、p18，p21和p27的生物化學行為表明，它們也是腫瘤抑制因子，但是還沒有詳細的、有關它們基因在腫瘤或細胞系中突變分析的報道。本文提供的結果給出了MTS1在體內(nèi)作為細胞分裂抑制劑的證據(jù)。
位于人9號染色體9p21段的p16基因(MTS1)尤其令人感興趣，因為它在高比例的某些類型的癌腫和衍生自腫瘤的細胞系中突變或純合缺失(Caldas et al.，1994；Kamb et al.，1994b；Mori etal.，1994；Nobori et al.，1994)。另外，在幾個已知攜帶9p21連鎖黑素瘤易感性的親緣族中，MTS1突變與患黑素瘤的傾向性一起分離(Hussussian et al.，1994；Kamb et al.，1994a)。然而，對于MTS1在遺傳性和偶發(fā)性癌腫中的作用，還有一些未解決的問題。幾個對9p21標記具有高LOD值的、易患黑素瘤的親緣族在MTS1編碼序列中沒有發(fā)現(xiàn)突變。而且，腫瘤或細胞系中MTS1純合缺失優(yōu)勢對于腫瘤抑制基因失活而言也是不典型的，因而暗示在MTS1附近存在其他參與癌腫形成的基因。
最近的報道暗示，某些促有絲分裂和抗有絲分裂的信號影響細胞周期的進程，這種影響至少部分地是通過調(diào)控Cdk抑制劑的活性而進行的(Firpo et al.，1994；Hannon and Beach，1994；Kato etal.，1994；Polyak et al.，1994a；Slingerland et al.，1994)。例如，TGFβ誘導的細胞周期的抑制可以通過激活p15和p27而介導。相反地，在IL-2誘導的靜止T淋巴細胞的促有絲分裂過程中，p27被負調(diào)控。相對較少知道的是MTS1的調(diào)控。最近許多的報道提供的證據(jù)表明，MTS1的水平部分地由Rb蛋白質調(diào)控(Serrano et al.，1993；Li et al.，1994a；Tam et al.，1994b；Parry et al.，1995)。這些以及其他發(fā)現(xiàn)(Serrano et al.，1995)導致建立了一個MTS1作用的模型，其中MTS1抑制Cdk4/6，從而防止Rb的磷酸化。Rb隨后參與反饋環(huán)，限制MTS1的水平。
這些結果為MTS1在細胞周期的調(diào)控中起著杰出作用提供了遺傳證據(jù)。此外，這些結果暗示，體內(nèi)MTS1的靶目標是腫瘤形成的主要因素。如果MTS1在體內(nèi)抑制Cdk4而不是Cdk2，那么Cdk4是癌基因的強有力候選基因。在MTS1中普遍存在突變暗示，Cdk4在大多數(shù)(如果不是全部的話)細胞中是細胞分裂的通用激活劑。關于MTS1對不同Cdk影響的進一步生物化學研究有助于弄清在正常細胞和轉化細胞中Cdk活性的等級關系。與p16相似，如果p21是Cdk的通用抑制劑，那么其基因也會在高比例的腫瘤中缺失或突變。
如果MTS1是大多數(shù)正常細胞中處于活性狀態(tài)的通用腫瘤抑制因子，那么預計MTS1的種系突變會導致易患除黑素瘤之外的癌腫。例如p53基因的種系突變，就象在Li-Fraumeni綜合征中發(fā)現(xiàn)的突變一樣，會增加患多種癌腫的可能性，其中包括兒童期肉瘤、乳房癌(Malkin et al.，1990)。以前的研究發(fā)現(xiàn)，在某些易患黑素瘤的家族中，胰腺癌的發(fā)病率異乎尋常地高(Bergman et al.，1990；Nancarrow et al.，1993)。該觀察結果與在胰腺腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)存在MTS1的純合缺失相一致。有可能MTS1傾向性遺傳與MTS1體細胞遺傳是不同的。例如，由于選擇的劣勢，MTS1周圍區(qū)域缺失數(shù)千堿基對DNA的大缺失可能不存在于人基因庫中。然而，這種缺失在轉化的體細胞中可能是有利的，這可能是因為它們?nèi)コ硕鄠€基因。這種可能性與存在另一個與MTS1極其相似的基因即MTS2相一致。MTS2位于MTS1外顯子1的上游約12kb處，MTS2第一個外顯子位于MTS2第二個外顯子的上游約2.5kb處。MTS2按與MTS1類似的方式發(fā)揮其功能。與僅使兩個基因中任一個失活的突變相比，將MTS1和MTS2都去除的缺失可以給細胞提供更大的生長優(yōu)勢?；蛘?，這兩個基因是在不同的或部分相同的細胞種類中發(fā)揮作用。這些可能性需要進一步的研究。實施例10MTS1E1β的突變分析由于在衍生自腫瘤的細胞系中失活p16純合缺失占優(yōu)勢，以及9p21連鎖的、易患黑素瘤的親緣族沒有p16的突變，所以導致其他人士提出在p16附近存在其他的同樣涉及癌腫形成的基因(Cairnset al.，1994；Spruck et al.，1994)。如果E1β編碼調(diào)控細胞生長中所涉及的蛋白質，那么這些序列就可能含有存在于偶發(fā)性和/或家族性癌腫中的、在較早期研究中所錯過的突變。因此，在從各種不同的腫瘤所衍生而得的細胞系中以及在某些易患黑素瘤的親緣族中篩選E1β的突變。
已有關于易患黑素瘤家系的遺傳特性的報道(Cannon-Albrightet al.，1992)。從易患黑素瘤的親緣族(Kamb et al.，1994a)以及從細胞系(Liu et al.，1995)中分離基因組DNA的過程已有描述。用正向引物(5′-AGTCTGCAGTTAAGG-3′SEQ ID NO33)和反向引物(5′-GGCTAGAGGCGAATTATCTGT-3′SEQ ID NO34)對E1β進行PCR擴增，在下列條件下進行30個循環(huán)97℃3秒、65℃10秒、75℃20秒。將擴增反應產(chǎn)物稀釋100倍，然后在同樣的反應條件下，使用同樣的正向引物和不同的反向引物(5′-CACCAAACAAAACAAGTGCCG-3′SEQ ID NO35)再次擴增。PCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，然后用Qiagen珠(Qiagen，Inc)進行抽提。獲得的產(chǎn)物用Cyclist測序試劑盒(Stratagene)及上述的正向引物(SEQ ID NO33)測序。
在一組來自4種腫瘤(表6)、共計24個細胞系中，以及在患病家族成員之間共同攜帶明顯的單倍型、但以前研究(Kamb et al.，1994a)沒有發(fā)現(xiàn)p16突變的6個黑素瘤親緣族(Cannon-Albright etal.，1992)中，沒有檢測到E1β的序列突變體。這些試驗暗示，在腫瘤的進程中，E1β突變不是常見的事件，而且它們與這些親緣族中9p21連鎖的黑素瘤易感性無關。
表6篩選E1β突變的細胞系類型數(shù)目肺(癌)3膀胱(癌) 7神經(jīng)膠質瘤9黑素瘤5總計1 24注1以前并沒有表明這些細胞系在p16區(qū)域含有純合缺失或攜帶p16編碼序列的突變(Liu et al.，1995)。根據(jù)以前的結果(Liuet al.，1995)，在膀胱和黑素瘤組中，應有類似數(shù)目和類型的細胞系在p16編碼序列有4個點突變。實施例11對MTS2進行突變篩選細胞系中的MTS2突變在衍生自腫瘤的細胞系中，去除MTS1的純合缺失優(yōu)勢暗示，在MTS1附近存在另外的、涉及癌腫形成的基因。如果MTS2基因涉及偶發(fā)性癌腫，那么在腫瘤細胞系中可能含有突變。因此，在一組腫瘤細胞系中篩選MTS2編碼序列的突變。
按Kamb等人(1994a)所述的方法，通過PCR擴增MTS2的外顯子1和2。使用引物對2E1.F1(5′-AGGGAAGAGTGTCGTTAAG-3′SEQ ID NO19)和2E1.R2(5′-AGACTCCTGTACAAATCTAC-3′SEQ ID NO20)來獲得外顯子1。使用引物對89F(SEQ IDNO12)和50R(SEQ ID NO11)來獲得外顯子2。擴增后，DNA產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，然后用Qiagen珠(Qiagen，Inc)進行抽提。獲得的產(chǎn)物用Cyclist測序試劑盒(Stratagene)及引物2E1.F1對外顯子1測序，用引物89F和50R對外顯子2測序。
在一組衍生自膀胱癌、神經(jīng)膠質瘤、星形細胞瘤、腎癌、肺癌和黑素瘤的細胞系中，篩選MTS2編碼序列的突變。所有這些細胞系類型都高頻率地含有MTS1和MTS2的純合缺失(Kamb et al.，1994b)。衍生自黑素瘤、腎癌、肺癌和膀胱癌的細胞系含有MTS1點突變或移碼突變(Liu et al.，1995)。然而，神經(jīng)膠質瘤和星形細胞瘤的細胞系不含有這種類型的MTS2突變。用于這些篩選試驗的特殊細胞系是從一組以前表明不攜帶MTS2和MTS1序列純合缺失的細胞系中選出(Kambét al.，1994b)。
在篩選的58個細胞系中的任一個中都沒有在MTS2編碼序列中發(fā)現(xiàn)MTS2突變(表7)。根據(jù)以前對這些細胞系類型中MTS1的研究，該組細胞系中應含有約8個局限于膀胱癌、黑素瘤、肺癌和腎癌組的MTS1突變(Liu et al.，1995)。因此，從這組腫瘤細胞系中沒有獲得有關MTS2體細胞突變的證據(jù)。
表7細胞系中MTS2突變的篩選多態(tài)性1細胞系類型 #篩選數(shù)目 #變化的數(shù)目 變化類型 編碼效果星形細胞瘤 20膀胱(癌)41 G→A；C→A無神經(jīng)膠質瘤 60黑素瘤 17 2 G→A；C→A無腎(癌) 41 G→A；C→A無肺(癌) 10 1 G→A；C→A無小細胞肺(癌)72 G→A；C→A無非小細胞肺(癌) 80總計58 71這些常見的多態(tài)性(Kamb et al.，1994a)位于內(nèi)含子1，靠近核苷酸位置-27(C至A)和-103(G至A)處的3′受體位置。在親緣族中篩選MTS2突變在無MTS1編碼序列突變的9p21連鎖的易患黑素瘤親緣族中，MTS2基因可能是造成黑素瘤易感性的原因，這一可能性吸引人們把它弄清楚。已有關于易患黑素瘤家系的遺傳特性的報道(Cannon-Albright et al.，1992)。使用標準程序，利用從全血中分離出的淋巴細胞，分離出來自家族成員的基因組DNA(Kamb et al.，1994a)。如上所述，在具有高LOD值的9p21連鎖易患黑素瘤且以前的研究(Kamb et al.，1994a)沒有發(fā)現(xiàn)MTS1突變的親緣族中(見表8)，篩選MTS2編碼序列的突變。沒有檢測到MTS2突變。因此，這些試驗沒有提供MTS2損傷造成遺傳性黑素瘤的證據(jù)，盡管僅依據(jù)這些有限的試驗還不能將這種可能性排除。
表8在易患黑素瘤的親緣族中篩選MTS2種系突變親緣族 LOD值 病例總數(shù) 攜帶單倍型的數(shù)目3346 5.9721 213137 1.9 17 211764 1.04443006 0.19633161 -0.01 10 83343 -0.53 10 8實施例12MTS1和MTS1E1βRNA的表達兩個p16啟動子p16mRNA的兩種不同形式可能通過兩種不同的途徑形成。轉錄可以從不同的啟動子起始，或者mRNA可以得自同一個啟動子，然后進行不同的拼接產(chǎn)生不同形式的轉錄物。
因為甚至當上游的E1β序列缺失時，α形式也可以在細胞系中轉錄，所以說明存在獨立的α轉錄及β轉錄啟動子。細胞系A375和SK-mel含有一種缺失，該缺失在E1α和E1β之間存在一個斷點(圖13)。這個近端的斷點在這兩個細胞系中還沒有被準確定位，但是位于E1β5′端上游至少85kb處。用α-特異性引物進行逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)，這兩種細胞系都表達α轉錄物(圖15)。RT-PCR的程序如下從T細胞、細胞系或人組織分離的總RNA(Sambrooket al.，1989)合成cDNA(Clontech)。cDNA反應采用9聚物引發(fā)DNA的合成并且使用SuperscriptII反轉錄酶(Betheda ResearchLaboratories)。通過將α32P-dATP(Amersham)摻入合成反應物(0.1Ci/mmol)，然后測定摻入到最終產(chǎn)物中的放射性核苷酸的數(shù)量，從而計算出cDNA產(chǎn)率。用PCR方法，使用α或β特異性地來自E2的正向引物和半嵌套反向引物，通過連續(xù)兩輪擴增分析p16α和p16β轉錄物水平。在第一次擴增中，用α-特異性引物AS.1(5′-CAACGCACCGAATAGTTACG—3′SEQ ID NO26)或β-特異性引物BS.1(5′-TACTGAGGAGCCAGCGTCTA-3′SEQ ID NO27)以及X2.R140′(5′-AGCACCACCAGCGTGTC-3′SEQ ID NO22)擴增2ng的cDNA模板。反應是在Perkin-Elmer9600熱循環(huán)儀上，按下列條件進行20個循環(huán)97℃3秒；65℃10秒；75℃20秒。反應產(chǎn)物稀釋100倍，然后用引物AS.1或BS.1和X2B(5′-CGTGTCCAGGAAGCCC-3′SEQ ID NO23)再次進行擴增。X2B寡聚物在其5′端用γ32P-dATP(DuPont)進行標記(Sambrook etal.，1989)。PCR條件如上，但是只進行15個循環(huán)。為了消除由于基因組DNA污染造成的問題，PCR產(chǎn)物跨E1α或E1β/E2拼接點。產(chǎn)物通過在5％變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分開。抽干的凝膠用X-OMAT(柯達)膠片曝光過夜。
結果暗示，α轉錄物從獨立于E1β5′序列的啟動子處開始轉錄。另一種解釋是，缺失導致異位啟動子序列與E1α融合。但是，這似乎不可能，因為A375和SK-mel93是各自獨立分離的細胞系。α啟動子的準確位置還不清楚，但是RNase保護分析表明，它至少位于p16起始密碼子上游440bp處。因此，人p16基因是復雜的，它具有兩種部分重疊的轉錄物。這兩種轉錄物具有不同的編碼潛力，而且由不同的啟動子Pα和Pβ產(chǎn)生。
p16的表達方式有關基因功能的線索來自對基因在不同組織中表達方式的分析。為了確定p16的表達方式，從11個組織中制備一套cDNA樣品，然后用α和β特異性引物進行篩選(圖16A-D)。在所有檢測的組織中都檢測到兩種形式的p16轉錄物，盡管存在一些差異。例如，在脾中，α和β形式之間的比率傾向于β。相反，在乳房中該比率傾向于α。這些表達數(shù)據(jù)與某些研究相符，這些研究發(fā)現(xiàn)在來自許多不同組織類型的細胞系中，都存在p16的缺失和點突變(Kamb et al.，1994b；Liu et al.，1995)，這暗示p16在多種組織中具有作用。
考慮到p16的生物化學功能，即在體外表現(xiàn)為Cdk4和Cdk6的抑制劑(Serrano et al.，1993；Li et al.，1994a；Parry et al.，1995)，可以在細胞周期時分析細胞中p16的表達。用植物凝集素(PHA)加上白細胞介素-2(IL-2)刺激人外周血淋巴細胞(PBL)，在刺激后不同時間內(nèi)收獲細胞。這些細胞用流式細胞儀分析以確定細胞所處的周期階段，用RT-PCR分析以確定p16基因表達的相對水平，以及用Western印跡法分析以確定p16蛋白質的水平。從正常的成年供者抽取血液，然后從中分離出外周血淋巴細胞并且通過在Ficoll-Hypaque梯度(Boyum，1968)中懸浮而部分純化。再按以前所述的逆流淘析法(Elstad et al.，1988)進一步純化淋巴細胞。原作者估計，用這種方法制備的細胞群98％是純的B和T細胞。純化的細胞在添加10％小牛血清的RPMI(Gibco)中生長，用10μg/mlPHA(Sigma)和10U/ml IL-2(Sigma)誘導靜止細胞。用流式細胞儀監(jiān)視細胞周期的進展。按制造商所述的方法，用RNazol B(CINNA/BIOTECX Laboratories，Inc.)從原代T細胞中分離出RNA。用誘導后分離出的T細胞cDNA制作一系列的稀釋物，從而確定PT-PCR的量。確定靶目標不再被擴增時的稀釋倍數(shù)，從而確定存在于未稀釋樣品中的靶cDNA的數(shù)量。盡管來自不同PCR試驗的結果是相符的，但是稀釋試驗表明，只有當RNA水平差異大于4倍時才能檢測出RNA水平的變化。得自Rb+和Rb-細胞系的cDNA樣品都用這種方式進行分析。對于各種cDNA樣品(無論來自組織、細胞系還是T細胞)，都輕易地檢測到人肌動蛋白，并且它們的含量大體相同。
兩種形式p16轉錄物的比率在細胞周期中發(fā)生顯著的變化(圖6B-C)。起初，B形式較少，但是在刺激后30—40小時，其水平開始上升。同時，α形式的表達水平維持相對穩(wěn)定，也許只有稍許增加。通過使用流式細胞儀發(fā)現(xiàn)，比率的變化與離開G0期進入S期的細胞相關。用模板稀釋試驗檢測RT-PCR的量。這些試驗表明，RT-PCR可以檢測轉錄水平4倍或更大的變化。估計β誘導至少為10倍。因此，當細胞進入細胞周期時，它們改變兩種p16轉錄物的相對量使得比率的變化傾向于β。
我們還檢測了當T細胞通過細胞周期時，p16蛋白質表達的水平。在促有絲分裂誘導后的不同時期分離蛋白質，然后對分離的蛋白質進行Western印跡分析。用針對完整多肽C-末端20個氨基酸的p16抗體測定p16蛋白質的水平。當細胞離開G0期時，p16蛋白質的水平維持相對穩(wěn)定。因此，在細胞周期中p16編碼RNA(α轉錄物)和p16蛋白質兩者都維持相對穩(wěn)定。有其他學者報道，在S期p16水平會有溫和增加(Tam et al.，1994b)。我們沒有觀察到p16的增加，這可能反映了在不同細胞類型中p16調(diào)控的差異，或者是因為在檢測蛋白質(或cDNA)水平增加2—3倍時存在問題。
p16在腫瘤細胞系中的表達以前的研究表明，Rb影響p16的表達(Serrano et al.，1993；Liet al.，1994a；Parry et al.，1995)。我們測試了細胞中Rb狀態(tài)對βmRNA表達的影響(圖16D)。從一組細胞系中制備cDNA，其中5個含有野生型的Rb蛋白質，6個含有無功能的Rb蛋白質(Parry etal.，1995)。正如預計的那樣，僅在Rb陰性細胞系中檢測到α轉錄物。但是，在Rb陽性和Rb陰性細胞系中都檢測到β轉錄物。因此，與α相反，βRNA的表達與衍生自腫瘤的細胞系中Rb的突變狀態(tài)無關。
有證據(jù)表明，p16是多基因家族的成員(Guan et al.，1995)。與其他多基因家族相似，該家族的成員可能執(zhí)行著重復的功能、不同的功能或者以不同的暫時性或組織特異性方式執(zhí)行著功能。因此，考慮到p16蛋白質的低水平和明顯沒有Rb對p16的調(diào)控，有可能p16不在T淋巴細胞中調(diào)控細胞周期。然而因為當誘導T細胞時，β轉錄物顯著地被誘導，而且又因為在高比例的T細胞衍生腫瘤中p16是缺失的(Hebert et al.，1994)，因此，似乎p16在人T細胞中起著重要作用。僅在用病毒轉化的細胞系或衍生自腫瘤的細胞系中，觀察到Rb對p16的明顯影響。也許，在野生型組織中p16是按其他方式被調(diào)控的。
E1β是p16的保守和調(diào)控部分盡管，β轉錄物的作用不明，但是結果表明它對于p16基因座的功能至關重要，因為(i)E1β在鼠中是保守的；(ii)β轉錄物的相對含量按組織特異性和依賴于細胞周期的方式進行調(diào)控和(iii)兩個細胞系攜帶的純合缺失去除E1β，而不是E1α。這些結果暗示，E1β是野生型p16發(fā)揮功能所必需的。
分離鼠的βcDNA，并且與人的MTS1E1β比較。用稱為雜交體捕獲RACE(HCR)的改良雜交體選擇程序分離鼠cDNA克隆。從鼠的乳房和胸腺中分離出富含poly-A+的RNA。第一條cDNA鏈的合成反應(Sambrook et al.，1989)采用隨機的12聚物和SuperscriptII反轉錄酶(Bethesda Research Laboratories)。在第二條鏈合成之后，通過將特異性的雙鏈寡聚物(雙鏈RP.2)(5′-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTGTTC-3′SEQ ID NO28)連于其5′端而將cDNA錨住。第二條cDNA鏈的5′端是在連接反應中唯一被磷酸化的DNA末端。在連接反應后，錨住的cDNA通過在SepharoseCL-4B柱洗脫而純化。錨住的cDNA用p16特異性反向引物(5′-AGCGTGTCCAGGAAGCCTTC-3′SEQ ID NO29)和嵌套式RP.2(RP.B)(5′-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTG-3′SEQ ID NO30)進行擴增，隨后用位于第一次擴增所用反向引物上游處的、生物素標記的基因特異性寡核苷酸(5′-ACTGCGAGGACCCCACTACCTTCTCC-3′SEQ ID NO31)進行捕獲。捕獲的cDNA被再次擴增，其中使用RP.B和位于捕獲寡核苷酸上游處的、基因特異性反向引物(5′—GAACGTTGCCCATCATCATC-3′SEQ ID NO32)。獲得的產(chǎn)物被凝膠純化、克隆和測序。通過克隆和對鼠基因組克隆(含有在低嚴緊性下與人E2探針雜交序列)進行測序而確定鼠p16寡核苷酸的序列。
將鼠β轉錄物與人進行比較，結果暗示，E1β并不編碼蛋白質。只有含有E2中p16閱讀框的序列是嚴格保守的。因此，如果β轉錄物被翻譯，那么似乎蛋白質會從E2中起始而且按照與編碼p16同樣的閱讀框進行翻譯。推導出的多肽的計算分子量為10kDa，而且保留p16中4個錨蛋白(ankyrin)重復序列中的23/4。然而，p15僅含有31/2錨蛋白重復序列(Hannon and Beach，1994)，而其他蛋白質的折疊和發(fā)揮功能只有1或2個重復。p10分子是否存在于體內(nèi)以及它是否抑制Cdk4/6還需要進一步測試。
βRNA的功能如果β轉錄物的角色是抑制細胞生長，那么我們能夠在衍生自腫瘤的細胞系中發(fā)現(xiàn)中斷E1β的突變形式。與該觀點相符的是兩個黑素瘤細胞系，它們的缺失是將E1β去除但是仍然能夠繼續(xù)表達a轉錄物。在這些細胞系中p16編碼序列是野生型的。然而，在一組25個腫瘤細胞系中沒有發(fā)現(xiàn)E1β中小的遺傳損傷(例如堿基置換)。因此，還難于作出結論E1β是純合缺失的目標。如果E1β外顯子不編碼蛋白質，那么小的遺傳損傷不足以中斷其功能?；蛘撸鲜鋈笔У哪繕丝赡苁瞧渌?。例如，有可能在這些黑素瘤細胞系中p15基因(MTS2)是缺失的相關目標。在這種觀點中，E1β缺失純粹是因為，與E1α相比，它更靠近P15。然而，因為我們不能在許多細胞系中檢測P15的點突變，又因為沒有細胞系是含有特異性地去除p15的缺失(Kamb et al.，1994b)，因此這種解釋似乎是不可能的。
遺傳證據(jù)暗示，p16和Rb是生長調(diào)控途徑中的成員，該路徑在腫瘤發(fā)生過程中經(jīng)常被失活。如果β轉錄物的角色是負調(diào)控細胞生長，那么它可能是另一個一定是獨立于p16和Rb突變的路徑的一部分。這樣便可以解釋為什么特異性中斷E1β的缺失只有在Rb-細胞系中才能觀察到。根據(jù)E1β的表達方式，E1β似乎在活躍的循環(huán)細胞中起作用。關于E1β角色的明確結論有待于分析其在體內(nèi)的表達。實施例13MTS2 mRNA的表達按制造商所述的方法，用RNazol B(CINNA/BIOTECXLaboratories，Inc.)從細胞系或原代T細胞中分離出RNA。從總RNA(Sambrook et al.，1989)合成cDNA，其中采用隨機9聚物引發(fā)DNA的合成。通過將α32P-dATP(Amersham)摻入合成反應物(0.1Ci/mmol)，然后測定摻入最終產(chǎn)物中的放射性核苷酸的數(shù)量，從而計算出cDNA產(chǎn)率。用PCR方法，使半嵌套(heminested)反向引物，通過連續(xù)兩輪擴增而分析MTS2的表達。在第一次擴增中，用E1F(5′-TGAGGGTCTGGCCAGC-3′SEQ ID NO21)和X2.R140′(5′-AGCACCACCAGCGTGTC-3′SEQ ID NO22)擴增2ng的cDNA模板。反應是在Perkin-Elmer9600熱循環(huán)儀上，按下列條件進行20個循環(huán)97℃3秒；65℃10秒；75℃20秒。反應產(chǎn)物稀釋100倍，然后用引物E1F和X2B(5′-CGTGTCCAGGAAGCCC-3′SEQ ID NO23)再次進行擴增。X2B寡聚物在其5′端用γ32P-dATP(DuPont)進行標記(Sambrook etal.，1989)。PCR條件如上，但是只進行15個循環(huán)。產(chǎn)物通過在5％變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳而分開。抽干的凝膠用X-OMAT(柯達)膠片曝光過夜。
在不同組織中MTS2的表達已發(fā)現(xiàn)，MTS2在許多組織類型中表達，包括那些MTS2純合缺失導致腫瘤的類型(見圖10A)。但是，在不同組織中還是存在某些差異。例如，在肺中MTS2轉錄物能輕易地被檢測到，但是在前列腺和腦組織中檢測不出。相反，在所有檢測的細胞中都可以檢測到緊密相關的MTS1基因的表達。目前還不清楚MTS2 RNA水平的這種組織特異性差異是否反映了對MTS2蛋白質的組織特異性需求。
在細胞周期中MTS2的表達如果MTS2調(diào)控細胞周期中的重要轉變，那么其表達會在細胞周期中變化。例如，在正常分裂細胞中，p21 mRNA的豐度會隨細胞周期各階段的不同而變化(Li et al.，1994b)。為了測試MTS2的轉錄是否在細胞周期中被調(diào)控，用PHA和IL2刺激靜止的人T細胞，并在刺激后的不同階段進行監(jiān)測(見圖10B)。當細胞離開G0期通過細胞周期各階段時，沒有檢測到MTS2表達水平的明顯變化。相反，調(diào)控基因Cdk4的表達按人們的預期發(fā)生變化(Matsushime et al.，1992)。因此，關于通過正常分裂細胞的周期時MTS2 mRNA的差異性表達方面的證據(jù)，還沒有發(fā)現(xiàn)。
已提出，MTS1蛋白質參與一個涉及成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白質Rb的生長調(diào)控途徑(Serrano et al.，1993；Guan et al.，1995；Serranoet al.，1995)。最近的研究提供了強有力和詳盡的證據(jù)，支持MTS1至少部分地受Rb的調(diào)控(Li et al.，1994a；Parry et al.，1995)。MTS1和MTS2之間的生物化學方面的相似性暗示，MTS2也可能受Rb的調(diào)控。這種可能性可以通過比較MTS2 mRNA在Rb陽性細胞系和Rb陰性細胞系中的水平(濃度)加以確認。沒有檢測到Rb狀態(tài)和MTS2 RNA水平之間的相關性(見圖10C)。這暗示，細胞系的Rb狀態(tài)并不顯著地影響MTS2轉錄物的豐度。因此，與MTS1相反，MTS2的表達是獨立于Rb的。實施例14MTS1和MTS2的異位表達通過聚合酶鏈反應，使用引物MTS1.F(5′-AAA GGA TCCATT GCC ACC ATG GAG CCG GCG GCG GGG AGC AGC ATGGAG CCT TCG GCT-3′)(SEQ ID NO17)和E3.R(5′-TTTGAA TTC AAT CGG GGA TGT CTG—3′)(SEQ ID NO18)擴增出MTS1的483bp片段。設計的引物MTS1.F在5′端附近含有限制性內(nèi)切酶位點以便以后的克隆，并且含有Kozak共有序列(Kozak，1987)。用于該反應的模板DNA來自乳房組織的cDNA。將產(chǎn)生的片段插入已用EcoRI和BamHI消化的表達載體pcDNA3(In Vitrogen)。pcDNA3含有巨細胞病毒(CMV)啟動子和編碼氨芐青霉素和新霉素抗性的密碼子。產(chǎn)生的重組載體pcDNAp16，再通過電穿孔進入細胞系HS294T。HS294T來自黑素瘤并且含有MTS1和MTS2的純合缺失。HS294T在添加有10％小牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和L-谷氨酸鹽的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco)中生長。細胞在37℃，于5％二氧化碳中生長。HS294T與pSS(Stratagene)按1∶4的比例進行共轉化從而將潮霉素抗性賦予轉化細胞，與此同時，HS294T與含有插入在CMV啟動子下游的MTS1編碼序列的pcDNA3(Invitrogen)表達載體，或不含有插入子的pcDNA3載體共轉化。
將MTS2的編碼序列同樣地克隆入pcDNA3，同樣地也形成Kozak共有序列，從而產(chǎn)生pcDNAp15，然后將其導入HS294T。其中，使用在實施例13中制備的MTS2 cDNA。
將含有潮霉素抗性選擇標記的質粒pSS(Stratagene)與pcDNAp16或pcDNAp15同時共轉化，在電穿孔中每樣品池含20微克pSS。電穿孔的條件為每樣品池800微升細胞(1.5×106細胞/毫升)和500微法(μF)電容，400伏特。用pcDNA3和pSS進行對照試驗。將電穿孔后的細胞(約400微升)置于含300微克/毫升潮霉素的培養(yǎng)皿中。14天后對集落進行計數(shù)。結果列于表9。
9pcDNAp15 pcDNAp16質粒 集落/平板集落/平板pcDNA3＋pSS 26.6±4.8 17.2±0.15pcDNAp15＋pSS 3.8±0.8——pcDNAp16＋pSS ——1.1 ±0.5當含有融合于CMV啟動子的全長MTS2編碼序列的構建物被轉化入HS294T時，與對照相比，它以七倍的比例抑制集落形成，因此可以與MTS1異位表達相匹配。該結果表明，MTS2的異位表達足以抑制細胞的生長。還不清楚轉化的細胞是否是停在G1期(如同MTS1異位表達所造成的那樣)，或者其生長是以其他方式被終止的。從表9可以得出結論，在原本缺乏p15或p16表達(此處是因為純合缺失)的細胞系中，p15或p16過度表達會抑制細胞的生長。精確的機制還不清楚，但可能是由于p15或p16過度表達使細胞分裂停止或殺死細胞。這些實驗數(shù)據(jù)暗示，p15和p16在體內(nèi)的確是作為腫瘤抑制蛋白，因此p15和p16可能具有治療用途。
出于多種原因，MTS2是腫瘤抑制基因的有力候選基因。它具有廣泛的與MTS1序列相似性，它在體外與Cdk結合并且抑制其活性，而且體內(nèi)MTS2的異位表達抑制細胞生長。上述結果導致存在這樣的可能性盡管MTS2和MTS1之間存在生物化學方面的相似性，但是兩種蛋白質在體內(nèi)具有很不相同的功能。MTS2的兩個特征暗示，情況可能是這樣的i)是MTS2而不是MTS1被TGFβ誘導(Hannon and Beach，1994)和ii)與MTS1不同，MTS2的轉錄似乎與Rb無關。可能MTS2根本不涉及腫瘤形成。或者，MTS2參與一個與涉及MTS1的途徑不同的腫瘤抑制途徑。該途徑中的各種因子還不清楚，但是可以想象，其中某些因子在體細胞中會以比MTS2高得多的頻率發(fā)生突變。在這種觀點中，缺乏MTS2的體細胞突變并不能排除其在腫瘤抑制中的重要角色。如上所述，MTS2的異位表達抑制細胞生長，這角色與MTS2是腫瘤抑制因子相符。MTS2表達水平在細胞周期中是穩(wěn)定的，而且它被TGFβ誘導，這些暗示，在G1期的停止中，MTS2發(fā)揮作用，而不必一定調(diào)控細胞周期中各事件的時機。相反，MTS1的表達受Rb的調(diào)控，這表示MTS1在細胞周期轉變中起作用。因此有必要測試MTS2作為體內(nèi)生長調(diào)控分子的功能，并且分析MTS2發(fā)揮功能的途徑。實施例15兩步法檢測樣品中存在的MTS根據(jù)Antonarakis等人的方法(1985)處理病人樣品，通過1％瓊脂糖凝膠而分開，然后轉至尼龍膜上供Southern印跡分析。膜在150mJ時，用GS基因接頭(GS Gene Linker)(Bio-Rad)進行UV交聯(lián)。對應于SEQ ID NO4中核苷酸448-498位置的MTS探針被亞克隆入pTZ18U。將噬菌粒(phagemid)轉化入用M13K07輔助噬菌體(Bio-Rad，Richmond，CA)感染的大腸桿菌MV1190。用標準程序(見Sambrook，et al.，1989)分離單鏈DNA。
印跡在65℃、7％十二烷基磺酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4中預雜交15-30分鐘。該方法與Nguyen等人(1992)所述的方法相同。印跡在65℃、7％SDS、0.5M NaPO4中與25-50ng/ml單鏈DNA探針雜交過夜。雜交后進行洗滌，其中包括在65℃、5％SDS、40mM NaPO4中洗滌30分鐘，共二次，然后在65℃、1％SDS、40mM NaPO4中洗滌30分鐘，共二次。
接著，印跡用磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH6.8)在室溫下漂洗5分鐘，與含0.2％酪蛋白的PBS于室溫下保溫30—60分鐘，然后在PBS中漂洗5分鐘。然后，印跡在搖動水浴中，于45℃，用雜交緩沖液(6M尿素、0.3M NaCl和5X Denhardt′s溶液(見Sambrook，etal.，1989))預培育5—10分鐘。移去緩沖液，并代之以50-75微升/cm2新鮮雜交緩沖液加上2.5nM共價相連的寡核苷酸-堿性磷酸酶偶聯(lián)物，其中核苷酸序列與通用引物位置(UP-AP，Bio-Rad)互補。印跡在45℃雜交20—30分鐘，雜交后的洗滌是在6M尿素、1×標準檸檬酸鹽水(SSC)、0.1％SDS中于45℃洗滌10分鐘，二次；然后在1×SSC，0.1％TritonX-100洗滌10分鐘，一次。印跡在室溫下用1×SSC漂洗10分鐘。
印跡在搖動水浴中，于室溫下，在底物緩沖液(0.1M二乙醇胺、1mM MgCl2、0.02％疊氮化鈉、pH10.0)中培育10分鐘。各印跡和底物緩沖液以及0.2mM AMPPD(3-(2′-螺金剛烷)-4-甲氧基-4-(3′-磷?；趸?苯基-1，2-二氧雜環(huán)丁烷，二鈉鹽，Bio-Rad)被一起置于熱封閉袋中。在室溫下，搖動保溫20分鐘后，移去多余的AMPPD溶液。印跡用X光底片曝光過夜。陽性條帶表示存在MTS。實施例16產(chǎn)生針對MTS的多克隆抗體MTS編碼序列的片段在大腸桿菌中作為融合蛋白進行表達。高表達的蛋白質用凝膠洗脫法進行純化，并按類似于Harlow和Lane(1988)所述的程序免疫兔和小鼠。已表明該程序可以產(chǎn)生針對各種其他蛋白質的抗體(例如參見Kraemer，et al.，1993)。
簡言之，將MTS編碼序列區(qū)段作為質粒PET5A(Novagen，Inc.，Madison，WI)中的融合蛋白進行克隆。MTS整合序列包括對應于SEQ ID NO4中448-498的氨基酸。用IPTG誘導后，通過SDS/PAGE證實具有預計分子量的融合蛋白的表達。融合蛋白用電洗脫法從凝膠中純化出。通過在N末端的蛋白質測序鑒別出蛋白質是MTS融合產(chǎn)物。接著，純化的蛋白質被用作免疫原去免疫兔。免用100微克蛋白質和完全Freund佐劑進行免疫，然后按3周間隔再進行兩次，第一次用100微克免疫原和不完全Freund佐劑，第二次用100微克免疫原和PBS。在此之后兩周收集含有抗體的血清。
重復該程序，以獲得針對MTS基因突變型形式的抗體。這些抗體，以及針對野生型MTS的抗體，被用于在不同的組織和生物體液中檢測突變型形式的存在及相對水平。實施例17產(chǎn)生針對MTS的單克隆抗體用下列方案產(chǎn)生單克隆抗體。使用含有完整MTS或MTS肽(野生型或突變型)的免疫原免疫小鼠，該MTS或MTS肽用戊二醛或EDC連于鑰孔血藍蛋白。這些是本領域中熟知的。
將免疫原和佐劑混合。每個小鼠接受4次10—100微克免疫原的注射，在第4次注射之后，從小鼠中采集血液樣品以確定血清中是否含有針對免疫原的抗體。用ELISA或RIA確定血清效價。選出血清中表明存在針對免疫原的抗體的小鼠，用于產(chǎn)生雜交瘤。
從免疫小鼠中取出脾臟，制備單細胞懸浮液(見Harlow andLane，1988)。基本上用Kohler和Milstein(1975)所述的方法融合細胞。簡言之，按Harlow和Lane(1988)所述的方法，用聚乙二醇將P3.65.3骨髓瘤細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD)和免疫脾細胞融合在一起。按2×105細胞/孔的密度將細胞置于96孔的組織培養(yǎng)板上。檢查各孔是否有細胞的生長，并且對生長的孔中的上清液通過ELISA或RIA，用野生型或突變型MTS靶蛋白進行測試以確定MTS特異性抗體的存在。對陽性孔中的細胞繼續(xù)進行培養(yǎng)并且亞克隆以獲得并證實單克隆系。
具有所需特異性的克隆在小鼠中作為腹水或者在空心纖維系統(tǒng)中繼續(xù)繁殖和生長，從而產(chǎn)生出足夠的抗體供研究和分析之用。實施例18MTS的夾心分析將單克隆抗體連于固相表面，例如板、試管、珠或顆粒。較佳地，抗體被附著于96孔ELISA板的孔表面。將含有MTS肽/蛋白質(野生型或突變型)的100微升樣品(例如血清、尿液、組織胞液)加至固相抗體。樣品在室溫下保溫2小時。接著倒去樣品液體，用緩沖液洗滌固相以去除非結合的物質。將第二種單克隆抗體(針對MTS肽/蛋白質的不同的抗原決定簇)加至固相。該抗體是用檢測分子(例如I125、酶、熒光基團、生色基團)標記的。固相和第二種抗體在室溫下保溫2小時。倒去第二種抗體，用緩沖液洗滌固相以去除非結合的物質。
定量地測定結合標記物的數(shù)量，它與樣品中MTS肽/蛋白質的數(shù)量成正比例。再使用對野生型MTS特異的單克隆抗體以及對各種MTS突變特異的單克隆抗體進行分析。
很明顯地，本發(fā)明的方法和內(nèi)容可以用于各種不同的實施例中，其中只有一小部分公開于此。本領域中的熟練技術人員知曉，還存在其他的體現(xiàn)形式(或實施例)，這些都是屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)。因此，上述的實施例只用于闡述目的，并不用于限制目的。參考文獻清單American Cancer Society (1992). In Cancer Facts and Figures-1992.Anand，R.(1992).Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press).Anderson，et al.(1980).Proc. Natl. Acad.Sci.USA775399-5403.Anderson，J.A.，et al.(1992).J.Otolaryngology21321.Antonarakis，S.E.，et al.(1985).NewEngl.J.Med.313842-848.Ausubel，F(xiàn).M.，et al.(1992).Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley and Sons，NewYork. New York).Beaucage & Carruthers(1981). Tetra.Letts.221859-1862.Bergman，W.，et al.(1990).Br.J.Cancer61，932-936.Berkner(1992).Curr.Top.Microbiol.Immunol.15839-61，Berkner，et al.(1988). 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專利和專利申請清單美國專利No.3,817,837美國專利No.3,850,572美國專利No.3,939,350美國專利No.3,996,345美國專利No.4,275,149美國專利No.4,277,437美國專利No.4,366,241美國專利No.4,376,110美國專利No.4,486,530美國專利No.4,683,195美國專利No.4,683,202美國專利No.4,81 6,567美國專利No.4,868,105美國專利No.5,252,479EPO出版物No.225,807歐洲專利申請出版物No.0332435Geusen，歐洲專利申請No.84/03664，1984年9月13日出版Hitzeman et al.，EP73,675APCT申請出版物WO93/07282
序列表(1)一般信息(i)申請人Skolnick，Mark H.
Cannon-Albright，Lisa A.
Kamb，Alexander(ii)發(fā)明名稱多腫瘤抑制因子基因種系突變及檢測該基因癌腫傾向性的方法(iii)序列數(shù)目36(iv)通訊地址(A)地址Venable，Baetjer，Howard & Civiletti，LLP(B)街1201 New York Avenue，Suite 1000(C)城市Washington(D)州DC(E)國家美國(F)郵政編碼20005(v)計算機可讀形式(A)記錄介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容型(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)本申請資料(A)申請?zhí)朥S
(B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/251,938(B)申請日01—06月—1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/215,088(B)申請日18—03月—1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/214,581(B)申請日18—03月—1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/227,369(B)申請日14—04月—1994(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朥S08/214,582(B)申請日18—03月—1994(viii)律師/代理人信息(A)姓名Saxe，Stephen A.
(B)登記號38,609(C)參考/文檔號24884—109348—PCT—2(ix)通訊信息(A)電話202—962—4848(B)傳真202—962—8300(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度447堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(ix)特征(A)名稱/檢索符號CDS(B)位置1..447(xi)序列描述SEQ ID NO1ATG GAG CCT TCG GCT GAC TGG CTG GCC ACG GCC GCG GCC CGG GGT CGG 48Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg1 5 10 15GTA GAG GAG GTG CGG GCG CTG CTG GAG GCG GTG GCG CTG CCC AAC GCA 96Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Asn Ala20 25 30CCG AAT AGT TAC GGT CGG AGG CCG ATC CAG GTC ATG ATG ATG GGC AGC 144Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser
35 40 45GCC CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG GAG CCC AAC TGC 192Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys50 55 60GCC GAC CCC GCC ACT CTC ACC CGA CCC GTG CAC GAC GCT GCC CGG GAG 240Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu65 70 75 80GGC TTC CTG GAC ACG CTG GTG GTG CTG CAC CGG GCC GGG GCG CGG CTG 288Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu85 90 95GAC GTG CGC GAT GCC TGG GGC CGT CTG CCC GTG GAC CTG GCT GAG GAG 336Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu100 105 110CTG GGC CAT CGC GAT GTC GCA CGG TAC CTG CGC GCG GCT GCG GGG GGC 384Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly115 120 125ACC AGA GGC AGT AAC CAT GCC CGC ATA GAT GCC GCG GAA GGT CCC TCA 432Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser130 135 140GAC ATC CCC GAT TGA 447Asp Ile Pro Asp *145(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度149氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg1 5 10 15Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Asn Ala20 25 30Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser35 40 45Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys50 55 60Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu65 70 75 80Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu85 90 95Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu100 105 110Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly115 120 125Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser130 135 140Asp Ile Pro Asp *145(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度1149堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(ix)特征(A)名稱/檢索符號內(nèi)含子(B)位置1..890(ix)特征(A)名稱/檢索符號外顯子(B)位置891..1016(ix)特征(A)名稱/檢索符號內(nèi)含子(B)位置1017..1149(xi)序列描述SEQ ID NO3TCCCCCGCCC GTWTTAAWTA AACCTCATCT TTCCAGAGTC TGTTCTTATA CCAGGAAATG 60TACACGTCTG AGAAACCCTT GCCCCAGACA GTCGTTTTAC ACGCAGGAGG GGAAGGGGAG 120GGGAAGGAGA GAGCAGTCCT TTTCTCCAAA AGGAATCCTT NGAACTAGGG TTTCTGACTT 180AGTGAACCCC GCGYTCCTGA AAATCAWGGG TTGAGGGGGT AGGGGGACAC TTYCCTAGTC 240GYACAGSTKA TTTCGMTYCT CGGTGGGGCT CTCACAMCTA GGAAAGAATW GTTTTGCTTT 300TTCTTATGAT TAAAAGAAGA AGCCATACTT TTCCCTATGA CACCAAACAC CCCGATTCAA 360TTTGGCAGTT AGGAAGGTTG TATCGCGGAG GAAGGAAACG GGGCGGGGGC GGATTTCTTT 420TTTAACAGAG TGAACGCACT CAAACACGCC TTTGCTGGCA GGCGGGGGGA GCGCGGCTGG 480GAGCAGGGGA GGCCGGAGGG CGGTGTGGGG GGCAGGTGGG GAGGAGCCCA GTCCTCCTTC 540CTTGCCAACG CTGGCTCTGG CGAGGGCTGC TTYCGGCTGG TGCCCCCGGG GGAGACCCAA 600CCTGGGGCGA CTTCAGGGGT GCCACATTCG CTAAGTGCTC GGAGTTAATA GCACCTCCTC 660CGAGCACTCG CTCACAGCGT CCCCTTGCCT GGAAAGATAC CGCGGTCCCT CCAGAGGATT 720TGAGGGACAG GGTCGGAGGG GGCTCTTCCG CCAGCACCGG AGGAAGAAAG AGGAGGGGCT 780GGCTGGTCAC CAGAGGGTGG GGCGGACCGC GTGCGCTCGG CGGCTGCGGA GAGGGGGAGA 840GCAGGCAGCG GGCGGCGGGG AGCAGCATGG AGCCGGCGGC GGGGAGCAGC ATGGAGCCTT 900CGGCTGACTG GCTGGCCACG GCCGCGGCCC GGGGTCGGGT AGAGGAGGTG CGGGCGCTGC 960TGGAGGCGGT GGCGCTGCCC AACGCACCGA ATAGTTACGG TCGGAGGCCG ATCCAGGTGG 1020GTAGAGGGTC TGCAGCGGGA GCAGGGGATG GCGGGCGACT CTGGAGGACG AAGTTTGCAG 1080GGGAATTGGA ATCAGGTAGC GCTTCGATTC TCCGGAAAAA GGGGAGGCTT CCTGGGGAGT 1140TTTCAGAAC 1149(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度1187堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(ix)特征(A)名稱/檢索符號內(nèi)含子(B)位置1..191(ix)特征(A)名稱/檢索符號外顯子(B)位置192..498(ix)特征(A)名稱/檢索符號內(nèi)含子(B)位置499..1187(xi)序列描述SEQ ID NO4GAATTCATTG TGTACTGAAG AATGGATAGA GAACTCAAGA AGGAAATTGG AAACTGGAAG 60CAAATGTAGG GGTAATTAGA CACCTGGGGC TTGTGTGGGG GTCTGCTTGG CGGTGAGGGG 120GCTCTACACA AGCTTCCTTT CCGTCATGCC GGCCCCCACC CTGGCTCTGA CCATTCTGTT 180CTCTCTGGCA GGTCATGATG ATGGGCAGCG CCCGAGTGGC GGAGCTGCTG CTGCTCCACG 240GCGCGGAGCC CAACTGCGCC GACCCCGCCA CTCTCACCCG ACCCGTGCAC GACGCTGCCC 300GGGAGGGCTT CCTGGACACG CTGGTGGTGC TGCACCGGGC CGGGGCGCGG CTGGACGTGC 360GCGATGCCTG GGGCCGTCTG CCCGTGGACC TGGCTGAGGA GCTGGGCCAT CGCGATGTCG 420CACGGTACCT GCGCGCGGCT GCGGGGGGCA CCAGAGGCAG TAACCATGCC CGCATAGATG 480CCGCGGAAGG TCCCTCAGGT GAGGACTGAT GATCTGAGAA TTTGTACYCT GAGAGCTTCC 540AAAGCTCAGA GCATTCATTT TCCAGCACAG AAAGTTCAGC CCGGGAGACC AGTCTCCGGT 600CTTGCGCTCA GCTCACGCGC CAATGCGGTG GGACGGCCTG AGTCTCCCTA TGCGCCCTGC 660CSCGCACAGC GCGGCAAATG GGAAATAATC CCGAAATGGA CTTGCGCACG TGAAAGCCCA 720TTTTGTACGT TATACTTCCC AAAGCATACC ACCACCCAAA CACCTACCCT CTGCTAGTTC 780AAGGCCTAGA CTGCGGAGCA ATGAAGACTC AAGAGGCTAG AGGTCTAGTG CCCCCTCTTC 840CTCCAAACTA GGGCCAGTTG CATCSACTTA CCAGGTCTGT TTCCTCATTT GCATACCAAG 900CTGGCTGGAC CAACCTCAGG ATTTCCAAAC CCAATTGTGC GTGGCATCAT CTGGAGATCT 960CTCGATCTCG GCTCTTCTGC ACAACTCAAC TAATCTGACC CTCCTCAGCT AATCTGACCC 1020TCCGCTTTAT GCGGTAGAGT TTTCCAGAGC TGCCCCAGGG GGTTCTGGGG ACATCAGGAC 1080CAAGACTTCG CTGACCCTGG CAGTCTGTGC ACCGGAGTTG GCTCCTTTCC CTCTTAAACT 1140TGTGCAAGAG ATCCCTATAG TGAGTCGTAT TATNCGGCCG CGAATTC 1187(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度1244堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(ix)特征
(A)名稱/檢索符號內(nèi)含子(B)位置1..273(ix)特征(A)名稱/檢索符號misc—RNA(B)位置274..529(D)其他信息/注意點＝″對應于SEQ ID NO4的外顯子″(xi)序列描述SEQ ID NO5GATCATCACT TTACCATCAA CTTTCTTGTC TCTGAACGTT TAGAGAATAA AATGGCATTT60AATTGGTVCT GAGTWTAACC TGAAGGTGGG GTGGGAAAGT GGWTTGCATC AGCAADTGAA 120GAAACACCAG ACATCAGAGA CCTGAACACC TCTGCACTGG GTGAAAACTT GGCAATTAGG 180TGTTTCTTTA AATGGCTCCA CCTGCCTTGC CCCGGCCGGC ATCTCCCATA CCTGCCCCCA 240CCCTGGCTCT GACCACTCTG CTCTCTCTGG CAGGTCATGA TGATGGGCAG CGCCCGCGTG 300GCGGAGCTGC TGCTGCTCCA CGGCGCGGAG CCCAACTGCG CAGACCCTGC CACTCTCACC 360CGACCGGTGC ATGATGCTGC CCGGGAGGGC TTCCTGGACA CGCTGGTGGT GCTGCACCGG 420GCCGGGGCGC GGCTGGACGT GCGCGATGCC TGGGGTCGTC TGCCCGTGGA CTTGGCCGAG 480GAGCGGGGCC ACCGCGACGT TGCAGGGTAC CTGCGCACAG CCACGGGGGA CTGACGCCAG 540GTTCCCCAGC CGCCCACAAC GACTTTATTT TCTTACCCAA TTTCCCACCC CCACCCACCT 600AATTCGATGA AGGCTGCCAA CGGGGAGCGG CGGAAAGCCT GTAAGCCTGC AAGCCTGTCT 660GAGACTCACA GGAAGGAGGA GCCGACCGGG AATAACCTTC CATACATTTT TTTCTTTGTC 720TTATCTGGCC CTCGACACTC ACCATGAAGC GAAACACAGA GAAGCGGATT TCCAGGGATA 780TTTAGGAGTG TGTGACATTC CAGGGGTCGT TTGNTTTTCA GGGTTTTCTG AGGGAAAGTG 840CATATGAAAT CCTTGACTGG ACCTGGTGGC TACGAATCTT CCCGATGGAT GAATCTCCCA 900CTCCAGCGCT GAGTGGGAGA AGGCAGTGAT TAGCACTTGG GTGACGGCAG TCGATGCGTT 960CACTCCAATG TCTGCTGAGG AGTTATGGTG AACCCACAAC TTAGGCCCTA GCGGCAGAAA 1020GGAAAACCTG AAGACTGAGG ACAAAGTGGA GGAGGGCCGA GGTGGGCTTC AGTATGTCCC 1080CNNCGGCGCT TTAGTTTGAG CGCATGGCAA GTCACATGCG TAAACGACAC TCTCTGGAAG 1140CCCTGGAGAC CCTCGCCCAA CTCCACCAGA TAGCAGAGGG GTAAGAGAGG ATGTGCAAGC 1200GACGACAGAT GCTAAAATCC CTGGATCACG ACGCTGCAGA GCAC 1244(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO6CAGCACCGGA GGAAGAAAG 19(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO7GCGCTACCTG ATTCCAATTC 20(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO8GGAAATTGGA AACTGGAAGC20(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO9TCTGAGCTTT GGAAGCTCT 19(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO10ATCATCACT TTACCATCAA C 21(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO11GGGTGGGAAA TTGGGTAAG 19(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO12TGAGTTTAAC CTGAAGGTGG 20(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特征(A)長度1131堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源
(A)有機體人(ix)特征(A)名稱/檢索符號CDS(B)位置338..655(xi)序列描述SEQ ID NO13CGCGCCTGCG GGGCGGAGAT GGGCAGGGGG CGGTGCGTGG GTCCCAGTCT GCAGTTAAGG60GGGCAGGAGT GGCGCTGCTC ACCTCTGGTG CCAAAGGGCG GCGCAGCGGC TGCCGAGCTC 120GGCCCTGGAG GCGGCGAGAA CATGGTGCGC AGGTTCATGG TGACCCTCCG GATTCGGCGC 180GCGTGCGGAC CGCCGCGAGT GAGGGTTTTC GTGGTTCACA TCCCGCGGCT CACGGGGGAG 240TGGGCAGCAC CAGGGGCGCC CGCCGCTGTG GCCCTCGTGC TGATGCTACT GAGGAGCCAG 300CGTCTAGGGC AGCAGCCGCT TCCTAGAAGA CCAGGTC ATG ATG ATG GGC AGC GCC355Met Met Met Gly Ser Ala150 155CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG GAG CCC AAC TGC GCC 403Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala160 165 170GAC CCC GCC ACT CTC ACC CGA CCC GTG CAC GAC GCT GCC CGG GAG GGC 451Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly175 180 185TTC CTG GAC ACG CTG GTG GTG CTG CAC CGG GCC GGG GCG CGG CTG GAC 499Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp190 195 200GTG CGC GAT GCC TGG GGC CGT CTG CCC GTG GAC CTG GCT GAG GAG CTG 547Val Arg Asp 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NO14的信息(i)序列特征(A)長度l06氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO14Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly1 5 10 15Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His20 25 30Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg35 40 45Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val50 55 60Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg65 70 75 80Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala85 90 95Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp *100 105(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特征(A)長度751堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(ix)特征(A)名稱/檢索符號CDS(B)位置335..751(xi)序列描述SEQ ID NO15CGGGCAGTGA GGACTCCGCG ACGCGTCCGC ACCCTGCGGC CAGAGCGGCT TTGAGCTCGG60CTGCGTCCGC GCTAGGCGCT TTTTCCCAGA AGCAATCCAG GCGCGCCCGC TGGTTCTTGA 120GCGCCAGGAA AAGCCCGGAG CTAACGACCG GCCGCTCGGC CACTGCACGG GGCCCCAAGC 180CGCAGAAGGA CGACGGGAGG GTAATGAAGC TGAGCCCAGG TCTCCTAGGA AGGAGAGAGT 240GCGCCGGAGC AGCGTGGGAA 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Ala Thr Gly Asp *130 135(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特征(A)長度57堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO17AAAGGATCCA TTGCCACCAT GGAGCCGGCG GCGGGGAGCA GCATGGAGCC TTCGGCT 57(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特征(A)長度24堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO18TTTGAATTCA ATCGGGGATG TCTG 24(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO19AGGGAAGAGT GTCGTTAAG19(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO20AGACTCCTGT ACAAATCTAC 20(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人
(xi)序列描述SEQ ID NO21TGAGGGTCTG GCCAGC 16(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO22AGCACCACCA GCGTGTC 17(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特征(A)長度16堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假設否(iv)反義是(vi)最初來源
(A)有機體人(xi)序列描述SEQ ID NO23CGTGTCCAGG AAGCCC16(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特征(A)長度144堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO24AATTCGGCAC GAGGCAGCAT GGAGCCTTCG GCTGACTGGC TGGCCACGGC CGCGGCCCGG 60GGTCGGGTAG AGGAGGTGCG GGCGCTGCTG GAGGCGGTGG CGCTGCCCAA CGCACCGAAT 120AGTTACGGTC GGAGGCCGAT CCAG 144(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特征(A)長度395堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO25AAGAGAGGGT TTTCTTGGTA AAGTTCGTGC GATCCCGGAG ACCCAGGACA GCGTAGCTGC 60GCTCTGGCTT TCGTGAACAT GTTGTTGAGG CTAGAGAGGA TCTTGAGAAG AGGGCCGCAC 120CGGAATCCTG GACCAGGTGA TGATGATGGG CAACGTTCAC GTAGCAGCTC TTCTGCTCAA 180CTACGGTGCA GATTCGAACT GCGAGGACCC CACTACCTTC TCCCGCCCGG TGCACGACGC 240AGCGCGCGAA GGCTTCCTGG ACACGCTGGT GGTGCTGCAC GGGTCAGGGG CTCGGCTGGA 300TGTCCGCGAT GCCTGGGGTC GCCTCCCGCT CGACTTCGCC CAAGAGCGGG GACATCAAGA 360CATCGTGCGA TATTTGCGTT CCGCTGGGTG CTCTT 395(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO26CAACGCACCG AATAGTTACG20(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO27TACTGAGGAG CCAGCGTCTA 20(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特征(A)長度30堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO28TGAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCATTGTTC30(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO29AGCGTGTCCA GGAAGCCTTC 20(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特征(A)長度27堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型其他核酸(xi)序列描述SEQ ID NO30TGAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCATTG 27(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特征(A)長度26堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO31ACTGCGAGGA CCCCACTACC TTCTCC 26(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(xi)序列描述SEQ ID NO32GAACGTTGCC CATCATCATC 20(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特征(A)長度15堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(xi)序列描述SEQ ID NO33AGTCTGCAGT TAAGG15(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO34GGCTAGAGGC GAATTATCTG T 21(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核酸(C)股性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義是(xi)序列描述SEQ ID NO35CACCAAACAA AACAAGTGCC G 21(2)SEQ ID NO36的信息(i)序列特征(A)長度947堿基對(B)類型核酸(C)股性雙鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型cDNA(iii)假設否(iv)反義否(vi)最初來源(A)有機體人(ix)特征(A)名稱/檢索符號混合特征(B)位置151(D)其他信息/注意點＝″拼接位點受體。″(ix)特征(A)名稱/檢索符號混合特征(B)位置458(D)其他信息/注意點＝″拼接位點受體?！?xi)序列描述SEQ ID NO36ATGGAGCCGG CGGCGGGGAG CAGCATGGAG CCTTCGGCTG ACTGGCTGGC CACGGCCGCG 60GCCCGGGGTC GGGTAGAGGA GGTGCGGGCG CTGCTGGAGG CGGTGGCGCT GCCCAACGCA 120CCGAATAGTT ACGGTCGGAG GCCGATCCAG GTCATGATGA TGGGCAGCGC CCGAGTGGCG 180GAGCTGCTGC TGCTCCACGG CGCGGAGCCC AACTGCGCCG ACCCCGCCAC TCTCACCCGA 240CCCGTGCACG ACGCTGCCCG GGAGGGCTTC CTGGACACGC TGGTGGTGCT GCACCGGGCC 300GGGGCGCGGC TGGACGTGCG CGATGCCTGG GGCCGTCTGC CCGTGGACCT GGCTGAGGAG 360CTGGGCCATC GCGATGTCGC ACGGTACCTG CGCGCGGCTG CGGGGGGCAC CAGAGGCAGT 420AACCATGCCC GCATAGATGC CGCGGAAGGT CCCTCAGACA TCCCCGATTG AAAGAACCAG 480AGAGGCTCTG AGAAACCTCG GGAAACTTAG ATCATCAGTC ACCGAAGGTC CTACAGGGCC 540ACAACTGCCC CCGCCACAAC CCACCCCGCT TTCGTAGTTT TCATTTAGAA AATAGAGCTT 600TTAAAAATGT CCTGCCTTTT AACGTAGATA TAAGCCTTCC CCCACTACCG TAAATGTCCA 660TTTATATCAT TTTTTATATA TTCTTATAAA AATGTAAAAA AGAAAAACAC CGCTTCTGCC 720TTTTCACTGT GTTGGAGTTT TCTGGAGTGA GCACTCACGC CCTAAGCGCA CATTCATGTG 780GGCATTTCTT GCGAGCCTCG CAGCCTCCGG AAGCTGTCGA CTTCATGACA AGCATTTTGT 840GAACTAGGGA AGCTCAGGGG GGTTACTGGC TTCTCTTGAG TCACACTGCT AGCAAATGGC 900AGAACCAAAG CTCAAATAAA AATAAAATTA TTTTCATTCA TTCACTC94權利要求
1.一種在哺乳動物中診斷與發(fā)生癌腫的傾向性相關的多態(tài)性的方法，這些癌腫包括如黑素瘤、白血病、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、慢性淋巴細胞性白血病以及胰腺、乳房、甲狀腺、卵巢、子宮、睪丸、腎、胃和直腸的癌腫，其特征在于，包括在哺乳動物樣品中檢測野生型MTS基因或其表達產(chǎn)物的種系改變，該改變即表示存在患癌腫的傾向。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該MTS基因是MTS1。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該MTS基因是MTS2。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該MTS基因是MTS1E1β。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該表達產(chǎn)物是MTS1的mRNA。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該表達產(chǎn)物是MTS2的mRNA。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，該表達產(chǎn)物是MTS1E1β的mRNA。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因mRNA的改變是通過將來自該組織樣品的mRNA與MTS基因探針雜交而檢測的。
9.如權利要求6所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因mRNA的改變是通過將來自該組織樣品的mRNA與MTS基因探針雜交而檢測的。
10.如權利要求6所述的方法，其特征在于，是在MTS基因的調(diào)控區(qū)域檢測改變。
11.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變是通過觀察單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率的改變而檢測的。
12.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變是通過將從該組織分離出的基因組DNA與MTS基因探針雜交而檢測的。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，MTS基因探針與選自下組的外顯子雜交SEQ ID NO3的核苷酸891—1016和SEQ ID NO4的核苷酸192—498。
14.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變是通過與MTS等位基因特異性探針的雜交而檢測的。
15.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過擴增該組織中全長或部分MTS基因以產(chǎn)生擴增序列，然后對擴增序列測序。
16.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過針對特異性MTS等位基因，擴增全長或部分MTS基因。
17.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過對該組織中的全長或部分MTS基因進行分子克隆，以產(chǎn)生克隆的序列，然后對克隆的序列測序。
18.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過當分子(1)和(2)相互雜交形成雙鏈時，鑒別分子(1)——從該組織中分離出的MTS基因的基因組DNA或MTSmRNA和分子(2)——與人野生型MTS區(qū)域DNA互補的核酸探針之間的錯配。
19.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過擴增該組織中的MTS基因序列，然后將擴增的序列與含有野生型MTS基因序列的核酸探針雜交。
20.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過擴增該組織中的MTS基因序列，然后將擴增的序列與含有非野生型MTS基因序列的核酸探針雜交。
21.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過篩選缺失突變。
22.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過篩選點突變。
23.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過篩選插入突變。
24.如權利要求1所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的改變的檢測是通過用含有MTS基因的核酸探針與MTS基因進行原位雜交。
25.如權利要求1所述的方法，其特征在于，表達產(chǎn)物是蛋白質分子。
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變通過免疫印跡法檢測。
27.如權利要求25所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變通過免疫細胞化學方法檢測。
28.如權利要求25所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變的是檢測通過分析從該組織中分離出的MTS基因蛋白質與Cdk的相互結合作用。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，該Cdk為Cdk4。
30.如權利要求25所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變是通過分析Cdk生物化學活性的抑制作用。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，該Cdk為Cdk4。
32.一種證實哺乳動物中的MTS基因座沒有易患癌腫傾向的方法，其特征在于，包括在哺乳動物樣品中檢測野生型MTS基因或其表達產(chǎn)物，存在野生型基因或其表達產(chǎn)物即表示在MTS基因座沒有易患癌腫的傾向。
33.如權利要求32所述的方法，其特征在于，該MTS基因是MTS1。
34.如權利要求32所述的方法，其特征在于，該MTS基因是MTS2。
35.如權利要求32所述的方法，其特征在于，該表達產(chǎn)物是MTS1的mRNA。
36.如權利要求32所述的方法，其特征在于，該表達產(chǎn)物是MTS2的mRNA。
37.如權利要求35所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因mRNA是通過將來自該組織樣品的mRNA與MTS基因探針雜交而檢測的。
38.如權利要求36所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因mRNA是通過將來自該組織樣品的mRNA與MTS基因探針雜交而檢測的。
39.如權利要求32所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因是通過將從該組織分離出的基因組DNA與MTS基因探針雜交而檢測的。
40.如權利要求39所述的方法，其特征在于，MTS基因探針與選自下組的外顯子雜交SEQ ID NO3的核苷酸891—1016和SEQ ID NO4的核苷酸192—498。
41.如權利要求32所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的檢測是通過擴增該組織中全長或部分MTS基因，以產(chǎn)生擴增序列，然后對擴增序列測序。
42.如權利要求32所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的檢測是通過對該組織中的全長或部分MTS基因進行分子克隆，以產(chǎn)生克隆的序列，然后對克隆的序列測序。
43.如權利要求32所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因的檢測是通過用含有MTS基因的核酸探針與MTS基因進行原位雜交。
44.如權利要求32所述的方法，其特征在于，表達產(chǎn)物是蛋白質分子。
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變通過免疫印跡法檢測。
46.如權利要求44所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變通過免疫細胞化學方法檢測。
47.如權利要求44所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變的檢測是通過分析從該組織中分離出的MTS基因蛋白質與Cdk的相互結合作用。
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，該Cdk為Cdk4。
49.如權利要求44所述的方法，其特征在于，野生型MTS基因蛋白質的改變的檢測是通過分析對Cdk生物化學活性的抑制作用。
50.如權利要求49所述的方法,其特征在于,該Cdk為Cdk4。
51.一種分離的DNA，其特征在于，它含有核苷酸353為A的SEQ ID NO1。
52.一種分離的DNA，其特征在于，它含有核苷酸277為T的SEQ ID NO1。
53.一種與人改變的MTS基因序列互補的核酸探針，其特征在于，它與部分MTS基因雜交，該部分MTS基因含有核苷酸353為A的SEQ ID NO1。
54.一種與人改變的MTS基因序列互補的核酸探針，其特征在于，它與部分MTS基因雜交，該部分MTS基因含有核苷酸277為T的SEQ ID NO1。
55.一種可復制的克隆載體，其特征在于，它含有如權利要求51或52所述的分離的DNA和在宿主細胞中可運作的復制子。
56.一種表達系統(tǒng)，其特征在于，它含有可操作地連于合適調(diào)控序列的如權利要求51或52所述的分離的DNA。
57.用權利要求55所述的可復制克隆載體轉化的重組宿主細胞。
58.用權利要求56所述的表達系統(tǒng)轉化的重組宿主細胞。
59.一種產(chǎn)生重組MTS多肽的方法，其特征在于，包括在能有效地產(chǎn)生該MTS多肽的條件下，培養(yǎng)權利要求58所述的細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及人癌腫中的多腫瘤抑制因子(簡稱MTS)基因的體細胞突變及其在人癌腫的診斷和預后方面的應用。本發(fā)明還涉及MTS基因的種系突變及其在診斷癌腫發(fā)生的傾向方面的應用。本發(fā)明還涉及MTS基因突變的人癌腫的治療，其中包括基因治療、蛋白質置換治療和蛋白質模擬。最后，本發(fā)明涉及篩選用于癌腫治療的藥物。
文檔編號C07H21/02GK1128049SQ95190374
公開日1996年7月31日 申請日期1995年3月17日 優(yōu)先權日1994年3月18日
發(fā)明者M·H·斯科爾尼克, L·A·坎農(nóng)·奧爾布賴特, A·坎巴 申請人:猶他大學研究基金會, 億萬遺傳股份有限公司