專利名稱：含dna損傷劑和p53的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總的說(shuō)來(lái)涉及的領(lǐng)域是改善化學(xué)治療性干預(yù)作用的新策略。從另外的方面講，本發(fā)明提供了將DNA損傷劑的效力與腫瘤抑制基因的聯(lián)合傳遞相結(jié)合的新方法和組合物。DNA損傷因子和腫瘤抑制基因異源表達(dá)的結(jié)合將產(chǎn)生優(yōu)于單個(gè)組分之作用的顯著協(xié)同作用。
當(dāng)前，已知包括放射療法、外科手術(shù)和化學(xué)療法在內(nèi)的癌癥治療方法的療效都是有限的。在美國(guó)，僅死于肺癌的人數(shù)每年都在140,000以上。最近，隨著年齡的變化而變化的肺癌死亡率在婦女中已超過(guò)了乳癌死亡率。盡管減少吸煙計(jì)劃的施行已降低了吸煙的盛行，但較高的肺癌死亡率將持續(xù)到21世紀(jì)。合理地開(kāi)發(fā)新的肺癌療法將有賴于在分子水平上對(duì)肺癌生物學(xué)的了解。
目前已經(jīng)明確，各種癌癥至少部分是由于遺傳異常所致，所述遺傳異?；蛘咭鹨环N或多種基因的過(guò)度表達(dá)，或者引起異常或突變基因的表達(dá)。例如，在許多情況下，已知癌基因的表達(dá)會(huì)引起癌癥?！鞍┗颉笔窃谶z傳上發(fā)生了改變的基因，其突變的表達(dá)產(chǎn)物以某種方式破壞正常的細(xì)胞功能或調(diào)控(Spandidos et al.，1989)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，至今為止所研究的大多數(shù)癌基因被“激活”是突變的結(jié)果，所說(shuō)突變通常是發(fā)生于正常細(xì)胞基因編碼區(qū)(即“原癌基因”)的點(diǎn)突變，導(dǎo)致被表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物中氨基酸的替換。這一被改變的表達(dá)產(chǎn)物表現(xiàn)出參予致癌過(guò)程的異常功能(Travali et al.，1990)。潛在的突變可以通過(guò)多種途徑引起，例如化學(xué)誘變或電離輻射。目前已鑒定了大量的癌基因和癌基因家族，包括ras、myc、Beu、raf、erb、src、fms、jun和abl，并在不同程度上對(duì)其特征進(jìn)行了描述(Travali etal.，1990；Bishop，1987)。
在正常的細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，據(jù)認(rèn)為促生長(zhǎng)原癌基因和抑生長(zhǎng)的腫瘤抑制基因兩者是平衡的。數(shù)種因素可以引起這兩種力量失衡，從而導(dǎo)致形成致癌狀態(tài)。所述的因素之一就是腫瘤抑制基因的突變(Weinberg，1991)。
編碼細(xì)胞蛋白p53的基因是一種重要的腫瘤抑制基因，該p53蛋白是調(diào)控細(xì)胞增殖的53kD核磷蛋白。p53基因突變和等位基因從該基因所在的染色體17p上喪失是在人惡性腫瘤中最多見(jiàn)的改變。p53蛋白在進(jìn)化過(guò)程中高度保寧，并在多數(shù)的正常組織中表達(dá)。已經(jīng)證明野生型p53涉及細(xì)胞周期的調(diào)控(Mercer，1992)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Fields etal.，1990；Mietz et al.，1992)、DNA復(fù)制(Wilcock andLane，1991；Bargonetti et al.，1991)和誘導(dǎo)編程性細(xì)胞死亡(Yonish-Rouach et al.，1991；Shaw et al.，1992)。
已經(jīng)知道多種突變的p53等位基因，其中單個(gè)堿基的替換導(dǎo)致合成具有十分不同的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)特性之蛋白質(zhì)，最終引起惡性腫瘤(Hollsteinet al.，1991)。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)p53基因是常見(jiàn)的人類癌癥中最常見(jiàn)的突變基因(Hollstein et al.，1991；Weinberg，1991)，并且與和吸煙有關(guān)的癌癥特別相關(guān)聯(lián)(Hollstein et al.，1991；Zakut-Houri et al.，1985)。已有文獻(xiàn)記載了p53在乳癌中的過(guò)度表達(dá)(Casey et al.，1991)。
對(duì)于癌癥的基因療法的最具挑戰(zhàn)性方面之一是涉及利用腫瘤抑制基因，如p53。已有報(bào)道說(shuō)明，將野生型p53轉(zhuǎn)染至某些類型的乳癌和肺癌細(xì)胞中能夠在細(xì)胞系中恢復(fù)生長(zhǎng)抑制調(diào)控作用(Casey etal.，1991；Takahasi et al.，1992)。雖然DNA轉(zhuǎn)染并不是將DNA導(dǎo)入病人細(xì)胞中的一種可行手段，但如果能開(kāi)發(fā)傳遞p53基因的改善方法，那么上述結(jié)果就證明將野生型p53用于存在突變p53基因的癌細(xì)胞可能是一種有效的治療方法。
目前，人們正在研究和開(kāi)發(fā)能夠用于腫瘤抑制之基因療法的基因傳遞系統(tǒng)。以病毒為基礎(chǔ)的基因轉(zhuǎn)移載體特別引人注意，這是因?yàn)椴《揪哂懈腥净罴?xì)胞的效力，在這一感染過(guò)程中，病毒遺傳物質(zhì)本身得以轉(zhuǎn)移。在這方面已經(jīng)取得一些進(jìn)展，例如，已經(jīng)用遺傳工程方法生產(chǎn)了用于傳遞各種基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。然而，因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒的感染性取決于靶細(xì)胞上逆轉(zhuǎn)錄病毒受體的可獲得性，所以主要的問(wèn)題還與用于基因療法的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有關(guān)，所述受體難以濃縮和純化，而且它們只能有效地整合到正在復(fù)制的細(xì)胞中。
腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的抗性代表了臨床腫瘤學(xué)中存在的主要問(wèn)題。NSCLC占肺癌病例的至少80％，而具有NSCLC的病人通常對(duì)化療是不具反應(yīng)性的(Doyle，1993)。目前的癌癥研究目標(biāo)之一是通過(guò)研究基因產(chǎn)物和化療藥物之間的相互作用來(lái)尋找改善癌癥的基因替代療法效力的途徑。當(dāng)單純皰疹胸苷激酶(HS-tK)基因通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)傳遞至腦腫瘤細(xì)胞時(shí)，成功地誘導(dǎo)對(duì)抗病毒劑9-(1，3-二-羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤的敏感性(Culver，et al.，1992)。HS-tK基因產(chǎn)物是外源病毒酶，而wt-p53蛋白在正常組織中表達(dá)，這說(shuō)明通過(guò)改變wt-p53的表達(dá)所進(jìn)行的化學(xué)抗性調(diào)節(jié)可能是利用內(nèi)源性遺傳設(shè)計(jì)所介導(dǎo)之途徑的另一種手段。
腺病毒系統(tǒng)對(duì)于體內(nèi)的基因傳遞具有很大的優(yōu)勢(shì)，如產(chǎn)生高滴度病毒、高感染力和對(duì)許多類型細(xì)胞的感染性。然而，被導(dǎo)入基因表達(dá)的穩(wěn)定性和持續(xù)性仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題。在給予DNA損傷刺激后的6小時(shí)內(nèi)能在對(duì)化療藥物敏感的細(xì)胞中出現(xiàn)p53水平升高(Fritsche，etal.，1993；Zhan，et al.，1993)，盡管如果去除所述刺激，升高的D53 DNA結(jié)合性在4小時(shí)過(guò)程中會(huì)逆轉(zhuǎn)(Tishler，et al.，1993)。因此，即使在中止與藥物的接觸后高水平的p53表達(dá)仍可以維持。通過(guò)Ad-p53進(jìn)行的Wt-p53表達(dá)在感染后第3天達(dá)到峰值(比內(nèi)源野生型高14倍)，并在第9天降至較低水平(Zhang，et al，1993)。這表明短暫的wt-p53高水平表達(dá)足以在癌細(xì)胞中啟動(dòng)細(xì)胞毒性程序。
p53具有在人肺癌細(xì)胞中作為化學(xué)敏感性決定子的重要作用。包括外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法在內(nèi)的各種治療方案都曾被試驗(yàn)性用于人NSCLC，但長(zhǎng)期的存活率仍不令人滿意。所需要的是一種聯(lián)合療法，它可以單獨(dú)使用，或者作為有效的輔助治療以防止原發(fā)腫瘤切除后的局部復(fù)發(fā)，或者作為對(duì)于產(chǎn)生了抗藥性的原發(fā)、轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)肺癌通過(guò)損害內(nèi)注射所能給予的一種治療方法。還需要開(kāi)發(fā)、研究和改善用于癌癥治療的新組合物之臨床適用性的組合物和方法。而且，必須證明這些方法和組合物在體內(nèi)環(huán)境中的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明闡述了對(duì)于通過(guò)將腫瘤抑制基因或蛋白與DNA損傷劑或因子的作用相結(jié)合用于制備殺傷細(xì)胞之經(jīng)改善的治療劑的需要。本發(fā)明還提供了組合物和方法，包括利用病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移在靶細(xì)胞中促進(jìn)野生型腫瘤抑制基因的表達(dá)(例如p53)和傳遞誘導(dǎo)DNA損傷的制劑或因子。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，利用本文所公開(kāi)的組合物可以在極大數(shù)量的靶細(xì)胞中誘導(dǎo)程序化的細(xì)胞死亡，也稱為編程性細(xì)胞死亡。
利用本發(fā)明，本發(fā)明人已經(jīng)證明了在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)，特別是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面的顯著作用。腫瘤細(xì)胞的形成和生長(zhǎng)也稱為“轉(zhuǎn)化”，它描述了已喪失其控制細(xì)胞分裂能力的細(xì)胞的形成和增生，這些細(xì)胞即為癌細(xì)胞。已經(jīng)預(yù)料到大量不同類型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞都是本發(fā)明方法和組合物可能的靶，如肉瘤、黑瘤、淋巴瘤和非常廣泛的實(shí)體瘤等。盡管存在惡性細(xì)胞生長(zhǎng)的任何組織都可能成為靶，但肺和乳腺組織是優(yōu)選的靶。本發(fā)明人在本文公開(kāi)，當(dāng)表達(dá)p53的重組傳遞載體與DNA損傷劑結(jié)合使用時(shí)能夠顯著降低細(xì)胞生長(zhǎng)速率。
本發(fā)明人在一些實(shí)施方案中提供了殺傷細(xì)胞(如惡性細(xì)胞)的方法和組合物，方法是將細(xì)胞或細(xì)胞群與能有效殺死細(xì)胞之結(jié)合量的p53蛋白或基因和一種或多種DNA損傷劑相接觸。能用本發(fā)明殺死的細(xì)胞可以包括例如不需要的良性細(xì)胞，如良性的前列腺增生細(xì)胞或超活性的甲狀腺細(xì)胞；涉及自身免疫疾病的細(xì)胞，如產(chǎn)生與關(guān)節(jié)炎、狼瘡、重癥肌無(wú)力、鱗狀轉(zhuǎn)化、營(yíng)養(yǎng)不良等有關(guān)的抗體的B細(xì)胞。雖然一般可用于殺死所有不需要的細(xì)胞，但本發(fā)明特別適用于殺死惡性細(xì)胞?！皭盒约?xì)胞”被定義為已喪失了控制細(xì)胞分裂周期能力、導(dǎo)致“轉(zhuǎn)化的”或“癌性”表型的細(xì)胞。
為了利用本發(fā)明的方法和組合物殺死象惡性或轉(zhuǎn)移細(xì)胞這樣的細(xì)胞，一般可以將“靶細(xì)胞”與能有效殺死所述細(xì)胞之結(jié)合量的p53蛋白或基因和至少一種DNA損傷劑相接觸。該方法可以包括將所述細(xì)胞與p53蛋白或基因和DNA損傷劑或因子同時(shí)接觸。所述過(guò)程的完成可以通過(guò)將所述細(xì)胞與單個(gè)組合物或包括兩種藥劑的藥物配方接觸，或者通過(guò)將所述細(xì)胞與兩種不同的組合物或配方同時(shí)接觸，其中的一種組合物包括p53蛋白或基因，而另一種組合物包括DNA損傷劑。
當(dāng)然可以想到，靶細(xì)胞可以首先與DNA損傷劑接觸，然后再與p53蛋白或基因接觸，或者反之。然而，在DNA損傷劑和p53被分別應(yīng)用于細(xì)胞的情況下，通常應(yīng)該保證傳遞每種物質(zhì)時(shí)間之間的有效時(shí)期不能失效，這樣的話，DNA損傷劑和p53將仍然能夠?qū)λ黾?xì)胞產(chǎn)生有利的聯(lián)合作用。在這種情況下，可以認(rèn)為應(yīng)該將所述細(xì)胞與兩種制劑接觸，彼此間隔大約12-24小時(shí)，更優(yōu)選的是間隔大約6-12小時(shí)，延遲時(shí)間僅大約12小時(shí)為最優(yōu)選。
術(shù)語(yǔ)“接觸”和“暴露”在用于細(xì)胞時(shí)所描述的是腫瘤抑制基因或蛋白(如p53)和DNA損傷劑或因子傳遞給靶細(xì)胞或與靶細(xì)胞直接一起放置的過(guò)程。為了能夠殺死細(xì)胞，兩種制劑要以能有效殺死細(xì)胞(即誘導(dǎo)程序化細(xì)胞死亡或編程性細(xì)胞死亡)的結(jié)合量傳遞給細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“殺死”、“程序化細(xì)胞死亡”和“編程性細(xì)胞死亡”在本文中相互交換著使用，以描述導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡的一系列胞內(nèi)過(guò)程。細(xì)胞的死亡過(guò)程包括胞內(nèi)蛋白酶和核酸酶的激活，這導(dǎo)致例如細(xì)胞核退化和核DNA斷裂。理解由各種胞內(nèi)分子相互作用所產(chǎn)生的細(xì)胞死亡的精確機(jī)理并不是實(shí)施本發(fā)明所必需的。
DNA損傷劑或因子在本文被定義為當(dāng)在應(yīng)用于細(xì)胞時(shí)可誘導(dǎo)DNA損傷的任何化學(xué)物質(zhì)或處理方法。這類損傷劑或因素包括誘導(dǎo)DNA損傷的輻射和波，如γ-射線、X-射線、紫外線照射、微波、電子發(fā)射等。多種化學(xué)物質(zhì)(也描述為“化療劑”)具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用，它們都可以用于本文所公開(kāi)的聯(lián)合治療方法。被認(rèn)為適用的化療劑包括如阿霉素、5-氟尿嘧啶(5FU)、依托泊甙(VP-16)、喜樹(shù)堿、放線菌素D、絲裂霉素C、順鉑(CDDP)和過(guò)氧化氫。本發(fā)明也包括一種或多種DNA損傷劑的聯(lián)合應(yīng)用，所述損傷劑無(wú)論是以輻射為基礎(chǔ)還是為實(shí)在的化合物，例如，將X射線與順鉑聯(lián)用，或?qū)㈨樸K與依托泊甙聯(lián)用。在某些實(shí)施方案中，順鉑與p53基因或蛋白的聯(lián)合應(yīng)用作為所述化合物是特別優(yōu)選的。
只要能夠引起細(xì)胞中功能性p53蛋白的水平升高，任何方法都可用于使細(xì)胞與p53蛋白接觸。這包括直接將p53蛋白傳遞給細(xì)胞，也包括傳遞編碼p53的基因或DNA片段，所述基因?qū)⒃诩?xì)胞中指導(dǎo)p53的表達(dá)和產(chǎn)生。在蛋白質(zhì)的傳遞中存在如蛋白降解和較低的細(xì)胞攝取之缺陷，據(jù)認(rèn)為應(yīng)用能表達(dá)p53蛋白的重組載體將提供特別的益處。
大量的重組質(zhì)粒和載體可以在經(jīng)遺傳工程方法處理后來(lái)表達(dá)p53蛋白，從而用于向細(xì)胞傳遞p53。這些包括例如用裸DNA和p53質(zhì)粒直接將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞(Wolfe et al.，1990)；將編碼p53的DNA收入脂質(zhì)體(Ledley et al.，1987)或收入含病毒包膜受體蛋白的蛋白脂質(zhì)體中(Nicolau et al.，1983)和與聚賴氨酸-糖蛋白載體復(fù)合物偶聯(lián)的編碼p53的DNA。
遺傳工程方法獲得的表達(dá)p53的重組病毒的應(yīng)用也進(jìn)行了研究。如Miller(Miller，1992)所述，各種病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、單純皰疹病毒(美國(guó)專利5,288,641，并入本文作為參考)、巨細(xì)胞病毒等都可以使用；可以使用的還可以是重組的腺伴隨病毒(AAV載體)，如美國(guó)專利5,139,941所述(并入本文作為參考)以及特別是重組的腺病毒載體?，F(xiàn)有技術(shù)已熟知制備復(fù)制缺陷型感染性病毒的技術(shù)，其例證如Ghosh-Choudhury&Graham(1987)；McGrory et al.，(1988)和Gluzman et al.，(1982)，上述文獻(xiàn)都并入本文作為參考。
為了根據(jù)本發(fā)明殺死細(xì)胞，通常應(yīng)該將所述細(xì)胞與能有效殺死細(xì)胞的結(jié)合量的p53蛋白或基因和DNA損傷劑相接觸。術(shù)語(yǔ)“有效殺死細(xì)胞的結(jié)合量”是指p53和DNA損傷劑的量是足夠的，以致于當(dāng)其聯(lián)合用于細(xì)胞中時(shí)，該細(xì)胞被誘導(dǎo)進(jìn)行編程性細(xì)胞死亡。盡管不是在所有的實(shí)施方案中都需要，但p53和DNA損傷劑的結(jié)合有效量將優(yōu)選地是能夠誘導(dǎo)比單獨(dú)使用各成分時(shí)多得多的細(xì)胞死亡的劑量，最優(yōu)選的是，結(jié)合有效量是指與單用各種成分所觀察到的作用相比能誘導(dǎo)增效性細(xì)胞死亡的量。
許多的體外參數(shù)可用于確定本發(fā)明組合物和方法所產(chǎn)生的效果。這些參數(shù)包括例如觀察與本發(fā)明所述組合物接觸前后的凈細(xì)胞數(shù)以及所形成的多細(xì)胞腫瘤球體的大小，如在組織培養(yǎng)中形成的集落。在本文的實(shí)施例7中特別表明了體外的殺細(xì)胞作用。另外，還可以檢測(cè)表明細(xì)胞正在進(jìn)行編程性細(xì)胞死亡的參數(shù)，如細(xì)胞基因組DNA斷裂成核小體大小的片段，這通常是通過(guò)用瓊脂糖凝膠電泳分離片斷、將DNA染色并將該DNA與DNA大小梯度相比較來(lái)鑒定。核小體大小片段是以具有約200bp堿基單位的單體和多體之漸進(jìn)性梯度來(lái)鑒定的。
類似地，“治療有效量”是指p53蛋白或基因和DNA損傷劑在聯(lián)合施用于動(dòng)物時(shí)能在動(dòng)物中有效殺死細(xì)胞的量。這尤其是以殺死癌細(xì)胞為證明，所述癌細(xì)胞例如是存在于患腫瘤之動(dòng)物或人體中的肺癌、乳癌或結(jié)腸癌細(xì)胞?！爸委熡行月?lián)合”因此而通常指能夠比任意單一成分殺死更多細(xì)胞的p53和DNA損傷劑之結(jié)合量，優(yōu)選地是指能產(chǎn)生協(xié)同性腫瘤負(fù)荷減輕的結(jié)合量。
對(duì)細(xì)胞死亡的某些體內(nèi)和間接體內(nèi)參數(shù)進(jìn)行研究也是有效的手段，借此可以評(píng)估本發(fā)明組合物和方法的有效性。例如，借助有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)家已知的冰凍組織切片的TdT表達(dá)或利用其它的染色方法和靶抗原的檢測(cè)，可以觀察對(duì)致癌性生長(zhǎng)抑制作用的影響。當(dāng)然，確定腫瘤包塊、生長(zhǎng)和存活力的其它手段也可用于評(píng)估對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。特別是可以在癌癥的各種動(dòng)物模型系統(tǒng)中評(píng)定這些影響，包括將人的癌細(xì)胞定位于動(dòng)物中的那些模型。已知腫瘤動(dòng)物模型與AIDS病的不同，它對(duì)于人的治療方案有很高的預(yù)見(jiàn)性(Roth et al.，editors(1989))。一個(gè)預(yù)測(cè)性動(dòng)物模型的例證方案為其中有人的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(H358細(xì)胞)在皮下生長(zhǎng)的方案。利用這個(gè)系統(tǒng)本發(fā)明人已證明，在將含p53的腺病毒輸入腫瘤內(nèi)時(shí)還同時(shí)施用化療劑，產(chǎn)生了幾乎意外有效的腫瘤縮小。
將p53蛋白傳遞給細(xì)胞所特別優(yōu)選的方法是將所述細(xì)胞與重組的腺病毒病毒體或病毒顆粒接觸，后者包括了含p53表達(dá)區(qū)的重組腺病毒載體，該表達(dá)區(qū)位于能夠指導(dǎo)p53在所指定細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子之調(diào)控下。
載體中的p53表達(dá)區(qū)含有一段基因組序列，但為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，可以認(rèn)為一般寧愿使用p53 cDNA序列，因?yàn)槠湓诂F(xiàn)有技術(shù)中易于獲取，而且更易于操作。除了含有p53表達(dá)區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)之外，該載體通常還含有聚腺苷酸化信號(hào)，如SV40早期基因，或魚(yú)精蛋白基因，聚腺苷酸化信號(hào)等。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以考慮希望將p53表達(dá)區(qū)定位于較強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子的調(diào)控之下，所述啟動(dòng)子如CMV啟動(dòng)子、病毒LTR、RSV或SV40啟動(dòng)子，或與能在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中高水平表達(dá)的基因相關(guān)的啟動(dòng)子，如延伸因子1或肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。所有這類變異體都被認(rèn)為適用于本發(fā)明。目前，特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)IE啟動(dòng)子。
p53基因或cDNA可以簡(jiǎn)單地借助將p53編碼序列插入或加入到病毒基因組中而得以被導(dǎo)入本發(fā)明的重組腺病毒中。然而，優(yōu)選的腺病毒將是復(fù)制缺陷型病毒，其中復(fù)制和/或包裝所必需的病毒基因已從腺病毒載體構(gòu)建體中去除，使得p53表達(dá)區(qū)被導(dǎo)入該位置。無(wú)論是復(fù)制所必需的基因(如E1A、E1B、E2和E4)還是非必需的基因(如E3)，任何基因都可以被去除而代以p53。特別優(yōu)選的是那些其中腺病毒載體的E1A和E1B區(qū)已被去除，而p53表達(dá)區(qū)導(dǎo)入到其位置上的載體和病毒體，這可由

圖1的基因組結(jié)構(gòu)來(lái)舉證說(shuō)明。
如Ghosh-Choudhury和Graham(1987)、McGrory等人(1988)以及Gluzman等人所說(shuō)明(每篇文獻(xiàn)均引入本文作為參考)，制備復(fù)制缺陷型腺病毒的技術(shù)是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的。人們也已了解各種細(xì)胞系可用于繁殖重組腺病毒，只要其能與所存在的復(fù)制缺陷互補(bǔ)。優(yōu)選的細(xì)胞系是人293細(xì)胞系，但任何允許進(jìn)行復(fù)制(即在優(yōu)選的情況下能夠表達(dá)E1A和E1B)的細(xì)胞系都可以使用。而且，所述細(xì)胞能夠在塑料平皿或懸浮培養(yǎng)中繁殖，以獲得其病毒貯備物。
本發(fā)明并不僅僅局限于缺乏E1的病毒和表達(dá)E1的細(xì)胞。實(shí)際上，病毒與宿主細(xì)胞的其它互補(bǔ)性聯(lián)合也可以與本發(fā)明相聯(lián)系應(yīng)用。可以使用缺乏功能性E2的病毒和表達(dá)E2的細(xì)胞，正如可以使用缺乏功能性E4的病毒和表達(dá)E4的細(xì)胞等一樣。當(dāng)復(fù)制所非必需的一個(gè)基因被去除和取代，例如E3基因，這一缺陷不必由宿主細(xì)胞所專門互補(bǔ)。
除了要求腺病毒載體經(jīng)遺傳工程處理以表達(dá)p53外，并不認(rèn)為原腺病毒的性質(zhì)是成功實(shí)施本發(fā)明的關(guān)鍵。腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞群A-F中的任意一種。C亞群中的5型腺病毒是為了獲得用于本發(fā)明方法的條件性復(fù)制缺陷型腺病毒載體的優(yōu)選起始材料。這是因?yàn)?型腺病毒是一種人腺病毒，現(xiàn)已了解了有關(guān)的大量生化和遺傳學(xué)信息，并且在歷史上已被用于以腺病毒作載體的大多數(shù)構(gòu)建物中。
本發(fā)明的方法和組合物同樣地適用于在體外和在體內(nèi)殺死細(xì)胞。當(dāng)待殺細(xì)胞位于動(dòng)物體內(nèi)時(shí)，例如肺癌、乳癌或結(jié)腸癌細(xì)胞或其它具有p53突變的細(xì)胞，就可將p53蛋白或基因和DNA損傷劑以藥物學(xué)上可接受的形式施用于動(dòng)物。本文所用術(shù)語(yǔ)“藥物學(xué)上可接受的形式”是指可施用于動(dòng)物的任何組合物形式和將動(dòng)物與輻射相接觸的形式，即動(dòng)物體的某個(gè)區(qū)域被例如γ射線、X射線、紫外線、微波、電子發(fā)射等照射的方式。DNA損傷性輻射和波的應(yīng)用是放射治療領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。
本發(fā)明還提供了治療癌癥的有利方法，通常包括給患癌癥的動(dòng)物或病人施用治療有效量的p53蛋白或基因和DNA損傷劑。利用攜帶了能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)p53之載體的重組病毒，特別是腺病毒即可以達(dá)到上述目的。傳遞p53基因的組合物通常是以藥物學(xué)上可以接受的組合物形式在密切接觸腫瘤的情況下施用于動(dòng)物。將治療有效量的p53基因(如位于重組病毒內(nèi))經(jīng)直接的損害內(nèi)注射至腫瘤部位是一種優(yōu)選的方法。然而，也可以考慮其它的胃腸外施用途徑，如靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、內(nèi)窺鏡和皮下注射。
在根據(jù)本發(fā)明治療癌癥時(shí)，將腫瘤細(xì)胞與除了p53蛋白或基因外的DNA損傷劑接觸。通過(guò)利用DNA損害性照射，如用X-射線、紫外線、γ-射線或者微波照射所在的腫瘤部位即可達(dá)到上述目的。另外，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)給動(dòng)物施用治療有效量的含DNA損傷化合物的藥物組合物而與DNA損傷劑接觸，所述DNA損傷化合物例如有阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、喜樹(shù)堿、放線菌素D、絲裂霉素C或更優(yōu)選的順鉑。該DNA損傷劑可以通過(guò)與如上所述的p53蛋白、基因或基因傳遞系統(tǒng)相結(jié)合而加以制備，并以結(jié)合的治療組合物或試劑盒形式使用。
本發(fā)明的意外成功通過(guò)發(fā)現(xiàn)在用裸鼠模型所進(jìn)行的研究中Ad5CMV-p53病毒與順鉑的聯(lián)用產(chǎn)生了意義深遠(yuǎn)的結(jié)果而得以證明。病毒-DNA損傷療法的結(jié)合顯著地抑制了H358細(xì)胞的致癌性，該細(xì)胞正常情況下能產(chǎn)生明顯的腫瘤包塊。通過(guò)Ad5CMV-p53的治療，肺癌細(xì)胞的致癌性受到抑制，但不受表達(dá)熒光素酶之對(duì)照病毒的抑制，這表明p53蛋白與DNA損傷劑相結(jié)合具有極大的治療效力。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已經(jīng)知道一些用來(lái)把包括DNA表達(dá)構(gòu)建體的化療配方傳遞到真核細(xì)胞的方法。就本文而言，有經(jīng)驗(yàn)的人員能用各種不同的有效方式把DNA損傷劑和p53蛋白或基因傳遞到細(xì)胞中。
對(duì)于體內(nèi)的DNA傳遞而言，本發(fā)明人考慮了各種基因傳遞系統(tǒng)的應(yīng)用，如病毒介導(dǎo)的和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。本文所用術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”描述的是利用傳遞系統(tǒng)，如腺病毒、AAV、逆轉(zhuǎn)錄病毒或質(zhì)粒傳遞基因轉(zhuǎn)移法將DNA定向地傳遞給真核細(xì)胞?？梢赃x擇病毒基因傳遞的特異性，以優(yōu)先地指導(dǎo)所述基因到達(dá)特定的靶細(xì)胞，例如這可以通過(guò)使用能夠感染特定細(xì)胞類型的病毒來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)然，不同的病毒宿主范圍將指定選來(lái)用于基因傳遞的病毒，以及可能的腫瘤抑制基因，后者被表達(dá)用于殺死指定的惡性細(xì)胞類型。
還要看到，可以通過(guò)各種途徑提供DNA損傷化療劑，如通過(guò)利用靜脈內(nèi)和皮下注射等胃腸道外傳遞方法進(jìn)行。這類方法是藥物傳遞領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的，并且在本文的藥物制備及處理部分還有更進(jìn)一步的描述。
對(duì)于體外的基因傳遞而言，可以使用多種方法，例如磷酸鈣或葡聚糖硫酸酯介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染；電穿孔法；玻璃導(dǎo)彈擊靶法等。根據(jù)本發(fā)明的公開(kāi)而顯而易見(jiàn)的確切組合物和實(shí)施過(guò)程，上述方法都是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
其它的實(shí)施方案涉及包括藥物配方的組合物，含有p53蛋白或基因和DNA損傷劑，如順鉑。在這類組合物中，p53可以是能夠在一種動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p53蛋白的DNA片段、重組載體或重組病毒的形式。通過(guò)分散于藥物學(xué)上可接受的溶液或緩沖液中，可以配制包括含有重組病毒基因傳遞系統(tǒng)(如腺病毒顆粒)的所述組合物以供體內(nèi)施用。優(yōu)選的藥物學(xué)上可接受的溶液包括用磷酸、乳酸、Tris等緩沖的中性鹽溶液。
當(dāng)然，在利用病毒傳遞系統(tǒng)過(guò)程中，希望純化病毒體，以致其能夠基本不含不需要的污染物質(zhì)，如缺損干擾病毒顆?；騼?nèi)毒素和其它的致熱原，這樣就不會(huì)在接受載體構(gòu)建體的細(xì)胞、動(dòng)物或人體中引起任何不利反應(yīng)。優(yōu)選的載體純化方法包括應(yīng)用浮力密度梯度，如氯化銫梯度離心法。
本發(fā)明優(yōu)選的藥物組合物是那些包括分散于藥物學(xué)上可接受溶液或緩沖液中的p53蛋白或更優(yōu)選的p53基因和化療DNA損傷劑。列舉的化療劑是阿霉素、5-氟尿嘧啶、喜樹(shù)堿、放線菌素D、過(guò)氧化氫、絲裂霉素C、順鉑(CDDP)和依托泊甙(VP-16)，其中選用順鉑是特別優(yōu)選的。
本發(fā)明還有更進(jìn)一步的實(shí)施方案是用于殺死細(xì)胞(如惡性細(xì)胞)的試劑盒，可以配制成治療性試劑盒用于癌癥治療。本發(fā)明的試劑盒通常是在合適的容器工具中含有能夠在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p53蛋白的重組載體的藥物配方和DNA損傷劑的藥物配方。重組載體和DNA損傷劑可以存在于單個(gè)容器中，或者這些成分分別存在于不同的或分開(kāi)的容器工具中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組載體是存在于腺病毒顆粒上的、表達(dá)p53的重組腺病毒載體，而DNA損傷劑為順鉑。
所述試劑盒的成分優(yōu)選的是以液體溶液提供，或者為干粉。當(dāng)各成分以液體溶液提供時(shí)，該溶液為水溶液，特別優(yōu)選的是無(wú)菌水溶液。當(dāng)試劑或組分為干粉時(shí)，該粉末可通過(guò)加入適當(dāng)?shù)娜軇﹣?lái)重新配制?？梢哉J(rèn)識(shí)到，所述溶劑也可以在另一容器工具中提供。
下文的附圖是本說(shuō)明書(shū)的一部分，并包括了對(duì)本發(fā)明某些方面更進(jìn)一步的說(shuō)明。通過(guò)參考一個(gè)或多個(gè)附圖，并結(jié)合本文特定實(shí)施例的詳細(xì)描述，將可以更好地理解本發(fā)明。
圖1.產(chǎn)生重組p53腺病毒的方案。p53表達(dá)盒被插入到pXCJL.1的XbaI和ClaI位點(diǎn)之間。用p53表達(dá)載體(pEC53)和重組質(zhì)粒pJM17共同轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。使被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞維持在培養(yǎng)基中直到開(kāi)始出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)。通過(guò)對(duì)DNA的PCR分析來(lái)鑒定新產(chǎn)生的p53重組腺病毒(Ad5CMV-p53)，其中的PCR分析法利用了從經(jīng)蛋白酶K和酚提取處理的CPE上清液中制備的DNA模板。
圖2A.用于對(duì)Ad5CMV-p53 DNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析的圖譜。該圖表示了p53表達(dá)盒位于其上的Ad5CMV-p53基因組DNA、PCR引物和限制性酶切位點(diǎn)。基因組大小約為35.4kb，被分成100個(gè)圖單位(1m.u.＝0.35kb)。p53表達(dá)盒取代了Ad5基因組上的E1區(qū)(1.3-9.2m.u.)。引物1位于人CMV主要IE基因啟動(dòng)子下游的第一個(gè)內(nèi)含子。引物2位于SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)中。距p53 cDNA插入段兩端15-20bp的兩個(gè)引物定義了一段1.40kb的PCR產(chǎn)物。引物3和4分別定位于Ad5基因組的11m.u.和13.4m.u.，其它義了一段0.86kb的病毒基因組特異性PCR產(chǎn)物。
圖2B.PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠分析。將定義1.4kb(p53)和0.86kb(Ad5)DNA片段的兩對(duì)引物用于每一反應(yīng)。用于每一反應(yīng)中的DNA模板為pEC53質(zhì)粒(泳道1)、Ad5/RSV/GL2DNA(泳道2)、無(wú)DNA(泳道3)和Ad5CMV-p53 DNA(泳道4)。被標(biāo)示的泳道(M)對(duì)應(yīng)于分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
圖2C.Ad5CMV-p53 DNA的限制性酶切圖譜。分別用無(wú)酶(U)、HindIII(H)、BamHI(B)、EcoRI(E)和ClaI(C)消化經(jīng)CsCl梯度純化的Ad5CMV-p53 DNA樣品，并在1％瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分析。所標(biāo)示的泳道(M)是分子量標(biāo)準(zhǔn)物。
圖3A、圖3B、圖3C和圖3D。利用重組腺病毒對(duì)293細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)的觀察。圖3A、圖3B、圖3C和圖3D是293細(xì)胞的一系列相差成象(×400)。圖3A、圖3B、圖3C和圖3D是單頁(yè)圖的4個(gè)分圖。圖3A，轉(zhuǎn)染前；圖3B，轉(zhuǎn)染后12天的陰性對(duì)照；圖3C，轉(zhuǎn)染后12天開(kāi)始的CPE；圖3D，轉(zhuǎn)染后14天CPE完成。
圖4A、圖4B、圖4C和圖4D。用重組腺病毒感染的細(xì)胞的免疫組織學(xué)。圖4A、圖4B、圖4C和圖4D是H358細(xì)胞的一系列免疫組織學(xué)圖像。圖4A、圖4B、圖4C和圖4D是單頁(yè)圖的4個(gè)分圖。Ad5CMV-p53在H358細(xì)胞中的感染性。用Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2以50PFU/細(xì)胞感染H358細(xì)胞共24小時(shí)。單用培養(yǎng)基作為模擬感染。經(jīng)免疫染色法分析被感染的細(xì)胞。圖4A是用抗p53抗體探查的模擬感染。圖4B是用Ad5/RSV/GL2對(duì)照感染并用抗p53抗體探測(cè)的感染細(xì)胞。圖4C是用不相關(guān)抗體(MOPC-21)探測(cè)的Ad5 CMV-p53感染細(xì)胞。圖4D是用抗p53抗體探測(cè)的Ad5CMV-p53感染的細(xì)胞。所用抗p53抗體為Pab1801，親和素-生物素法用于染色。
圖5A.考馬斯蘭染色的SDS-PAGE凝膠，比較在H358細(xì)胞中表達(dá)的外源p53的相對(duì)水平。在感染后24小時(shí)和72小時(shí)制備用30PFU/細(xì)胞的Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染的H358細(xì)胞樣品?？捡R斯蘭染色的SDS-PAGE分析表明了所載蛋白樣品的相對(duì)含量。泳道1和4含有Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞的樣品。泳道2和3含有用Ad5CMV-p53的兩種單獨(dú)的貯備物感染24小時(shí)后的細(xì)胞樣品。泳道5和6是在感染后72小時(shí)收集的Ad5CMV-p53感染細(xì)胞的樣品。泳道7是感染后72小時(shí)的模擬感染H358的樣品。泳道M為預(yù)染的分子量標(biāo)準(zhǔn)物(KDa)(GIBCO-BRL)。
圖5B。圖5A所示SDS-PAGE對(duì)等泳道設(shè)置凝膠的Western印跡分析。通過(guò)利用抗p53抗體的Western印跡方法分析p53表達(dá)的相對(duì)水平。所用的第一抗體是抗p53蛋白的單克隆抗體(PAb1801，Oncogene Science Inc.)和抗β-肌動(dòng)蛋白的單克隆抗體(AmershamInc.)。HRP連接的第二抗體和ECL developer得自Amersham Inc.。用Western印跡法分析病毒感染的H358細(xì)胞。圖5B的Western印跡與圖5A中的有相同的順序和構(gòu)成。
圖6.用Western印跡法確定的p53表達(dá)時(shí)間過(guò)程。用10PFU/細(xì)胞的Ad5CMV-p53感染多個(gè)平皿的H358細(xì)胞。在感染后的指定時(shí)間點(diǎn)制備細(xì)胞裂解物。同時(shí)用抗p53抗體和抗肌動(dòng)蛋白抗體探測(cè)Western印跡。命名為“C”的泳道代表陰性對(duì)照。直方圖表示由光密度計(jì)確定的p53相對(duì)含量。
圖7A.細(xì)胞系H358的病毒感染人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。按照105細(xì)胞/平皿(60mm)和6個(gè)平皿/細(xì)胞系的量接種細(xì)胞。24小時(shí)后，以10m.o.i(感染復(fù)數(shù)，即PFU/細(xì)胞)的Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞。感染后，每天對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，共計(jì)六天。生長(zhǎng)曲線表示從4個(gè)不同的研究中得到的數(shù)據(jù)。
圖7B.細(xì)胞系H322的病毒感染人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。按105細(xì)胞/平皿(60mm)和6個(gè)平皿/細(xì)胞系的量接種細(xì)胞。24小時(shí)后，以10m.o.i.(感染復(fù)數(shù)，即PFU/細(xì)胞)的Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞。感染后，每天對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，共計(jì)六天。生長(zhǎng)曲線表示從4個(gè)不同的研究中得到的數(shù)據(jù)。
圖7C.細(xì)胞系H460的病毒感染人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。按105細(xì)胞/平皿(60mm)和6個(gè)平皿/細(xì)胞系的量接種細(xì)胞。24小時(shí)后，以10m.o.i.(感染復(fù)數(shù)，即PFU/細(xì)胞)的Ad5 CMV-p53或Ad5/RSV/GL2感染細(xì)胞。感染后，每天對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，共計(jì)六天。生長(zhǎng)曲線表示從4個(gè)不同研究中所獲得的數(shù)據(jù)。
圖8.Ad5CMV-p53在常位(orthotopic)肺癌模型中試驗(yàn)的流程圖。該圖中總結(jié)了用H226Br細(xì)胞和病毒接種處理裸鼠的劑量與方案。
圖9A、圖9B、圖9C和圖9D。從被處理和對(duì)照小鼠剖離的肺和縱隔樣品。圖9A、圖9B、圖9C和圖9D。是一個(gè)圖的4個(gè)分圖。在處理后的六周末將小鼠處死。分離肺及縱隔組織用于評(píng)估腫瘤的形成。圖9A是從正常裸鼠得到的縱隔段樣品；圖9B是從載體(PBS)處理的小鼠得到的縱隔段樣品；圖9C是從Ad5 CMV-p53處理的小鼠得到的縱隔段樣品；圖9D是從Ad5/RSV/GL2處理的小鼠得到的縱隔段樣品。箭頭表示腫瘤塊。
圖10A.連續(xù)接觸CDDP對(duì)親代、Ad-Luc感染的和Ad-p53感染的H358細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響。H358細(xì)胞(1.5×105細(xì)胞/孔)按雙份置于24孔板中。24小時(shí)后，加入100μl培養(yǎng)基、Ad-Luc病毒貯液(108PFU/ml)或Ad-p53病毒貯液(108PFU/ml)。再經(jīng)過(guò)24小時(shí)的培養(yǎng)后，用含10μg/ml CDDP的新鮮培養(yǎng)基更換含病毒的培養(yǎng)基。
圖10B.接觸CDDP24小時(shí)對(duì)親代、Ad-Luc感染的和Ad-p53感染的H358細(xì)胞生長(zhǎng)速率的影響。細(xì)胞與CDDP連續(xù)接觸(圖10A)或接觸24小時(shí)(圖10B)，然后在不含藥物的培養(yǎng)基中回收。保持為附著單層的細(xì)胞通過(guò)檢測(cè)臺(tái)盼蘭攝入來(lái)評(píng)估5天中的存活情況。圖中示出了均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差。第5天的Ad-p53CDDP組細(xì)胞數(shù)與其它的A和B組有顯著性差異(p＜0.05，Student t檢驗(yàn))。
圖10C.不同濃度的CDDP對(duì)Ad-p53感染的H358細(xì)胞的存活力的影響。與Ad-Luc或Ad-p53病毒接觸24小時(shí)后，用0、10或100μg/ml的CDDP處理細(xì)胞，然后評(píng)估存活力。
圖11A.與CDDP接觸的Ad-p53感染的H358細(xì)胞中的核小體DNA斷裂。如圖10的說(shuō)明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染并用CDDP處理24小時(shí)。
圖11B、圖11C、圖11D、圖11E、圖11F和圖11G。用Ad-p53對(duì)生長(zhǎng)于箱式玻片上的H358細(xì)胞感染24小時(shí)，再用CDDP處理24小時(shí)，固定后用于原位標(biāo)記DNA斷裂。所示圖為無(wú)(B)或有(D)CDDP的親代H358細(xì)胞；無(wú)(D)或有(E)CDDP的Ad-Luc感染細(xì)胞；無(wú)(F)或有(G)CDDP的Ad-p53感染細(xì)胞。箭頭表示深染的核片段的例子。短線＝100μm。
圖12A. Ad-p53感染和CDDP處理對(duì)H358腫瘤球體的聯(lián)合影響。如前所述(Takahashi et al.，1989)制備H358細(xì)胞的多細(xì)胞腫瘤球體。在第0天，將直徑為150-200μm的球狀物置于24孔瓊脂包被板中，與Ad-p53或Ad-Luc接觸24小時(shí)。第1天，在除去含病毒的培養(yǎng)基后加入含10μg/ml CDDP的培養(yǎng)基。第2天，保溫24小時(shí)后，用1ml新鮮的不含藥物培養(yǎng)基代替覆蓋物。用倒置顯微鏡檢測(cè)垂直直徑。根據(jù)公式a2×b/a12×b1計(jì)算體積的相對(duì)改變，公式中a和b分別是球狀物的最小和最大直徑，而a1和b1是第1天的直徑。只有Ad-p53/CDDP球狀物的相對(duì)體積比對(duì)照組(Ctl)有顯著性縮小(p＜0.05，student t-檢驗(yàn))。
圖12B、圖12C、圖12D和圖12E。用TdT進(jìn)行原位dUTP標(biāo)記以檢測(cè)編程性細(xì)胞死亡。如實(shí)施例7的材料與方法所述，在第3天將H358細(xì)胞球狀物固定并染色。(B)對(duì)照的未處理球狀物；(C)用CDDP處理的球狀物；(D)用Ad-p53感染的球狀物和(E)Ad-p53感染的經(jīng)CDDP處理的球狀物。短線＝100μm。
圖13A.通過(guò)腫瘤體積的改變檢測(cè)用Ad-p53進(jìn)行體內(nèi)感染后由CDDP誘導(dǎo)的編程性細(xì)胞死亡。懸于0.1ml Hank平衡鹽溶液中的H358細(xì)胞(5×106)經(jīng)皮下注射到BALB/C雌性nu/nu小鼠的右脅腹。30天后，再將200μl培養(yǎng)基本身或含Ad-Luc(108pFU/ml)或Ad-p53(108PFU/ml的培養(yǎng)基注射到直徑為5-6mm的腫瘤中。進(jìn)行腫瘤內(nèi)注射(100μl)和在兩個(gè)相對(duì)的位置進(jìn)行腫瘤周圍注射(各50μl)。經(jīng)腹膜內(nèi)給予CDDP(3mg/kg)或生理鹽水對(duì)照。在不了解何為處理組的情況下，用測(cè)徑器在兩個(gè)垂直直徑上檢測(cè)腫瘤的大小，并通過(guò)一個(gè)假設(shè)具有以橫切面直徑之積的平方根為平均腫瘤直徑的球形來(lái)計(jì)算腫瘤的體體。每個(gè)處理組用5只小鼠，已給出了均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。用Student t-檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)。箭頭表示處理的天數(shù)。圖中顯示了兩個(gè)獨(dú)立的檢測(cè)結(jié)果。試驗(yàn)1中從第5天開(kāi)始p＜0.05；試驗(yàn)2中從第7天開(kāi)始p＜0.05(B-E)。
圖13B、圖13C、圖13D和圖13E。利用TdT介導(dǎo)的生物素-dUTP標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行的組織學(xué)研究。在處理開(kāi)始5天后收集腫瘤，并立即包入O.C.T.化合物中。在低溫控制器中以5μm厚度切冷凍組織。如圖12的說(shuō)明所述，用1μg/ml蛋白酶K處理切片并染色。所示圖為單用CDDP處理的H358腫瘤(B)、單用Ad-p53處理(C)或用Ad-p53與CDDP聯(lián)合處理的腫瘤(D，E)。短線＝0.5mm。所有的動(dòng)物護(hù)理都是根據(jù)UT M.D.Anderson Institutional Animal Care and UseCommittee的要求進(jìn)行。A.肺癌發(fā)展中的分子學(xué)過(guò)程本發(fā)明人進(jìn)行的研究已經(jīng)證實(shí)了導(dǎo)致癌癥發(fā)生和進(jìn)展的重要分子過(guò)程。這使得本發(fā)明人能夠開(kāi)發(fā)恢復(fù)某些正常蛋白質(zhì)功能從而使惡性表型能在體內(nèi)得以抑制的新方法。
大多數(shù)常見(jiàn)肺癌的組織學(xué)(80％)都?xì)w于術(shù)語(yǔ)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，其包括了鱗狀癌、腺癌和大細(xì)胞未分化癌。許多有關(guān)肺癌分子生物學(xué)的現(xiàn)有資料都源于對(duì)罕見(jiàn)的小細(xì)胞肺癌(SCLC)的研究。SCLC與NSCLC的區(qū)別在于細(xì)胞的神經(jīng)內(nèi)分泌特征；SCLC對(duì)化療具有很好的反應(yīng)性，但在治療之后很快復(fù)發(fā)。NSCLC還可以作為其它致癌物誘導(dǎo)的上皮癌模型。本研究中所得到的方法和觀察資料可用于其它類型的上皮癌。
已經(jīng)積累的充足的證據(jù)說(shuō)明惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程是由遺傳學(xué)改變所介導(dǎo)的。在癌細(xì)胞中檢測(cè)到的主要損害出現(xiàn)在顯性癌基因和腫瘤抑制基因。顯性癌基因在一類稱為原癌基因的基因中發(fā)生了改變，原癌基因參予重要的正常細(xì)胞功能，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。發(fā)生于具有轉(zhuǎn)化能力的顯性癌基因的初級(jí)修飾作用包括點(diǎn)突變、轉(zhuǎn)位、重排和擴(kuò)增。腫瘤抑制基因可能需要通過(guò)突變、缺失或兩者的結(jié)合使純合子的功能喪失而發(fā)生轉(zhuǎn)化。一些腫瘤抑制基因可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄而在控制增生方面起作用。對(duì)顯性及腫瘤抑制癌基因的表達(dá)進(jìn)行修飾可能影響與惡性表型有關(guān)的某些細(xì)胞特征。
盡管對(duì)涉及癌基因介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化機(jī)理的了解不斷增多，但在開(kāi)發(fā)特異性地針對(duì)癌基因及其產(chǎn)物的治療策略方面沒(méi)有取得多大進(jìn)展。起初，這一領(lǐng)域的研究集中在顯性癌基因上，因?yàn)檫@些基因是首先被鑒定特征的。DNA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移研究表明了通過(guò)轉(zhuǎn)移了惡性人腫瘤DNA后的正常細(xì)胞獲得惡性表型。B.癌癥中的p53和p53突變p53在目前被認(rèn)為是腫瘤抑制基因(Montenarh，1992)。在因化療致癌劑、紫外線照射和多種病毒(包括SV40)轉(zhuǎn)化的許多細(xì)胞中都已發(fā)現(xiàn)存在高水平的p53。p53基因是大量人腫瘤中常見(jiàn)的突變失活靶，并已被描述成多發(fā)人癌中最常見(jiàn)的突變基因(Mercer，1992)。在50％以上的人NSCLC(Hollestein，et al.，1991)和其它的廣譜腫瘤中都有突變。
p53基因編碼375個(gè)氨基酸的磷蛋白，后者能與宿主蛋白(如大T抗原和E1B)形成復(fù)合物。該蛋白質(zhì)見(jiàn)于正常組織和細(xì)胞，但與轉(zhuǎn)化細(xì)胞或腫瘤組織相比其濃度甚微。令人感興趣的是，野生型p53似乎在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂中很重要。已經(jīng)證明野生型p53的過(guò)度表達(dá)在某些情況下對(duì)人腫瘤細(xì)胞系有抗增生作用。因此，p53可以作為細(xì)胞生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)劑(Weinberg，1991)，可以直接抑制失控的細(xì)胞生長(zhǎng)或間接地活化抑制所述生長(zhǎng)作用的基因。所以，野生型p53失活或缺乏可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化作用。然而，一些研究表明，突變p53的存在可能是完全表達(dá)所述基因轉(zhuǎn)化潛力所必需的。
盡管野生型p53被認(rèn)為是許多細(xì)胞類型的很重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，但其遺傳學(xué)和生化學(xué)特性似乎也具有作用。錯(cuò)義突變對(duì)于p53而言是常見(jiàn)的，并且對(duì)于癌基因的轉(zhuǎn)化力是必需的。由點(diǎn)突變所引起的單一遺傳學(xué)變化可產(chǎn)生致癌性p53。但與其它癌基因不同，已知p53點(diǎn)突變發(fā)生在至少30個(gè)不同的密碼子，常常構(gòu)成能在細(xì)胞表型中產(chǎn)生位移的顯性等位基因而不降低純合性。另外，許多這些顯性負(fù)等位基因可能在生物體中有耐受性，并在種系中傳遞。各種突變的等位基因可能包括從最弱的功能失調(diào)性顯性負(fù)等位基因到較強(qiáng)外顯的顯性負(fù)等位基因(Weinberg，1991)。
據(jù)Casey及其同事報(bào)道，將編碼野生型p53的DNA轉(zhuǎn)染到人乳癌細(xì)胞系中可在這類細(xì)胞中恢復(fù)生長(zhǎng)抑制的調(diào)控(Casey et al.，1991)。也已證實(shí)了對(duì)野生型p53而非突變p53轉(zhuǎn)染至人肺癌細(xì)胞系中的類似作用(Takahasi et al.，1992)。p53在突變基因上呈顯性，當(dāng)被轉(zhuǎn)染至有該突變基因的細(xì)胞中時(shí)，將篩選抗增生作用。被轉(zhuǎn)染p53的正常表達(dá)并不影響具有內(nèi)源p53的細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，這類構(gòu)建體能被正常細(xì)胞攝入而沒(méi)有不利影響。
因此，用野生型p53治療p53相關(guān)性癌癥有可能減少惡性腫瘤細(xì)胞數(shù)目。然而，如上所述的研究還遠(yuǎn)未達(dá)到這一目標(biāo)，這較多的是因?yàn)镈NA轉(zhuǎn)染法并不能用于將DNA導(dǎo)入病人體內(nèi)的癌細(xì)胞中。C.基因治療技術(shù)至今已提出了數(shù)種基因治療的實(shí)驗(yàn)手段，但每種都有其特定的缺點(diǎn)(Mulligan，1993)。如上所述，基本的轉(zhuǎn)染方法在于通過(guò)例如穿透細(xì)胞膜的物理方法或化學(xué)方法而非生物學(xué)方法將含目的基因的DNA導(dǎo)入細(xì)胞中。正常情況下，這種方法局限于能夠從機(jī)體暫時(shí)取出，并能耐受治療的細(xì)胞毒性的細(xì)胞，即淋巴細(xì)胞。與某些脂類和兩親的肽形成的脂質(zhì)體或蛋白質(zhì)結(jié)合物可用于轉(zhuǎn)染，但基因的整合效率仍然很低，大約每1,000-100,000個(gè)細(xì)胞發(fā)生一次整合，并且轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)在增生細(xì)胞中限于數(shù)天，或在非增生細(xì)胞中限于數(shù)周。因此，DNA轉(zhuǎn)染對(duì)于癌癥治療而言顯然不是一種適宜的方法。
第二種方法利用病毒的天然能力進(jìn)入細(xì)胞，帶入其遺傳物質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄病毒有希望作為基因傳遞載體，因?yàn)槠淠軐⑵浠蛘系剿拗骰蚪M中，轉(zhuǎn)移大量外源遺傳物質(zhì)，感染廣譜的物種和細(xì)胞類型，并能夠在特定細(xì)胞系中包裝。然而，有三個(gè)主要問(wèn)題妨礙了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)際應(yīng)用。首先，逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染性依賴于靶表面上病毒受體的可獲得性。其次，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能有效地整合到復(fù)制細(xì)胞中。最后，逆轉(zhuǎn)錄病毒難以濃縮和純化。D.用于基因治療的腺病毒構(gòu)建體人類腺病毒是雙鏈DNA腫瘤病毒，基因組大小約為36kb(Tooza，1981)。作為真核基因表達(dá)的模式系統(tǒng)，腺病毒已被廣泛地研究并進(jìn)行了清楚的特征鑒定，這就使其成為開(kāi)發(fā)作為基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的腺病毒的有吸引力系統(tǒng)。這組病毒易于生長(zhǎng)和操作，而且其在體內(nèi)和體外顯示了廣泛的宿主。在裂解性感染的細(xì)胞中，腺病毒能夠關(guān)閉宿主的蛋白質(zhì)合成，指導(dǎo)細(xì)胞器合成大量病毒蛋白和產(chǎn)生大量病毒。
基因組的E1區(qū)包括編碼負(fù)責(zé)病毒基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)的E1A和E1B以及少數(shù)的細(xì)胞基因。包括E2A和E2B的E2表達(dá)使得合成病毒復(fù)制性功能，如DNA結(jié)合蛋白、DNA聚合酶和引導(dǎo)復(fù)制的終止蛋白。E3基因產(chǎn)物防止由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和腫瘤壞死因子引起的細(xì)胞溶解，并且對(duì)于病毒的繁殖似乎很重要。與E4蛋白質(zhì)相關(guān)的功能包括DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉。晚期基因產(chǎn)物包括大多數(shù)的病毒粒子衣殼蛋白，并且其只在來(lái)自主要晚期啟動(dòng)子的單個(gè)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的大部分加工過(guò)程出現(xiàn)后才表達(dá)。主要的晚期啟動(dòng)子(MLP)在感染晚期表現(xiàn)出高效率(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。
因?yàn)橹挥行〔糠值牟《净蚪M似乎需要為順式(Tooza，1981)，所以腺病毒來(lái)源的載體在用于有關(guān)的細(xì)胞系(如293細(xì)胞)時(shí)能提供取代大DNA片段的良好潛力。已開(kāi)發(fā)出了Ad5轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系(Graham，et al.，1977)來(lái)提供反式的必需病毒蛋白。本發(fā)明人因此推測(cè)，腺病毒的特征使之成為用于體內(nèi)擊中癌細(xì)胞的優(yōu)良候選物(Grunhaus&Horwitz，1992)。
用于將外源蛋白質(zhì)傳遞給細(xì)胞的腺病毒系統(tǒng)的特別的優(yōu)點(diǎn)包括(i)能夠用外源DNA取代比較大的病毒DNA片段；(ii)重組腺病毒的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；(iii)腺病毒施用于人體的安全性；以及(iv)不存在任何已知與腺病毒感染有關(guān)的癌癥或惡性腫瘤；(v)能夠獲得高滴度的重組病毒和(vi)腺病毒的高感染性。
腺病毒優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒的進(jìn)一步的特性包括高水平的基因表達(dá)。另外，與逆轉(zhuǎn)錄病毒序列不同，它不依賴于宿主基因的復(fù)制。因?yàn)镋1區(qū)的腺病毒轉(zhuǎn)化基因易于缺失并仍然提供有效的表達(dá)載體，所以，由腺病毒載體所產(chǎn)生的致癌危險(xiǎn)性被認(rèn)為是微不足道的(Grunhaus&Horwitz，1992)。
總之，腺病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是基于重組的工程化腺病毒，該病毒因其基因組的一部分缺失(如E1鐵失)而不能復(fù)制，但仍然保留其感染力。當(dāng)在腺病毒基因組中發(fā)生另外的缺失時(shí)可表達(dá)比較大的外源蛋白質(zhì)。例如，E1和E3兩個(gè)區(qū)缺失的腺病毒能夠攜帶達(dá)10kb的外源DNA，并能在293細(xì)胞中生長(zhǎng)成高滴度(Stratford-Perricaudet and Perricaudet，1991a)。還有在腺病毒感染后出現(xiàn)轉(zhuǎn)基因預(yù)料之外的持續(xù)性表達(dá)的報(bào)道。
腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移目前已作為介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞和整體動(dòng)物中的手段進(jìn)行研究。例如，在治療有罕見(jiàn)的隱性遺傳學(xué)疾病鳥(niǎo)氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶(OTC)缺陷的小鼠時(shí)，發(fā)現(xiàn)腺病毒構(gòu)建體可用于提供正常的OTC酶。不幸的是，在17個(gè)病例中只有4例的OTC達(dá)到了正常水平的表達(dá)(Stratford-Perricaudet et al.，1991b)。因此，該缺陷在大多數(shù)小鼠中僅得到部分的糾正，而且沒(méi)有引起生理學(xué)或表型的改變。這類結(jié)果因而就沒(méi)有對(duì)腺病毒載體用于癌癥治療產(chǎn)生多大促進(jìn)作用。
試圖用腺病毒將囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)的基因轉(zhuǎn)移到Cotton大鼠肺上皮中的努力已獲部分成功，盡管還不可能評(píng)價(jià)被轉(zhuǎn)移的基因在動(dòng)物上皮中的生物活性(Rosenfeld et al.，1992)。而且，這些結(jié)果證明了基因的轉(zhuǎn)移和CFTR蛋白在肺氣管細(xì)胞中的表達(dá)，但未顯示生理學(xué)作用。在1991年的Science文章中，Rosenfeld等人表明了α1抗胰蛋白酶蛋白的肺表達(dá)，但同樣未顯示生理作用。事實(shí)上，他們估計(jì)所觀察到的表達(dá)水平僅為人體中達(dá)到肺保護(hù)作用所需水平的2％，即遠(yuǎn)低于生理作用所需量。
人α1抗胰蛋白酶基因已通過(guò)門靜脈內(nèi)注射而導(dǎo)入正常大鼠的肝臟中，該基因被表達(dá)并導(dǎo)致被轉(zhuǎn)入的人蛋白質(zhì)分泌到所述小鼠的血漿中(Jaffe et al.，1992)。然而，令人失望的是，所得量不足以具有治療價(jià)值。
這類結(jié)果并未證明腺病毒能夠指導(dǎo)足夠的蛋白質(zhì)在重組細(xì)胞中表達(dá)以達(dá)到生理學(xué)上有關(guān)的作用，因此也未表明腺病毒系統(tǒng)在有關(guān)癌癥治療中的用途。而且，在本發(fā)明之前，p53被認(rèn)為不能被摻入包裝細(xì)胞中，如那些用于制備腺病毒的細(xì)胞，因?yàn)樗怯卸拘缘?。又因?yàn)橄俨《镜腅1B與p53結(jié)合，所以這被認(rèn)為是腺病毒為什么和p53技術(shù)不能聯(lián)合的進(jìn)一步原因。E.p53-腺病毒構(gòu)建體和腫瘤抑制本發(fā)明提供了具有新穎且更有效的腫瘤抑制基因載體的癌癥基因療法。該重組病毒開(kāi)發(fā)了腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)，如高滴度、較寬的靶范圍、有效轉(zhuǎn)導(dǎo)和在靶細(xì)胞中的非整合作用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，創(chuàng)建了一種復(fù)制缺陷、不依賴輔助因子的腺病毒，其在人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子的控制下表達(dá)野生型p53(Ad5 CMV-p53)。
當(dāng)需要在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)時(shí)，對(duì)表達(dá)載體的調(diào)控功能通常由病毒提供。例如，常用的啟動(dòng)子源于多瘤病毒、2型腺病毒和猴病毒40(SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子特別有用，因?yàn)閮烧叨家子趶乃霾《局幸赃€含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段而獲得。更小或更大的SV40片段也可以使用，只要其包括從HindIII位點(diǎn)向位于病毒的復(fù)制起點(diǎn)的BglI位點(diǎn)延伸的大約250bp序列。而且，也有可能并常常希望利用正常情況下與所包括的基因序列相關(guān)的啟動(dòng)子或調(diào)控序列，只要這類調(diào)控序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)具有相容性。
復(fù)制起點(diǎn)可以由載體構(gòu)建體提供，以包括一個(gè)外源起點(diǎn)，如可以來(lái)源于SV40或其它的病毒(如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)理提供。如果載體被整合到細(xì)胞染色體上，后者通常就足夠了。
優(yōu)選的p53腺病毒的設(shè)計(jì)和繁殖在圖1中用圖解表示。與此相關(guān)，已開(kāi)發(fā)了改善的方案用于繁殖和鑒定重組腺病毒(討論如下)。鑒定之后，如圖2所示用PCR分析法對(duì)p53重組腺病毒從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行證實(shí)。在分離并證實(shí)結(jié)構(gòu)后，用p53腺病毒感染具有純合性p53基因缺失的人肺癌細(xì)胞系H358。Western印跡法表明外源p53蛋白以高水平表達(dá)(圖4和圖5)，并在感染后的第3天達(dá)到峰值(圖6)。
在p53點(diǎn)突變的細(xì)胞系H322中還表明，突變的p53受到外源p53表達(dá)的下調(diào)作用。作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，使用了與Ad5CMV-p53具有結(jié)構(gòu)相似性的病毒體(Ad5/RSV/GL2)。該病毒體在病毒體的表達(dá)盒中含有由勞氏肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶cDNA。在受病毒體Ad5/RSV/GL2感染的細(xì)胞中既未檢測(cè)到p53表達(dá)也未有檢測(cè)到肌動(dòng)蛋白表達(dá)的變化。與未感染的細(xì)胞或用對(duì)照病毒體感染的細(xì)胞相比，由Ad5CMV-p53感染的H358細(xì)胞的生長(zhǎng)受到極大抑制(圖7A)。H322細(xì)胞的生長(zhǎng)也受到p53病毒體的顯著抑制(圖7B)，而含有野生型p53的人肺癌H460細(xì)胞的生長(zhǎng)受到較小的影響(圖7C)。
Ad5CMV-p53介導(dǎo)了對(duì)肺癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的強(qiáng)抑制作用。當(dāng)用MOI低于1PFU/細(xì)胞的Ad5CMV-p53感染細(xì)胞時(shí)沒(méi)有生長(zhǎng)抑制作用產(chǎn)生，而當(dāng)MOI高于100PFU/細(xì)胞時(shí)，甚至用對(duì)照病毒Ad5/RSV/GL2也能觀察到細(xì)胞毒性。在我們的研究中，對(duì)于生長(zhǎng)速率研究的理想劑量是10-50PFU/細(xì)胞。在該劑量范圍內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用歸因于所表達(dá)的p53蛋白。
裸鼠中的試驗(yàn)證明，用Ad5CMV-p53處理的H358細(xì)胞其致癌性被極大地抑制。在常位的人肺癌小鼠模型中，將有p53點(diǎn)突變的致癌性H226Br細(xì)胞在病毒處理前3天經(jīng)氣管內(nèi)接種。Ad5CMV-p53的氣管內(nèi)灌注在該模型系統(tǒng)中防止腫瘤形成，這表明修飾的腺病毒是介導(dǎo)腫瘤抑制基因在人癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)移和表達(dá)的有效載體，并且，Ad5CMV-p53病毒可被進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成為用于癌癥基因療法的治療劑。
如Western印跡分析法所證實(shí)，Ad5CMV-p53在人肺癌細(xì)胞中介導(dǎo)了高水平的p53基因表達(dá)。外源p53蛋白比H460細(xì)胞中的內(nèi)源野生型p53多大約14倍，并且比H358細(xì)胞中β-肌動(dòng)蛋白內(nèi)對(duì)照多大約2-4倍。高水平的表達(dá)可以歸因于(1)高效的基因轉(zhuǎn)移，(2)強(qiáng)CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)p53 cDMA，和(3)增強(qiáng)p53 cDNA轉(zhuǎn)錄的腺病毒E1增強(qiáng)子。在H358細(xì)胞中，感染后p53表達(dá)的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)于15天。然而，在感染第5天后表達(dá)水平迅速下降。對(duì)來(lái)自感染的H358細(xì)胞的DNA樣品進(jìn)行PCR分析表明了病毒DNA水平隨著降低的蛋白質(zhì)水平而降低，這說(shuō)明在癌細(xì)胞的體外連續(xù)生長(zhǎng)過(guò)程中喪失了病毒DNA。
p53表達(dá)水平的降低還因?yàn)榭刂苝53表達(dá)的CMV啟動(dòng)子的細(xì)胞弱化作用，因?yàn)橐郧耙呀?jīng)報(bào)道過(guò)宿主細(xì)胞介導(dǎo)的CMV啟動(dòng)子關(guān)閉的現(xiàn)象(Dai，et al.，1992)。腺病毒載體是非整合性基因轉(zhuǎn)移載體，因而基因表達(dá)的持續(xù)時(shí)間取決于多種因素，包括宿主細(xì)胞、所轉(zhuǎn)移的基因和有關(guān)的啟動(dòng)子。Crystal及其同事證明，在感染后的6周可在Cotton大鼠上皮細(xì)胞中檢測(cè)到囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白基因的低水平表達(dá)(Rosenfeld et al.，1992)。Perricaudet的實(shí)驗(yàn)室證明微營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(minidystrophin)基因在mdx小鼠肌肉中的最小表達(dá)在感染后持續(xù)3月以上。在本研究中所觀察到的野生型p53蛋白的短期高水平表達(dá)對(duì)用Ad5CMV-p53進(jìn)行體內(nèi)治療后的正常細(xì)胞具有減少可能有的副作用的有利影響。
本文公開(kāi)的研究表明，p53重組腺病毒具有腫瘤抑制特性，該特性可能是通過(guò)恢復(fù)p53蛋白質(zhì)在腫瘤細(xì)胞中的功能而起作用。這些結(jié)果提供了將Ad5CMV-p53病毒體作為治療劑用于癌癥治療的證據(jù)。F.DNA損傷劑多種DNA損傷劑可用于本發(fā)明，如可直接交聯(lián)DNA的試劑、可嵌入DNA的試劑以及通過(guò)影響核酸合成導(dǎo)致染色體和有絲分裂畸變的試劑。
可以想出直接交聯(lián)核酸尤其是DNA的試劑并示于本文中，以產(chǎn)生導(dǎo)致協(xié)同的抗腫瘤聯(lián)合作用的DNA損傷?？捎萌珥樸K的試劑和其它DNA烷化劑。順鉑已廣泛用于治療癌癥，其臨床應(yīng)用的有效量是20mg/m2每三周用5天，總共3個(gè)療程。順鉑口服不吸收，因此必須經(jīng)靜脈、皮下、腫瘤內(nèi)或腹膜內(nèi)注射應(yīng)用。
可損傷DNA的試劑也包括干擾DNA復(fù)制、有絲分裂和染色體分離的化合物。這些化合物的例子包括亞德里亞霉素(也稱為阿霉素)、依托泊甙、維拉帕來(lái)、鬼臼毒素等等。這些化合物在廣泛用于治療腫瘤的臨床過(guò)程中是以靜脈推注施用的，亞德里亞霉素劑量為25-75mg/m2，以21天為間隔；依托泊甙靜脈內(nèi)給藥35-50mg/m2或口服給藥為靜脈內(nèi)藥量加倍。
破壞核酸前體合成及精度的試劑和亞單位也可造成DNA損傷。由此開(kāi)發(fā)了大量的核酸前體。尤其有用的是那些經(jīng)過(guò)廣泛測(cè)試并容易得到的試劑。由此，如5-氟尿嘧啶(5-FU)的試劑優(yōu)選用于腫瘤組織，使其在擊靶腫瘤細(xì)胞方面尤其有用。盡管毒性很大，5-FU仍可用在大范圍的載體中，包括局部應(yīng)用，然而常用的靜脈施用的劑量范圍為3-15mg/kg/天。
其它引起DNA損傷并已廣泛使用的因素包括通常稱為γ-射線、X-射線和/或放射性同位素直接傳遞至腫瘤細(xì)胞。其它DNA損傷因素的形式也可考慮，如微波和UV照射。很可能所有的這些因素對(duì)DNA前體、DNA復(fù)制與修復(fù)和染色體組裝及維持造成損傷。X-射線的劑量范圍從在較長(zhǎng)時(shí)間(3-4周)內(nèi)每天為50-200倫琴至單次照射2000到6000倫琴。放射性同位素的劑量范圍很寬，并依賴于同位素的半衰期、射出射線的強(qiáng)度與類型以及腫瘤細(xì)胞攝取情況。
有經(jīng)驗(yàn)的人員可參見(jiàn)“Remington′s Pharmaceuticel Sciences”15版，第33章，尤其是624-652頁(yè)。劑量的改變必須依所治療對(duì)象的狀況進(jìn)行。負(fù)責(zé)用藥的人員在任何情況下決定單個(gè)受試者的適宜劑量。進(jìn)一步來(lái)講，人用的制劑應(yīng)符合無(wú)菌、無(wú)致病原、總體安全性以及純度標(biāo)準(zhǔn)等FDA Office of Biologics的標(biāo)準(zhǔn)。G.p53與順鉑治療在一項(xiàng)測(cè)定將基因替換療法與化療結(jié)合起來(lái)治療人類癌癥效果的嘗試中，發(fā)明者檢測(cè)了是否順序應(yīng)用Ad-p53和CDDP可以引起體內(nèi)程序化細(xì)胞死亡。在直接腫瘤內(nèi)注射Ad-p53或腹膜內(nèi)施用CDDP3天后，皮下植入至nu/nu小鼠的H358腫瘤顯示出輕度生長(zhǎng)緩慢。然而，如果同時(shí)應(yīng)用Ad-p53和CDDP，腫瘤部分復(fù)歸且腫瘤大小仍然統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著小于其它任何治療組腫瘤。經(jīng)過(guò)兩個(gè)治療周期，生長(zhǎng)抑制作用更為顯著(圖13A)。組織學(xué)檢查顯示在以CDDP治療小鼠的Ad-D53注射區(qū)域腫瘤細(xì)胞大量破壞。原位染色表明在非細(xì)胞區(qū)域周圍有大量程序化死亡細(xì)胞(圖13B-E)。相反，單獨(dú)以CDDP或Ad-p53治療的腫瘤既無(wú)非細(xì)胞構(gòu)成，也無(wú)程序化細(xì)胞死亡區(qū)域。
本發(fā)明描述了結(jié)合了用DNA交聯(lián)劑的常規(guī)化療的一種新的人類基因治療方法。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗性是臨床腫瘤學(xué)上主要的問(wèn)題。NSCLC是至少80％肺癌病人的原因；然而患NSCLC的病人一般對(duì)化療不反應(yīng)(Doyle，1993)。目前癌癥研究的一個(gè)目的是通過(guò)研究基因產(chǎn)物與化療藥物間相互作用找到改善基因替換療法的效果。單純性皰疹-胸苷激酶(HS-tK)基因在由逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)傳至腦腫瘤時(shí)成功地引起對(duì)抗病毒劑9-(1，3-二羥-2-丙氧甲基)鳥(niǎo)嘌呤的易感性(Culver，et al.，1992)。HS-tK基因產(chǎn)物是一外源性病毒酶，而wt-p53蛋白在正常組織內(nèi)表達(dá)，這表明由wt-p53表達(dá)改變引起的化學(xué)抗性的調(diào)節(jié)可能是采用由外源遺傳程序介導(dǎo)之途徑的另一種路徑。
腺病毒系統(tǒng)對(duì)于體內(nèi)基因傳遞有潛在的優(yōu)勢(shì)，如容易產(chǎn)生高滴度病毒、高感染效率和對(duì)多種類型細(xì)胞有感染性。然而對(duì)所導(dǎo)入基因表達(dá)的穩(wěn)定性及持久性仍有爭(zhēng)議。對(duì)于化學(xué)-基因療法，表達(dá)的水平及高感染性可能比表達(dá)的持久性更有意義，因?yàn)樗幬锟稍趲滋靸?nèi)殺死受染細(xì)胞。對(duì)化療藥物敏感的細(xì)胞內(nèi)p53水平的升高可在DNA損傷刺激6小時(shí)后產(chǎn)生(Fritsche，et al.，1993，Zhan，et al.，1993)，盡管如果去除刺激物增加的p53 DNA結(jié)合活性可在4小時(shí)內(nèi)被送轉(zhuǎn)(Tishler，et al.，1993)。在本模型中，wt-p53基因的表達(dá)是由包含于Ad-p53載體中的巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子獨(dú)立驅(qū)動(dòng)的。因此，即使在停止暴露給藥物之后，p53表達(dá)的高水平仍可維持。由Ad-p53引起的wt-p53蛋白表達(dá)在感染后第3天達(dá)到高峰(比內(nèi)源性野生型大14倍)并至第9天降至低水平(Zhang，etal.，1993)。這表明wt-p53表達(dá)的短暫高水平足以啟動(dòng)癌癥細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞毒程序。H.病人與治療方案發(fā)明者建議對(duì)患p53相關(guān)聯(lián)癌癥如不可切除阻塞性支氣管內(nèi)癌的病人將腺病毒-p53基因構(gòu)建體局部傳送至肺癌細(xì)胞將是傳遞治療有效基因抵抗臨床疾病的非常有效的方法。p53基因的傳遞是結(jié)合DNA損傷劑或因子產(chǎn)生的。這種聯(lián)合的方法對(duì)目前癌癥治療是一明顯的改進(jìn)，如對(duì)單用順鉑敏感性的喪失，它依賴于試圖通過(guò)影響DNA損傷殺死或去除最后一個(gè)癌細(xì)胞。由于腫瘤細(xì)胞休眠是一已存在的現(xiàn)象，這使有效殺死癌細(xì)胞很不可能。
據(jù)估計(jì)NSCLC細(xì)胞對(duì)腺病毒構(gòu)建體攝取將降低這些細(xì)胞的增殖速率，然而本發(fā)明實(shí)施例顯示將p53腺病毒與DNA損傷劑或因子聯(lián)合應(yīng)用可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤大小的極度減小，這種現(xiàn)象單用任何因素時(shí)均未出現(xiàn)。本文公開(kāi)的組合物及方法強(qiáng)有力地預(yù)示影響肺時(shí)間的增加將仍不斷擴(kuò)展、可防止腫瘤再生長(zhǎng)及腫瘤細(xì)胞分化和延長(zhǎng)病人存活時(shí)間。
部分或完全氣道阻塞且外部光束放療失敗或不能接受外部光束放療的不能切除支氣管內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)患者被考慮接受本聯(lián)合治療方案。對(duì)此病的現(xiàn)有治療僅是短期的治標(biāo)治療。盡管進(jìn)行外部光束放療，大多數(shù)病人仍有復(fù)發(fā)。有可能插入短期治療導(dǎo)管且施用另外的放療、靜脈內(nèi)施用DNA損傷劑。接受目前治療之病人的生存期中值為6個(gè)月。短期治療失敗的病人也適合接受基因治療。用激光或活檢鉗可從氣道去除腫瘤。這可以與注射腺病毒構(gòu)建體聯(lián)合，這樣就減少了必須注射的體積，施用病毒構(gòu)建體不排除接受其它治標(biāo)治療的病人，如果腫瘤進(jìn)行性生長(zhǎng)的話。I.其它基因轉(zhuǎn)移技術(shù)成功的基因治療一般要求把能夠改正遺傳疾病的基因整合至宿主基因組中，在那里它可與宿主DNA共同存在并復(fù)制，且能以補(bǔ)償缺陷基因的水平進(jìn)行表達(dá)。理想地用一種或幾種治療治愈疾病而無(wú)嚴(yán)重副作用。到目前為止已有幾條基因治療途徑，它們可以與本發(fā)明一起應(yīng)用。
第一種途徑是例如通過(guò)化學(xué)或物理法穿透細(xì)胞膜將含目的基因的DNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)。這一方法通常局限于可暫時(shí)從體內(nèi)取出且能耐受治療的細(xì)胞毒的細(xì)胞(即淋巴細(xì)胞)。以某些脂質(zhì)及兩親性肽形成的脂質(zhì)體或蛋白結(jié)合物可用于體內(nèi)轉(zhuǎn)染(Stewart et al.，1992；Torchilin，etal.，1992；Zhu，et al.，1993)，然而存在的基因整合效率很低。據(jù)估計(jì)目的基因只能整合至1,000-100,000個(gè)細(xì)胞中的一個(gè)細(xì)胞的基因組中。無(wú)整合存在時(shí)，轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)限于在增殖細(xì)胞中幾天或在非增殖細(xì)胞中數(shù)周，因?yàn)榉钦螪NAs的分解。
第二種途徑利用病毒的自然屬性進(jìn)入細(xì)胞，攜帶其自身的遺傳物質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄病毒由于其將其基因整合入宿主基因組中的能力有希望作為基因傳遞載體轉(zhuǎn)移大量的外源遺傳物質(zhì)、感染廣譜的種屬和細(xì)胞類型并可在特殊細(xì)胞系中組裝(Miller，1992)。
第三種途徑采用其它的病毒如腺病毒、單純皰疹病毒(HSV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)和腺病毒伴隨病毒AAV，這些病毒經(jīng)過(guò)工程處理可作為基因轉(zhuǎn)移的載體。盡管某些可接受外源遺傳物質(zhì)的病毒在其可容納的核苷酸數(shù)目及它們所感染細(xì)胞的范圍上受限，但這些病毒已經(jīng)顯示出成功地影響基因表達(dá)。然而，腺病毒不將其遺傳物質(zhì)整合至宿主基因組中并因此不需要為基因表達(dá)宿主的復(fù)制，這使其理想地適于快速、有效、異源基因表達(dá)。
即使本發(fā)明已描述了某種程度的特殊性，但很明顯，根據(jù)以前的公開(kāi)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言多種變化、修改及改變均是顯而易見(jiàn)的。因此，打算將所有落入本發(fā)明精神及范圍的這類變化、修改和改變包含在限定的權(quán)利要求中。
下面的實(shí)施例包括進(jìn)來(lái)以闡述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到，下文公開(kāi)的技術(shù)代表了由發(fā)明者發(fā)現(xiàn)并在發(fā)明的實(shí)施中很好發(fā)揮功能的技術(shù)，并因此可被認(rèn)為組成了本發(fā)明實(shí)施中的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識(shí)到可以在已公開(kāi)的特殊實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變并仍獲得相似的結(jié)果而不離開(kāi)本發(fā)明的精神與范圍。
實(shí)施例1p53表達(dá)載體的構(gòu)建本實(shí)施例描述了p53表達(dá)載體的構(gòu)建。如所指示構(gòu)建該載體并用其替代腺病毒株Ad5基因組的E1區(qū)(1.3～9.2m.u.)，且用于構(gòu)建實(shí)施例2所述的腺病毒病毒體。
圖1所示的p53表達(dá)盒插入至pXCJL1(Dr.Frank L.Graham，McMaster University，Canada提供)的XbaI和ClaI位點(diǎn)之前，該表達(dá)盒含有人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(Boshart，et al.，1985)、p53cDNA和SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)。
基因組大小約35.4kb，分成100個(gè)圖譜單位(1m.u.＝0.35kb)。p53表達(dá)盒取代了Ad5基因組的E1區(qū)(1.3-9.2m.u.)。
引物1序列為5′-GGCCCACCCCCTTGGCTTC-3′(SEQ IDNO1)，并位于人CMV主要IE基因啟動(dòng)子(Boshart，et al.，1985)下游的第一內(nèi)含子中。引物2序列為5′-TTGTAACCATTATAAGCTGC-3′(SEQ ID NO2)，且位于SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)中。兩個(gè)引物距p53 cDNA插入子兩端15-20bp，限定了1.40kb PCR產(chǎn)物。引物3序列為5′-TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG-3′(SEQ IDNO3)且引物4序列為5′-CATCTGAACTCAAAGCGTGG-3′(SEQ ID NO4)，分別位于Ad5基因組的11m.u.和13.4m.u.處，它們限定了0.86kb病毒基因組特異性PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例2重組p53腺病毒的產(chǎn)生和增殖本實(shí)施例描述了適于產(chǎn)生表達(dá)p53的輔助非依賴性重組腺病毒的一種方法。所用的產(chǎn)生重組腺病毒的分子方法是基于這樣的事實(shí)，即由于腺病毒裝配的限制，pJM17不能在自身上形成病毒。因此，轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)p53表達(dá)載體質(zhì)粒和pJM17之間的同源重組產(chǎn)生了僅可在表達(dá)必需腺病毒蛋白的細(xì)胞內(nèi)裝配的活病毒。
本實(shí)施例的方法應(yīng)用293細(xì)胞作為宿主細(xì)胞以增殖在E1或E3區(qū)域含異源性DNA表達(dá)盒取代物的病毒。該過(guò)程需要DNA共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染很大程度上決定了病毒增殖的效率。在本發(fā)明之前，將DNA轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中的方法通常是磷酸鈣/DNA共沉淀法(Graham andran der Eb，1973)。然而，該方法和噬菌斑測(cè)定法均相對(duì)較難且典型地造成病毒增殖效率低。如本實(shí)施例所示，在用細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，用脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染可顯著改善轉(zhuǎn)染及隨后的受染細(xì)胞的鑒定。
將293細(xì)胞系保存在加有10％熱失活馬血清的Dulbecco改良極限必需培養(yǎng)基中。按照生產(chǎn)者的方法(Boehringer Mannheim Biochemicals，1992)以DOTAP介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)染將進(jìn)行同源重組的p53表達(dá)載體和質(zhì)粒pJM17(McGrory，et al.，1988)共轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞中。這一過(guò)程圖示于圖1中。
于轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將293細(xì)胞(傳代35，60％融合)在60mm培養(yǎng)皿或24孔平板中接種。每孔中的細(xì)胞以30μl DOTAP、2μg p53表達(dá)載體和3μg質(zhì)粒pJM17轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后每2-3天更換MEM培養(yǎng)基直至進(jìn)行EP。
實(shí)施例3重組腺病毒的確認(rèn)鑒定本實(shí)施例說(shuō)明一種確認(rèn)鑒定在合適細(xì)胞系共轉(zhuǎn)染后的重組病毒體的新聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)定法。
從測(cè)試板上收集等份的細(xì)胞培養(yǎng)上清液(50-370μl)，于56℃用蛋白酶K(50μg/ml，含0.5％SDS和20mM EDTA)處理1小時(shí)，用苯酚-氯仿提取，并用乙醇沉淀核酸。將DNA沉淀物再懸浮于20μl dH2O中用作PCR擴(kuò)增的模板。PCR引物及其序列的相對(duì)位置示于圖1中，分別為SEQ ID NOS1、2、3和4。cDNA插入段特異性引物限定了一個(gè)1.4kb PCR產(chǎn)物，且病毒基因組特異性引物限定了一個(gè)0.8kb PCR產(chǎn)物。于含4mM MgCl2、50mM Kcl、0.1％triton X-100、200μM各dNTPs、10mM Tris-Cl(pH9.0)、2μM各引物以及1.0單位Taq聚合酶(Promega)共50μl的反應(yīng)液中進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)于94℃進(jìn)行0.5分鐘、56℃下0.5分鐘和72℃下1分鐘，共30次循環(huán)。
為了簡(jiǎn)化新增殖重組病毒的鑒定過(guò)程，開(kāi)發(fā)了對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液DNA樣品的直接PCR測(cè)定法。用蛋白酶K處理等份(50或370μl)的有CPE之細(xì)胞培養(yǎng)上清液且以苯酚/氯仿提取。乙醇沉淀后，用使用兩對(duì)引物以擴(kuò)增插入段特異性及病毒-基因組-特異性序列的PCR分析DNA樣品。PCR引物靶及其序列示于圖1中。引物1、2、3和4分別由SEQ ID NO1、2、3和4代表。
結(jié)果，從表達(dá)載體(陽(yáng)性對(duì)照)及陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)物的DNA樣品中擴(kuò)增了1.4kb cDNA插入段和0.86kb病毒基因組片段(圖2B，分別為1道和4道)。僅0.86kb片段從Ad5/RSV/GL2病毒的DNA樣品中擴(kuò)增出(陰性對(duì)照，2道)。從用兩種之一的未處理陽(yáng)性細(xì)胞培養(yǎng)基上清液的PCR反應(yīng)中未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(3道)。
這些結(jié)果表明，用少至50μl的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液制備DNA模板即可通過(guò)PCR檢測(cè)出釋入細(xì)胞培養(yǎng)基中的腺病毒。根據(jù)這些結(jié)果將開(kāi)發(fā)出用這一技術(shù)測(cè)定腺病毒滴度(常規(guī)上用噬菌斑檢測(cè)法測(cè)定)的定量方法。
于CsCl梯度純化的病毒DNA上通過(guò)雙脫氧DNA測(cè)序證實(shí)了Ad5CMV-p53病毒中p53 cDNA的野生型序列。以相似方法產(chǎn)生的對(duì)照病毒Ad5/RSV/GL2具有除Rous肉瘤病毒啟動(dòng)子外的相似于Ad5 CMV-p53的結(jié)構(gòu)，而且將熒光素酶cDNA用于其表達(dá)盒中。攜帶大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(LacZ)、Ad5CMV-Laz的重組腺病毒也與Ad5CMV-p53具有相似的結(jié)構(gòu)，且如Zhang et al.所公開(kāi)的及從Dr.FrankL.Graham(參見(jiàn)Graham，et al.1991)處獲得。
病毒的貯存、效價(jià)和感染。根據(jù)Graham和Prevec(1991)的方法用噬菌斑純化法得到Ad5CMV-p53、Ad5/RSV/GL2和Ad5CMV-Lacz病毒的單一克隆。于293細(xì)胞中增殖單一病毒克隆。收集顯示完全細(xì)胞病變效應(yīng)之293細(xì)胞培養(yǎng)基并于1000×g離心10分鐘。等分收集上清液并作為病毒貯存物貯于-20℃。用噬菌斑測(cè)定法(Graham andPrevec，1991)測(cè)定病毒效價(jià)。通過(guò)將病毒溶液加至細(xì)胞單層中(0.5ml每60mm培養(yǎng)皿)以及室溫溫育30分鐘并且每5分鐘稍加攪拌的過(guò)程進(jìn)行細(xì)胞系感染。然后加入培養(yǎng)基，將受染細(xì)胞放回到37℃溫箱中。
在多種細(xì)胞系如H226Br、H322、H460、Hela、HepG2、LM2和Vero中用Ad5 CMV-LacZ也評(píng)估了重組腺病毒的基因轉(zhuǎn)移效率。用X-gal染色，在以MOI為30PFU/細(xì)胞的Ad5CMV-Lacz感染后，所有細(xì)胞系均有97-100％染成藍(lán)色。
實(shí)施例4于人肺癌細(xì)胞中的Ad5CMV-p53導(dǎo)向的p53基因的表達(dá)本實(shí)施例描述了用重組p53腺病毒感染有純合子p53基因缺失的人肺癌細(xì)胞。結(jié)果表明這些細(xì)胞的生長(zhǎng)和突變體p53的表達(dá)受到抑制，這說(shuō)明將Ad5CMV-p53病毒體作為用于轉(zhuǎn)移細(xì)胞控制的有用物的潛在能力。
在經(jīng)3.8％福爾馬林固定并以溶于甲醇的3％H2O2處理5分鐘的受染細(xì)胞單層上進(jìn)行免疫組化測(cè)定。免疫組化分析是用Vectastain Elite試劑盒(Vector，Burlingame，CA)進(jìn)行的。所用第一抗體為抗-p53抗體PAb1801(Oncogene Science，Manhasset，NY)；MOPC-21(Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)用作陰性對(duì)照。第二抗體為親和素標(biāo)記的抗小鼠IgG(Vector)。用親和素化辣根過(guò)氧化物酶ABC復(fù)合試劑檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物。最后用Harris蘇木精(Sigma)復(fù)染并以Cytoseal60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)上片。
進(jìn)行受染細(xì)胞系的免疫組化分析以檢查由Ad5CMV-p53病毒CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的p53表達(dá)的原位表達(dá)。在H358細(xì)胞系(該細(xì)胞系具有純合子p53缺失)中，當(dāng)用Ad5CMV-p53以30-50噬菌斑形成單位(PFU)/細(xì)胞多重感染細(xì)胞時(shí)，經(jīng)免疫組化分析p53基因轉(zhuǎn)移效率達(dá)97-100％(圖4)。
由Ad5CMV-LacZ(一種攜帶由人CMV IE啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的LacZ基因的病毒)證實(shí)了重組腺病毒的高效轉(zhuǎn)移。以X-gal染色，在MOI為30-50PFU/細(xì)胞下所有受檢細(xì)胞(包括Hela、HepG2、LM2和人NSCLC癌細(xì)胞系)為97-100％β-半乳糖苷酶活性陽(yáng)性。這些結(jié)果表明腺病毒載體是將基因轉(zhuǎn)移入人癌細(xì)胞中的有效載體。
在以磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞后在培養(yǎng)皿中以SDS-PAGE樣品緩沖液(每60mm培養(yǎng)皿0.5ml)裂解單層細(xì)胞，這樣制備出全細(xì)胞裂解液，對(duì)其進(jìn)行Western印跡分析。為進(jìn)行SDS-PAGE分析，每道載有相當(dāng)于5×104細(xì)胞(10-15ml)的細(xì)胞裂解物。將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至HybondrTM-ECL膜(Amersham，Arlington Heights，IL)上。以溶于PBS中0.5％干燥奶斷薄膜且以第一抗體探查小鼠抗人p53單克隆抗體PAb1801和小鼠抗人β-肌動(dòng)蛋白單克隆抗體(Amersham)，沖洗并以第二抗體探查辣根過(guò)氧化物酶連接的兔抗小鼠IgG(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)。根據(jù)Amersham的增強(qiáng)化學(xué)熒光法使膜顯影。用光密度計(jì)(Mokcular DynamicsInc.，Sunnyvale，CA)測(cè)定表達(dá)的外源p53的相對(duì)量。
Western印跡顯示，外源p53蛋白表達(dá)水平高(圖5A、2、3道和5、6道)。感染后第3天蛋白量達(dá)到高峰(圖6，插入段，0.5天-3天)。作為對(duì)照，構(gòu)建與實(shí)施例1的重組Ad5CMV-p53結(jié)構(gòu)相似的病毒體。該病毒體含有由存在于病毒表達(dá)盒中的Rous肉瘤病毒LTR啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶cDNA。在由病毒體Ad5/RSV/GL2感染的細(xì)胞中既未發(fā)現(xiàn)p53表達(dá)也無(wú)肌動(dòng)蛋白表達(dá)的改變。
用重組p53腺病毒感染3種人肺NSCLC細(xì)胞系細(xì)胞系H358(它具有純合子p53基因缺失)、細(xì)胞系H322(它具有在密碼子248處p53基因的點(diǎn)突變(G至T))和細(xì)胞系H460(它具有野生型p53基因)。在病毒感染前，將H322和H460(1×105)或H358(2×105)接種于60mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24小時(shí)，然后測(cè)定人NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)率。用病毒以感染的多重性(MOI)為10PFU/細(xì)胞感染的細(xì)胞。培養(yǎng)基用作模擬感染對(duì)照。對(duì)經(jīng)不同處理的每種細(xì)胞系的三組培養(yǎng)物于感染后第1-6天每天計(jì)數(shù)。
相比于未感染細(xì)胞或用對(duì)照病毒體感染的細(xì)胞，以Ad5CMV-p53感染的H358細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制(圖7A)。H322細(xì)胞的生長(zhǎng)也被p53病毒體顯著抑制(圖7B)，而含野生型p53的人肺癌H460細(xì)胞的生長(zhǎng)受影響程度較小(圖7C)。Ad5CMV-p53病毒感染H358細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制79％，而未感染細(xì)胞或以對(duì)照病毒感染的細(xì)胞的生長(zhǎng)未受抑制。H322細(xì)胞系(它具有p53的點(diǎn)突變)的生長(zhǎng)被Ad5CMV-p53抑制72％，而含野生型p53的H460細(xì)胞系的生長(zhǎng)受影響較小(28％抑制)。
結(jié)果顯示p53重組腺病毒具有抑制腫瘤性質(zhì)，它是通過(guò)在腫瘤細(xì)胞中恢復(fù)p53蛋白功能實(shí)現(xiàn)其作用的。
實(shí)施例5Ad5CMV-p53對(duì)p53缺失細(xì)胞的治療本實(shí)施例涉及用重組p53腺病毒在體外重建對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制并因此用于治療細(xì)胞的惡性或轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)。本實(shí)施例描述了某些方式，以這些方式本發(fā)明可預(yù)期用于通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的基因療法治療癌癥。
以MOI10PFU/細(xì)胞用Ad5CMV-p53和Ad5/RSV/GL2感染H358細(xì)胞。以培養(yǎng)基作為模擬感染處理等量的細(xì)胞。感染后24小時(shí)，收獲經(jīng)處理的細(xì)胞并以PBS沖洗兩次。對(duì)于每種處理，將3百萬(wàn)(3×106)細(xì)胞(體積為0.1ml)皮下注射至每只裸鼠(Harlan，Co.，Houston，TX)。每種處理用5只小鼠。注射前對(duì)小鼠進(jìn)行放射(300cGy，60Co)，注射后每周檢查。于6周末評(píng)估腫瘤形成情況并計(jì)算腫瘤體積，其方法是假設(shè)腫瘤為一球體，以其十字交叉的直徑乘積之平方根作為腫瘤的平均直徑計(jì)算。
為測(cè)定Ad5CMV-p53介導(dǎo)的對(duì)腫瘤生成的抑制作用，以H358細(xì)胞(人NSCLC型細(xì)胞)對(duì)裸鼠皮下注射致使致癌生長(zhǎng)。將已用Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2以10PFU/細(xì)胞感染24小時(shí)的細(xì)胞對(duì)每只小鼠注射一次。只用培養(yǎng)基處理的H358細(xì)胞用作模擬感染的對(duì)照。于注射后第14天首先可能知的腫瘤僅由模擬或?qū)φ詹《靖腥炯?xì)胞引起，如表I所示
表IAd5CMV-p53對(duì)裸鼠中H358腫瘤生長(zhǎng)性的作用a
a以2×106細(xì)胞/小鼠的量將經(jīng)處理的H358細(xì)胞皮下注射6周末測(cè)定腫瘤的大小。
如表I所示，接受Ad5CMV-p53處理細(xì)胞的小鼠未發(fā)生腫瘤。6周末腫瘤的直徑為4-10mm。該研究開(kāi)始時(shí)每組5只小鼠；在Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2組的各組中均有一只未完成實(shí)驗(yàn)。早期的死亡被認(rèn)為是院內(nèi)感染引起的。
實(shí)施例6Ad5CMV-p53對(duì)肺癌的治療本實(shí)施例涉及用重組p53腺病毒體內(nèi)重建對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用并因此用于治療動(dòng)物的癌癥。本實(shí)施例描述了某些方式，以這些方式本發(fā)明可預(yù)期用于通過(guò)腺病毒介導(dǎo)的基因療法治療癌癥。
在常位人肺癌小鼠模型中進(jìn)一步評(píng)價(jià)Ad5CMV-p53抑制腫瘤生長(zhǎng)性的效力。由于H358和H322細(xì)胞在該模型中不能產(chǎn)生腫瘤，故用H226Br細(xì)胞系。該細(xì)胞系起源于鱗狀肺癌并從肺轉(zhuǎn)移至腦。H226Br在p53基因的外顯子7(密碼子254)處有點(diǎn)突變(ATC變成GTC)，且在小鼠中具有腫瘤生長(zhǎng)性。
以前已描述了在常位人肺癌小鼠模型中進(jìn)行試驗(yàn)的步驟(Georges，et al.，1993)。簡(jiǎn)而言之，通過(guò)氣管內(nèi)滴注，將H226Br細(xì)胞接種至已經(jīng)放射照射處理(300cGy，60Co)的裸鼠上。每只小鼠接受含2×106細(xì)胞的0.1ml PBS。接種三天后，通過(guò)氣管內(nèi)滴注0.1ml病毒或載體(PBS)(一天一次，共兩天)處理每組10只小鼠。所用病毒劑量為每只小鼠5×107Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2。6周末無(wú)痛苦處死小鼠。通過(guò)分解肺及縱膈組織并測(cè)量腫瘤的大小來(lái)評(píng)估腫瘤的形成。通過(guò)腫瘤塊部分的組織學(xué)分析證實(shí)了腫瘤。
用氣管內(nèi)滴注的形式以2×106H226Br細(xì)胞/鼠的量給經(jīng)照射處理的裸鼠接種。接種三天后，通過(guò)氣管內(nèi)滴注0.1ml Ad5CMV-p53或Ad5/RSV/GL2或載體(PBS)(一天一次，共2天)處理每只小鼠(每組8～10只小鼠)。所用病毒劑量為5×107PFU/小鼠。通過(guò)分解肺及縱膈組織并測(cè)量腫瘤的大小來(lái)評(píng)估腫瘤的形成。此過(guò)程的流程圖示于圖7中，分解的有代表性的樣本示于圖8中。以組織學(xué)分析證實(shí)所測(cè)的腫瘤。腫瘤測(cè)量之?dāng)?shù)據(jù)總結(jié)于表II中表IIAd5CMV-p53對(duì)常位人肺癌小鼠模型中H226Br腫瘤生長(zhǎng)性的作用a
a.氣管內(nèi)給小鼠接種2×106H226Br細(xì)胞/小鼠。接種后第3天，氣管內(nèi)給小鼠施用載體或病毒(每只0.1ml，5×107)，一天一次共兩天。6周末評(píng)估腫瘤形成。b.P＜0.05，與接受載體PBS或病毒對(duì)照相比時(shí)變異的雙向(two-way)分析。
僅有25％的Ad5CMV-p53處理的小鼠生成腫瘤，而在載體或Ad5/RSV/GL2對(duì)照組中，70-80％的受處理小鼠生成腫瘤。Ad5CMV-p53組的腫瘤平均大小顯著小于對(duì)照組腫瘤。這些結(jié)果表明，在常位人肺癌小鼠模型中Ad5CMV-p53可阻止H226Br形成腫瘤。
實(shí)施例7p53與DNA損傷間的協(xié)同編程性細(xì)胞死亡(程序化細(xì)胞死亡)的生化特征顯示由于核DNA裂解的DNA斷裂之特征形式。近期的研究已顯示由化療藥物或離子化放射引起的編程性細(xì)胞死亡可能與p53基因的狀態(tài)有關(guān)，而且DNA損傷刺激因素可以升高處于編程性細(xì)胞死亡過(guò)程中的細(xì)胞的胞內(nèi)p53蛋白水平(Lowe，et al.，1993，Clarke，et al.，1993，F(xiàn)ritsche，et al.，1993，Harper，etal.，1993，El-Deiry，et al.，1993)。由野生型p53(wt-p53)蛋白水平的增加導(dǎo)致的細(xì)胞周期于G1期的抑制可使DNA修復(fù)有更多的時(shí)間；如不可能達(dá)到理想的修復(fù)，p53可激發(fā)程序化細(xì)胞死亡。因此，p53可以對(duì)由化療劑引起的編程性腫瘤細(xì)胞死亡作出貢獻(xiàn)。
由錯(cuò)義突變或缺失引起的p53基因失活是人類癌癥患者最常見(jiàn)的遺傳改變(Levine，et al.，1991，Hollstein，et al.，1991)。已有報(bào)導(dǎo)p53功能喪失增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的抗性(Lowe，et al.，1993)。發(fā)明者的研究顯示其p53兩等位基因均缺失的人非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)H358細(xì)胞對(duì)化療藥物有抗性，而有內(nèi)源性wt-p53的WTH 226b細(xì)胞系容易地顯示以順鉑(CDDP)和依托泊甙(VP-16)治療16小時(shí)后的程序化細(xì)胞死亡(T.Fujiwara，E.A.Grimm，T.Mukhopadhyay，J.A.Roth，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。因此，發(fā)明者試圖測(cè)定以腺病毒載體將wt-p53基因?qū)際358是否可以增強(qiáng)細(xì)胞體外和體內(nèi)對(duì)DNA交聯(lián)劑CDDP的敏感性。材料與方法H358細(xì)胞由A.Gazdar和J.Minna友好地提供(Takahashi，etal.，1989)。腺病毒載體以前報(bào)導(dǎo)了含編碼人wt-p53(Ad-p53)或熒光素酶(Ad-Luc)的cDNA之重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定(Zhang，et al.，1993)。簡(jiǎn)而言之，將含人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、wt-p53 cDNA和SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)的p53表達(dá)盒插至pXCJ L.1的XbaI和ClaI位點(diǎn)之間。以脂質(zhì)體介導(dǎo)技術(shù)將p53穿梭載體和重組質(zhì)粒pJM17共轉(zhuǎn)染入293細(xì)胞(Ad5轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系)。收集顯示完整的細(xì)胞病變效應(yīng)之293細(xì)胞培養(yǎng)上清液并用于隨后的感染。以相似方法生產(chǎn)對(duì)照Ad-Luc病毒。于293細(xì)胞中增殖Ad-p53和Ad-Luc病毒。以Hela細(xì)胞檢測(cè)排除可復(fù)制病毒的存在。用噬菌斑檢測(cè)法測(cè)定病毒滴度(Graham，etal.，1991)。核小體DNA斷裂的檢測(cè)通過(guò)在裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS和50μg/ml蛋白酶K)中于55℃溫育6小時(shí)，從接受或不接受CDDP處理的親本、Ad-Luc感染以及Ad-p53感染細(xì)胞中分離DNA。以等量體積的苯酚提取DNA兩次，以氯仿-異戊醇(24∶1)提取一次，然后在乙醇中沉淀。在1.5％瓊脂糖凝膠上對(duì)樣品電泳，并用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色識(shí)別。
根據(jù)以前報(bào)告的方法(Gavrieli，et al.，1992)進(jìn)行TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記。以0.01％NP-40處理單層細(xì)胞。玻片浸入TdT緩沖液(30mM Tris-HCl，pH7.2；140mM卡可酸鈉；1mM氯化鈷)中并與生物素化dUTP(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)和TdT于37℃溫育45分鐘。玻片覆以2％牛血清白蛋白10分鐘且與親和素-生物素復(fù)合物(Vectastain Elite Kit；Vector Laboratories，Burlingame，CA)溫育30分鐘。用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行比色檢測(cè)。結(jié)果用人wt-p53 cDNA通過(guò)暴露給Ad-p53體外轉(zhuǎn)導(dǎo)H358細(xì)胞。Western印跡顯示早在用Ad-p53感染24小時(shí)后即有高水平的wt-p53蛋白表達(dá)，但在親本(未感染)細(xì)胞或Ad-LUC感染的對(duì)照細(xì)胞中未測(cè)出wt-p53(數(shù)據(jù)未顯示)。同時(shí)進(jìn)行的免疫組化評(píng)價(jià)顯示，在80％以上的受染細(xì)胞中可檢測(cè)到wt-p53蛋白質(zhì)，這表明由Ad-p53的p53轉(zhuǎn)移和表達(dá)具有高效(數(shù)據(jù)未顯示)。
持續(xù)將Ad-p53受染H358細(xì)胞暴露給CDDP很快減小了其活力，而親本及Ad-Luc受染細(xì)胞的顯著細(xì)胞死亡僅發(fā)生于暴露給CDDP72小時(shí)后(圖10A)。以Ad-p53轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中活性的喪失極大地增強(qiáng)。而且，即使當(dāng)細(xì)胞在暴露24小時(shí)后維持在無(wú)藥的培養(yǎng)基中時(shí)，也可觀察到活性的降低，這提示在24小時(shí)內(nèi)可產(chǎn)生致死性的損傷(圖10B)。wt-p53轉(zhuǎn)錄的H358細(xì)胞對(duì)CDDP的敏感性有劑量依賴性(圖10C)。
在暴露于CDDP24小時(shí)后表達(dá)wt-p53的細(xì)胞中明顯看到表明DNA斷裂的核小體間DNA梯；而親本及Ad-Luc受染細(xì)胞未顯示出DNA斷裂(圖11A)。檢測(cè)原位程序化細(xì)胞死亡之DNA斷裂特征的終末脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)的2′-脫氧尿苷-5′-三磷酸(dUTP)-生物素缺口末端標(biāo)記顯示在以CDDP處理24小時(shí)的Ad-p53受染細(xì)胞中的許多程序化死亡細(xì)胞，如圖11G所示，它顯示了未出現(xiàn)于圖11B-F中的染成黑色的核及核片段。
已知wt-p53的導(dǎo)入會(huì)導(dǎo)致某些含缺失或突變p53的腫瘤細(xì)胞系中的程序化細(xì)胞死亡(Yonish-Rovach，et al.，1991，Shaw，et al，1992，Ramqvist，et al.，1993)。然而，單一的wt-p53的過(guò)度表達(dá)不能促進(jìn)p53陰性H358細(xì)胞系中的DNA斷裂(圖11)，盡管Ad-p53抑制了其生長(zhǎng)(圖10)。這與發(fā)明者以前的表明在逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的wt-p53轉(zhuǎn)移后可得到穩(wěn)定的H358克隆及這些克隆比親本細(xì)胞生長(zhǎng)更慢的觀察結(jié)果(Cai，et al.，1993)相符。
以H358球形體體積的相對(duì)變化為指標(biāo)評(píng)價(jià)將Ad-p53和CDDP聯(lián)合應(yīng)用的潛在治療效果。多細(xì)胞腫瘤球體模型在體外顯示出與原發(fā)性腫瘤和微小轉(zhuǎn)移瘤相似的結(jié)構(gòu)。以CDDP治療可使Ad-p53受染H358球形體相對(duì)體積減小，但對(duì)親本或Ad-Luc受染球形體無(wú)顯著作用(圖12A)。原位TdT介導(dǎo)的dUTP標(biāo)記顯示在Ad-p53受染球形體表面有許多細(xì)胞處于程序化細(xì)胞死亡過(guò)程中，而在未被Ad-p53感染的球形體上未看見(jiàn)程序化死亡的細(xì)胞(圖12B-E)。發(fā)明者以前報(bào)告過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的wt-p53表達(dá)抑制了通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)導(dǎo)致的H322a球形體的生長(zhǎng)(Fujiwara，et al.，1993)。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不能感染H358球形體，因?yàn)檫@些球形體中的細(xì)胞對(duì)外源TGF-α不能產(chǎn)生快速增殖。暴露于CDDP通過(guò)誘導(dǎo)表面的程序化細(xì)胞死亡能減小Ad-p53受染H358球形體的大小，這一發(fā)現(xiàn)提示，Ad-p53感染非增殖細(xì)胞且CDDP啟動(dòng)了靜態(tài)細(xì)胞的程序化死亡過(guò)程。
實(shí)施例8治療方案中p53和DNA損傷劑的應(yīng)用如本文下文及實(shí)施例5、6和7所描述，已用一種動(dòng)物模型作為臨床前試驗(yàn)的一部分。對(duì)已建立符合腺病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移治療適應(yīng)癥的病人檢測(cè)其抗腺病毒抗體的存在。如果抗體存在且該病人有對(duì)藥物或天然物質(zhì)過(guò)敏史，則提示可在嚴(yán)密的臨床觀察下以大約103至106的試驗(yàn)劑量應(yīng)用重組腺病毒。
為了用Ad5CMV-p53對(duì)瘤癥進(jìn)行治療，應(yīng)根據(jù)可被美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)接受的可對(duì)人體進(jìn)行施用的方法制備和純化在適宜啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件如CMV啟動(dòng)子調(diào)控之下表達(dá)p53的重組腺病毒。這些方法包括但不限于氯化銫密度梯度離心，接著測(cè)試效力及純度。
有2種方法被認(rèn)為是適于進(jìn)行p53腺病毒治療方法的，一是直接或局部施用，另一種是全身應(yīng)用。本方法適于治療任何已知與p53突變相聯(lián)系的不同的癌癥。至于全身施用，已顯示簡(jiǎn)單的腺病毒靜脈注射足以引起遠(yuǎn)離注射部位處組織的病毒感染(Stratford-Perricaudet et al.，1991b)，因而它適于所有p53相關(guān)惡性病的治療?？梢砸匀魏嗡幚韺W(xué)可接受的溶液靜脈注射或于一段時(shí)間內(nèi)滴注的方法給病人施用病毒。總的來(lái)說(shuō)，據(jù)信施用的功能病毒顆粒的有效量從1×1010至5×1012。
特別是考慮到腫瘤，如果愿意，可以以類似于氣管內(nèi)應(yīng)用囊性纖維化透膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白的方式更直接進(jìn)行重組腺病毒的物理?yè)舭?Rosenfeld et al.，1992)。這將會(huì)使重組p53腺病毒輸送到最接近靶細(xì)胞的部位。方法原位以TdT進(jìn)行dUTP標(biāo)記以檢測(cè)程序化細(xì)胞死亡。第三天固定H358球形體并如實(shí)施例7所描述染色。簡(jiǎn)言之，將標(biāo)記的TdT探針接觸浸入TdT緩沖液中的載玻片且于37℃與生物素化dUTP和TdT溫育45分鐘。以2％牛血清白蛋白覆涂玻片10分鐘并與親和素-生物素復(fù)合物溫育30分鐘。用二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行比色檢測(cè)。
體內(nèi)Ad-p53感染后由CDDP導(dǎo)致的程序化細(xì)胞死亡。將溶于0.1ml Hank′s平衡鹽溶液中的H358細(xì)胞(5×106)皮下注射至BALB/c雌性nu/nu小鼠的右脅側(cè)。30天后，將200μl培養(yǎng)基或者含Ad-Luc(108PFU/ml)或Ad-p53(108pFU/ml)的培養(yǎng)基注射到5-6mm直徑的腫瘤中。在兩個(gè)相反的位點(diǎn)進(jìn)行瘤內(nèi)(100μl)和瘤周(每側(cè)50μl)注射。腹膜內(nèi)給予CDDP(3mg/kg)或?qū)φ丈睇}液。(A)腫瘤體積改變。在不知道治療組的情況下用測(cè)徑器以兩個(gè)互相垂直的方向測(cè)量腫瘤的直徑，并且假設(shè)腫瘤為一球形體，以交叉垂直測(cè)量的直徑之積的平方根作為平均直徑計(jì)算腫瘤體積。每治療組用5只小鼠，均值+/-SE如所示。用Student t-檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。箭頭表示治療日。兩次獨(dú)立的檢測(cè)如所示。檢測(cè)1中自第5天p＜0.05；檢測(cè)2中自第7天p＜0.05。
用TdT介導(dǎo)的生物素-dUTP標(biāo)記技術(shù)的組織學(xué)研究。治療開(kāi)始5天后收獲腫瘤并立即浸入O.C.T.化合物中。以5μm厚度于低溫恒溫器中對(duì)冷凍組織進(jìn)行切片。切片用1μg/ml蛋白酶K處理并如上文所述染色。對(duì)動(dòng)物所做的處理符合UT M.D.Anderson Institutional Animal Careand Use Committee的要求。結(jié)果為顯示聯(lián)合應(yīng)用基因替換療法和化療治療人類癌癥的方法之體內(nèi)效果及組合物的效力，發(fā)明人檢測(cè)了順序施周Ad-p53和CDDP是否可在體內(nèi)產(chǎn)生程序化細(xì)胞死亡。在3天直接腫瘤內(nèi)注射Ad-p53或腹膜內(nèi)施用CDDP后，皮下植入于nu/nu小鼠的H358腫瘤顯示輕度生長(zhǎng)減緩。然而，如果同時(shí)施用Ad-p53和CDDP，腫瘤部分復(fù)歸且腫瘤大小仍然統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著小于其他任何治療組腫瘤。經(jīng)過(guò)兩個(gè)治療周期，生長(zhǎng)抑制作用更為顯著(圖13A)。組織學(xué)檢查顯示在以CDDP治療小鼠的Ad-p53注射部位腫瘤細(xì)胞大量破壞。原位染色表明在非細(xì)胞區(qū)域周圍有大量程序化死亡細(xì)胞(圖13B-E)。相反，單獨(dú)以CDDP或Ad-p53治療的腫瘤既無(wú)非細(xì)胞構(gòu)成，也無(wú)程序化細(xì)胞死亡區(qū)域。
更詳盡地說(shuō)，可按下述程序開(kāi)發(fā)優(yōu)選的治療方案。病人首先進(jìn)行支氣管鏡檢查以評(píng)價(jià)阻塞程度。在內(nèi)窺鏡下盡可能地切除腫瘤。較好地是病人在局部或全身麻醉下進(jìn)行支氣管鏡檢查。從支氣管鏡活檢通道穿過(guò)StifcorTM透支氣管穿刺針(21g)。然后用小體積如約10ml或更少的p53腺病毒注射至殘留腫瘤部位。
在任何情況下，由于所用腺病毒不能復(fù)制，因此估計(jì)病毒本身對(duì)受試者健康不會(huì)有損害作用。然而，在治療期間病人仍應(yīng)住院至少48小時(shí)以監(jiān)測(cè)急性或延遲的不良反應(yīng)。過(guò)去已強(qiáng)調(diào)了對(duì)作為人用基因轉(zhuǎn)移載體的復(fù)制缺陷腺病毒之應(yīng)用的安全性方面的關(guān)注(Rosenfeld et al.，1992；Jaffe et al.，1992)，但應(yīng)適宜地監(jiān)測(cè)施用的腺病毒的劑量以進(jìn)一步減少不希望有的副作用的機(jī)會(huì)。
人們應(yīng)考慮提出反應(yīng)需求存在或毒性存在的標(biāo)準(zhǔn)有多種。為幫助測(cè)定毒性的存在，在進(jìn)行治療前應(yīng)對(duì)腫瘤床拍照。將測(cè)量其最長(zhǎng)直徑和與之垂直之直徑。以這些數(shù)據(jù)可以計(jì)算出腫瘤重新生長(zhǎng)的速度。
進(jìn)行性的時(shí)間也可從第一次觀察到腫瘤體積的減小至有進(jìn)行性疾病的證據(jù)時(shí)。進(jìn)行性疾病定義為所測(cè)病變直徑的乘積相加增加≥25％。在確定進(jìn)行性之前病人必須至少接受2個(gè)療程。以進(jìn)入本方案的病人數(shù)計(jì)算存活率。
隨訪檢查應(yīng)包括所有進(jìn)行癌癥治療的常規(guī)檢查，包括監(jiān)測(cè)臨床體征以及取活檢用以評(píng)價(jià)不同p53基因表達(dá)情況的標(biāo)準(zhǔn)及分子生物學(xué)分析。這也可提供已攝取轉(zhuǎn)移的基因之細(xì)胞數(shù)以及體內(nèi)相對(duì)啟動(dòng)子強(qiáng)度的信息。基于所獲數(shù)據(jù)，即可對(duì)治療進(jìn)行調(diào)整。這些調(diào)整可包括用不同啟動(dòng)子的腺病毒構(gòu)建體或注射pfu數(shù)的改變以保證更多或所有的腫瘤細(xì)胞感染無(wú)重組基因的非生理性過(guò)度表達(dá)。
可以設(shè)想由腺病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)移外源基因的表達(dá)可以在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)延續(xù)。病毒轉(zhuǎn)移外源基因的治療有效的長(zhǎng)期表達(dá)應(yīng)隨個(gè)例不同而不同。標(biāo)志基因受限于評(píng)價(jià)基因表達(dá)的治療相關(guān)持續(xù)方面，因?yàn)閷?duì)任何所給的遺傳疾病有改善作用所需的表達(dá)水平可與完全治愈另一種疾病所需的水平有很大差別。
本發(fā)明的組合物及方法已在優(yōu)選實(shí)施方案中進(jìn)行了描述，但很明顯對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以對(duì)組合物、方法和本文所述方法的步驟或步驟的順序上作某些變化而不離開(kāi)本發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體地說(shuō)，很明顯某些化學(xué)或生理學(xué)上相關(guān)的試劑可以替代本文所述的試劑而得到相同或相似的結(jié)果。所有對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯相似替代和修改均被認(rèn)為在如所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明之精神、范圍和構(gòu)思內(nèi)。所要求的所有物質(zhì)和方法均可在無(wú)不適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件下制得及進(jìn)行。
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序列表(1)一般情況(i)申請(qǐng)人姓名BOARD OF REGENTS，THE UNIVERSITY OFTEXAS SYSTEM街201West 7th Street城市Austin州Texas國(guó)家United States of America郵編78701電話(512)499-4462傳真(512)499-4523(ii)發(fā)明人ROTH，Jack A.
FUJIWARA，ToshiyoshiGRIMM，Elizabeth A.
MUKHOPADHYAY，TapasZHANG，Wei-WeiandOWEN-SCHAUB，Laurie B.
(iii)發(fā)明名稱含DNA損傷劑和p53的方法和組合物(iv)序列數(shù)目4(v)通訊地址(A)地址ARNOLD，WHITE&DURKEE(B)街道P.O.BOX4433(C)城市HOUSTON(D)州TEXAS
(E)國(guó)家USA(F)郵編77210(vi)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒質(zhì)類型軟盤/ASCII(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件WORDPERFECT5.1(vii)現(xiàn)有申請(qǐng)數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)栁粗?B)申請(qǐng)CONCURRENTLY HEREWITH(C)分類未知(viii)優(yōu)先申請(qǐng)日(A)申請(qǐng)?zhí)朥SSN08/233,002(B)申請(qǐng)日25APRIL1994(C)分類未知(ix)律師/機(jī)構(gòu)信息(A)姓名HIGHLANDER，STEVEN L.
(B)注冊(cè)號(hào)37，642(C)參考/備案號(hào)UTFC403PCT(x)通訊信息(A)電話(512)418-3000(B)傳真(713)789-2679(C)用戶電報(bào)79-0924(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈
(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)序列描述SEQ ID NO1GGCCCACCC CCTTGGCTTC 20(2)SEQ ID NO2的信息(iii)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(iv)序列描述SEQ ID NO2TTGTAACCAT TATAAGCTGC 20(2)SEQ ID NO3的信息(v)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(vi)序列描述SEQ ID NO3TCGTTTCTCA GCAGCTGTTG 20(2)SEQ ID NO4的信息(vii)序列特征(A)長(zhǎng)度20堿基對(duì)
(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(viii)序列描述SEQ ID NO4CATCTGAACT CAAAGCGTGG 20
權(quán)利要求
1.一種殺細(xì)胞方法，包括將細(xì)胞與能殺死所述細(xì)胞之結(jié)合量的p53蛋白或基因和DNA損傷劑接觸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與p53蛋白或基因和X射線、紫外射線、γ射線、微波、阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、喜樹(shù)堿、放線菌素D、絲裂霉素C或順鉑接觸。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)胞與p53蛋白或基因和順鉑接觸。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與在所述細(xì)胞中表達(dá)p53蛋白的重組載體和DNA損傷劑接觸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述表達(dá)p53的重組載體是裸DNA質(zhì)粒、脂質(zhì)體中的質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、AAV載體或重組腺病毒載體。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述表達(dá)p53的重組載體是重組腺病毒載體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述表達(dá)p53的重組載體是含有位于巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子控制之下的p53表達(dá)區(qū)的重組腺病毒載體。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述重組腺病毒載體含有p53表達(dá)區(qū)、巨細(xì)胞病毒IE啟動(dòng)子和SV40早期聚腺苷酸化信號(hào)。
9.權(quán)利要求6的方法，其中至少一個(gè)腺病毒復(fù)制所必需的基因從所述腺病毒載體構(gòu)建體中缺失，并p53表達(dá)區(qū)被導(dǎo)入其位置上。
10.權(quán)利要求9的方法，其中腺病毒載體的E1A和E1B區(qū)缺失，而在其位置上導(dǎo)入p53表達(dá)區(qū)。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述重組腺病毒載體存在于重組的腺病毒內(nèi)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞首先與p53蛋白或基因接觸，繼而再與DNA損傷劑接觸。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞首先與DNA損傷劑接觸，繼而再與p53蛋白或基因接觸。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞同時(shí)與p53蛋白或基因和DNA損傷劑接觸。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與含有p53蛋白或基因的第一組合物和含有DNA損傷劑的第二組合物接觸。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述第一或第二組合物分散于藥物學(xué)上可接受的配方中。
17.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞與含有p53蛋白或基因和DNA損傷劑的單一組合物相接觸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述組合物分散在藥物學(xué)上可接受的配方中。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞與含有能在所述細(xì)胞中表達(dá)p53的重組載體和DNA損傷劑的單一組合物相接觸。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述細(xì)胞與含有包括了能在所述細(xì)胞中表達(dá)p53之重組載體的重組腺病毒和DNA損傷劑的單一組合物相接觸。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是人細(xì)胞。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是惡性腫瘤細(xì)胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞是肺癌細(xì)胞。
24.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞是乳癌細(xì)胞。
25.權(quán)利要求22的方法，其中所述細(xì)胞在p53基因有突變。
26.權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞，所述p53蛋白或基因和DNA損傷劑以藥物學(xué)上可接受的形式施用于動(dòng)物。
27.一種治療癌癥的方法，包括給癌癥動(dòng)物施用治療有效組合的p53蛋白或基因和DNA損傷劑。
28.權(quán)利要求27的方法，包括將治療有效量的藥物組合物注射到腫瘤部位，并將所述腫瘤與DNA損傷劑接觸，其中的組合物含有包括能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)p53的重組載體的重組腺病毒。
29.權(quán)利要求28的方法，其中的腫瘤通過(guò)用X射線、紫外射線、γ射線或微波照射腫瘤部位而與DNA損傷劑接觸。
30.權(quán)利要求28的方法，其中的腫瘤是通過(guò)給動(dòng)物施用治療有效量的含DNA損傷化合物的藥物組合物而與DNA損傷劑接觸。
31.權(quán)利要求28的方法，其中的DNA損傷劑是順鉑。
32.含p53蛋白或基因和DNA損傷劑的組合物。
33.權(quán)利要求32的組合物，含有p53蛋白或基因和阿霉素、5-氟尿嘧啶、依托泊甙、喜樹(shù)堿、放線菌素D、絲裂霉素C或順鉑。
34.權(quán)利要求33的組合物，含有p53蛋白或基因和順鉑。
35.權(quán)利要求32的組合物，含有能在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p53蛋白的重組載體和DNA損傷劑。
36.權(quán)利要求35的組合物，其中所述重組載體是裸DNA質(zhì)粒、脂質(zhì)體中的質(zhì)粒、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、AAV載體或重組的腺病毒載體。
37.權(quán)利要求36的組合物，其中所述重組載體是重組腺病毒載體。
38.權(quán)利要求37的組合物，其中所述重組載體是存在于重組腺病毒顆粒中的重組腺病毒載體。
39.權(quán)利要求32的組合物，含有存在于重組腺病毒顆粒中的重組腺病毒載體和順鉑。
40.權(quán)利要求32的組合物，分散于藥物學(xué)上可接受的配方中。
41.權(quán)利要求40的組合物，配制成損害部位內(nèi)施用。
42.一種治療試劑盒，在適當(dāng)?shù)娜萜鞴ぞ咧泻心茉趧?dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p53蛋白的重組載體的藥物配方和DNA損傷劑的藥物配方。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述重組載體和所述DNA損傷劑存在于單一容器工具內(nèi)。
44.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述重組載體和所述DNA損傷劑存在于不同的容器工具內(nèi)。
45.權(quán)利要求42的試劑盒，含有包括能在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p53蛋白的重組載體的重組腺病毒的藥物配方和順鉑的藥物配方。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤抑制基團(tuán)和DNA損傷劑或因子在用于殺細(xì)胞，尤其是殺癌細(xì)胞中的應(yīng)用。腫瘤抑制基團(tuán)p53通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)的體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移和化療劑傳遞。被處理的細(xì)胞進(jìn)行有特異性DNA斷裂的編程性細(xì)胞死亡。將p53-腺病毒構(gòu)建體經(jīng)皮下直接注射到腫瘤中，然后經(jīng)腹膜內(nèi)施用DNA損傷劑順鉑，誘導(dǎo)大量的腫瘤編程性細(xì)胞死亡性破壞。本發(fā)明還提供了利用復(fù)制缺陷的野生型p53腺病毒和用于治療人類癌癥的DNA損傷藥物相結(jié)合的基因替代方案的臨床應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/47GK1147768SQ9519277
公開(kāi)日1997年4月16日 申請(qǐng)日期1995年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月25日
發(fā)明者J·A·羅斯, T·?；呃? E·A·格里姆, T·穆克霍帕德亞, W·W·張, L·B·奧溫沙布 申請(qǐng)人:德克薩斯州立大學(xué)董事會(huì)