專利名稱：合成熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明主要涉及分子生物學(xué)、生物技術(shù)和蛋白質(zhì)合成領(lǐng)域。特別是，本發(fā)明涉及一種在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)的新方法?，F(xiàn)有技術(shù)有證據(jù)表明，新生多肽在核糖體上獲得二級和三級結(jié)構(gòu)。Beckman及其同事(1990)證明Hsp70與新生蛋白相互作用，并假定發(fā)生了共翻譯折疊。核糖體本身可能在折疊過程中起著重要作用。Lim和Spirin(1986)假設(shè)合成的新生肽一定呈α螺旋。已有人綜述了利用熒光技術(shù)來研究新生肽和新生蛋白在核糖體上的延伸和折疊。過去，這些技術(shù)被用于說明MS2蛋白在與核糖體結(jié)合時發(fā)生折疊。
已發(fā)現(xiàn)伴隨蛋白幫助許多蛋白從它們的變性狀態(tài)折疊成活性狀態(tài)，但關(guān)于這些蛋白質(zhì)在翻譯過程中是否在核糖體上發(fā)生作用知之甚少。Hartl及其同事提供數(shù)據(jù)表明，DnaJ是在小麥胚芽核糖體上與螢水蟲螢光素酶或氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶新生肽結(jié)合的第一個伴隨蛋白(Hendrick等，1993)。
先前的技術(shù)缺少在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)的有效方法。本發(fā)明實現(xiàn)了本領(lǐng)域長期存在的這種需求和期望。
發(fā)明概述在本發(fā)明中，來自香豆素—馬來酰亞胺基-SAcMet-tRNAf(CPM-SAcMet-tRNAf)的香豆素被摻入在細(xì)菌的無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)中核糖體上合成的新生多肽N末端。熒光技術(shù)被用于監(jiān)測N末端探針的局部環(huán)境和遷移率以及伴隨蛋白對來自核糖體上的新生或全長多肽的折疊、激活和釋放的順序作用。本發(fā)明顯示，在新生硫氰酸酶多肽以肽基-tRNA的形式結(jié)合在核糖體上時，伴隨蛋白影響它們的折疊。伴隨蛋白幫助它們以酶活性蛋白的形式從核糖體上釋放。
在本發(fā)明的一個實施例中，提供了一種在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成熒光標(biāo)記蛋白的方法，包括(a)將從無細(xì)胞提取物中獲得的核糖體樣品與含目標(biāo)蛋白編碼序列的質(zhì)粒DNA一同培養(yǎng)，所述的樣品與具有熒光標(biāo)記的氨酰tRNA一起培養(yǎng)在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基中；(b)通過將新合成的熒光標(biāo)記蛋白與所述樣品中的其它熒光組份分離來部分純化所述的熒光標(biāo)記蛋白；(c)測定合成蛋白的量；(d)測定新合成蛋白的熒光及(e)測定新合成蛋白的生物活性。
以下為了闡述目的，給出的本發(fā)明優(yōu)選實施例的說明將明確本發(fā)明的其它及進(jìn)一步的內(nèi)容、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。
附圖簡述為了達(dá)到和具體理解本發(fā)明的上述特點(diǎn)、優(yōu)點(diǎn)和目的以及其它方面，參照附圖中說明的某些實施例可更具體地說明以上概述的本發(fā)明。這些附圖構(gòu)成說明書的一部分。但需要注意的是，


本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所以不應(yīng)被視為其范圍的限制。
圖1顯示了在〔14C〕亮氨酸存在下翻譯得到或由CPM-SAc〔35S〕Met-tRNAf引發(fā)的游離的及與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的分析結(jié)果。以〔14C〕亮氨酸(160Ci/mol)或CPM-SAc〔35S〕Met-tRNAf(4,000Ci/mol)為放射活性前體，利用偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯來合成硫氰酸酶。培養(yǎng)后，離心反應(yīng)混合物。通過SDS-PAGE和放射自顯影術(shù)分析上清液和重懸的核糖體。所示為放射自顯影圖(前2幅分別標(biāo)為〔14C〕亮氨酸和CPM〔35S〕Met)。泳道1和2，得自與中間〔14C〕亮氨酸的共同培養(yǎng)；泳道3和4，得自與N末端CPM-SAc-〔35S〕甲硫氨酸的共同培養(yǎng)。泳道1和3，20ul上清液；泳道2和4，20ul重懸的核糖體。圖1的第3幅(標(biāo)為抗RHO抗體)顯示用抗硫氰酸酶抗體探測的Western印跡。利用Amersham的ECL系統(tǒng)可以看到與第二抗體共價結(jié)合的辣根過氧化物酶的位置。箭頭指示出得自牛肝的天然硫氰酸酶的電泳遷移率。
圖2顯示了利用硝基甲烷的香豆素?zé)晒獾拟?。給出釋放的或與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶的穩(wěn)態(tài)熒光強(qiáng)度的Stern-Volmer點(diǎn)，與游離CPM-SAc-Met-tRNA(線1)和與核糖體結(jié)合的該tRNA(線6)比較。線2，上清液中酶活性形式的CPM-硫氰酸酶；線3，用DnaK釋放的CPM-硫氰酸酶；線4，用嘌呤霉素釋放的CPM-硫氰酸酶；線5，與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶。
圖3顯示與抗香豆素抗體共同培養(yǎng)前和后的CPM標(biāo)記的硫氰酸酶的熒光發(fā)射譜。對與核糖體結(jié)合的(A)或釋放入上清液的(B)CPM-硫氰酸酶進(jìn)行了分析(實線)。然后加入抗香豆素IgG并再次獲取發(fā)射光譜(虛線)。插入框中給出了各個被分析樣品的定量熒光數(shù)據(jù)。
圖4顯示DnaJ影響抗香豆素IgG與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶的相互作用。首先，獲取與稀疏霉素共同培養(yǎng)后的核糖體上CPM-硫氰酸酶的光譜(實線)。設(shè)置三份平行樣品(在核糖體上與稀疏霉素共培養(yǎng)的CPM-硫氰酸酶)，加入DnaJ或DnaK或以上兩者。獲取光譜(未示出)并進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)與表VI中的一致或非常相近。然后在每一樣品中加入抗香豆素IgG。室溫培養(yǎng)10分鐘后，獲取光譜并在此顯示。(×－×)DnaJ＋I(xiàn)gG；(…)DnaK＋I(xiàn)gG；(－－)DnaJ和DnaK＋I(xiàn)gG。
本發(fā)明的詳細(xì)說明在本發(fā)明的描述中，使用了下列縮寫RHO，硫氰酸酶；CPM，3-(4-馬來酰亞胺基苯基)-4-甲基-7-(二乙基氨基)香豆素；CPM-硫氰酸酶，N末端的甲硫氨酸用CPM標(biāo)記的硫氰酸酶；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；抗-CPM IgG，抗香豆素的兔多克隆抗體；CPM-SAc-Met-tRNAf，先被甲硫氨酸氨?；僭诩琢虬彼岬陌被ㄟ^巰基乙酸以CPM標(biāo)記的起始tRNA；IgG，免疫球蛋白；Fab，IgG的木瓜蛋白酶酶解片段。
本發(fā)明還涉及一種在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)的方法，其步驟包括(a)將得自無細(xì)胞提取物的核糖體樣品與包含目標(biāo)蛋白編碼序列的質(zhì)粒DNA一同培養(yǎng)，所述的樣品與具有熒光標(biāo)記的氨酰tRNA一起培養(yǎng)在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基中；(b)通過將新合成的熒光標(biāo)記蛋白與所述樣品中的其它熒光組份分離來部分純化所述的熒光標(biāo)記蛋白；(c)測定合成蛋白量；(d)測定新合成蛋白的熒光及(e)測定新合成蛋白的生物活性。
通常，在本發(fā)明中，熒光標(biāo)記位于所述蛋白質(zhì)的N末端。在某優(yōu)選實施例中，用于本發(fā)明方法的氨酰tRNA是甲硫氨酰-tRNA-甲硫氨酸/f。較好的是，熒光標(biāo)記與起始tRNA的氨基酸共價連接。
在本發(fā)明的方法中，轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基一般含有RNA聚合酶、三磷酸核苷、能量再生系統(tǒng)和溶于緩沖液中的氨基酸。在某優(yōu)選實施例中，從稱為S30的E.coli提取物中分離出核糖體。在某優(yōu)選實施例中，質(zhì)粒DNA是非線性化的。較好的是，培養(yǎng)步驟(a)在37℃進(jìn)行約30分鐘。而且，在本發(fā)明的方法中，部分純化熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)，其方法選自離心、離子交換色譜和凝膠過濾。
以下給出的實施例是為了說明本發(fā)明的各種實施方法，而不是為了對本發(fā)明進(jìn)行任何形式的限定。
實施例1化學(xué)試劑向Boehringer-Mannheim購買三磷酸核苷和E.coli tRNA；3-(4-馬來酰亞胺基苯基)-7-二乙基氨基-4-甲基香豆素(CPM)購自Molecular Probes Inc.(Eugene，OR)。tRNAfMet，利福平、嘌呤霉素、稀疏霉素和其它生物化學(xué)試劑購自Sigma。核糖核酸酶A和T1的混合物(“RNase混合物”)購自Ambion(Austin，TX)?！?4C〕亮氨酸和〔35S〕甲硫氨酸購自NEN-Dupont。伴隨蛋白DnaK、DnaJ、GrpE，GroEL和GroES購自Epicentre Technologies(Madison，WI)。從牛肝線粒體中分離原初硫氰酸酶質(zhì)粒和硫氰酸酶，由Paul Horowitz博士(University of TexasHealth Science Center，San Antonio，TX)提供多克隆抗硫氰酸酶抗體。由Warren Tate博士(University of Otago，New Zealand)提供抗E.coli釋放因子1和2的多克隆抗體。第二抗體(山羊-抗-兔IgG-辣根過氧化物酶和兔-抗-綿羊IgG辣根過氧化物酶)購自Zymed(South SanFrancisco，CA)。
實施例2在體外系統(tǒng)中按照Kudlicki等在Anal.Biochem.206389(1992)中所述進(jìn)行質(zhì)粒的增殖、SP6 RNA聚合酶的分離和E.coli的無細(xì)胞提取物(S30)的制備以及核糖體組份與S30的分離。簡而言之，質(zhì)粒是按標(biāo)準(zhǔn)方法(J.Sambrook等，(1989)Molecular Cloning，Cold Spring HarborLaboratory Press)制備的，但用Q柱色譜替代CsCl離心步驟。SP6和T7RNA聚合酶可購置。使用的核糖體組份是根據(jù)G.Zubay從E.coli K12(A19)制備的S30分離而得的。細(xì)胞在37℃培養(yǎng)于加有20％葡萄糖(10ml/2L培養(yǎng)基)的LB(Sigma)培養(yǎng)液中。在對數(shù)中期于37℃收獲細(xì)胞，并在壓碎器中裂解。然后在30,000×g離心30分鐘，由此制得S30提取物。在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑，苯基甲基磺酰氯，終濃度為0.5mM。將等份的S30(每份9ml)在Beckman Ti 50離心轉(zhuǎn)頭中以47,000rpm轉(zhuǎn)速離心4小時。將沉淀的核糖體在1.0ml的20mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM Mg(OAc)2和1mM DTT中重懸成約1200A260單位/ml的懸浮液。將此核糖體組份分成小份儲存于-70℃。
根據(jù)以前對用CPM標(biāo)記Phe-tRNAPhe的α氨基所作的描述(Odom等，1990)制備CPM-SAcMet-tRNA。簡而言之，用二硫基二乙酸?；?5S〕Met-tRNAf中甲硫氨酸的α氨基，然后還原成相應(yīng)的硫基乙酸衍生物。其中的巰基與馬來酰亞胺(CPM)反應(yīng)。在兔體內(nèi)誘導(dǎo)抗CPM抗體；如已有的描述(Picking等，1992)，從免疫的兔血清中分離IgG組份。
偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯體外系統(tǒng)已有詳細(xì)的記述(Kudlicki等，1992)。簡而言之，總體積30μl的用于進(jìn)行偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中含有50mM Tris-乙酸(pH7.8)、14mM Mg(OAc)2，36mM NH4OAc、72mM KOAc，2mMCa(OAc)2，0.5mM EDTA、2％聚乙二醇-6000、2mM DTT、1.2mMATP、GTP、UTP和CTP各0.8mM，0.5mM cAMP、27mM磷酸烯醇式丙酮酸、0.35μg丙酮酸激酶、1μg亞葉酸、83μM14C-亮氨酸、其它19種氨基酸各330μM、20μg E.coli tRNA(Boehringer)、0.5μg利福平、0.3mM葡萄糖-6-磷酸鹽、1.2A260單位E.coli核糖體組份、0.5μg質(zhì)粒DNA和0.5μg SP6 RNA聚合酶。稀釋14C-亮氨酸至40Ci/摩爾用于測定。在37℃培養(yǎng)30分鐘。為了大規(guī)模合成CPM-硫氰酸酶，將反應(yīng)混合物放大至0.9ml，除含上述鹽和低分子量組份外另加5mM Na2S2O3。將60A260單位未洗滌過的核糖體與約10-15μg非線性化質(zhì)粒(pSP65)一起培養(yǎng)，該質(zhì)粒含有位于SP6啟動子下游的硫氰酸酶編碼序列。將CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf(350Ci/mol)用作放射性前體；省去亞葉酸。在一些對照實驗中，〔14C〕亮氨酸(40 Ci/mol)與非放射性fMet-tRNAf共用。在37℃培養(yǎng)30分鐘后，樣品加載于0.6ml蔗糖緩沖液上，45,000rpm離心45分鐘。然后，收集保存上清液，去除蔗糖層；漂洗核糖體沉淀后重懸在60μl的20mM Tris-HCl，pH7.5、10mM Mg(OA)2、30mM NH4OAc、1mMDTT、5mM Na2S2O3(溶液A)中。離心后，馬上用核糖核酸酶A和T1(各為0.1mg和2,000U/ml)在37℃處理上清液15分鐘，以降解剩余的CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf。然后將產(chǎn)生的反應(yīng)混合物在平衡于溶液A中的Sephadex G100柱(1×20cm)上進(jìn)行色譜，從含香豆素和〔35S〕甲硫氨酸的低分子量降解產(chǎn)物中分離出新合成的CPM標(biāo)記的硫氰酸酶。
實施例3熒光測定在SLM-Aminco Instruments Inc.(Urbana，IL)的8000C型光子計數(shù)熒光分光光度計上進(jìn)行熒光測定。以1nm發(fā)射間隔、0.5秒/波長增加的掃描速度測定光譜；激發(fā)波長為390nm。根據(jù)以CPM-SAc-甲硫氨酸形式存在于樣品中的〔35S〕甲硫氨酸的放射活性標(biāo)定光譜和相應(yīng)的相對量子產(chǎn)率。通過積分發(fā)射光譜測定相對熒光量子產(chǎn)率。將上清液中CPM-硫氰酸酶的相對量子產(chǎn)率設(shè)為1.00，其它的量子產(chǎn)率都是與該值的比較值。如Odom等(1984)所述在480nm發(fā)射波長測定熒光各向異性。為了進(jìn)行熒光研究，將一份重懸的核糖體或一份處理后的上清液以420μl的總體積培養(yǎng)在比色杯中，其中含有上述偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基中的鹽和低分子量組份但沒有氨基酸和UTP及CTP(溶液B)。測得光譜后，加入最少量的待測組份。再次測定光譜前，將比色杯在37℃培養(yǎng)10分鐘。加入的分別是抗CPM-IgG，0.1mg；伴隨蛋白GroES，1.6μg；GroEL，6μg；DnaK，4μg；DnaJ，2μg；GrpE，3μg。
實施例4硫氰酸酶的定量測定用三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白質(zhì)來定量測定硫氰酸酶多肽的量，以本領(lǐng)域熟知的方式進(jìn)行SDS-PAGE和放射自顯影術(shù)分析。根據(jù)Tsalkova等(1993)給出的Sorbo(1953)分析硫氰酸酶活性。簡而言之，在量熱實驗中測定硫氰酸酶的酶活性，該實驗利用該酶以S2O32-為底物測定CN-向SCN-的轉(zhuǎn)化。通過測定該產(chǎn)物與鐵離子的復(fù)合物在460nm處的光吸收來檢測和定量形成的SCN-。一個單位定義為在該實驗系統(tǒng)中于37℃下生成1μmol產(chǎn)物/分鐘的酶量。
用針對釋放因子1和2的胎牛抗體或兔抗硫氰酸酶抗體，再用對應(yīng)的已連接辣根過氧化物酶的第二抗體檢測SDS-PAGE的Western印跡。利用Amershams的ECL的產(chǎn)品通過化學(xué)發(fā)光檢測辣根過氧化物酶。
實施例5N末端以香豆素標(biāo)記的硫氰酸酶的折疊為了測試伴隨蛋白在新生硫氰酸酶折疊和活化中的作用，香豆素在翻譯中從CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf中摻入酶的N末端。利用化學(xué)反應(yīng)酶衍生法形成的Met-tRNAf，然后用于引發(fā)上述的E.coli核糖體上蛋白質(zhì)的合成。在用三氯乙酸沉淀體外合成的硫氰酸酶多肽后，通過放射活性檢測CPM-SAc-〔35S〕甲硫氨酸在轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)中形成的多肽N末端的摻入情況。如圖1所示，利用SDS-PAGE和放射自顯影術(shù)鑒定產(chǎn)物。從上清液中分離出核糖體后進(jìn)行分析。上清液中的和核糖體組份中的全長硫氰酸酶在SDS聚丙烯酰胺凝膠上的遷移率存在著差異。
為了進(jìn)一步鑒定偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯過程中合成的全長產(chǎn)物，將SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后得到的多肽轉(zhuǎn)移至PVDF膜上并用抗硫氰酸酶抗體檢測。圖1顯示被抗硫氰酸酶抗體識別的兩種全長形式。由于與核糖體結(jié)合的多肽可以被轉(zhuǎn)化為具有酶活性的可溶性蛋白，本發(fā)明確切顯示，該多肽是可溶性酶的前體形式。
可溶性的和與核糖體結(jié)合的多肽差異的本質(zhì)還不知道。一種可能性是，遷移率較低的形式與tRNA或由其衍生的核苷酸共價結(jié)合。以下觀察結(jié)果表明這種假設(shè)是不正確的電泳遷移方式不受用核糖核酸酶混合物進(jìn)行的樣品預(yù)培養(yǎng)或在pH10.5、100℃預(yù)培養(yǎng)10分鐘的影響。肽與tRNA3’末端核糖間的酯鍵在后一種情況中必定被水解。而且，沒有檢測到具有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，蓖麻毒蛋白或二氫葉酸還原酶的核糖體結(jié)合形式的類似遷移緩慢的多肽。所以，遷移緩慢的多肽主要與硫氰酸酶有關(guān)。還沒有確定遷移緩慢形式的本質(zhì)，但它很可能是因為翻譯通過了位于硫氰酸酶編碼序列末端的UGA終止密碼子，從而導(dǎo)致在另一同相UAG密碼子位置終止前13個附加密碼子的翻譯。但是，令人驚奇的是這種較長前體形式在多肽的活化和釋放中可以明顯地充分轉(zhuǎn)化為可溶性形式。
來自加入反應(yīng)混合物的CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNAf中的放射性標(biāo)記的甲硫氨酰只可以出現(xiàn)在硫氰酸酶的N末端而不可以在內(nèi)部。CPM與用巰基乙酸?；募琢虬彼釒€基之間的硫酯鍵在培養(yǎng)條件下具有化學(xué)和酶學(xué)穩(wěn)定性。CPM-SAcMet-tRNA不會被甲硫氨酰-tRNA合成酶脫酰基化，而tRNAmMet不會在酶作用下被CPM-SAc-〔35S〕甲硫氨酸氨酰化。而且，在反應(yīng)混合物中包含了大量過量的非標(biāo)記的甲硫氨酸(350μM)。這大大降低了可能存在并使甲硫氨酸摻入多肽內(nèi)部位置的游離〔35S〕甲硫氨酸的比放射活性。所以，香豆素的摩爾數(shù)被認(rèn)為正比于〔35S〕甲硫氨酸的放射性，并用放射性標(biāo)定熒光強(qiáng)度和光譜數(shù)據(jù)，從而使以下給出的這些參數(shù)的數(shù)據(jù)正比于熒光量子產(chǎn)率并可在不同實驗間比較。
實施例6新合成的CPM標(biāo)記的硫氰酸酶的分布新合成的CPM標(biāo)記的硫氰酸酶在合成后立即通過一層蔗糖溶液離心沉淀出核糖體，然后分析其分別在可溶性和核糖體組份中的分布。表I顯示〔14C〕亮氨酸摻入了N末端未被香豆素修飾的硫氰酸酶多肽的內(nèi)部。這種情況中，非放射性fMet-tRNAf被用于引發(fā)蛋白質(zhì)的合成。這些新合成多肽中的約半數(shù)(根據(jù)〔35S〕甲硫氨酸測定為62％及根據(jù)〔14C〕亮氨酸測定為43％)被發(fā)現(xiàn)存在于核糖體組份中。其余新合成蛋白質(zhì)中的大多數(shù)在上清液中被回收。通過分析抽干的聚丙烯酰胺凝膠中的多肽放射自顯影術(shù)判斷，上清液中蛋白質(zhì)產(chǎn)物是全長硫氰酸酶(圖1)。
由硫氰酸酶多肽中〔35S〕甲硫氨酸和〔14C〕亮氨酸的摻入情況來測定無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中合成的硫氰酸酶的摩爾數(shù)。在所述條件下，只從質(zhì)粒(pSP65)轉(zhuǎn)錄一段編碼序列，即硫氰酸酶的mRNA。無質(zhì)粒的反應(yīng)混合物中〔14C〕亮氨酸在肽中的摻入量低于質(zhì)粒存在下?lián)饺肓康?％，并將其作為空白減去。全長硫氰酸酶每條鏈含24個亮氨酸殘基，分子量為33,000。所以，利用已知的全長產(chǎn)物的百分率(對上清液組份來說近乎100％)，就可以由N末端的甲硫氨酸或內(nèi)部的亮氨酸計算出合成的全長蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)。該值被用于計算硫氰酸酶的酶比活性即單位/mg硫氰酸酶。硫氰酸酶活性的單位數(shù)定為形成一摩爾硫氰酸/每分鐘。
實施例7硫氰酸酶活性根據(jù)摻入的〔14C〕亮氨酸測得的上清液中硫氰酸酶的酶比活性為774單位/mg硫氰酸酶。這一活性與報道的天然牛硫氰酸酶的比活性和用分離自牛肝的天然硫氰酸酶測定的值相似。所以，從核糖體上釋放入上清液的翻譯產(chǎn)物幾乎全部折疊成天然構(gòu)象。相反，核糖體上的新生多肽沒有酶活性。由香豆素〔35S〕甲硫氨酸形成新合成的硫氰酸酶N末端時存在類似情況上清液中的硫氰酸酶有活性而核糖體上的多肽沒有酶活性。
在使用N末端探針的蛋白質(zhì)合成過程中由核糖體上釋放的〔35S〕甲硫氨酸標(biāo)記的硫氰酸酶較少，但它的表觀酶比活性(833單位/mg硫氰酸酶)比天然酶高約17％。這可能是因為有些N末端〔35S〕甲硫氨酸被從新形成的酶上去除。
實施例8新合成的硫氰酸酶的穩(wěn)定性直接在上清液和核糖體組份中測定新合成硫氰酸酶N末端的CPM-〔35S〕甲硫氨酸的穩(wěn)定性。在37℃培養(yǎng)60分鐘可觀察到損失了約10％三氯乙酸可沉淀的放射性，而上清液中的酶活性沒有損失(沒有給出數(shù)據(jù))。
天然硫氰酸酶在N末端沒有甲硫氨酸。從多種蛋白質(zhì)的N末端去除甲硫氨酸的特異性酶是已知的。如果是體外合成的硫氰酸酶，利用放射性不會測得在N末端沒有香豆素-〔35S〕甲硫氨酸的多肽，結(jié)果低估了這些樣品中存在的硫氰酸酶蛋白的量。由N末端甲硫氨酸計算而得的上清液中較高的酶比活性(833單位/mg比根據(jù)內(nèi)部的亮氨酸測得的744單位/mg，表I)反映了對這些樣品中存在的硫氰酸酶蛋白的低估。而且，少量的硫氰酸酶分子可能是由在制備S30組份時未除盡的非標(biāo)記的內(nèi)源甲酰甲硫氨酸(fmet-tRNA)引發(fā)的。必須指出，合成和離心后，立即用核糖核酸酶處理上清液，然后在Sephadex G100柱上色譜分析以將CPM標(biāo)記的硫氰酸酶與低分子量熒光化合物分離。無論如何，表I顯示香豆素可以摻入在硫氰酸酶的N末端，而且這些分子從核糖體上釋放時是有酶活性的。
表I有酶活性的帶N末端CPM-SAcMet的硫氰酸酶的合成總反應(yīng)混合物 核糖體組份 上清液N末端CPM-〔35S〕-Met摻入量(pmol) 3.4 2.1 1.2酶活性(單位×10-3) 32.1 0.0 33比活性(單位/mg) -10.08333內(nèi)部〔14C〕亮氨酸摻入量(pmol) 65(2.7)230 0酶活性(單位×10-3) 28(1.2)20.00.0比活性(單位/mg) 30.3(1.3)231.0 744以CPM-SAc-〔35S〕Met-tRNA或fMet-tRNAf為起始tRNA，以〔14C〕亮氨酸為放射性標(biāo)記，利用偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯合成硫氰酸酶。在37℃培養(yǎng)30分鐘后，離心反應(yīng)混合物制取核糖體組份和上清液，分別測定其中合成的蛋白質(zhì)量和酶活性。給出的是30μl反應(yīng)混合物量。天然硫氰酸酶的酶比活性約750單位/mg蛋白質(zhì)。1是因為核糖體上的不完全和全長無活性硫氰酸酶多肽而沒有計算。2是計算括號中酶(24亮氨酸殘基/硫氰酸酶多肽)的pmol。為3該表觀酶比活性始終被發(fā)現(xiàn)大于天然硫氰酸酶的比活性。
實施例9CPM標(biāo)記的硫氰酸酶的熒光特性表II概括了上清液中游離的和與核糖體結(jié)合的CPM-SAcMet-硫氰酸酶的熒光參數(shù)。圖3A和3B中給出了相應(yīng)的發(fā)射光譜。為了比較，表II中包括了游離在溶液中或與核糖體結(jié)合的CPM-SAc-Met-tRNAf的數(shù)據(jù)。每份樣品中N末端標(biāo)記的CPM-SAcfMet-tRNAf或硫氰酸酶的摩爾數(shù)(根據(jù)〔35S〕甲硫氨酸測得)相似；然后用放射性將熒光數(shù)據(jù)標(biāo)定為共同的香豆素摩爾數(shù)。相對于相對量子產(chǎn)率設(shè)定為1.00的上清液中酶活性CPM-SAcMet-硫氰酸酶的量子產(chǎn)率給出熒光量子產(chǎn)率Q(表II)。這樣，不同的圖和表中的光譜和相對量子產(chǎn)率數(shù)據(jù)在此可直接比較。
上清液中酶活性CPM-硫氰酸酶的量子產(chǎn)率略高于與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶(相對量子產(chǎn)率1.00比0.89)，但兩者都大大高于游離在溶液中(Q＝0.43)或與核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心結(jié)合(Q＝0.63)的CPM-SAcMet-tRNAf的熒光強(qiáng)度。后者是形成N末端帶CPM-SAc甲硫氨酸的新生硫氰酸酶的肽合成引發(fā)前的狀態(tài)。量子產(chǎn)率反映了香豆素探針的局部環(huán)境。對游離的香豆素或CPM-半胱氨酸而言，隨溶劑極性的降低，在發(fā)射光譜中量子產(chǎn)率增加并發(fā)生紅移。為了比較，在水中游離CPM-半胱氨酸的絕對量子產(chǎn)率和最大發(fā)射波長分別為0.31和486nm，但在乙醇中分別為0.91和470nm，在二噁烷中分別為0.51和460nm。所以，表II中的光譜數(shù)據(jù)似乎顯示，與核糖體結(jié)合的CPM-SAcMet-tRNAf的香豆素探針當(dāng)它位于新生肽N末端時遇到的是更具疏水性的環(huán)境，但仍以肽基-tRNA的形式結(jié)合在核糖體上。當(dāng)新生的硫氰酸酶以酶活性形式釋放入上清液時，量子產(chǎn)率進(jìn)一步增加。這些差異反映了如下文所考慮的新生硫氰酸酶最終折疊成天然構(gòu)象過程中的不同階段。溶液中游離的CPM-Met-tRNAf的熒光各向異性約0.17，與核糖體結(jié)合時約0.36(表II)。與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的N末端CPM-Met的各向異性為0.31，但當(dāng)酶從核糖體上以酶活性形式釋放入上清液時下降至0.18。該差異似乎反映了由核糖體造成的熒光基團(tuán)活動的限制，這是因為探針本身活動的位阻效應(yīng)和/或游離硫氰酸酶溶液和與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的旋轉(zhuǎn)松弛或旋轉(zhuǎn)時間的差異。后一個參數(shù)反映硫氰酸酶和核糖體的質(zhì)量差異。
表IICPM-SAcMet-硫氰酸酶和游離在溶液中及與核糖體結(jié)合的CPM-SAcMet-tRNA的熒光特性被測組份 EMax1(nm) Rel.Q2A3A.CPM-硫氰酸酶上清液 4731.000.18與核糖體結(jié)合4710.890.31B.CPM-SAcMet-tRNAf上清液 4870.430.17與核糖體結(jié)合4800.630.36
用與測定表I中硫氰酸酶合成和酶活性樣品相同或類似的樣品測定硫氰酸酶的熒光特性。為了比較，將CPM-SAcMet-tRNA的熒光數(shù)據(jù)(上述的B)包括在內(nèi)。1EMax最大發(fā)射波長。2Rel.Q相對熒光量子產(chǎn)率；由積分熒光發(fā)射光譜測得，根據(jù)〔35S〕甲硫氨酸的放射性標(biāo)定，表示為與上清液中酶活性CPM-SAcMet-硫氰酸酶(參見表I)的相對值。3A熒光各向異性。
實施例10伴隨蛋白對與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的作用在伴隨蛋白存在下，由核糖體上釋放的酶是具有酶活性的，其比活性與天然硫氰酸酶相似，并且含有較高比例的具有天然構(gòu)象的酶分子。相反，與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶是沒有酶活性的。
本發(fā)明說明了伴隨蛋白(DnaJ、DnaK、GrpE、GroEL、GroES)對來自與核糖體結(jié)合的、沒有酶活性的新生CPM-硫氰酸酶的作用，并將觀察到的作用與酶的釋放和酶比活性相關(guān)聯(lián)。后一種情況被作為硫氰酸酶正確折疊成其天然構(gòu)象的尺度。單獨(dú)加入5種伴隨蛋白中的每一種，然后在非翻譯條件下同時一起加入含帶全長硫氰酸酶的核糖體的反應(yīng)混合物中。
表IIIA顯示，伴隨蛋白DnaK和GroES均引起硫氰酸酶多肽的明顯釋放，這一點(diǎn)反映在熒光各向異性的降低。相反，DnaJ產(chǎn)生小的但明顯的各向異性的增加。伴隨蛋白GrpE和GroEL對熒光的作用很小。當(dāng)核糖體與所有伴隨蛋白一起培養(yǎng)時，可以觀察到對由核糖體上釋放的蛋白質(zhì)量和熒光的較大作用。該反應(yīng)混合物然后被離心分離成核糖體和上清液組份。
表IIIB中給出上清液中硫氰酸酶多肽中〔35S〕甲硫氨酸的pmol數(shù)。與所有伴隨蛋白一起培養(yǎng)后上清液中的硫氰酸酶的酶比活性達(dá)到天然硫氰酸酶的水平，與天然酶的745單位/mg相比為695單位/mg。被釋放物質(zhì)的量子產(chǎn)率、各向異性和最大發(fā)射波長也與具有酶活性的硫氰酸酶的很相似(參見表II)。相反，只有DnaK或GroES存在下，從核糖體上釋放的硫氰酸酶基本沒有酶活性，即使其90％以上由全長硫氰酸酶多肽組成(沒有給出數(shù)據(jù))。而且，它的量子產(chǎn)率和最大發(fā)射波長與具有酶活性的硫氰酸酶的不同，這表明該物質(zhì)沒有折疊成天然構(gòu)象。所以，本發(fā)明證明伴隨蛋白只有在一同作用于與核糖體結(jié)合的新生硫氰酸酶時，才有效地促進(jìn)向天然構(gòu)象折疊。DnaK和GroES引起新生鏈從核糖體上的部分釋放，但必須有其它伴隨蛋白才完成在核糖體上的折疊過程。
表III由伴隨蛋白介導(dǎo)的來自與核糖體結(jié)合的CPM-SAcMet-硫氰酸酶的熒光的改變A.帶CPM-SAc-〔35S〕Met-標(biāo)記的硫氰酸酶的核糖體添加物 EMax1(nm) Rel.Q1A1無 4710.89 0.31DnaJ 4710.92 0.32DnaK 4730.97 0.26GrpE 4710.89 0.29GroEL 4720.90 0.30GroES 4740.94 0.25全部 4751.03 0.21B.來自上述A的上清液添加物EMax1Rel.Q1A1被釋放的酶比活性(nm) 硫氰酸酶(單位/(pmol) mg)無 * * * 0.22DnaJ * * * 0.15DnaK 4851.17 0.19 1.952GrpE * * * 0.22GroEL * * * 0.30GroES 4801.12 0.19 1.503全部 4731.00 0.18 2.61695
含有4.5pmol新生硫氰酸酶中的CPM-SAc〔35S〕甲硫氨酸的核糖體在非翻譯條件下與指定的伴隨蛋白在37℃培養(yǎng)10分鐘。直接測定(A部分)或在離心之后對上清液測定(B部分)反應(yīng)混合物的熒光特性。只測定上清液的酶活性。1縮寫的注釋見表II。*物質(zhì)量不足以進(jìn)行熒光特性的可靠測定。
SDS-PAGE后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色來評定商購的伴隨蛋白質(zhì)量。伴隨蛋白產(chǎn)生期望的大小或電泳遷移率的單條帶，但GroES含有較高分子量的污染，而DnaJ看上去是雙條帶的。檢查全部使用的伴隨蛋白中由釋放因子1或釋放因子2引起的污染。用相應(yīng)的抗體檢測SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的Western印跡。用此法在各種伴隨蛋白制劑中都沒有測得釋放因子中的任一種(沒有給出數(shù)據(jù))。
表III顯示單獨(dú)的伴隨蛋白都不能將無活性的與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶轉(zhuǎn)化成其天然構(gòu)象。然后，對順次加入一種或兩種伴隨蛋白進(jìn)行檢查。表IV中顯示的本發(fā)明未預(yù)計到的一方面內(nèi)容是，添加順序似乎很重要。只有最先加DnaJ，然后加DnaK和GrpE，最后加GroEL和GroES(表IV的A部分)才能獲得具有酶活性的硫氰酸酶。釋放和活化與各向異性的減退和相對量子產(chǎn)率的增加相關(guān)聯(lián)。相反，以GroEL/Es為最先加入的伴隨蛋白，然后將與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶多肽與其余伴隨蛋白一起培養(yǎng)時，各向異性保持較高而且量子產(chǎn)率改變很小(表IV的B部分)。此時的酶活性接近檢測的下限值。表IV中，在總反應(yīng)混合物中測定熒光參數(shù)，但在離心后的上清液中測定酶活性。GroEL/Es可能影響仍與核糖體結(jié)合的或在其加入前已經(jīng)釋放的硫氰酸酶的熒光。
表IV伴隨蛋白順序加入的作用順序添加物EMax1Rel.Q1A1酶比活性(nm)(單位/mg硫氰酸酶)A.無(↓＋) 4710.890.310DnaJ(↓然后＋) 4710.920.330DnaK＋GrpE(↓然后＋)4741.010.262GroEL＋GroEs4801.200.20217B.無(↓+) 4710.890.310GroEL＋GroEs(↓然后＋) 4730.910.293GrpE(↓然后＋) 4730.910.293DnaK＋DnaJ 4740.930.279含有4.5pmol新生硫氰酸酶中的CPM-SAc〔35S〕甲硫氨酸的核糖體與接A或B順序加入的指定伴隨蛋白在37℃培養(yǎng)10分鐘。如前文所述測定熒光參數(shù)，然后離心樣品并測定得到的上清液中被釋放的硫氰酸酶的量及其酶活性，由此計算出酶比活性。1縮寫的注釋見表II。2在上清液中測得。在給定條件下培養(yǎng)并測定熒光后，如前所述從上清液中分離出核糖體。
實施例11無酶活性的硫氰酸酶轉(zhuǎn)化的要求本發(fā)明還顯示了沒有酶活性的硫氰酸酶向酶活性構(gòu)象轉(zhuǎn)化的伴隨蛋白和培養(yǎng)要求。重復(fù)表IV的A部分中直至加入DnaK/GrpE(在加入GroEL＋GroEs之前)，然后離心樣品，迅速將釋放的蛋白質(zhì)與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶肽分離。含有被釋放的全長硫氰酸酶肽的上清液被吸回?zé)晒獗壬校瑴y定熒光參數(shù)(表V，A部分，第1行)，然后加入GroES/EL(第2行)。培養(yǎng)10分鐘后，測定光譜并如前所述計算各向異性。與之類似，含有與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的核糖體組份在被重懸于溶液B后進(jìn)行分析，并在無GroES/EL或有GroES/EL存在下再培養(yǎng)。然后測定樣品的光譜特性(表VB的前2欄)。最后，再次離心樣品制得上清液和核糖體組份。測定上清液中被釋放的硫氰酸酶的比活性(表VB的末2欄)。表V顯示在與DnaJ、DnaK和GrpE共培養(yǎng)但不加GroES/EL后，約1.8pmol CPM-硫氰酸酶(為原樣品中與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶的約30％)被釋放入上清液。該物質(zhì)的各向異性較低(正如預(yù)計的)并且沒有酶活性。向含有被釋放的CPM-硫氰酸酶的該組份中加入GroES/EL，對各向異性沒有作用而對酶活性的作用極小。與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶在加入GroES/EL前具有很高的各向異性，因為在先前的培養(yǎng)中被DnaK釋放的CPM-硫氰酸酶已從樣品中被離心去除。加入GroES/EL后，各向異性急驟下降(表VB)，并且測到了酶活性。這種被釋放的蛋白質(zhì)的酶比活性與天然酶相同。
表V顯示GroES/EL對已釋放的多肽作用極小或沒有作用，但似乎能在核糖體先與DnaK、DnaJ和GrpE分別培養(yǎng)后引起與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的活化與釋放。為了比較，表VC中包括的由嘌呤霉素而從核糖體上釋放的硫氰酸酶多肽的結(jié)果數(shù)據(jù)。在核糖體與嘌呤霉素培養(yǎng)后，各種伴隨蛋白都對來自CPM-硫氰酸酶的酶活性和熒光沒有可測得的作用。與之類似，單獨(dú)或合用的伴隨蛋白都對在原轉(zhuǎn)錄/翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)中從核糖體上釋放的具有酶活性的CPM-硫氰酸酶的酶活和熒光沒有作用(沒有給出數(shù)據(jù))。
表VGroEL/ES對已釋放的和與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的作用Rel.O1A1量(pmol)酶比活性(單位/mg)A.被釋放的硫氰酸酶(上清液)無 1.16 0.187 1.8 0GroEL/ES 1.17 0.187 1.8 6.7B.核糖體組份無 0.83 0.373 0.1 0GroEL/ES 0.98 0.221 1.4 728C.由嘌呤霉素釋放的硫氰酸酶(上清液)無 1.21 0.199 2.2 0所有伴隨蛋白 1.20 0.198 2.1 0
為獲取表V的數(shù)據(jù)，與核糖體結(jié)合的CPM-Met-硫氰酸酶(約4.5pmol)在溶液B中與DnaK、DnaJ和GrpE一起培養(yǎng)。接著，離心樣品，將核糖體組份重懸于同體積的溶液B中后，對上清液和核糖體組份進(jìn)行分析。取用小份樣品測定硫氰酸酶的光譜、含量和活性。然后在各樣品中加入GroEL和GroES，并再次進(jìn)行測試。對于核糖體組份，在加入GroEL/ES后，再次在airfuge(離心機(jī))中離心樣品后測定硫氰酸酶的量和酶比活性。
為獲取表V中C部分的數(shù)據(jù)，與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶與2mM嘌呤霉素在37℃培養(yǎng)10分鐘，然后離心培養(yǎng)化合物。只對上清液在加或不加伴隨蛋白培養(yǎng)后進(jìn)行分析。1縮寫的定義見表II。
實施例12稀疏霉素阻斷與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶的釋放抗菌素稀疏霉素與50S核糖體結(jié)合，Kd值約0.1M，抑制了肽基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)。在微摩爾濃度時，稀疏霉素對來自帶有CPM-硫氰酸酶的核糖體的香豆素?zé)晒鉀]有作用。首先，如表III所述先后單獨(dú)加入稀疏霉素和伴隨蛋白。表VI顯示，各伴隨蛋白都對被測熒光參數(shù)沒有任何作用。在稀疏霉素之后將伴隨蛋白組合(沒有說明)或單獨(dú)加入時，在各向異性方面與表IIIA中的數(shù)據(jù)相比只有很小的改變，這表明大多數(shù)CPM-硫氰酸酶仍與核糖體結(jié)合著。熒光測定后的離心證實了這一點(diǎn)。在稀疏霉素存在下，少于10％的硫氰酸酶分子被釋放入上清液，而且這種被釋放的物質(zhì)是沒有酶活性的(沒有給出數(shù)據(jù))。所以，稀疏霉素抑制DnaK或GroES引起的硫氰酸酶從核糖體上的釋放。由于稀疏霉素干擾肽基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，本發(fā)明證明CPM-硫氰酸酶以肽基-tRNA的形式結(jié)合在核糖體上，而由DnaK和/或GroES引起的釋放與反應(yīng)中的肽基轉(zhuǎn)移酶中心有關(guān)，tRNA與多肽之間的鍵在該反應(yīng)中被水解。
表VI稀疏霉素抑制伴隨蛋白介導(dǎo)的來自與核糖體結(jié)合的CPM-SAcMet-硫氰酸酶的熒關(guān)的改變添加物 Max1Q1A1無 471 0.89 0.31先加稀疏霉素 471 0.90 0.30接著DnaJ 471 0.90 0.31或DnaK 471 0.92 0.30或GropE 471 0.90 0.30或GroEL 471 0.90 0.30或GroES 473 0.91 0.29DnaJ＋DnaK 471 0.92 0.32全部一起加471 0.90 0.29實驗條件與表III中的相同，但在單獨(dú)加入各種伴隨蛋白前加入4μM稀疏霉素。各種伴隨蛋白都只引起百分之幾的CPM-硫氰酸酶釋放入上清液。
實施例13N末端香豆素對硝基甲烷的可及度硝基甲烷對來自CPM-硫氰酸酶的熒光猝滅被評估作為測定探針在不同環(huán)境中的可及度。硝基甲烷是水溶性、不解離的小分子，它可以在溶液中通過與探針的碰撞有效地猝滅香豆素的熒光。圖2顯示了Stern-Volmer點(diǎn)。游離在溶液中和與核糖體結(jié)合的CPM-Met-tRNAf分別表現(xiàn)出最高和最低的猝滅性。游離在溶液中時，熒光團(tuán)的可及度較高，但當(dāng)CPM-Met-tRNAf與核糖體結(jié)合時它被極大地遮蔽了。位于酶活性硫氰酸酶N末端的CPM的可及度也較高。這與酶活性硫氰酸酶的各向異性數(shù)據(jù)(表II)和硫氰酸酶的晶體結(jié)構(gòu)一致，N末端在這種結(jié)構(gòu)中暴露在外。有趣的是，用DnaK或嘌呤霉素從核糖體上釋放的硫氰酸酶的猝滅性明顯較低。如表III和V所示，這種物質(zhì)是沒有酶活性的。使用兩者而獲得的數(shù)值相似，但低于對游離的、酶活性硫氰酸酶觀察到的值。因此，本發(fā)明證明這種被釋放的硫氰酸酶N末端的暴露程度不及天然硫氰酸酶，而且這部分沒有折疊成它的天然構(gòu)象。與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的更低的猝滅性可能部分由于核糖體(尤其是新生短多肽的)的遮蔽以及全長多肽的不完全折疊。
實施例14由抗香豆素IgG測得的中間狀態(tài)具有對CPM-熒光團(tuán)高結(jié)合特異性的多克隆抗體被用于評價與核糖體結(jié)合的全長硫氰酸酶鏈的折疊，并與游離在溶液中的具有酶活性的硫氰酸酶進(jìn)行比較。圖3A和3B表明，與核糖體結(jié)合的和游離的CPM-硫氰酸酶上的探針都能被抗香豆素抗體接近。對于后一種情況，具有酶活性的硫氰酸酶通過與全部伴隨蛋白共培養(yǎng)從核糖體上釋放，然后如表II的有關(guān)描述將核糖體從反應(yīng)混合物中離心去除。在來自游離的和與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶的熒光中，抗體均引起各向異性和與紅移相關(guān)聯(lián)的量子產(chǎn)率的增加。在抗香豆素IgG存在下，兩種情況中的最大發(fā)射波長都約為456nm。量子產(chǎn)率和最大發(fā)射波長的改變明確反映了與免疫球蛋白結(jié)合引起的探針環(huán)境疏水性的增加。由抗體引起的與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的量子產(chǎn)率的增加(圖3A)低于游離在溶液中的具有酶活性的CPM-硫氰酸酶(圖3B)。這種量子產(chǎn)率上的差異可能是因為核糖體部分遮蔽了較短的新生肽與抗體的接近。先前已經(jīng)從新生的寡聚丙氨酸和新生的MS2外殼蛋白觀察到這種現(xiàn)象。與先前CPM-SAcAla-tRNA的結(jié)果一樣，結(jié)合在核糖體P位置的CPM-SAcMet-tRNAf似乎被完全遮蔽而不能被IgG靠近，因為在與抗CPM IgG共培養(yǎng)后，三個參數(shù)都沒有發(fā)生任何改變(沒有給出數(shù)據(jù))。
為了證明伴隨蛋白對與核糖體結(jié)合的新生CPM-硫氰酸酶的作用，在含有與用于圖3A的相似的核糖體反應(yīng)混合物中先加入稀疏霉素，再將DnaJ或DnaK單獨(dú)或一起加入。在稀疏霉素存在下，很少的硫氰酸酶從核糖體上釋放，正如表VI所描述的。培養(yǎng)后，加入抗香豆素IgG。圖4顯示了所得的反應(yīng)混合物的發(fā)射光譜。同時給出只與稀疏霉素(不加伴隨蛋白或抗香豆素IgG)一起培養(yǎng)的樣品的發(fā)射光譜以供比較。分別或一起使用GroEL和GroES都不能引起在IgG存在下就單獨(dú)的DnaJ或與DnaK一起觀測到的任何光譜改變。
含有DnaK或DnaJ或這兩種的樣品的光譜可以直接與圖3A的光譜比較，圖3A的光譜取自不加伴隨蛋白，但加有IgG或不加IgG的含與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的樣品。在加入IgG后與DnaK共培養(yǎng)對所得的發(fā)射光譜幾乎沒有作用，但與DnaJ共培養(yǎng)的樣品明顯地有一條獨(dú)特的雙峰曲線。這一結(jié)果對同時含有DnaJ和DnaK的樣品更明顯。在這種情況中，明顯的最大強(qiáng)度出現(xiàn)在光譜中435nm和472nm處。后者與不加IgG時游離的或與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的最大值十分接近(如圖3A和3B中所示)。
雙峰發(fā)射光譜表明，在IgG存在下，在與DnaJ或DnaJ和DnaK共培養(yǎng)的樣品中存在著兩種熒光物質(zhì)。一種可能性是抗香豆素抗體能夠只與部分CPM-硫氰酸酶相互作用，因為DnaJ結(jié)合在有些新生硫氰酸酶肽的N末端。Hartl及其同事提供的數(shù)據(jù)表明DnaJ能夠與與核糖體結(jié)合的新生硫氰酸酶肽化學(xué)交聯(lián)。但是，有幾條證據(jù)表明DnaJ不與與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的N末端結(jié)合—至少不明顯(即無法測得)作用于N末端香豆素。首先，如表III所示，單獨(dú)的DnaJ對量子產(chǎn)率、各向異性或最大發(fā)射波長沒有明顯作用。其次，DnaJ似乎并不遮蔽N末端的香豆素。新生的CPM-硫氰酸酶的某些部分對IgG的遮蔽會導(dǎo)致與不加DnaJ的樣品相比量子產(chǎn)率和各向異性的降低。但并沒有發(fā)現(xiàn)這種降低(比較圖4的插入表和圖3的插入表)。IgG能結(jié)合兩種熒光物質(zhì)的香豆素(最大發(fā)射波長約440nm和470nm，圖4)，這可以由IgG在發(fā)射光譜的這兩個區(qū)域引起類似的熒光強(qiáng)度改變來證明。所以，圖4表明DnaJ引起新生肽或核糖體的狀態(tài)改變，這種改變某種程度地影響了新生肽與IgG結(jié)合時探針的環(huán)境。DnaK似乎有助于由DnaJ引起的這種改變。
實施例15在本發(fā)明的另一應(yīng)用中，由含有位于T7啟動子下游編碼序列的質(zhì)粒在E.coli S30提取物中利用偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯合成了酵母的TATA盒結(jié)合蛋白。其中，培養(yǎng)中加有T7 RNA聚合酶。起始tRNA是CPM-SAc〔35S〕Met-tRNAf。
在10μl反應(yīng)混合物中，約合成了125ng N(香豆素)酵母TATA盒結(jié)合蛋白。將反應(yīng)混合物放大62倍。培養(yǎng)后，將600μl含約7.5ng標(biāo)記過的蛋白質(zhì)的反應(yīng)混合物上樣在0.5ml含DEAE纖維素的柱上，該柱平衡在20mM Tris-HCl，pH7.9、100mM KCl、0.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)，5mMβ-巰基乙醇和20％甘油(緩沖液A)中。約0.75μg酵母TATA盒結(jié)合蛋白不吸附在基質(zhì)上，利用加有200mM KCl的相同緩沖液洗脫回收到約1.5μg N(香豆素)酵母TATA盒結(jié)合蛋白。利用350mM KCl洗脫柱另外回收到3.0μg香豆素標(biāo)記的蛋白。該物質(zhì)被上樣在平衡于緩沖液A中的肝素—瓊脂糖凝膠柱上(1ml床層體積)。約半數(shù)被吸附的放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)通過將緩沖液A中的鹽濃度提高至0.7M KCl而被洗脫。洗脫的蛋白質(zhì)被用于熒光研究酵母TATA盒結(jié)合蛋白與特異性DNA序列的結(jié)合。將一段突變DNA序列作為對照。香豆素?zé)晒獾牧孔赢a(chǎn)率和熒光各向異性的改變表明，如本文所述純化的體外合成的蛋白質(zhì)特異性地與含有TATA盒的DNA序列相互作用。
就在此揭示的無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)而言，蛋白質(zhì)的合成以較高的線速度進(jìn)行約20分鐘，然后迅速降低。在線速合成階段具有酶活性的硫氰酸酶被合成并從核糖體上釋放，但系統(tǒng)失效與外觀為全長的硫氰酸酶多肽以肽基-tRNA的形式在核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心內(nèi)的積累相關(guān)聯(lián)。與嘌呤霉素的反應(yīng)性和稀疏霉素阻斷蛋白質(zhì)終止和釋放的效果表明，這些積累的新生多肽以肽基-tRNA的形式位于核糖體的P位置。本文中，“終止”僅指與水解新生多肽與tRNA之間的酯鍵直接相關(guān)的那些反應(yīng)；“釋放”指蛋白質(zhì)與核糖體分離。積累起來的與核糖體結(jié)合的新生硫氰酸酶是沒有酶活性的，但只需將核糖體與伴隨蛋白DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL和GroES同時培養(yǎng)就可以將它們釋放并轉(zhuǎn)化為具有完整活性的酶。在所用的條件下沒有可測得的氨基酸向新生蛋白質(zhì)中的摻入。將核糖體先與DnaJ、DnaK和GrpE共培養(yǎng)，再與GroEL和GroES培養(yǎng)，這樣可產(chǎn)生酶活性降低的硫氰酸酶。這似乎確立了這些反應(yīng)的順序，并得到使用DnaJ的結(jié)果的支持。
通過與嘌呤霉素反應(yīng)或只與DnaK或GroES共培養(yǎng)而從核糖體上釋放的蛋白質(zhì)沒有酶活性。這些被釋放的硫氰酸酶不被與任何伴隨蛋白組合物的共培養(yǎng)而活化。這有些奇怪，因為GroEL和GroES能有效促進(jìn)被脲或鹽酸胍變性的硫氰酸酶折疊成具有酶活性的蛋白質(zhì)。GroEL和GroES是否在核糖體上介導(dǎo)折疊或在剛釋放的蛋白質(zhì)經(jīng)歷可阻斷GroEL和GroES作用的次級反應(yīng)前與之作用還有待確定。
來自新生硫氰酸酶N末端的香豆素的熒光改變反映了在活化、終止和酶從核糖體上釋放過程中發(fā)生的伴隨蛋白依賴性反應(yīng)。來自香豆素的熒光對熒光團(tuán)的局部環(huán)境十分敏感，探針在核糖體中位置的改變、與之連接的新生肽的折疊、或靠近探針的伴隨蛋白的結(jié)合都易于反映在熒光的量子產(chǎn)率、最大發(fā)射波長和各向異性的改變中。從核糖體上釋放的具有完整酶活性的CPM-硫氰酸酶和與核糖體結(jié)合的CPM-硫氰酸酶的這些參數(shù)的差異是明顯的，而且反映了在蛋白質(zhì)構(gòu)象上的差異。例如，比較具有酶活性的可溶性CPM-硫氰酸酶(表II)和與DnaK或GroES共培養(yǎng)后從核糖體上釋放的沒有酶活性的可溶性硫氰酸酶(表III)的相對量子產(chǎn)率。不清楚為什么這兩種與ATP明顯無關(guān)的蛋白質(zhì)促進(jìn)了硫氰酸酶的釋放。它們在這方面的活性使人想到釋放因子3(RF-3)的活性，它具有GTP酶活性。
硫氰酸酶具有不同的構(gòu)象得到了圖2的支持，其中顯示了不同狀態(tài)下的蛋白質(zhì)的硝基甲烷熒光猝滅的差異。這些差異可能反映了不同構(gòu)象的蛋白質(zhì)本身對探針遮蔽的差異。但是，一個顯著的特征在于，無論是單個伴隨蛋白或?qū)⑺鼈兘M合都不引起與抗香豆素IgG觀察到的相比的熒光明顯改變(圖3A和3B)。這可能表明伴隨蛋白都不直接與CPM-硫氰酸酶的N末端相互作用。圖4顯示DnaJ促進(jìn)某種會影響與核糖體結(jié)合的硫氰酸酶的反應(yīng)，這可以由與抗香豆素IgG反應(yīng)的結(jié)果得到證明。與DnaJ反應(yīng)后，N末端的香豆素以可以被抗香豆素抗體區(qū)別的兩種狀態(tài)存在。最大發(fā)射波長靠近440nm的組份由單獨(dú)的DnaJ產(chǎn)生，但在DnaK存在下被加強(qiáng)，這表明后者有助于被DnaJ促進(jìn)的反應(yīng)?？赡?，這些結(jié)果反應(yīng)新生鏈具有不同的長度，如一種或一類與DnaJ或DnaK或兩者反應(yīng)，其它(假設(shè)較短形式)則可能不與這些伴隨蛋白反應(yīng)。這兩種(假設(shè)的)不同長度的鏈可能產(chǎn)生了不同的出現(xiàn)于新生肽延伸中的折疊中間體。圖4中較突出的作用只有在稀疏霉素存在下觀察到。所以，最大發(fā)射波長在440nm和470nm的熒光物質(zhì)反映了由DnaJ和DnaK產(chǎn)生的受稀疏霉素作用的不同中間狀態(tài)。然后它們必須按終止反應(yīng)順序進(jìn)行肽基-tRNA的密碼指導(dǎo)的水解作用。所用的伴隨蛋白是高度純化的，而且?guī)缀醪缓尫乓蜃?。在E.coli細(xì)胞中大量的釋放因子1和2與核糖體偶合。
不清楚伴隨蛋白介導(dǎo)的反應(yīng)如何或為什么影響因子介導(dǎo)的肽基-tRNA鍵的水解作用，終止反應(yīng)和新生蛋白質(zhì)從核糖體上的釋放。前面的反應(yīng)受稀疏霉素的阻斷，并被認(rèn)為可能與肽基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)有關(guān)。人們已經(jīng)注意到利用在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上形成的蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生相似的結(jié)果。信號識別顆粒與核糖體的偶合抑制了新生肽的延伸，直至信號識別顆?！阈律鞍踪|(zhì)°核糖體復(fù)合物與受體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的?？康鞍踪|(zhì)相互作用。
有一個問題，即終止、折疊和釋放反應(yīng)發(fā)生在核糖體內(nèi)的什么位置。在多肽合成過程中，氨酰-tRNA和以肽基-tRNA形式的短肽牢固結(jié)合在疏水性位置即肽基轉(zhuǎn)移酶中心，它位于核糖體大亞基中部隆起的基部。tRNA結(jié)合在兩個核糖體亞基間界面上的特定位置，新生肽以肽基-tRNA的形式位于肽基轉(zhuǎn)移酶中心。但是，電子顯微攝影顯示，出口區(qū)即新生蛋白質(zhì)從核糖體上出現(xiàn)的區(qū)域位于大亞基的遠(yuǎn)端表面，距肽基轉(zhuǎn)移酶中心遠(yuǎn)至90埃或90埃以上。以丙氨酸殘基表示的新生聚丙氨酸肽長度被用于估計肽基轉(zhuǎn)移酶中心至肽的N末端探針可被IgG或其Fab片段接觸的位置的距離，對前者而言約60殘基或90埃(1.5埃/螺旋構(gòu)象中的氨基酸殘基)，對Fab而言約40殘基或60埃。與作為Fab來源的相應(yīng)IgG相比，抗香豆素Fab能夠與更短的肽反應(yīng)，這表明其個體較小可以使它更深地向核糖體內(nèi)滲透。對DnaJ與小麥胚芽核糖體上短至55個氨基酸的氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶和螢火蟲螢光素酶新生肽的化學(xué)交聯(lián)已有所報道。這一肽鏈長度與上述聚丙氨酸的結(jié)果十分一致。
本發(fā)明顯示，短新生肽的氨基末端在核糖體的某區(qū)域內(nèi)被遮蔽，直至它們延伸至一定的長度，在該長度時它們的N末端完全離開肽基轉(zhuǎn)移酶中心所在區(qū)域。該區(qū)域可能涉及最早由Yonath及其同事報道的貫穿核糖體大亞基的通道。Eisenstein等(1994)綜述了核糖體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)表明在核糖體大亞基內(nèi)的肽基轉(zhuǎn)移酶中心和出口區(qū)之間存在著一個或一個以上的通道或空腔。Crowley及其同事(1993)提供了表明新生的真核細(xì)胞膜蛋白在其合成過程中穿過類似通道的數(shù)據(jù)。本發(fā)明提出，核糖體大亞基內(nèi)的該空腔提供了一個庇護(hù)所，至少部分折疊過程在此發(fā)生，此處的環(huán)境可以部分遮蔽新生蛋白質(zhì)，使它不受蛋白酶和細(xì)胞質(zhì)中可能存在的其它降解過程作用。
本說明書中提到的任一專利或公開文獻(xiàn)都表明了本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員的水平。這些專利和公開文獻(xiàn)在此以與單獨(dú)所列參考文獻(xiàn)的相同程度被引用參考。
本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員將很容易理解，本發(fā)明適合于實施文中提及的目的和獲取提及的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)以及與之相關(guān)的內(nèi)容。在此描述的結(jié)合方法、步驟、處理方法、分子和具體化合物一起給出的實施例代表了優(yōu)選的實施方法，它們是示范性的，無意于對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限制。本領(lǐng)域中熟練技術(shù)人員將在其中進(jìn)行的改變和其它用途都包含在本發(fā)明的精神之內(nèi)，由權(quán)利要求的范圍來界定。
權(quán)利要求
1.一種在原核的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，其步驟包括(a)將取自無細(xì)胞提取物的核糖體樣品與包含目標(biāo)蛋白編碼序列的質(zhì)粒DNA一起培養(yǎng)，所述的樣品與帶熒光標(biāo)記的氨酰tRNA一起培養(yǎng)在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基中；(b)通過將新合成的熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)與樣品中其它熒光組份分離來部分純化所述的熒光標(biāo)記蛋白；(c)測定合成的蛋白質(zhì)的量；(d)測定新合成的蛋白質(zhì)的熒光；(e)測定新合成的蛋白質(zhì)的生物活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的熒光標(biāo)記在所述的蛋白質(zhì)的N末端。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的氨酰tRNA是起始氨酰tRNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的熒光標(biāo)記與起始氨酰tRNA的氨基酸共價連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基中含有含于緩沖液中的RNA聚合酶、三磷酸核苷、能量再生系統(tǒng)、利福平和氨基酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的質(zhì)粒DNA是非線性化的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的培養(yǎng)步驟(a)在約37℃進(jìn)行約30分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)利用選自離心、離子交換色譜和凝膠過濾的方法來部分純化。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的原核的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)是E.coli的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中合成熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)的方法，其步驟包括(a)將取自無細(xì)胞提取物的核糖體樣品與包含目標(biāo)蛋白編碼序列的質(zhì)粒DNA一起培養(yǎng)，所述的樣品與帶熒光標(biāo)記的氨酰tRNA一起培養(yǎng)在偶聯(lián)的轉(zhuǎn)錄/翻譯培養(yǎng)基中；(b)通過將新合成的熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)與樣品中其它熒光組分分離來部分純化所述的熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)；(c)測定合成蛋白質(zhì)的量；(d)測定新合成蛋白質(zhì)的熒光；(e)測定新合成蛋白質(zhì)的生物活性。
文檔編號C07K1/00GK1143390SQ95191586
公開日1997年2月19日 申請日期1995年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1994年11月3日
發(fā)明者W·庫德利基, G·克雷默爾, B·哈德斯蒂 申請人:研究發(fā)展基金會