專利名稱：：二核苷-5'，5'-焦磷酸酯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯其中符號(hào)A和B各自獨(dú)立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′二-脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)；符號(hào)X各自獨(dú)立地代表氧或硫；符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或從1至10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的堿的加成鹽。本發(fā)明還包括制備式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的方法，將它們包藏在生物載體特別是紅細(xì)胞中從而將上述化合物導(dǎo)向特定部位或參與病理學(xué)疾病如腫瘤或病毒感染的發(fā)展或引起這些疾病如腫瘤或病毒感染的細(xì)胞群的方法，以及含有包藏式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的所述生物載體，特別是紅細(xì)胞的組合物。包藏生物活性分子的紅細(xì)胞膜化學(xué)修飾是一種向靶細(xì)胞傳遞生理活性形式的被包藏分子的有利方法。參見，例如-DeFloraA.etal.“作為載體和生物反應(yīng)器的工程化紅細(xì)胞”，免疫學(xué)年，Basel，Karger，(1993)，第7卷，168-174。-TonettiM.等人，“負(fù)載阿霉素的自體紅細(xì)胞的肝導(dǎo)向”歐洲癌癥研究雜志，(1991)，第27卷，No.7,947-948。-ZocchiE.等人，“作為釋放抗贅生物藥物5-氟-2’-脫氧尿苷的人和鼠源紅細(xì)胞”，生物科學(xué)進(jìn)展，(1991)，第8卷，Pergamon出版社plc.51-57。-DeFloraA.等人，“被囊性5-氟-2’-脫氧尿苷-5’-單磷酸在人體紅細(xì)胞中向抗贅生物藥物5-氟-2’-脫氧尿苷的轉(zhuǎn)化”。美國(guó)國(guó)家學(xué)術(shù)科學(xué)匯編，(1988)，第85卷，3145-3149。-DeFloraA.等人，“載體紅細(xì)胞技術(shù)一種用于診斷和治療的多用途工具”，診斷學(xué)中的生物技術(shù)，Elsevier科學(xué)出版社B.V.，(1985)，223-236。上述文章和出版物引用了本領(lǐng)域中進(jìn)一步的文獻(xiàn)。下列專利文獻(xiàn)也公開了將生物活性物質(zhì)，特別是磷酸化化合物包藏在轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞中的方法和適于其用途的組合物，以及誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生的細(xì)胞，尤其是紅細(xì)胞選擇性地挑出其它細(xì)胞并與之融合的方法國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)92/22306，美國(guó)專利號(hào)4,931,276，美國(guó)專利號(hào)4,652,449以及歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)298280。在本說明書和權(quán)利要求書中，“非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)”一詞是指通過除去戊糖基團(tuán)中5′位置上的羥基從非天然存在的核苷衍生的基團(tuán)?！胺?hào)X各自獨(dú)立地代表氧或硫”一語(yǔ)是指每個(gè)符號(hào)X可以代表氧或硫原子，而與其它假設(shè)的含義無(wú)關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所有符號(hào)X代表氧或者其中只有一或兩個(gè)代表硫而其它代表氧。在后一種情況下，最優(yōu)選的式(I)化合物是其中代表硫的符號(hào)X通過雙鍵與磷原子直接相連或者是基團(tuán)XR或(和)XR1的一部分的那些化合物。術(shù)語(yǔ)“生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子”是指適用于藥學(xué)實(shí)際的陽(yáng)離子并且包括那些對(duì)式(I)化合物的生物載體無(wú)毒并適合于將其包藏到所述載體的過程的陽(yáng)離子。當(dāng)符號(hào)R和/或R1獨(dú)立地代表氫時(shí)，式(1)化合物可以與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的堿形成加成鹽。可以用式(I)的化合物代表這樣的鹽，其中基團(tuán)XR和/或XR1中的符號(hào)X代表陰離子形式的氧和/或硫原子(即O-和/或S-)并且符號(hào)R和/或R1代表生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子。藥學(xué)實(shí)際應(yīng)用中可接受的陽(yáng)離子是從堿或堿土金屬如鈉、鉀和鎂，銨，以及脂肪族、脂環(huán)族和芳香族胺如甲胺、二甲胺、三乙醇胺、呱啶、哌嗪、N-甲基哌啶、N-甲基哌嗪、嗎啉和甲基吡啶衍生的陽(yáng)離子。適于藥學(xué)實(shí)際應(yīng)用以及包藏過程的生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子是，例如，Na+和K+。術(shù)語(yǔ)“從1至10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)”是指直鏈或支鏈烷基殘基，其可選擇性地含有不飽和和/或一或兩個(gè)選自羥基、巰基、氯、碘、氟、溴、氨基、(C1-C4)烷基氨基、二-(C1-C4)烷基氨基、(C1-C4)烷氧基和(C1-C4)烷硫基的取代基。優(yōu)選地，上述術(shù)語(yǔ)是指1至4個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、1，1-二甲基乙基、和2-甲基丙基，其可選擇性地含有一或兩個(gè)如上所述的取代基。進(jìn)一步優(yōu)選的本發(fā)明化合物組包括其中符號(hào)A、B和X如上述規(guī)定而符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或上述(C1-C4)烷基的那些式(I)化合物。這一組優(yōu)選的化合物還包括其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子如Na+、K+、和其它上面提到的陽(yáng)離子的堿的加成鹽。最優(yōu)選的本發(fā)明化合物組是其中符號(hào)A和B如上述規(guī)定，所有符號(hào)X代表氧而R和R1代表氫的式(I)的那些衍生物及它們與生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子如Na+或K+的鹽。可以說明本發(fā)明的某些具體的式(I)二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的實(shí)例具體表示于下列表I中。表1AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB表1(續(xù))AB其中A和B至少一個(gè)代表從5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷衍生的5′-C′基團(tuán)的上述式(I)二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯可用作抗腫瘤治療藥和其中A和B至少一個(gè)代表選自下列非天然存在的核苷的5′-C′基團(tuán)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯可用作抗病毒治療藥，特別是抗逆轉(zhuǎn)錄病毒感染如HIV感染，這些非天然存在的核苷是胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷，以及腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷。根據(jù)上述特性，含有兩種類型上述5′-′C′基團(tuán)的二核苷可以用作抗腫瘤和抗病毒藥。制備二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的方法是按照已在本領(lǐng)域描述過的方法進(jìn)行的。參見例如A.M.Michelson，“通過陽(yáng)離子交換進(jìn)行核苷酸酐的合成”，于生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)，(1964)，91，1-13。按照該方法，式(II)的磷酸核苷其中A、X和R具有如上的同樣含義，其通過與活化劑如焦磷酸四苯基酯或氯基磷酸二苯基酯(diphenylphosphochloridate)反應(yīng)在磷酸部分的XH基團(tuán)上活化，形成上述磷酸核苷的活化磷酸酯。然后將活化磷酸酯與式(III)的磷酸核苷反應(yīng)其中B、X和R1具有如上的同樣含義，通過活化的磷酸二苯基酯部分的替代從活化的磷酸酯形成式(I)化合物。用于制備本發(fā)明的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的方法的其它例子可以從US4855304引用的文獻(xiàn)中獲得，US4855304公開了一些適用于抑制植物病毒復(fù)制的二核苷焦磷酸酯和焦磷酸酯類似物。國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO91/00867描述了具有生物活性包括抗病毒活性的5′-二磷酸己糖核苷。在本發(fā)明有代表性的實(shí)施方案中，基本上在A.M.Michelson所述的條件下進(jìn)行上述反應(yīng)途徑，即，先將式(II)的磷酸核苷或其鹽(如鈉、鋰、或鋇鹽)轉(zhuǎn)化成與受阻叔胺堿如三正丁基胺或三正辛基胺、或與受阻季銨堿如甲基-三-正辛基氫氧化銨的相應(yīng)鹽。通常通過將磷酸核苷或其鹽(優(yōu)選鈉鹽)洗脫流過吡啶鎓型的離子交換(強(qiáng)陽(yáng)離子)樹脂經(jīng)過吡啶鎓中間體的形成進(jìn)行這一轉(zhuǎn)化。該步驟的主要目的是消除鈉或其它礦物陽(yáng)離子。然后將吡啶鎓鹽與含等摩爾量受阻叔胺堿的甲醇溶液一起保溫，然后減壓干燥生成與受阻叔胺堿的鹽。然后在不干擾反應(yīng)物的過量酸受體(每摩爾活化劑1.2至2摩爾)如脂肪族叔胺(如三正丁胺)或雜環(huán)叔胺(如N-甲基哌啶、N-甲基吡咯烷)的存在下使式(II)磷酸核苷的鹽與過量(每摩爾磷酸核苷1.5至2.5摩爾)活化劑(如氯基磷酸二苯基酯或焦磷酸四苯基酯)接觸。一般通過使用惰性非質(zhì)子傳遞有機(jī)溶劑如環(huán)醚(如二噁烷)或其混合物作為溶劑的無(wú)水條件下在室溫進(jìn)行活化反應(yīng)。在某些情況下，建議加入其它溶解力高的惰性有機(jī)溶劑(如二甲基甲酰胺)以提高反應(yīng)物濃度，從而提高反應(yīng)速度。在上述條件下，活化的磷酸酯的形成通常在2至5小時(shí)內(nèi)完成。然后在惰性有機(jī)非質(zhì)子傳遞溶劑如吡啶、六甲基磷酰胺二甲基甲酰胺或其混合物的存在下使活化的磷酸酯和磷酸核苷(III)與受阻叔胺堿或氫氧化季銨(如前面例舉的那些)的鹽反應(yīng)。反應(yīng)一般在20℃和35℃之間的溫度范圍進(jìn)行，在15至30小時(shí)期間內(nèi)完成。一般通過在減壓下蒸發(fā)溶劑，然后付諸常用的純化步驟，包括色譜法，來(lái)回收反應(yīng)粗品。例如，對(duì)于其中R和/或R1是氫的式(I)化合物的純化步驟，將粗產(chǎn)物懸浮于水中，用堿金屬氫氧化物水溶液調(diào)節(jié)pH值至8后，用不與水相混合的非質(zhì)子傳遞有機(jī)溶劑如乙醚萃取該溶液。通過聯(lián)合柱色譜法(如用凝膠過濾柱并以水作洗脫劑)和HPLC法(如用直鏈烴官能化的硅膠反相柱并以于水中的甲醇線性梯度洗脫，或者用強(qiáng)陰離子交換樹脂并以于水中的氯化鋰線性梯度洗脫)對(duì)含二核苷焦磷酸酯的水相進(jìn)行進(jìn)一步純化。本發(fā)明的式(I)二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯通常是穩(wěn)定的化合物，特別是在與生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的鹽如鈉或鉀鹽的形式下分離時(shí)很穩(wěn)定。因此，盡管當(dāng)R和/或R1表示氫時(shí)，它們可以游離酸的形式得以分離和表征，(例如，通過將鹽的水溶液載于H+型離子交換樹脂上并用水或甲醇和水的混合物洗脫樹脂)，但優(yōu)選以鹽的形式保存或使用，最優(yōu)選為生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的鹽?？梢园凑諛?biāo)準(zhǔn)方法從相應(yīng)的非磷酸化核苷制備非天然存在的磷酸核苷的原料?，F(xiàn)有技術(shù)中所述的這樣的非磷酸化前體的例子是胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZT)，腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDA)，5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷(FDU)，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDC)，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZDDU)，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDI)，以及鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(DDG)。參見下列文獻(xiàn)LeveneP.A.，生物化學(xué)雜志，(1929)，第83卷，793；Davoli等人，化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，(1948)，967；HowardG.A.等人，化學(xué)學(xué)會(huì)雜志，(1947)，1052；RobinsM.J.等人，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)雜志(1971)，9320，5277；ChuC.K.等人，有機(jī)化學(xué)雜志(1989)，54，2217；CollaL.等人，歐洲醫(yī)學(xué)化學(xué)治療雜志，(1985)，No.4,295。在大多數(shù)情況下上述前體也是可商購(gòu)的(例如從SIGMA化學(xué)公司，St.Louis，MO，美國(guó)，購(gòu)買)。將非磷酸化的前體轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的磷酸化化合物的方法也是現(xiàn)有技術(shù)已知的。一個(gè)典型的制備核苷單磷酸酯的步驟包括在縮合劑如二環(huán)己基碳化二亞胺的存在下于室溫使核苷與磷酸氰乙基酯在無(wú)水吡啶中的溶液相接觸。通?？梢栽谂c堿或堿土金屬的鹽如鈉、鋰或鋇鹽的形式下回收和純化最終產(chǎn)物。在某些情況下，核苷單磷酸酯是可以商購(gòu)的(例如5-氟-2′-脫氧尿嘧啶-5′-單磷酸酯，SIGMA化學(xué)公司，St.Louis，MO，美國(guó))。具有抗病毒(包括抗HIV)和/或抗腫瘤活性的式(I)化合物可用作藥物組合物的活性成分。為了證實(shí)某些代表本發(fā)明的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的抗-HIV活性，在HTLV-1轉(zhuǎn)化的細(xì)胞素MT-4上進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，MT-4對(duì)HIV感染高度敏感并可被HIV感染。用HIV誘導(dǎo)的細(xì)胞病變的抑制作為終點(diǎn)。該試驗(yàn)的步驟基本上如R.Pauwels等人所述“用于檢測(cè)抗HIV化合物的基于四唑鎓的快速自動(dòng)比色檢查法”，病毒學(xué)方法雜志，20，(1988)，309-321。下列表II顯示了二-(胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷)-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯(二-AZT-5′，5′，P1，P2-焦磷酸酯)的50％有效濃度(IC.50)和50％細(xì)胞毒濃度(CC50)。用胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZT)作為對(duì)照化合物。表II抗-HIV體外活性本發(fā)明的化合物特別適于用作前藥而被細(xì)胞攜帶到特定的細(xì)胞群，化合物在這里可被迅速地體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性形式。紅細(xì)胞提供了作為藥物或前藥的生物載體的極難得的機(jī)會(huì)，這是因?yàn)?a)其代謝非常簡(jiǎn)單，因此具有相對(duì)有限的可與包藏的藥物或前藥相互作用的酶系列，(b)其可到達(dá)身體的各個(gè)部位，并可作為生物反應(yīng)器按照被控制的動(dòng)力學(xué)將包藏的藥物或前藥轉(zhuǎn)化成活性形式，該動(dòng)力學(xué)可以根據(jù)所涉及的酶的性質(zhì)來(lái)設(shè)計(jì)，以及(c)其適于相對(duì)簡(jiǎn)單的修飾，該悠飾可以提供對(duì)富含血細(xì)胞的組織或器官的位點(diǎn)特異性導(dǎo)向。我們知道某些核苷藥物的活性形式是磷酸化衍生物。具體地說，一般認(rèn)為三磷酸化衍生物是通過具有抗-HIV活性的脫氧核苷抑制病毒復(fù)制的形式。但是，三磷酸化的脫氧核苷不適用于臨床，因?yàn)樗鼈儾荒芡ㄟ^細(xì)胞膜。因此，抗-HIV脫氧核苷作用效果的一個(gè)重要因素是它們?nèi)绾文苋菀椎剡M(jìn)入靶細(xì)胞并通過細(xì)胞內(nèi)酶進(jìn)行磷酸化。無(wú)論怎樣，我們知道核苷不僅可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)磷酸化而且將核苷轉(zhuǎn)化成治療活性較低或根本無(wú)活性的化合物。細(xì)胞內(nèi)酶還可以促進(jìn)其它反應(yīng)。如果這些反應(yīng)的速率與磷酸化過程的速率差不多一樣，那么核苷的治療效果則被降低。這些問題非常重要，因?yàn)槟承┌屑?xì)胞(如巨噬細(xì)胞)磷酸化酶水平較低，因此給予所述被感染細(xì)胞磷酸化形式的抗病毒核苷可以在病毒抑制方面明顯優(yōu)越于一般的給藥途徑。本發(fā)明的一個(gè)目的是開發(fā)二核苷-5′，5′-P1，P2焦磷酸酯的性能，該化合物被包藏于紅血細(xì)胞中并被特異地帶到靶細(xì)胞，在這里可以通過酶途徑裂解焦磷酸酯鍵生成兩個(gè)核苷酸。包含有磷酸化基團(tuán)的兩個(gè)核苷酸以適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)形式實(shí)現(xiàn)所需生物功能或者迅速轉(zhuǎn)化成三磷酸化衍生物的活性形式，基本上沒有失活。二核苷焦磷酸酯比相應(yīng)的單磷酸酯更適合包藏和導(dǎo)向技術(shù)，這是因?yàn)橐坏┧鼈儽灰爰t細(xì)胞則其更加穩(wěn)定，并且在包藏和前藥位點(diǎn)特異性傳遞之間的時(shí)間里從紅血細(xì)胞膜擴(kuò)散出來(lái)的速率較低。這些特征更適于設(shè)計(jì)將核苷從其載體釋放出來(lái)的動(dòng)力學(xué)。二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其可以通過焦磷酸酯鍵結(jié)合不同的核苷對(duì)。這些核苷對(duì)顯示互補(bǔ)或協(xié)同作用，并將兩個(gè)核苷引入載體，傳遞到特定的靶細(xì)胞并在每一個(gè)步驟中同時(shí)以所希望的活性形式釋放。被包埋的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的典型靶細(xì)胞是巨噬細(xì)胞或者肝臟或脾臟身體部位。將所使用的紅細(xì)胞導(dǎo)向網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的方法已有描述，例如，ZocchiE.等人，在“載體紅細(xì)胞的肝或脾導(dǎo)向鼠體模型”中，生物技術(shù)和應(yīng)用生物化學(xué)(1987)，9，423-434以及在上面提到的TonettiM.等人的論文中有述。這些方法使靶細(xì)胞或身體部位能識(shí)別生物載體并與它們反應(yīng)，從而引起位點(diǎn)特異性和受藥代動(dòng)力學(xué)控制的藥物釋放。將抗腫瘤藥和前藥包藏于適宜的生物載體如紅細(xì)胞中，已被認(rèn)為是一種完成選擇性器官導(dǎo)向使對(duì)治療反應(yīng)和毒性均有陽(yáng)性作用的治療劑緩慢釋放出來(lái)的有效方法(ZocchiE.等人，在美國(guó)國(guó)家學(xué)術(shù)科學(xué)匯編(1989)，第86卷，2040-2044)。將5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯前藥包藏到紅血細(xì)胞中的一個(gè)實(shí)施例(參見DePloraA.等人，美國(guó)國(guó)家學(xué)術(shù)科學(xué)匯編(1988)，第85卷，3145-3149)。表明為了達(dá)到對(duì)活性非磷酸化藥物釋放的藥代動(dòng)力學(xué)上有用的控制，需要共同包藏等摩爾量的其它三磷酸核苷。同時(shí)夾帶其它核苷酸會(huì)引起生物相容性及選擇的核苷前藥與伴隨的三磷酸核苷之間的相互反應(yīng)問題。本發(fā)明提供的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于可以制備不需要同時(shí)夾帶其它三磷酸核苷的5-尿嘧啶前藥而完成適當(dāng)?shù)乃幋鷦?dòng)力學(xué)控制一個(gè)表現(xiàn)出有用的藥代動(dòng)力學(xué)特征的本發(fā)明前藥的代表性實(shí)例是含有兩個(gè)通過焦磷酸酯鍵相連的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-[二-(5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷)-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯]，核糖核苷單位的二核苷-5′，5′-焦磷酸酯，該焦磷酸酯相對(duì)于相應(yīng)的單磷酸酯表現(xiàn)出較低的脫磷酸化速率。將代表本發(fā)明的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯包藏到人紅血細(xì)胞中的典型實(shí)例是通過低滲透析和等滲釋放法用二-AZT-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯進(jìn)行的(DeFloraA.等人，美國(guó)國(guó)家學(xué)術(shù)科學(xué)匯編(1988)，第85卷，3145-3149)。所用的兩步法包括首先的透析步驟，在輕度旋轉(zhuǎn)下于4℃將經(jīng)洗滌和包裝的紅細(xì)胞(80％血細(xì)胞比容)對(duì)70倍體積的溶血緩沖液(5mMNa2HPO4添加4mMMgCl2，pH7.2，26mOsm)透析35分鐘。該步驟之后在透析袋中加入10-15M二-AZT-5′，5′-，P1，P2-焦磷酸酯并在同樣條件下再透析15分鐘。然后通過將紅細(xì)胞在4℃對(duì)添加了10mM葡萄糖和腺苷的pH7.4、310mOsm的磷酸鹽-鹽水緩沖液透析40分鐘而使其重封。然后用冰冷的NaCl水溶液(0.9％體積/體積)充分洗滌載帶的紅細(xì)胞并在37℃于10％血細(xì)胞比容的自體血漿中溫育。用下列方法以連續(xù)的時(shí)間間隔測(cè)定血漿和紅血細(xì)胞中二核苷焦磷酸酯及其代謝產(chǎn)物的濃度。在不同的時(shí)間，取出1ml保溫混合物的等分試樣。從血漿中分離紅細(xì)胞后，分別萃取這兩部分。將100微升包裝的紅血細(xì)胞(RBC)加在100微升水中，然后在劇烈振蕩下加入68微升3.7M高氯酸(PCA)。將樣品離心并用30微升3M碳酸鉀中和上清液，然后將樣品離心以除去形成的沉淀。用50微升3.7MPCT處理150微升血漿部分，用27微升3M碳酸鉀中和120微升的上清液并離心。將每種萃取液5微升注射到配備有HPODSHypersil4.6×60mm3微米粒經(jīng)柱子的HP1090儀(Hew/ett-Packard，PaloAlto，加拿大)中。溶劑程序是一線性梯度，從100％緩中液A(0.1MKH2PO4加5mM氫氧化叔丁銨(TBA)，pH4.9)開始，在30分鐘后增加到100％的緩沖液B(0.1MKH2PO4加5mM)TBA，在40％(體積/體積)的甲醇水中，pH4.9)；將100％緩沖液B維持到50分鐘。流速為0.4ml/分鐘，用設(shè)置在265nM的分克克度計(jì)監(jiān)測(cè)洗脫出來(lái)的化合物。各種化合物的保留時(shí)間是(用分鐘表示)AZT，17；AZT-單磷酸酯，21；二-AZT-焦磷酸酯，33。下面的表III和IV記載了上述測(cè)定的結(jié)果。表III二-AZT-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯及其代謝物在人血紅細(xì)胞中的濃度，以nmol/ml表示</tables>表IV二-AZT-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯及其代謝物在人血漿中的濃度，以nm/ml表示上面的數(shù)據(jù)表明人紅血細(xì)胞中二-AZT-5′，5′，P1，P2-焦磷酸酯濃度達(dá)到的值符合目前實(shí)踐中的治療要求，并且藥物從紅細(xì)胞中釋放出來(lái)的速率很低。上述特征使含有抗-HIV有效量的磷酸二核苷前藥的工程紅細(xì)胞特別適用于治療目的。實(shí)際上我們知道可以對(duì)人紅細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)修飾以包藏核苷藥物并給予特定的導(dǎo)向性質(zhì)，并且這樣的修飾除了選擇性導(dǎo)向特征外并不改變紅細(xì)胞的生理行為(國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO92/22306)。根據(jù)B.L.Robbins等人在抗微生物劑和化學(xué)治療，第38卷，No.1，(1994)115-121中報(bào)導(dǎo)的數(shù)據(jù)；我們估算了當(dāng)將其導(dǎo)向HIV-感染的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞時(shí)相應(yīng)于治療有效作用的紅細(xì)胞中二核苷焦磷酸酯的濃度。實(shí)際上，這些作者指出，在用AZT有效治療下的HZV感染患者中，外用血單核細(xì)胞(PBMCs)內(nèi)AZT三磷酸酯的細(xì)胞內(nèi)濃度的范圍是從5×10-15mol/106細(xì)胞至9×10-14mol/106細(xì)胞。當(dāng)至少一個(gè)含表III中所示濃度值的二核苷焦磷酸酯的紅細(xì)胞(相當(dāng)于約2×10-10mol/106細(xì)胞至4×10-10mol/106細(xì)胞)被PBMCs(例如單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)捕獲時(shí)這些值明顯增加。如上所述，本發(fā)明的二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯可以用作口服或胃腸外途經(jīng)給藥的藥物組合物的活性成分，或者可以用作包藏到生物載體中的活性藥物或前藥，這些生物載體被導(dǎo)向特定的身體部位(如肝/脾)和/或細(xì)胞群(如單細(xì)胞/巨噬細(xì)胞)。當(dāng)二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯被用作口服或胃腸外給藥的藥物組合物的活性成分時(shí)，所述組合物通常含有有效治療量的二核苷焦磷酸酯以及惰性載體和/或稀釋劑。例如，在口服給藥的液體藥組合物中，水，優(yōu)選滅菌水，可以用作載體和/或稀釋劑?？诜o藥的固體藥物組合物可以含有粘合劑、崩解劑和潤(rùn)滑劑、例如，白明膠、黃蓍膠或微晶纖維素可以用作粘合劑，藻酸或玉米淀粉可以用作崩解劑；硬脂酸鎂或鈣可以用作潤(rùn)滑劑。某些固體形式，如膠囊，可以含有液體載體，例如脂油。對(duì)于胃腸外給藥形式，優(yōu)選的載體和/或稀釋劑可以是生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水。口服和胃腸外給藥的液體藥物組合物還可以包括其它相容性成分，如溶劑、防腐劑、和/或輔料，比如聚乙二醇、丙二醇或甘油作為溶劑，羥苯甲酸甲酯作為抗菌劑?？箟难峄蚨蚧c作為抗氧化劑，乙二胺四乙酸作為螯合劑，乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽作為緩沖劑。另外，不破壞二核苷焦磷酸酯所需作用的其它活性成分也可被摻入藥物制劑。通常口服或胃腸外藥物組合物在患者體內(nèi)應(yīng)該能夠提供0.1至3.0μM范圍的血清濃度。但是，可以使用在該范圍之外的劑量，這被理解為必須根據(jù)疾病的類型和嚴(yán)重程度、被治療患者的狀態(tài)以及所用的特定二核苷焦磷酸酯來(lái)調(diào)整每日劑量。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等等可以用作口服給藥的固體劑型，而溶液、懸液、配劑和糖漿是優(yōu)先選用的液體劑型。胃腸外制劑通常包括用于皮下注射或靜脈給藥的溶液。單位劑型通?？梢院?0至500mg的二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯，這一表示具有純粹的舉例性質(zhì)，對(duì)本發(fā)明的范圍沒有任何限制。當(dāng)本發(fā)明的二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯用作包藏在適宜生物載體中的藥物或前藥時(shí)，含有這樣的二核苷焦磷酸酯的藥物組合物優(yōu)選含有轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞。修飾這些轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞的表面使其可被生物體細(xì)胞特異性識(shí)別，包含于這些紅細(xì)胞中的二核苷焦磷酸酯在生物體中將被整合。例如，歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)517986描述了一種完成被人或動(dòng)物病原性RNA-型病毒宿主細(xì)胞的所述特異性識(shí)別的典型途徑，這一途徑主要是基于在包藏二核苷焦磷酸酯之前或之后紅細(xì)胞的表面蛋白和/或跨膜蛋白與可被吞噬細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞)識(shí)別的特異性抗體結(jié)合，該吞噬細(xì)胞連續(xù)地吞噬紅細(xì)胞。按照優(yōu)選的實(shí)施方案，載帶二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯后，首先用表面或跨膜蛋白的可逆群集劑處理紅細(xì)胞，然后用共價(jià)連接的交聯(lián)劑處理，最后在自體血漿中溫育以結(jié)合IgG分子。這些紅細(xì)胞通過它們的受體被人巨噬細(xì)胞識(shí)別，然后以約每個(gè)巨噬細(xì)胞一個(gè)紅細(xì)胞的比率被吞噬。下面的實(shí)驗(yàn)詳細(xì)描述了載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞到人巨噬細(xì)胞的導(dǎo)向。使人紅細(xì)胞進(jìn)行上述的載帶二-AZT-焦磷酸酯的步驟，然后修飾紅細(xì)胞以提高巨噬細(xì)胞對(duì)它們的識(shí)別，這一步驟詳細(xì)描述于EP-A-517986中。如表V所示，發(fā)現(xiàn)載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞表現(xiàn)出約1,500IgG分子/細(xì)胞，并且比未處理過的紅細(xì)胞被更有效地吞噬。通過將50μlRBC與100μl5mMHEPES在含4％(重量/體積)牛血清白蛋白和0.1mCi放射性標(biāo)證的蛋白質(zhì)A(比活力30mCi蛋白質(zhì))的pH7.4的PBS中測(cè)定了結(jié)合的IgG/細(xì)胞的數(shù)量。將樣品在室溫保溫30分鐘，然后洗滌4次，在Beckman5500γ-計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)結(jié)合的放射活性。如M.Magnani等人的論文中所述在體外測(cè)定載帶藥物的紅細(xì)胞的細(xì)胞吞噬“磷酸化形式的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒核苷類似物導(dǎo)向巨噬細(xì)胞體外和體內(nèi)研究(1992)，美國(guó)國(guó)家學(xué)術(shù)科學(xué)匯編，896477-6481?！北鞻巨噬細(xì)胞對(duì)載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞的識(shí)別</tables>N.D.未檢出還估算了通過載體紅細(xì)胞向巨噬細(xì)胞傳遞的二-AZT-焦磷酸酯的量及其在巨噬細(xì)胞中的穩(wěn)定性。如上所述使人紅細(xì)胞以0.4μmol/mlRBC的濃度載帶二-AZT-焦磷酸酯，然后將其進(jìn)行修飾以提高巨噬細(xì)胞對(duì)它們的識(shí)別。以每個(gè)巨噬細(xì)胞100個(gè)RBC的比率向巨噬細(xì)胞中加入修飾過的紅細(xì)胞并吞噬24小時(shí)。用RP-MI1640介質(zhì)充分洗滌未消化的RBC(3次)并用0.9％(重量/體積)氯化銨洗滌一次。然后在RBC細(xì)胞吞噬后的0和24、48或72小時(shí)時(shí)制備巨噬細(xì)胞高氯酸提取液，用K2CO3中和。然后中和提取液，通過用IsoluteTMC8柱(得自國(guó)際吸著劑技術(shù)公司，英國(guó))按照廠方說明并用甲醇作為洗脫劑進(jìn)行二-ATZ-焦磷酸酯的固相萃取。如上所述用HPLC分析提取液。二-AZT-焦磷酸酯在人巨噬細(xì)胞中的穩(wěn)定性的結(jié)果示于圖1中。還進(jìn)行了在被貓免疫缺陷型病毒(FIV)感染的貓單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞上載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞的抗病毒活性的測(cè)定。按M.Magnani等人對(duì)人單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞的報(bào)導(dǎo)培養(yǎng)了貓單核細(xì)胞衍生物巨噬細(xì)胞“磷酸化形式的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒核苷類似物導(dǎo)向巨噬細(xì)胞體外和體內(nèi)研究(1992)，美國(guó)國(guó)家學(xué)術(shù)科學(xué)匯編，896477-6481。經(jīng)15小時(shí)以每個(gè)巨噬細(xì)胞100個(gè)RBC的比率加入載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞。載帶藥物的紅細(xì)胞的二-AZT-焦磷酸酯含量是)0.4μmol/mlRBC。充分洗滌除去未消化的紅細(xì)胞”。作為對(duì)照用“無(wú)載”紅細(xì)胞(即以同樣步驟處理紅細(xì)胞但不加入二-AZT-焦磷酸酯處理巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物。如M.Bendinelli等人論文中所述用330i.d./孔的貓免疫缺陷性病毒(pisaM-2)感染接受載帶二-AZT-焦磷酸酯的RBC、“無(wú)載”RBC或未加入RBC的巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物“貓免疫缺陷性病毒和用于AIDS研究的模型以及重要的貓病原體，(1995)，臨床微生物學(xué)評(píng)論，887-112。感染8小時(shí)后，充分洗滌(6次)細(xì)胞培養(yǎng)物以除去任何與巨噬細(xì)胞結(jié)合的病毒顆粒。然后將細(xì)胞培養(yǎng)物在37℃、5％CO2中保持3天，分離它們的全部DNA。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得來(lái)自巨噬細(xì)胞的DNA分離物，該技術(shù)包括于37℃用8M脲、0.3MNaCl、10mMTrisHcl，pH7.5溶解細(xì)胞60分鐘。用苯酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1體積/體積/體積)萃取，用乙醇沉淀DNA。通過在兩個(gè)階段擴(kuò)增病毒p24gag基因的498個(gè)堿基對(duì)進(jìn)行FIV原病毒DNA的分析。擴(kuò)增的第一階段使用了下列引物相應(yīng)于病毒序列中核苷酸1025-1044的5’-GG(ATATCCTATTCAAACAG-3’(有義)(SEQIDNo1)以及相應(yīng)于核苷酸1680-1699的5’-CC-TATATTTTACGTTGAGAA-3’(反義)(SEQIDNo2)。對(duì)于擴(kuò)增的第二步驟所用的引物為相應(yīng)于病毒序列核苷酸1141-1160的5’-TATGGTTTACTGCCTTCTCT-3’(有義)(序列IDNo3)以及相應(yīng)于核苷酸1619-1638的5’-GAATTCG-GTCTTTCATGGGA-3’(反義)(SEQIDNo4)。在Perkin-Elmer循環(huán)變溫加熱器中進(jìn)行的PCR是在終體積為50μl的含168ng基因組DNA、50mllKCl、10mMTricHCl、pH8.3、1.5mMMgCl2、0.005％Tween-20、0.005％NP-40、0.001％白明膠、150nM每種引物及5uReplithermDNA聚合酶(Epicentre技術(shù)公司，Madison，威斯康星州，美國(guó))的溶液中完成的。將含有第一對(duì)引物的反應(yīng)混合物在94℃變性1分鐘，在50℃退火1分鐘，在72℃延伸2分鐘，最后在72℃延伸15分鐘，如此循環(huán)40次。然后將如此擴(kuò)增的混合物10μl與第二對(duì)引物在完全同樣的條件下再次擴(kuò)增。通過在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳分析PCR產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并與克隆到TA-克隆質(zhì)粒(Invitrogen公司，SamDiego，加利福尼亞，美國(guó))中的498個(gè)堿基對(duì)的p24gag基團(tuán)探針雜交。作為內(nèi)部對(duì)照，用下列引物擴(kuò)增貓己糖激酶基因相應(yīng)于人己糖激酶I型cDNA中核苷酸2198-2219的5’-ACATG-GAGTGGGGGGCCTTTGG-3’(有義)(SEQIDNo5)。以及相應(yīng)于核苷酸2328-2349的5’-GTTGCGGACGATTTCACCCAGG-3’(反義)(SEQIDNo6)。用FIV己糖激酶探針檢測(cè)。結(jié)果示于圖2。在用鼠免疫缺陷病毒感染的鼠巨噬細(xì)胞上進(jìn)一步測(cè)定了載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞的抗病毒活性。從C57BL/6小鼠的腹膜腔獲得鼠巨噬細(xì)胞，如Rossi等人論文中所述進(jìn)行培養(yǎng)“利用二脫氧胞苷和二脫氧胞苷5’-三磷酸來(lái)抑制鼠體逆轉(zhuǎn)錄病毒誘發(fā)性免疫缺陷性疾病”，(1993)，J.AIDS，61179-1186。對(duì)于FIV的載帶二-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞及感染如文中所述，但有下列改進(jìn)按照標(biāo)準(zhǔn)方法(D.E.Yetter等人“鼠體逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)性免疫缺陷性疾病(MAIDS)所需要的功能性T-淋巴細(xì)胞”，(1987)，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，1651737-1742)從SC-1細(xì)胞以不含細(xì)胞的上清液制備鼠免疫缺陷病毒(LP-BM5)。按照下列步驟進(jìn)行病毒DNA的PCR分析。用下列寡核苷酸引物擴(kuò)增缺陷性病毒基因組(BM5d)5’-引物，相應(yīng)于病毒序列中核苷酸1456-1473的5’-AACCTTCCTC-CTCTGCCA-3’(有義)，以及3’引物，相應(yīng)于BM5d基因組的核苷酸1579-1596的5’-ACCACCTCCTGGGCTTTC-3’(反義)。第二對(duì)寡核苷酸引物用于擴(kuò)增203個(gè)堿基對(duì)的小鼠G6PD基因。這種擴(kuò)增作為內(nèi)部對(duì)照(自身標(biāo)準(zhǔn))估算小鼠基因組中相對(duì)的BM5d整合。用于該擴(kuò)增的核苷酸引物是5’-引物，5’-TGTTCTTCAAC-CCCGAGGAT-3’(有義)和3’-引物，5’-AAGACGTCCAGGAT-GAGGTGATC-3’(反義)。此處所用的四種引物描述于G.Brandi等人的論文中“在LP-BM5鼠體誘發(fā)性免疫缺陷性疾病模型中長(zhǎng)期施用2’，3’-二脫氧尿苷的功效和毒性”，(1995)，抗病毒化學(xué)和化學(xué)治療，6，153-161。在Perkin-Elmer循環(huán)變溫加熱器中進(jìn)行的PCR是在終體積為25μl的含0.229μg基因組DNA，相當(dāng)于約114,000個(gè)細(xì)胞、50mMKCl、10mMTris-HCl、pH8.3、1mMMgCl2、0.05％吐溫-20、0.005％NP-40、0.001％白明膠、四種三磷酸脫氧核糖核苷中的每一種150μM、每種引物20pmol以及2.5UReplitherDNA聚合酶(Epicontre技術(shù)公司，Madison，威斯康星州，美國(guó))的溶液中完成的。將反應(yīng)混合物在95℃變性30秒，在58℃退火30秒，在72℃延伸30秒，最后在72℃延伸10分鐘，如此循環(huán)37次。通過在2.5％瓊脂糖凝膠上電泳分析PCR產(chǎn)物，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并與32P-標(biāo)記的D30或G6PD探針雜交。用得自Bio-Rad(Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室，Hercules，加利福尼亞，美國(guó))的隨機(jī)引物DNA-標(biāo)記試劑盒標(biāo)記DNA探針。結(jié)果示于圖3。含有夾帶本發(fā)明的二核苷焦磷酸酯的修飾后的紅細(xì)胞的藥物組合物通常是以等滲溶液，如注射用生理鹽水或葡萄糖等滲溶液的形式存在，或者以可用于靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給藥的注射用溶液的臨時(shí)配制制劑形式存在。這些藥物組合物通常含有的紅細(xì)胞的量為優(yōu)選從2至8ml，二核苷-51，51-P1，P2-焦磷酸酯的量為約0.5至約10mM。本發(fā)明被包藏的二核苷焦磷酸酯的給藥劑量為約0.5至約80μg二核苷焦磷酸酯/每十克體重的患者，應(yīng)該理解，給出的這些數(shù)值是說明性的，而對(duì)本發(fā)明的范圍不構(gòu)成任何限制?！獔D1顯示了二-AZT-焦磷酸酯在人巨噬細(xì)胞中的穩(wěn)定性?！獔D2顯示了通過分析巨噬細(xì)胞中的FIV原病毒DNA測(cè)定的載帶雙-AZT-焦磷酸酯的紅細(xì)胞對(duì)抗FIV(PisaM-2)感染的貓單細(xì)胞-衍生的巨噬細(xì)胞的抗病毒活性?！獔D3顯示了通過分析缺陷性病毒基因組(Bμ5d)DNA測(cè)定的載帶雙-ATZ-焦磷酸酯的紅細(xì)胞對(duì)抗被鼠免疫缺陷病毒(LP-BM5)感染的鼠巨噬細(xì)胞的抗病毒活性。實(shí)施例1次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的制備。將100mg(0.4毫摩爾)次黃嘌呤2′，3′-二脫氧-D-核糖糖苷加入于1ml磷酸三乙酯中的0.11ml(1.2毫摩爾)磷酰氯中，并將混合物于-5℃攪拌2小時(shí)。用10ml冰冷的乙醚萃取混合物4次，然后在0℃于2000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。除去乙醚后，將殘余物于0℃懸浮在5ml水中，并立即用冷的1NNaOH中和。將混合物在冰浴上放置10分鐘并將pH值調(diào)節(jié)至7。真空干燥后，將殘余物溶于25ml甲醇中。將溶液加在含35g懸浮于乙醚中的硅膠的柱子上。通過如下洗脫柱子獲得了純化的標(biāo)題化合物(流速3ml/分鐘)150ml乙醚，150ml乙醚∶甲醇60∶40(體積/體積)的混合物，為了洗去所有雜質(zhì)，最后，用約300ml甲醇洗脫純化的產(chǎn)物。總過程產(chǎn)率為85％。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質(zhì)譜表明相應(yīng)于標(biāo)題化合物[M-1]-離子的分子離子在m/z315.2。實(shí)施例2胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的制備。將240mg(1mmol)胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷(AZT)溶于2ml1M磷酸氰乙基酯在吡啶中的溶液中，30℃真空干燥。將殘余物懸浮于19ml無(wú)水吡啶中，然后于30℃真空干燥，兩次。加入9.6ml無(wú)水吡啶和1.15g二環(huán)己基碳化二亞胺后，將混合物于25℃攪拌48小時(shí)。然后，加入2.8ml水并將溶液于25℃再攪拌30分鐘，最后于30℃真空干燥。將殘余物懸浮于9.6ml水中，過濾并在濾器上用9.6ml水再次洗滌。然后，在合并的濾液中加入19.6ml1NNaOH并使混合物回流加熱40分鐘。將溶液冷卻至25℃，經(jīng)過用15gDowex_50(H+)離子交換樹脂填充的柱子洗脫除去鈉陽(yáng)離子。用飽和Ba(OH)2溶液調(diào)節(jié)洗脫液的pH值至7.5以沉淀磷酸鹽陰離子。離心后，在30℃真空下使上清液減少至較小體積(30ml)，再次離心除去殘余的無(wú)機(jī)磷酸鹽。在4℃向混合物中加入二倍體積的乙醇以沉淀標(biāo)題化合物的鋇鹽。最后用丙酮和乙醚洗滌沉淀并在緩和的氮?dú)饬飨赂稍铩?biāo)題化合物的鋇鹽懸浮于5ml水中并與2gDowex_50(H+)離子交換樹脂的混合。然后將混合物加在含2gDowex_50(H+)離子交換樹脂的柱子上。用30ml甲醇∶水的1∶1(體積/體積)混合物洗脫柱子，最后用1NNaOH中和洗脫液，然后將含AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽的溶液冷凍干燥，給出產(chǎn)率為70％的標(biāo)題產(chǎn)物的鈉鹽。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質(zhì)譜表明相應(yīng)于標(biāo)題化合物[M-1]-離子的分子離子在m/z346.50。實(shí)施例3胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′，5′-P1-P2-焦磷酸酯的制備。a)次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的活化將50mg(0.016mmol)次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯溶于2ml水和1ml甲醇的混合物中，然后將溶液經(jīng)過1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂洗脫。用20ml50％甲醇水溶液洗滌柱子并將溶液真空干燥。將殘余物懸浮于0.22ml三正辛基胺于1.6ml甲醇的溶液中，然后，攪拌30分鐘，最后在30℃真空干燥。將所得殘余物懸浮于1mlN，N-二甲基甲酰胺中并于30℃真空干燥。這一步驟重復(fù)三次。將所得產(chǎn)物加入2.24ml二惡烷、0.096ml氯基磷酸二苯酯和0.137ml三丁基胺的溶液，并將混合物于25℃攪拌3小時(shí)。然后將其在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，在強(qiáng)烈振蕩下向殘余物中加入16ml乙醚。使混合物在冰上放置30分鐘，然后于1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。除去乙醚，將殘余物溶于0.96ml二惡烷中并于室溫真空干燥，產(chǎn)物按原樣用于繼續(xù)的步驟c)中。b)ATZ-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽將120mg(0.35mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽溶于2ml水和2ml甲醇中，并使溶液經(jīng)過1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂用20ml50％甲醇水溶液洗脫，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥。然后，向殘余產(chǎn)物中加入0.49ml三正辛基胺和3.5ml甲醇，攪拌混合物30分鐘，最后在30℃真空干燥。將殘余物再懸浮于1.75mlN，N-二甲基甲酰胺中并于30℃減壓(5mm汞柱)干燥。這一步驟重復(fù)三次，得到的產(chǎn)物按原樣用于繼續(xù)的步驟c)中。c)反應(yīng)將步驟a)的活化的次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯溶于0.9ml無(wú)水吡啶中，將混合物加入步驟b)的AZT-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽中。之后，向混合物中加入0.16ml六甲基磷酰胺，再在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥。然后加入0.2ml無(wú)水吡啶，在25℃攪拌混合物24小時(shí)，將殘余物懸浮于5ml水中并用1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至8，用5ml乙醚萃取溶液3次。分離含上述標(biāo)題產(chǎn)物的水層并按照下列步驟d)純化產(chǎn)物。d)純化將從步驟c)得到的水溶液的0.5ml等分試樣加在Sephadex_G10柱(55×1.3cm)上并以0.25ml/分鐘的流速用水洗脫。用裝備了反相柱(C18μBondapack_，10μm粒徑)的HPLC儀進(jìn)一步純化含標(biāo)題化合物的部分。溶劑程序是在30分鐘內(nèi)以流速1.5ml/分鐘甲醇在水中的線性梯度從0至30％(體積/體積)。在這些條件下，上述標(biāo)題化合物表現(xiàn)出的保留時(shí)間(Rt)約為7分鐘。合并表現(xiàn)出上述Rt值的部分，加樣至2g離子交換樹脂(Dowex_50W-X8，H+型)上并用20ml水洗脫。將洗脫液冷凍干燥給出產(chǎn)率為35％的上述標(biāo)題產(chǎn)物。用Hewlett-Packard5989A記錄的質(zhì)譜表現(xiàn)出相應(yīng)于標(biāo)題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z644。在pH4.940％(體積/體積)甲醇于水的磷酸鹽緩中液中紫外吸收光譜在252nm表現(xiàn)出最大吸收，在270nm有一肩峰。實(shí)施例4二-(胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷)-5′-5′-P1-P2-焦磷酸酯的制備a).AZT-5′-單磷酸酯的活化將100mg(0.26mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽溶于30ml水和2ml甲醇的混合物中，然后將溶液經(jīng)過1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂用20ml50％甲醇水溶液洗脫，然后在室溫真空干燥，將殘余物懸浮于0.45ml三正辛基胺和3.2ml甲醇的混合液中并在25℃攪拌30分鐘，然后，將其在室溫真空干燥。將殘余物溶于2mlN，N-二甲基甲酰胺中并減壓(5mm汞柱)干燥。這一步驟重復(fù)三次。然后，向殘余物中加入4.48ml二惡烷、0.2ml氯基磷酸二苯酯和0.27ml三正丁基胺，在25℃攪拌3小時(shí)后，將混合物于30℃減壓(5mm汞柱)干燥，然后，在強(qiáng)烈振蕩下向殘余物中加入16ml己烷。并將混合物在冰上放置30分鐘，然后于1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。將殘余物溶于2.0ml二惡烷中并真空干燥，回收的產(chǎn)物按原樣用于繼續(xù)的步驟c)中。b)AZT-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽將100mg(0.26mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽溶于3ml水和2ml50％甲醇水溶液的混合物中，將溶液載于含1gDowex_50W-X8(吡啶翁型)離子交換樹脂的柱子上并用20ml50％甲醇水溶液洗脫，將洗脫液真空干燥。然后，向殘余物中加入0.45ml三正辛基胺和3.2ml甲醇，使混合物在25℃攪拌30分鐘，，最后在室溫真空干燥。將殘余物懸浮于2mlN，N-二甲基甲酰胺中并減壓(5mm汞柱)干燥。這一步驟重復(fù)三次，得到的產(chǎn)物按原樣用于繼續(xù)的步驟c)中。c)反應(yīng)將步驟a)的活化的AZT-5′-單磷酸酯溶于1.8ml無(wú)水吡啶中，并將溶液與0.32ml六甲基磷酰胺一起加至步驟b)的AZT-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽中。室溫真空干燥后，將殘余物懸浮于6ml水中，用1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至8，用6ml乙醚萃取混合物3次。離心分離含上述標(biāo)題產(chǎn)物的水層，回收產(chǎn)物，并按照下列步驟d)純化。d)純化將從上面的步驟c)中得到的水溶液用反相HPLC柱純化。將水溶液的1ml等分試樣加在Bio-sil_C18Hl90-10柱(Biorad)(250×10mm，10μm粒徑)上，并用如下所述的乙醇于水中的線性梯度洗脫</tables>洗脫上述標(biāo)題化合物，Rt為11分鐘。合并表現(xiàn)出上述Rt值的部分，加樣至2g離子交換樹脂(Dowex_50W-X8，H+型)上并用30ml甲醇∶水50∶50(體積/體積)的混合物洗脫。將洗脫液冷凍干燥給出產(chǎn)率為35％的上述標(biāo)題產(chǎn)物。用Howlett-Packard5989A儀器記錄的質(zhì)譜表現(xiàn)出相應(yīng)于上述標(biāo)題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z675.9。在pH4.9，40％(體積/體積)甲醇于水的磷酸鹽緩沖液中紫外吸收光譜在265nm處表現(xiàn)出最大吸收。在D2O中，在VarianGemini分光光度計(jì)上，在20℃至30℃的溫度范圍在200MHz記錄的1H-NMR譜表現(xiàn)出的最明顯的化學(xué)位移在(δppm)1.639(-CH3)，2.225(-O-CH2)，3.943(寬1′-CH-和2′-CH2)，4.275(3′-CH)，5.955(4′-CH)，7.439(芳香族質(zhì)子6-CH)。實(shí)施例55-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷，胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核糖核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的制備a)AZT-5′-單磷酸酯的活化將70mg(0.182mmol)AZT-5′-單磷酸酯鈉鹽按照實(shí)施例4步驟a)中所述的同樣步驟進(jìn)行活化，并將產(chǎn)物按原樣用于下列步驟c)中。b)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽按照實(shí)施例4步驟b)中所述的同樣步驟將100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的三正辛基銨鹽，并將產(chǎn)物按原樣用于下列步驟c)中。c)反應(yīng)將步驟a)的活化的AZT-5′-單磷酸酯溶于1ml無(wú)水吡啶中并將溶液和0.2ml六甲基磷酰胺一起加入步驟b)的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽中。真空干燥后，向殘余物中加入0.2ml無(wú)水吡啶，并將混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。在30℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸去溶劑后，將殘余物懸浮于5.3ml水中，通過加入1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至8，用5ml乙醚萃取混合物3次。分離含上述標(biāo)題產(chǎn)物的水層，回收產(chǎn)物并按照下列步驟d)進(jìn)行純化。d)純化將從步驟c)中得到的水溶液加在含有2g事先用5mMHCl處理的Dowex_1-X8(C1-型)離子交換樹脂的柱子上。流速為0.4ml/分鐘。用10ml5mMHCl洗滌柱子，然后使用流速為0.5ml/分鐘的在5mMHCl中從0至600mM的LiCl線性梯度洗脫。收集并合并含標(biāo)題產(chǎn)物的部分，并通過加入1MLiCl調(diào)節(jié)pH值至6.5。然后在30℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將溶液濃縮至體積為4ml。用反相HPLC柱(μBondapack_C18，250×10mm，10μm粒徑)以流速為4ml/分鐘的水洗脫，上樣量為500μl，通過HPLC進(jìn)一步純化濃縮液。將回收的部分冷凍干燥，產(chǎn)生25mg標(biāo)題產(chǎn)物的鋰鹽。按照實(shí)施例4步驟d)的最后一部分所述的同樣步驟以實(shí)際的定量產(chǎn)率將該產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成標(biāo)題的游離酸化合物。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質(zhì)譜表現(xiàn)出相應(yīng)于標(biāo)題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z653。實(shí)施例6二-(5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷)-5′5′-P1，P2-焦磷酸酯的制備a)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯的活化按照實(shí)施例4步驟a)中所述的同樣步驟活化100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽。b)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯三正辛基銨鹽按照實(shí)施例4步驟b)中所述的同樣步驟將100mg(0.27mmol)5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的三正辛基銨鹽；并將產(chǎn)物按原樣用于下列步驟c)中。c)反應(yīng)將步驟a)的活化的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯鈉鹽溶于1ml無(wú)水吡啶中并將溶液和0.2ml六甲基磷酰胺一起加入步驟b)的5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核糖核苷-5′-單磷酸酯三正辛基銨鈉鹽中。真空干燥后，向殘余物中加入0.2ml無(wú)水吡啶，并將混合物在室溫下攪拌24小時(shí)。在30℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸去溶劑后，將殘余物懸浮于6ml水中，通過加入1NNaOH調(diào)節(jié)pH值至8，用6ml乙醚萃取混合物3次。分離含上述標(biāo)題產(chǎn)物的水層，回收產(chǎn)物并按照下列步驟d)進(jìn)行純化。d)純化將從步驟c)中得到的水溶液加在含有2g事先用5mMHCl處理的Dowex_1-X8(C1-型)離子交換樹脂的柱子上。流速為0.4ml/分鐘。用10ml5mMHCl洗滌柱子，然后使用流速為0.4ml/分鐘的在5mMHCl中從0至600mM的LiCl線性梯度洗脫。收集并合并含上述標(biāo)題產(chǎn)物的部分，并通過加入1MLiCl調(diào)節(jié)pH值至6.5。然后在30℃于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將溶液濃縮至體積為2ml，然后在冰中通過加入2倍體積的乙醇∶丙醇1∶4(體積/體積)混合物沉淀化合物，最后用丙酮和乙醚洗滌沉淀的化合物，用緩和的氮?dú)鈿饬鞲稍?，得到上述?biāo)題化合物的鋰鹽，按照實(shí)施例3步驟d)最后一部分中所述的同樣步驟將其轉(zhuǎn)化為游離酸。產(chǎn)率30％。用Hewlett-Packard5989A儀器記錄的質(zhì)譜表現(xiàn)出相應(yīng)于標(biāo)題化合物的[M-1]-離子的分子離子在m/z653。在40％(體積/體積)甲醇水的pH4.9磷酸鹽緩沖液中的紫外吸收光譜在269nm處表現(xiàn)出最大吸收。序列表(1)一般信息(I)申請(qǐng)人(A)名稱GRUPPOLEPETITS.P.A.(B)街道ViaR.Lepetit34(C)城市GERENZANO(VA)(E)國(guó)別意大利(F)郵編(ZIP)I-21040(II)發(fā)明名稱二核苷-5′，5′-焦磷酸酯(III)序列數(shù)目6(IV)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentinRelease#1.0，Version#1.30(EPO)(2)SEQIDNO1的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(IV)反義否(XI)序列描述SEQIDNO1GGCATATCCTATTCAAACAG20(2)SEQIDNo2的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(IV)反義否(XI)序列描述SEQIDNO2CCTATATTTTACGTTGAGAA20(2)SEQIDNo3的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(IV)反義是(XI)序列描述SEQIDNO3TATGGTTTACTGCCTTCTCT20(2)SEQIDNo4的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度20個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/desc＝“合成寡核苷酸”(IV)反義是(XI)序列描述SEQIDNO4GAATTCGGTCTTTCATGGGA20(2)SEQIDNo5的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/dess＝“合成寡核苷酸”(IV)反義否(XI)序列描述SEQIDNO5ACATGGAGTGGGGGGCCTTTGG22(2)SEQIDNo6的信息(I)序列特征(A)長(zhǎng)度22個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(II)分子類型其它核酸(A)描述/dess＝“合成寡核苷酸”(IV)反義是(XI)序列描述SEQIDNO6GTTGCGGACGATTTCACCCAGG2權(quán)利要求1.式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯其中符號(hào)A和B各自獨(dú)立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)；符號(hào)X各自獨(dú)立地代表氧或硫；符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或從1至10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的堿的加成鹽。2.權(quán)利要求1的二核苷，其中符號(hào)A代表選自下列非天然存在的核苷的5′-C′-基團(tuán)胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷以及鳥嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷；符號(hào)B代表選自下列非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷，胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷，次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷以及鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷；選自通過雙鍵與磷原子直接相連的那些化合物以及是基團(tuán)XR和XR1的一部分的那些化合物的一個(gè)或兩個(gè)符號(hào)X代表氧或硫并且其它的符號(hào)X分別代表氧；符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或1至4個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；以及其中R和/或R1代表氫的化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子，優(yōu)選鈉和鉀離子，的堿的加成鹽。3.如權(quán)利要求2的化合物，其中所有符號(hào)X代表氧，R和R1均代表氫，及其與生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子，優(yōu)選Na+或K+，的堿的鹽。4.權(quán)利要求2的化合物，其中每個(gè)符號(hào)A和B代表下列組合的非天然存在的核苷的5′-C′基團(tuán)1)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷2)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷3)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷4)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷5)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷6)A5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷B)次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷7)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷8)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3-二脫氧-D-核苷9)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B腺嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷10)A腺嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B腺嘧呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷11)A次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷12)A次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷13)A次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷14)A胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷15)A腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷16)A尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷17)A鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷B鳥嘌呤-2′-，3′-二脫氧-D-核苷18)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷19)A尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷20)A胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷21)A尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷B鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷；每個(gè)符號(hào)X代表氧；每個(gè)符號(hào)R和R1代表氫；及其與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子，優(yōu)選鈉或鉀離子，的堿的加成鹽。5.權(quán)利要求4的化合物，其中I)A代表非天然存在的核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團(tuán)而B代表非天然存在的核苷次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團(tuán)；II)每個(gè)符號(hào)A和B代表非天然存在的核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2，′3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′-基團(tuán)；或者III)A代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷的5′-C′基團(tuán)，而B代表非天然存在核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團(tuán)；或者IV)每個(gè)符號(hào)A和B代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷的5′-C′基團(tuán)；每個(gè)符號(hào)X代表氧；每個(gè)符號(hào)R和R1代表氫；及其鈉鹽和鉀鹽。6.權(quán)利要求5的化合物，其中每個(gè)符號(hào)A和B代表非天然存在核苷胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷的5′-C′基團(tuán)；每個(gè)符號(hào)X代表氧；每個(gè)符號(hào)R和R1代表氫；及其它們的鈉和鉀鹽。7.權(quán)利要求1至6任何一項(xiàng)中的化合物作為藥物的用途。8.權(quán)利要求1至4任何一項(xiàng)中的化合物，其中至少一個(gè)符號(hào)A和B代表選自下列非天然存在的核苷的5′-C′基團(tuán)胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷，尿嘌呤-3′-疊氮基-2′，3-二脫氧-D-核苷鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷其作為抗病毒劑的用途，特別是對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒感染如貓和鼠免疫缺陷性病毒感染和HZV感染。9.權(quán)利要求6的化合物作為抗病毒劑的用途，特別是對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒感染如貓和鼠免疫缺陷性病毒感染和HIV感染。10.權(quán)利要求1至4任何一項(xiàng)中的化合物，其中至少一個(gè)符號(hào)A和B代表非天然存在核苷5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷的5′-C′-基團(tuán)，其作為抗腫瘤劑的用途。11.權(quán)利要求5I)、II)和III)項(xiàng)的任何化合物用于生產(chǎn)抗-HIV劑的用途。12.權(quán)利要求6的化合物用于生產(chǎn)抗-HIV劑的用途。13.權(quán)利要求5III)項(xiàng)的任何化合物用于生產(chǎn)抗腫瘤劑的用途。14.一種含有式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的藥物組合物其中符號(hào)A和B各自獨(dú)立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)；符號(hào)X各自獨(dú)立地代表氧或硫；符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或從1至10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的堿的加成鹽。15.權(quán)利要求1至6的任何一項(xiàng)中的化合物用于生產(chǎn)抗腫瘤和/或抗病毒感染的治療劑的用途，其特征在于所述化合物被包藏在生物載體中。16.根據(jù)權(quán)利要求15的用途，其中的生物載體是轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞。17.一種含有包含式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞的組合物其中符號(hào)A和B各自獨(dú)立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)；符號(hào)X各自獨(dú)立地代表氧或硫；符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或從1至10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的堿的加成鹽。18.一種制備式(I)的二核苷-5′，5′-P1，P2焦磷酸酯的方法其中符號(hào)A和B各自獨(dú)立地代表選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′，3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′-C′基團(tuán)；符號(hào)X各自獨(dú)立地代表氧或硫；符號(hào)R和R1各自獨(dú)立地代表氫或從1至10個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)；以及其中R和/或R1代表氫的式(I)化合物與提供生物學(xué)上可接受的陽(yáng)離子的堿的加成鹽。該方法包括活化式(II)的磷酸核苷的XH基團(tuán)其中A，X和R具有與上面相同的含義，以形成活化的磷酸酯并將該活化的磷酸酯與式(III)的酸核苷與受阻叔胺堿的鹽反應(yīng)其中B、X和R1具有與上面相同的含義。19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中通過與焦磷酸酯四苯基或磷酸一酰氯二苯基酯反應(yīng)活化式(II)的磷酸核苷的XH基團(tuán)。20.根據(jù)權(quán)利要求18和19中任何一項(xiàng)的方法，其中式(III)的磷酸核苷與受阻叔胺堿的鹽是與三正丁基胺、三正辛基胺或甲基-三正辛基氫氧化銨的鹽。21.根據(jù)權(quán)利要求18、19和20中任何一項(xiàng)的方法，其中活化的式(II)磷酸核苷和式(III)的磷酸核苷與受阻叔胺的鹽的反應(yīng)是在不干擾反應(yīng)物的過量酸受體，優(yōu)選脂肪族叔胺或雜環(huán)叔胺存在下進(jìn)行的。22.根據(jù)權(quán)利要求18、19、20和21中任何一項(xiàng)的方法，其中活化的式(II)的磷酸核苷與式(III)的磷酸核苷的鹽的反應(yīng)是在室溫下在惰性有機(jī)溶劑優(yōu)選二噁烷的存在下進(jìn)行的，可選擇地還存在溶解力高的其它惰性有機(jī)溶劑，優(yōu)選二甲基甲酰胺。23.一種將權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯包藏到紅細(xì)胞中的方法，其特征在于將紅細(xì)胞(I)在溶血性緩沖液中透析，(II)在同樣的透析條件下與二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯接觸，(III)通過針對(duì)比所述溶胞產(chǎn)物高滲的磷酸鹽緩中液透析進(jìn)行重封，并且(IV)充分洗滌重封后的紅細(xì)胞。24.含權(quán)利要求1至6中任何一項(xiàng)的二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞的組合物，進(jìn)一步的特征在于修飾了這種轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞的表面，從而可被人或動(dòng)物病原性逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主細(xì)胞特異性識(shí)別。25.制備權(quán)利要求24的組合物的方法，其特征在于如下處理含二核苷-5′，5′-P1，P2-焦磷酸酯的紅細(xì)胞(I)先用表面蛋白或跨膜蛋白的可逆群集劑處理，(II)然后用共價(jià)連接交聯(lián)劑處理，最后，(III)在自體血漿中溫育以結(jié)合IgG分子。全文摘要本發(fā)明描述了選自胸腺嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、5-氟尿嘧啶-2′-脫氧-D-核苷、尿嘧啶-3′-疊氮基-2′，3′-二脫氧-D-核苷、鳥嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、次黃嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷、胞嘧啶-2′3′-二脫氧-D-核苷、和腺嘌呤-2′，3′-二脫氧-D-核苷的非天然存在核苷的5′，5′-焦磷酸酯，以及它們的生產(chǎn)和作為抗腫瘤和抗逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，包括HIV感染的治療劑的用途?；衔锟梢宰鳛樗幬锝M合物的活性發(fā)生成分或作為包藏在生物載體如轉(zhuǎn)化紅細(xì)胞中的前藥來(lái)給藥，從而導(dǎo)向引起病理學(xué)疾病產(chǎn)生的特定細(xì)胞群。文檔編號(hào)C07H21/00GK1154112SQ95194159公開日1997年7月9日申請(qǐng)日期1995年7月10日優(yōu)先權(quán)日1995年7月10日發(fā)明者A·德·費(fèi)羅拉,U·本納蒂,M·基維尼申請(qǐng)人:格魯波萊佩蒂特公司,熱那亞技術(shù)研究大學(xué)