專利名稱：與腫瘤排斥抗原前體mage-1結(jié)合的單克隆抗體，重組的mage-1，和衍生于mage-1的免疫原性肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般地涉及適用于腫瘤學(xué)研究的免疫遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及對生物體免疫系統(tǒng)通過例如所謂的腫瘤排斥抗原的呈遞，和本文中被稱作“腫瘤排斥抗原前體”或“TRAP”的表達(dá)以識別腫瘤之機(jī)理的研究和分析，更具體地說，本發(fā)明涉及一個這種TRAP，即重組產(chǎn)生的MAGE-1，和抗MAGE-1的單克隆抗體和抗血清，以及它們的用途。
背景和現(xiàn)有技術(shù)從多個不同方向?qū)λ拗魃矬w識別或不識別癌細(xì)胞進(jìn)行了研究。對本領(lǐng)域的理解意味著對基礎(chǔ)免疫學(xué)和腫瘤學(xué)的一些理解。
對小鼠腫瘤的早期研究揭示了這些研究顯示出當(dāng)移植到同系動物體內(nèi)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞排斥的分子。這些分子由受體動物的T細(xì)胞“識別”，促進(jìn)了伴隨移植細(xì)胞裂解的溶細(xì)胞T細(xì)胞反應(yīng)。通過用化學(xué)致癌劑，如甲基膽蒽體外誘導(dǎo)腫瘤首次得到這一證據(jù)。經(jīng)發(fā)現(xiàn)由腫瘤表達(dá)并可引起T細(xì)胞反應(yīng)的抗原對于各種腫瘤而言是不同的。Prehn、et al.J.Natl.Canc.Inst.18769-778(1957)；Klein et al.，Cancer Res.201561-1572(1960)；Gross Cancer Res.3326-333(1943).Basombrio.Cancer Res.302458-2462(1970)一般性教導(dǎo)了用化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)腫瘤以及細(xì)胞表面抗原的差異，逐漸知道這類抗原為“腫瘤特異性移植抗原”或“TSTA”。當(dāng)通過化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)觀察到這種抗原的呈遞之后，通過紫外線照射在體外誘導(dǎo)腫瘤也可得到類似的結(jié)果。例見Kripke.J.Natl.Canc.Inst.53333-1336(1974)。
當(dāng)觀察到上述文獻(xiàn)所述腫瘤類型的由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答時，可認(rèn)為自發(fā)的腫瘤一般是非免疫原性的。因此據(jù)信它們并不將可引發(fā)反應(yīng)的抗原呈遞給攜有腫瘤之受試者的腫瘤。例見Hewitt et al.，Brit.J.Cancer 33241-259(1976)。
如Boon et al.，J.Exp，Med.1521184-1193(1980)中的描述(此處引入?yún)⒖嘉墨I(xiàn))，呈遞tmu-抗原族的細(xì)胞系是通過誘變小鼠腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞系所得的免疫原性變異體。為了驗證，可通過突變不會在同系小鼠中產(chǎn)生免疫應(yīng)答并可形成腫瘤的腫瘤細(xì)胞(即″tum+″細(xì)胞)以得到tum-抗原。當(dāng)誘變這些tum+細(xì)胞時，它們將被同系小鼠排斥，而且不會形成腫瘤(因此為“tum-”)。例見Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74272(1977)。此處被編入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)。已發(fā)現(xiàn)許多腫瘤類型都呈現(xiàn)出這種現(xiàn)象，例見Frostet al.，Cancer Res 43125(1983)。
由于tum-變異體可引發(fā)免疫排斥過程，因而它們似乎不能形成進(jìn)行性腫瘤，有利于此假說的證據(jù)包括腫瘤“tum-”變異體，即那些在小鼠體內(nèi)不能正常形成腫瘤的變異體，在免疫系統(tǒng)受亞致死照射的抑制的小鼠中不能形成進(jìn)行性腫瘤，Van Pel et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA765282-5285(1979)；以及下述的觀察結(jié)果腹膜內(nèi)注射的肥大細(xì)胞瘤P815 tum-細(xì)胞呈指數(shù)增長達(dá)12-15天，而在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞流入當(dāng)中僅幾天后，它們即消失(Uyttenhove et al.，J.Exp，Med.1521175-1183(1980)).進(jìn)一步的證據(jù)包括下列的觀察結(jié)果即使當(dāng)給小鼠施用免疫抑制量的照射以及細(xì)胞隨后的攻擊時，小鼠仍獲得了免疫記憶以允許它們抵抗對相同tum-變異體的隨后的攻擊(Boon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA74272-275(1977)；Van Pel et al.，Supra；Uyttenhove et al.，Supra)。后來的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)自發(fā)腫瘤經(jīng)受誘變時，產(chǎn)生了能產(chǎn)生反應(yīng)的免疫原性變異體。事實上，這些變異體能引發(fā)抗原先腫瘤的免疫保護(hù)性應(yīng)答，例見Van Pel et al.，J.Exp.Med.1571992-2001(1983)。因此，已顯示出在腫瘤中引發(fā)所謂的“腫瘤排斥抗原”的呈遞是可能的，所述腫瘤是同系排斥反應(yīng)的靶子。當(dāng)將外源基因轉(zhuǎn)染進(jìn)自發(fā)性腫瘤時也得到類似的結(jié)果，例見Fearson et al.，Cancer Res，482975-1980(1988)。
已識別了一類抗原，所述抗原被呈遞于腫瘤細(xì)胞的表面，并由導(dǎo)致裂解的細(xì)胞毒性T細(xì)胞識別。此類抗原在下文中被稱為“腫瘤排斥抗原”或“TRA”。TRA會或不會引起抗體反應(yīng)。這些抗原被研究的程度取決于溶胞T細(xì)胞的體外鑒定研究，即由特殊的溶細(xì)胞性T細(xì)胞(下文的“CTL”)子集鑒定抗原的研究。所述子集通過識別呈遞的腫瘤排斥抗原而增殖，呈遞抗原的細(xì)胞被裂解。鑒定研究已鑒定出可特異性地裂解表達(dá)抗原之細(xì)胞的CTL克隆。在Levy et al.，Adv，Cancer Res 241-59(1977)；Boon et al.，J.Exp.Med.1521184-1193(1980)；Brunner et al.，J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.1241627-1634(1980)；Maryanski et al.，Eur.J.Immunol.12406-412(1982)；Palladino et al.，Canc.Res.475074-5079(1987)中可發(fā)現(xiàn)此類研究的例子。其它類型的由CTL識別的抗原，包括主要組織相容性抗原，雄性特異性H-Y抗原，以及本文所討論的被稱作“tum-”抗原的一類抗原都要求這種類型的分析。
上述文獻(xiàn)中描述的受試者的腫瘤例子已知為P815，例見已引入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的DePlaen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852274-2278(1988)；Szikora et al.，EMBO J91041-1050(1990)，和Sibille et al.，J.Exp.Med.17235-45(1990)。P815腫瘤是肥大細(xì)胞瘤，它是經(jīng)用甲基膽蒽在DBA/2小鼠中誘導(dǎo)并作為體外腫瘤和細(xì)胞系培養(yǎng)。誘變后P815系產(chǎn)生了許多tum-變異體，包括稱為P91A(Deplaen，文獻(xiàn)同上)，35B(Szikora，文獻(xiàn)同上)，和P198(Sibille，文獻(xiàn)同上)的變異體。與腫瘤排斥抗原相反(這是主要的區(qū)別)；tum-抗原僅當(dāng)腫瘤細(xì)胞被誘變之后才存在，而腫瘤排斥抗原不經(jīng)誘變即存在于所給腫瘤的細(xì)胞上，因此參照參考文獻(xiàn)，認(rèn)為細(xì)胞系可以為tum+，如稱為“P1”的細(xì)胞系，此細(xì)胞系可以誘發(fā)產(chǎn)生tum-變異體。由于tum-表型與親本細(xì)胞系的不同，故預(yù)計tum-細(xì)胞系的DNA與它們的tum+親本系相比有所不同，此差別可用于定位tum-細(xì)胞中感興趣的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)如P91A、35B和P198的tum-變異體的基因與正常的等位基因所不同的是基因編碼區(qū)有點突變，例見Szikora and Sibille，文獻(xiàn)同上，和Lurquin et al.，Cell58293-303(1989)。而本發(fā)明的TRA則情況不同。這些文獻(xiàn)也闡明衍生于tum-抗原的肽類由Ld分子呈遞以供CTL識別，P91A由Ld呈遞，P35由Dd呈遞，P198由Kd呈遞。
都已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的現(xiàn)有專利申請PCT/US92/04354，美國系列號807,043；764,364；728,838和707,702描述了特別涉及編碼多種TRAP的基因和其它核酸分子，而TRAP隨后被加工成腫瘤排斥抗原，或稱“TRA”。
上述這些基因可用作分離和純化的腫瘤排斥抗原前體和TRA本身的來源，這兩者都可用作藥劑以治療以抗原為“標(biāo)記物”的癌癥，并可在下文討論的腫瘤學(xué)多種診斷和監(jiān)視方法中用作藥劑。例如已知tum-細(xì)胞可用于產(chǎn)生CTL，所述CTL可裂解呈遞不同tum-抗原的細(xì)胞以及tum+細(xì)胞。例見已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的Maryanski et al.，Eur J.Immunol12401(1982)；和Van den Eynde et al.，Modern Trends in Leukemia IX(June1990)。腫瘤排斥抗原前體可在被基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)，然后可用于產(chǎn)生抗感興趣之腫瘤的免疫應(yīng)答。
在人腫瘤相似的病例中觀察到自身混合淋巴細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物(下文中的“MLTC”)經(jīng)常產(chǎn)生效應(yīng)器淋巴細(xì)胞，所述細(xì)胞可裂解自身腫瘤細(xì)胞，但不會裂解天然的殺傷靶，自身EBV-轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞或自身成纖維細(xì)胞(例見Anichini et al.，Immunol.Today 8385-389(1987))。已特別詳細(xì)地研究了黑素瘤的此反應(yīng)，用外周血細(xì)胞或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞進(jìn)行MLTC。此領(lǐng)域參考文獻(xiàn)的例子包括Knuth etal.，Proc Natl，Acad，Sci.USA 862804-2802(1984)；Mukherji et al.，J.Exp.Med，158240(1983)；Herin et al.，Int.J.Canc.39390-396(1987)；Topalian et al，J.Clin.Oncol 6839-853(1988)。已從MLTC效應(yīng)器細(xì)胞中衍生出穩(wěn)定的細(xì)胞毒性T細(xì)胞克隆(下文中的“CTL”)，這些克隆特異于腫瘤細(xì)胞，例見Makherji et al.，文獻(xiàn)同上，Herin et al，文獻(xiàn)同上，Knuth et al.，文獻(xiàn)同上。由這些自身CTL識別的腫瘤細(xì)胞上的抗原看上去不能表示培養(yǎng)的人為假象，因為在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了它們，Topalian et al.，文獻(xiàn)同上；Degiovanni et al.，Eur.J.Immunol.201865-1868(1990)。這些觀察結(jié)果，連同本文所用的分離特異性鼠腫瘤排斥抗原前體之基因的技術(shù)，已導(dǎo)致編碼人腫瘤上呈遞的TRA的腫瘤排斥抗原前體之核酸序列的分離?，F(xiàn)在已可分離出編碼腫瘤排斥抗原前體的核酸序列，包括但不局限于那些具有特殊腫瘤之大多數(shù)特征和下文所述之細(xì)節(jié)的序列。
另外的研究致力于由已知為人白細(xì)胞抗原或稱“HLA”的一類分子對TRA的呈遞，此研究已導(dǎo)致幾個有關(guān)此領(lǐng)域的意想不到的發(fā)現(xiàn)，具體地見于已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的美國專利申請系列號938,334，該文獻(xiàn)公開了由HLA-A1分子呈遞的九肽，此文獻(xiàn)教導(dǎo)如給出特定肽類對特定HLA分子的已知特異性，即可期望特定肽與一個HLA分子結(jié)合，而不與其它分子結(jié)合。這一點很重要，因為不同個體具有不同的HLA表型。結(jié)果，盡管鑒定出特定肽作為特異性HLA分子的配體(Partner)具有診斷和治療的結(jié)果，但這些僅與具有特定HLA表型的個體相關(guān)。需對此領(lǐng)域進(jìn)行進(jìn)一步的研究，因為細(xì)胞異常并不局限于某一特定的HLA表型，定向療法需要一些爭論中的異常細(xì)胞表型的知識。
在已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的1993年1月22日遞交的美國專利申請系列號008,446中，公開了MAGE-1表達(dá)產(chǎn)物被加工成二級TRA的事實。此二級TRA由HLA-C-克隆-10分子呈遞，此公開表明所給TRAP可產(chǎn)生多種TRA。
在已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn)的1992年12月22日遞交的美國專利申請系列號994,928中，酪氨酸酶被描述成腫瘤排斥抗原前體，此文獻(xiàn)公開了由一些正常細(xì)胞(如黑素細(xì)胞)產(chǎn)生的分子在腫瘤細(xì)胞中被加工以產(chǎn)生由HLA-A2分子呈遞的腫瘤排斥抗原。
上述文獻(xiàn)中提到的現(xiàn)有申請中討論了一般抗腫瘤排斥抗原前體的抗體。本研究者已利用編碼MAGE-1的分離核酸分子以產(chǎn)生重組的MAGE-1蛋白質(zhì)，以及衍生于此蛋白質(zhì)的肽類。這些已被用來產(chǎn)生與MAGE-1特異性結(jié)合的多克隆和單克隆抗體。這些抗體及其用途構(gòu)成了本發(fā)明及權(quán)利要求。
附圖的簡述

圖1圖示了MAGE-1基因，衍生于重組MAGE-1蛋白質(zhì)的寡肽，并將MAGE-2和MAGE-3推導(dǎo)的氨基酸序列中的相應(yīng)序列進(jìn)行了比較。
圖2A表示親和純化的MAGE-1重組蛋白質(zhì)的銀染SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果。圖2B表示免疫印跡研究，其中重組MAGE-1蛋白質(zhì)被用來抗衍生自三種肽(SEQ ID NOs2，3和4)免疫接種的兔抗血清。印跡于1∶1000的稀釋度下進(jìn)行，重組小鼠p53被用作對照。
圖3A表示MAb MA454抗六個黑素瘤系的反應(yīng)性模式，圖3B表示使用抗相同系的兔多克隆抗血清所得的結(jié)果，圖3C表示用MAGE-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系(MZ2-MEL2.2-ET.1)及其親本(MZ2-MEL2.2)所得的結(jié)果。
圖4表示使用抗組織裂解物抗體的免疫印跡分析。
優(yōu)選實施方案的詳細(xì)描述已鑒定了許多不同的“MAGE”基因，這一點可從上文提到的申請和文獻(xiàn)中看出。目前對MAGE-1基因有所爭議，它是下文中所討論的唯一基因。為方便起見，本文中將之表示為SEQ ID NO1。
本文所用的“MAGE”指的是從人細(xì)胞中分離的核酸序列。
當(dāng)本文討論“TRAP”或“TRA”特異于腫瘤類型時，意味著所述的分子與腫瘤類型相關(guān)，盡管不必要排除其它腫瘤類型。實施例1使用Van den Eynde et al.，J.Cancer 44634-640(1989)和以上提到的母申請中描述的，先前已觀察到可表達(dá)MAGE-1的細(xì)胞系MZ2-MEL3.1作為總RNA的來源，從細(xì)胞中提取總RNA，再如Van der Bruggen et al.，Science 2541643-1647(Dec，13，1991)(已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn))所述，使用CH08和CH09作為引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄/聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。此文獻(xiàn)描述了如Brasseur et al.，Int.J.Cancer 52839-841(1992)中所進(jìn)行的“RT-PCR”技術(shù)。然而，應(yīng)理解MAGE-1的序列是本領(lǐng)域已知的，除了CH08和CH09外還可使用其它引物。
一旦完成RT-PCR方案，即參照構(gòu)成已知技術(shù)的制造商的教導(dǎo)將產(chǎn)物直接克隆到質(zhì)粒pT7 Blue(Novagen，Madison WI)中?？寺『螅孟拗菩詢?nèi)切核酸酶處理重組質(zhì)粒DNA以產(chǎn)生包括含有MAGE-1基因之片段的片段，例見Van der Bruggen et al.文獻(xiàn)同上。
使用pT7 Blue中的BamHI和HindIII克隆位點將適當(dāng)?shù)腸DNA插入片段單向亞克隆到質(zhì)粒pQE9，pQE10和pQE11中。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌中，由于宿主質(zhì)粒含有l(wèi)ac操縱子，故可通過IPTG誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。可產(chǎn)生含有MAGE-1多肽序列的融合蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)可通過Ni2+離子親和層析純化。
得到重組克隆的DNA序列，并證實它可編碼163個氨基酸，其相當(dāng)于預(yù)測的MAGE-1氨基酸序列之推導(dǎo)的57-219位氨基酸以及來自質(zhì)粒自身的30個殘基。圖1顯示了它，預(yù)期的分子量約為20-22KDa。
事實上，當(dāng)研究pQE10中的克隆時，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生了約為20KDa的重組蛋白質(zhì)。如圖2A所示，也發(fā)現(xiàn)了其它較少量的蛋白質(zhì)種類，如70KD、43KDa、17KDa和15KDa。實施例2以下描述了用于生產(chǎn)MAGE-1抗體的方法，根據(jù)預(yù)測的MAGE-1氨基酸序列，制備了三個寡肽Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser(SEQ ID NO2)Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp(SEQ ID NO3)Asp Val Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr(SEQ ID NO4)用這些肽免疫兔，然后經(jīng)處理收集抗血清。
在免疫印跡實驗中，使用所制備的抗這三個肽的抗血清以及由大腸桿菌產(chǎn)生的重組MAGE-1蛋白質(zhì)。圖2B所示的結(jié)果表明僅有抗第一個肽，即SEQID NO2產(chǎn)生的抗血清才強(qiáng)烈反應(yīng)。與20KDa融合蛋白質(zhì)共同純化的其它蛋白質(zhì)種類也顯示出反應(yīng)性的事實表明它們是融合蛋白質(zhì)的聚集體。所用的肽相當(dāng)于預(yù)測的MAGE-1蛋白質(zhì)的MAGE-1的68-81位推導(dǎo)氨基酸。
當(dāng)使用黑素瘤細(xì)胞系MZ2-MEL3.1的裂解物進(jìn)行免疫印跡時，未發(fā)現(xiàn)可測的MAGE蛋白質(zhì)。實施例3然后制備單克隆抗體，用按以上文獻(xiàn)所述產(chǎn)生的純化重組蛋白質(zhì)免疫BALB/C小鼠。產(chǎn)生并克隆了雜交瘤。所使用的方法同Dippold et al.，Proc Natl Acad Sci USA776114-6118(1980)(已列入?yún)⒖嘉墨I(xiàn))的描述。當(dāng)然主要區(qū)別是免疫接種用的免疫原。
一旦產(chǎn)生了雜交瘤，可使用免疫接種的融合蛋白質(zhì)作為靶抗原，使用標(biāo)準(zhǔn)的固相ELISA在微量滴定板上篩選它們的上清液，發(fā)現(xiàn)有5個克隆可以反應(yīng)，在免疫印跡中它們都表現(xiàn)出溫和至強(qiáng)反應(yīng)性。
作為對照，還試驗了在相同質(zhì)粒載體中表達(dá)的小鼠p53蛋白質(zhì)，未見有反應(yīng)性，下表1中概況了這些結(jié)果表1小鼠抗重組MAGE-1的mAb對重組MAGE-1蛋白質(zhì)和對照p53蛋白質(zhì)的反應(yīng)性
*使用雜交瘤上清液的ELISA效價-、＜1∶16；+、1∶64；++、1∶256。#免疫印跡信號強(qiáng)度-、陰性；+、微弱；++、中等；+++，強(qiáng)烈。實施例4然后試驗抗黑素瘤細(xì)胞系裂解物的如以上文獻(xiàn)所述的mAb。所試驗的細(xì)胞系，即MZ2-MEL3.1，MZ2-MEL2.2和SK-MEL-187都是已知的。MZ2-MEL2.2是經(jīng)CTL選擇從MAGE-1陽性親代MZ2-MEL3.1中衍生的MAGE-1缺失變異體(Van der Bruggen et al.，Int.J.Cancer 44634-640(1989))。這些細(xì)胞已經(jīng)由RT-PCR“定型”為MAGE-1+2+3+(MZ2-MEL3.1)，MAGE-1-2+3+(MZ2-MEL2.2)，和MAGE1-2-3-(SK MEL-187)。通過在Nonidet P40(NP-40)緩沖液(1％NP-40，50mMTris-HCl，PH8.0，150mMNaCl)中勻漿細(xì)胞可制備裂解物，結(jié)果示于圖3A。
與46KDa蛋白質(zhì)反應(yīng)的單克隆抗體MA454存在于MZ2-MEL3.1裂解物中，但不存在于其它兩個細(xì)胞系的裂解物中。當(dāng)試驗三個其它的黑素瘤系時，僅有那些被定型為MAGE-1陽性的系才能與mAb反應(yīng)，MAGE-2或MAGE-3的表達(dá)是無關(guān)的。
還試驗了抗這些裂解物的以上文獻(xiàn)所述的多克隆抗血清，結(jié)果示于圖3B，對于MZ2-MEL3.1和經(jīng)MAGE-1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系MZ2-MEL2.2-ET.1而言為陽性，但對于親代系MZ2-MEL2.2而言為陰性。實施例5從肝、腎和睪丸組織中制備裂解物，并從包括一個MAGE-1+2+3+系，兩個MAGE-1-2+3+和一個MAGE-1-2-3-系的四個黑素瘤細(xì)胞系中也制備裂解物。如以上文獻(xiàn)所述制備裂解物，當(dāng)進(jìn)行免疫印跡時，睪丸裂解物與mAb 454為陽性反應(yīng)，正如MAGE-1陽性黑素瘤。其它裂解物都不呈陽性，這與mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)完全符合。
使用多克隆抗血清進(jìn)行相同的實驗，結(jié)果與單克隆抗體的相似，圖4表示了這些結(jié)果。
以上進(jìn)行的實驗描述了與腫瘤排斥抗原前體TRAP特異性結(jié)合的單克隆抗體的生產(chǎn)。此研究表明可與“野生型”MAGE-1分子和其重組形式結(jié)合，但不能與MAGE-2或MAGE-3結(jié)合。結(jié)合MAGE-1的mAb的特別優(yōu)選的種類，即mA454已被保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，登記號為HB11540。
因此本發(fā)明涉及MAGE-1特異性的單克隆抗體以及產(chǎn)生它們的雜交瘤，已發(fā)現(xiàn)mAb可用于測定細(xì)胞裂解物中MAGE-1的表達(dá)。具體地說，例如可以標(biāo)記的形式、與固相結(jié)合或其它經(jīng)處理的形式加入mAb以增加MAGE-1檢測的敏感性。有關(guān)mAb被使用的方法包括任何一種標(biāo)準(zhǔn)類型的免疫測定法，這些方法包括ELISA、RIA，競爭性試驗，凝集試驗和所有其它試驗。本文使用的“細(xì)胞裂解物”不僅指表達(dá)裂解的樣品，也指那些含有可在體內(nèi)被裂解之細(xì)胞的樣品或正常含有細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)的任何樣品。MAGE-1表達(dá)產(chǎn)物的檢測在例如診斷或監(jiān)測癌癥的存在或進(jìn)展中是有用的。
分離的重組MAGE-1蛋白質(zhì)也是本發(fā)明的特征，此分子的分子量經(jīng)SDS-PAGE測定約為20-22KDa，它作為免疫原是有用的，例如實施例中表明SEQ ID NOs2，3和4的肽類具有免疫原性。優(yōu)選地，它們可與適當(dāng)?shù)淖魟┞?lián)合使用。通過非重組方法得到的此分子的分離形式的分子量徑SDS-PAGE測定約為43KD，它可以與重組蛋白質(zhì)相同的方法被使用。如以上文獻(xiàn)所述，重組形式僅含有MAGE-1序列的57-219位氨基酸。本發(fā)明的一部分也包括經(jīng)SDS-PAGE測定其分子量約為34.3kd的全長分離重組MAGE-1蛋白質(zhì)，此蛋白質(zhì)含有由SEQ ID NO1之核苷酸3931-4761位所編碼的氨基酸序列。
本發(fā)明的其它特征對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，因而不需在此重復(fù)。
所用術(shù)語和表達(dá)方式在此僅用作描述性而非限制性的術(shù)語，在使用這種術(shù)語和表達(dá)方式時并不想排斥所示和所述特征或其它部分的任何相同方式，應(yīng)理解多種修改也可包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
序列表(1)一般信息(i)申請人Chen，Yao-Tseng；Stocket，Elisabeth；Chen，Yachi；Garin-Chesa，Pilar；Rettig，Wolfgang J.；Van der Bruggen，Pierre；Boon-Falleur，Thierry；Old，Lloyd J.
(ii)發(fā)明名稱與腫瘤排斥抗原前體MAGE-1結(jié)合的單克隆抗體，重組的MAGE-1，和衍生于MAGE-1的免疫原性肽(iii)序列數(shù)4(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人Felfe&Lynch(B)街道805 Third Avenue(C)城市紐約市(D)州紐約(F)郵編10022(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒介類型5.25寸磁盤，360kb存儲(B)計算機(jī)IBM(C)操作系統(tǒng)PC-DOS(D)軟件Wordperfect(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?8/190,411(B)申請日1994年2月1日(C)分類424(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?37,230(B)申請日1993年3月26日
(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)朠CT/US92/04354(B)申請日1992年5月22日(viii)在先申請資料(A)申請?zhí)?7/807,043(B)申請日1991年12月12日(ix)在先申請資料(A)申請?zhí)?7/764,364(B)申請日1991年9月23日(x)在先申請資料(A)申請?zhí)?7/728,838(B)申請日1991年7月9日(xi)在先申請資料(A)申請?zhí)?7/705,702(B)申請日1991年5月23日(xii)律師/代理人信息(A)姓名Hanson，Norman D.
(B)注冊號30,946(C)文檔號LUD5354(xiii)通訊信息(A)電話(212)688-9200(B)傳真(212)838-3884(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度5674bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA
(ix)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞MAGE-1基因(xi)序列描述SEQ ID NO1CCCGGGGCAC CACTGGCATC CCTCCCCCTA CCACCCCCAA TCCCTCCCTT 50TACGCCACCC ATCCAAACAT CTTCACGCTC ACCCCCAGCC CAAGCCAGGC 100AGAATCCGGT TCCACCCCTG CTCTCAACCC AGGGAAGCCC AGGTGCCCAG 150ATGTGACGCC ACTGACTTGA GCATTAGTGG TTAGAGAGAA GCGAGGTTTT 200CGGTCTGAGG GGCGGCTTGA GATCGGTGGA GGGAAGCGGG CCCAGCTCTG 250TAAGGAGGCA AGGTGACATG CTGAGGGAGG ACTGAGGACC CACTTACCCC 300AGATAGAGGA CCCCAAATAA TCCCTTCATG CCAGTCCTGG ACCATCTGGT 350GGTGGACTTC TCAGGCTGGG CCACCCCCAG CCCCCTTGCT GCTTAAACCA 400CTGGGGACTC GAAGTCAGAG CTCCGTGTGA TCAGGGAAGG GCTGCTTAGG 450AGAGGGCAGC GTCCAGGCTC TGCCAGACAT CATGCTCAGG ATTCTCAAGG 500AGGGCTGAGG GTCCCTAAGA CCCCACTCCC GTGACCCAAC CCCCACTCCA 550ATGCTCACTC CCGTGACCCA ACCCCCTCTT CATTGTCATT CCAACCCCCA 600CCCCACATCC CCCACCCCAT CCCTCAACCC TGATGCCCAT CCGCCCAGCC 650ATTCCACCCT CACCCCCACC CCCACCCCCA CGCCCACTCC CACCCCCACC 700CAGGCAGGAT CCGGTTCCCG CCAGGAAACA TCCGGGTGCC CGGATGTGAC 750GCCACTGACT TGCGCATTGT GGGGCAGAGA GAAGCGAGGT TTCCATTCTG 800AGGGACGGCG TAGAGTTCGG CCGAAGGAAC CTGACCCAGG CTCTGTGAGG 850AGGCAAGGTG AGAGGCTGAG GGAGGACTGA GGACCCCGCC ACTCCAAATA 900GAGAGCCCCA AATATTCCAG CCCCGCCCTT GCTGCCAGCC CTGGCCCACC 950CGCGGGAAGA CGTCTCAGCC TGGGCTGCCC CCAGACCCCT GCTCCAAAAG 1000CCTTGAGAGA CACCAGGTTC TTCTCCCCAA GCTCTGGAAT CAGAGGTTGC 1050TGTGACCAGG GCAGGACTGG TTAGGAGAGG GCAGGGCACA GGCTCTGCCA 1100GGCATCAAGA TCAGCACCCA AGAGGGAGGG CTGTGGGCCC CCAAGACTGC 1150ACTCCAATCC CCACTCCCAC CCCATTCGCA TTCCCATTCC CCACCCAACC 1200CCCATCTCCT CAGCTACACC TCCACCCCCA TCCCTACTCC TACTCCGTCA 1250CCTGACCACC ACCCTCCAGC CCCAGCACCA GCCCCAACCC TTCTGCCACC 1300TCACCCTCAC TGCCCCCAAC CCCACCCTCA TCTCTCTCAT GTGCCCCACT 1350CCCATCGCCT CCCCCATTCT GGCAGAATCC GGTTTGCCCC TGCTCTCAAC 1400CCAGGGAAGC CCTGGTAGGC CCGATGTGAA ACCACTGACT TGAACCTCAC 1450AGATCTGAGA GAAGCCAGGT TCATTTAATG GTTCTGAGGG GCGGCTTGAG 1500ATCCACTGAG GGGAGTGGTT TTAGGCTCTG TGAGGAGGCA AGGTGAGATG 1550CTGAGGGAGG ACTGAGGAGG CACACACCCC AGGTAGATGG CCCCAAAATG 1600ATCCAGTACC ACCCCTGCTG CCAGCCCTGG ACCACCCGGC CAGGACAGAT 1650GTCTCAGCTG GACCACCCCC CGTCCCGTCC CACTGCCACT TAACCCACAG 1700GGCAATCTGT AGTCATAGCT TATGTGACCG GGGCAGGGTT GGTCAGGAGA 1750GGCAGGGCCC AGGCATCAAG GTCCAGCATC CGCCCGGCAT TAGGGTCAGG 1800ACCCTGGGAG GGAACTGAGG GTTCCCCACC CACACCTGTC TCCTCATCTC 1850CACCGCCACC CCACTCACAT TCCCATACCT ACCCCCTACC CCCAACCTCA 1900TCTTGTCAGA ATCCCTGCTG TCAACCCACG GAAGCCACGG GAATGGCGGC 1950CAGGCACTCG GATCTTGACG TCCCCATCCA GGGTCTGATG GAGGGAAGGG 2000GCTTGAACAG GGCCTCAGGG GAGCAGAGGG AGGGCCCTAC TGCGAGATGA 2050GGGAGGCCTC AGAGGACCCA GCACCCTAGG ACACCGCACC CCTGTCTGAG 2100ACTGAGGCTG CCACTTCTGG CCTCAAGAAT CAGAACGATG GGGACTCAGA 2150TTGCATGGGG GTGGGACCCA GGCCTGCAAG GCTTACGCGG AGGAAGAGGA 2200GGGAGGACTC AGGGGACCTT GGAATCCAGA TCAGTGTGGA CCTCGGCCCT 2250GAGAGGTCCA GGGCACGGTG GCCACATATG GCCCATATTT CCTGCATCTT 2300TGAGGTGACA GGACAGAGCT GTGGTCTGAG AAGTGGGGCC TCAGGTCAAC 2350AGAGGGAGGA GTTCCAGGAT CCATATGGCC CAAGATGTGC CCCCTTCATG 2400AGGACTGGGG ATATCCCCGG CTCAGAAAGA AGGGACTCCA CACAGTCTGG 2450CTGTCCCCTT TTAGTAGCTC TAGGGGGACC AGATCAGGGA TGGCGGTATG 2500TTCCATTCTC ACTTGTACCA CAGGCAGGAA GTTGGGGGGC CCTCAGGGAG 2550ATGGGGTCTT GGGGTAAAGG GGGGATGTCT ACTCATGTCA GGGAATTGGG 2600GGTTGAGGAA GCACAGGCGC TGGCAGGAAT AAAGATGAGT GAGACAGACA 2650AGGCTATTGG AATCCACACC CCAGAACCAA AGGGGTCAGC CCTGGACACC 2700TCACCCAGGA TGTGGCTTCT TTTTCACTCC TGTTTCCAGA TCTGGGGCAG 2750GTGAGGACCT CATTCTCAGA GGGTGACTCA GGTCAACGTA GGGACCCCCA 2800TCTGGTCTAA AGACAGAGCG GTCCCAGGAT CTGCCATGCG TTCGGGTGAG 2850GAACATGAGG GAGGACTGAG GGTACCCCAG GACCAGAACA CTGAGGGAGA 2900CTGCACAGAA ATCAGCCCTG CCCCTGCTGT CACCCCAGAG AGCATGGGCT 2950GGGCCGTCTG CCGAGGTCCT TCCGTTATCC TGGGATCATT GATGTCAGGG 3000ACGGGGAGGC CTTGGTCTGA GAAGGCTGCG CTCAGGTCAG TAGAGGGAGC 3050GTCCCAGGCC CTGCCAGGAG TCAAGGTGAG GACCAAGCGG GCACCTCACC 3100CAGGACACAT TAATTCCAAT GAATTTTGAT ATCTCTTGCT GCCCTTCCCC 3150AAGGACCTAG GCACGTGTGG CCAGATGTTT GTCCCCTCCT GTCCTTCCAT 3200TCCTTATCAT GGATGTGAAC TCTTGATTTG GATTTCTCAG ACCAGCAAAA 3250GGGCAGGATC CAGGCCCTGC CAGGAAAAAT ATAAGGGCCC TGCGTGAGAA 3300CAGAGGGGGT CATCCACTGC ATGAGAGTGG GGATGTCACA GAGTCCAGCC 3350CACCCTCCTG GTAGCACTGA GAAGCCAGGG CTGTGCTTGC GGTCTGCACC 3400CTGAGGGCCC GTGGATTCCT CTTCCTGGAG CTCCAGGAAC CAGGCAGTGA 3450GGCCTTGGTC TGAGACAGTA TCCTCAGGTC ACAGAGCAGA GGATGCACAG 3500GGTGTGCCAG CAGTGAATGT TTGCCCTGAA TGCACACCAA GGGCCCCACC 3550TGCCACAGGA CACATAGGAC TCCACAGAGT CTGGCCTCAC CTCCCTACTG 3600TCAGTCCTGT AGAATCGACC TCTGCTGGCC GGCTGTACCC TGAGTACCCT 3650CTCACTTCCT CCTTCAGGTT TTCAGGGGAC AGGCCAACCC AGAGGACAGG 3700ATTCCCTGGA GGCCACAGAG GAGCACCAAG GAGAAGATCT GTAAGTAGGC 3750CTTTGTTAGA GTCTCCAAGG TTCAGTTCTC AGCTGAGGCC TCTCACACAC 3800TCCCTCTCTC CCCAGGCCTG TGGGTCTTCA TTGCCCAGCT CCTGCCCACA 3850CTCCTGCCTG CTGCCCTGAC GAGAGTCATC3880ATG TCT CTT GAG CAG AGG AGT CTG CAC TGC AAG CCT GAG GAA 3922GCC CTT GAG GCC CAA CAA GAG GCC CTG GGC CTG GTG TGT GTG 3964CAG GCT GCC ACC TCC TCC TCC TCT CCT CTG GTC CTG GGC ACC 4006CTG GAG GAG GTG CCC ACT GCT GGG TCA ACA GAT CCT CCC CAG 4048AGT CCT CAG GGA GCC TCC GCC TTT CCC ACT ACC ATC AAC TTC 4090ACT CGA CAG AGG CAA CCC AGT GAG GGT TCC AGC AGC CGT GAA 4132GAG GAG GGG CCA AGC ACC TCT TGT ATC CTG GAG TCC TTG TTC 4174CGA GCA GTA ATC ACT AAG AAG GTG GCT GAT TTG GTT GGT TTT 4216CTG CTC CTC AAA TAT CGA GCC AGG GAG CCA GTC ACA AAG GCA 4258GAA ATG CTG GAG AGT GTC ATC AAA AAT TAC AAG CAC TGT TTT 4300CCT GAG ATC TTC GGC AAA GCC TCT GAG TCC TTG CAG CTG GTC 4342TTT GGC ATT GAC GTG AAG GAA GCA GAC CCC ACC GGC CAC TCC 4384TAT GTC CTT GTC ACC TGC CTA GGT CTC TCC TAT GAT GGC CTG 4426CTG GGT GAT AAT CAG ATC ATG CCC AAG ACA GGC TTC CTG ATA 4468ATT GTC CTG GTC ATG ATT GCA ATG GAG GGC GGC CAT GCT CCT 4510GAG GAG GAA ATC TGG GAG GAG CTG AGT GTG ATG GAG GTG TAT 4552GAT GGG AGG GAG CAC AGT GCC TAT GGG GAG CCC AGG AAG CTG 4594CTC ACC CAA GAT TTG GTG CAG GAA AAG TAC CTG GAG TAC GGC 4636AGG TGC CGG ACA GTG ATC CCG CAC GCT ATG AGT TCC TGT GGG 4678GTC CAA GGG CCC TCG CTG AAA CCA GCT ATG TGA 4711AAGTCCTTGA GTATGTGATC AAGGTCAGTG CAAGAGTTC 4750GCTTTTTCTT CCCATCCCTG CGTGAAGCAG CTTTGAGAGA GGAGGAAGAG 4800GGAGTCTGAG CATGAGTTGC AGCCAAGGCC AGTGGGAGGG GGACGGGGCC 4850AGTGCACCTT CCAGGGCCGC GTCCAGCAGC TTCCCCTGCC TCGTGTGACA 4900TGAGGCCCAT TCTTCACTCT GAAGAGAGCG GTCAGTGTTC TCAGTAGTAG 4950GTTTCTGTTC TATTGGGTGA CTTGGAGATT TATCTTTGTT CTCTTTTGGA 5000ATTGTTCAAA TGTTTTTTTT TAAGGGATGG TTGAATGAAC TTCAGCATCC 5050AAGTTTATGA ATGACAGCAG TCACACAGTT CTGTGTATAT AGTTTAAGGG 5100TAAGAGTCTT GTGTTTTATT CAGATTGGGA AATCCATTCT ATTTTGTGAA 5150TTGGGATAAT AACAGCAGTG GAATAAGTAC TTAGAAATGT GAAAAATGAG 5200CAGTAAAATA GATGAGATAA AGAACTAAAG AAATTAAGAG ATAGTCAATT 5250CTTGCCTTAT ACCTCAGTCT ATTCTGTAAA ATTTTTAAAG ATATATGCAT 5300ACCTGGATTT CCTTGGCTTC TTTGAGAATG TAAGAGAAAT TAAATCTGAA 5350TAAAGAATTC TTCCTGTTCA CTGGCTCTTT TCTTCTCCAT GCACTGAGCA 5400TCTGCTTTTT GGAAGGCCCT GGGTTAGTAG TGGAGATGCT AAGGTAAGCC 5450AGACTCATAC CCACCCATAG GGTCGTAGAG TCTAGGAGCT GCAGTCACGT 5500AATCGAGGTG GCAAGATGTC CTCTAAAGAT GTAGGGAAAA GTGAGAGAGG 5550GGTGAGGGTG TGGGGCTCCG GGTGAGAGTG GTGGAGTGTC AATGCCCTGA 5600GCTGGGGCAT TTTGGGCTTT GGGAAACTGC AGTTCCTTCT GGGGGAGCTG 5650GCTGGGGCAT TTTGGGCTTT GGGAAACTGC AGTTCCTTCT GGGGGAGCTG 5700ATTGTAATGA TCTTGGGTGG ATCC 5724(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度14個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser Ser5 10(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度12個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO3Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp5 10(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度12個氨基酸殘基(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Val Lys Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5 10
權(quán)利要求書按照條約第19條的修改1、與腫瘤排斥抗原前體MAGE-1特異性結(jié)合的單克隆抗體。
2、如權(quán)利要求1的被稱作MA454的單克隆抗體。
3、產(chǎn)生如權(quán)利要求1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
4、如權(quán)利要求3的雜交瘤細(xì)胞系，其中所述單克隆抗體是MA454。
5、測定樣品中腫瘤排斥抗原前體MAGE-1的方法，包括使所說樣品與權(quán)利要求1的單克隆抗體接觸，并測定所說單克隆抗體與所說樣品成分的結(jié)合，以測定所說樣品中的MAGE-1。
6、如權(quán)利要求5的方法，其中所說單克隆抗體與固相結(jié)合。
7、如權(quán)利要求5的方法，其中所說單克隆抗體用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。
8、分離的MAGE-1腫瘤排斥抗原前體衍生物，它是分子量約為20kda至約22kda的蛋白質(zhì)。
9、分離的蛋白質(zhì)，它由SEQ ID NO1核苷酸序列的3931-4761位核苷酸編碼的57-219位氨基酸組成。
10、選自下列一組的分離肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4。
11、含有如權(quán)利要求8的至少一種分離蛋白質(zhì)和佐劑的免疫原性組合物。
12、含有如權(quán)利要求9的至少一種分離蛋白質(zhì)和佐劑的免疫原性組合物。
13、含有如權(quán)利要求10的至少一種分離肽和佐劑的免疫原性組合物。
權(quán)利要求
1.與腫瘤排斥抗原前體MAGE-1特異性結(jié)合的單克隆抗體。
2.如權(quán)利要求1的被稱作MA454的單克隆抗體。
3.產(chǎn)生如權(quán)利要求1的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
4.如權(quán)利要求3的雜交瘤細(xì)胞系，其中所述單克隆抗體是MA454。
5.測定樣品中腫瘤排斥抗原前體MAGE-1的方法，包括使所說樣品與權(quán)利要求1的單克隆抗體接觸，并測定所說單克隆抗體與所說樣品成分的結(jié)合，以測定所說樣品中的MAGE-1。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中所說單克隆抗體與固相結(jié)合。
7.如權(quán)利要求5的方法，其中所說單克隆抗體用可檢測的標(biāo)記物標(biāo)記。
8.分離的MAGE-1腫瘤排斥抗原前體。
9.如權(quán)利要求8的分離的MAGE-1腫瘤排斥抗原前體，它是分子量經(jīng)SDS-PAGE測定約為46kda的糖蛋白。
10.如權(quán)利要求8的分離的MAGE-1腫瘤排斥抗原前體，它是分子量經(jīng)SDS-PAGE測定約為34.3kda的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
11.分離的蛋白質(zhì)，它含有由SEQ ID No1核苷酸序列的3931-4761位核苷酸所編碼的57-219位氨基酸。
12.選自下列一組的分離肽SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，和SEQ ID NO4。
13.含有如權(quán)利要求9的至少一種分離蛋白質(zhì)和佐劑的免疫原性組合物。
14.含有如權(quán)利要求10的至少一種分離蛋白質(zhì)和佐劑的免疫原性組合物。
15.含有如權(quán)利要求11的至少一種分離蛋白質(zhì)和佐劑的免疫原性組合物。
16.含有如權(quán)利要求12的至少一種肽和佐劑的免疫原性組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及與腫瘤排斥抗原前體分子MAGE-1特異性結(jié)合的單克隆抗體，產(chǎn)生這些單克隆抗體的雜交瘤，以及它們的用途。本發(fā)明也描述了MAGE-1的重組體形式，可用作免疫原的肽類，以及含有此肽類和佐劑的免疫原性組合物。
文檔編號C07K14/47GK1145032SQ95191450
公開日1997年3月12日 申請日期1995年1月5日 優(yōu)先權(quán)日1994年2月1日
發(fā)明者陳耀成, 伊莉莎白·斯多克特, 陳亞奇, 皮拉爾·加林-凱薩, 沃爾夫?qū)·雷蒂希, 皮埃爾·范德布呂根, 蒂爾瑞·布恩-法勒爾, 勞埃德·J·奧德 申請人:路德維格癌癥研究所, 紀(jì)念斯隆-凱特林癌癥中心